细菌学检验2细菌学检验基本技术.ppt

第二章细菌学检验基本技术,郭霍法则（Kochspostulate）,证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则。在患病动物中存在可疑病原有机体，而健康动物中没有；可疑有机体在纯培养中生长；纯培养中的可疑有机体细胞能引起健康动物发病；可疑有机体被再次分离，并且和最初分离的有机体一样；,郭霍法则（Kochspostulate）,本章内容,第一节样本的采集与送检原则第二节细菌的分离培养方法第三节细菌的形态结构检查法第四节细菌的生化反应检查法第五节细菌的血清学检验第六节细菌毒素的检测第七节细菌数量的测定第八节细菌L型检验,第一节标本的采集与送检原则,本节主要讲：临床样本的采集与送检其余样本采集方法详见第七章,一、标本采集的一般原则1早期采集：应争取在使用抗生素之前采集；2无菌采集：避免杂菌污染；3根据致病菌在不同病期的体内分布和排出部位，采取不同标本。尽可能采集病变明显部位的材料。4采集适量标本：特别是无菌部位的标本。5安全采集6.标本必须新鲜，采集后尽快送检；7.送检过程中要采取适当的保存方式。,二、不同标本采样方法有所不同1血及骨髓样本的采集：采静脉血；2尿液样本的采集：晨起第一次尿液；中段尿或肾盂尿。3粪便样本的采集：脓血粘液便、肛拭子。4痰样本的采集：咳痰法、胃内采痰、咽拭子等。5上呼吸道样本的采集：清水反复漱口后，咽后壁拭子。6.其他临床样本的采集：脓汁(拭子、吸管)；脑脊液(穿刺)；,三、标本的送检与处理1.对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立即送检。2.其他所有的标本采集后最好在2h之内送到实验室。3.若不能及时送检，标本应置于一定环境中保存。4.一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h。,.病人标本中可能含有大量致病菌，必须注意安全防护。.标本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必须包装好，防止送检过程中倒翻或碰破流出。.对于烈性传染病标本运送时更要特别严格，必须按规定包装，由专人运送。.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送。,第二节细菌的分离培养方法,一、培养基（culturemedium）的制备培养基：是指人工配制的供细菌生长繁殖需要的各种营养物质配制而成的基质。,(一)培养基的的主要成分及其作用营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子等。水分：蒸馏水。凝固物质：琼脂（赋形剂）、明胶、卵白抑制剂和指示剂,2019/12/11,12,(二)制备培养基的一般程序,调配,溶化,矫正pH,过滤澄清,分装加塞,灭菌,检定,保存,(三)培养基的种类（按物理性状分类）,液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。半固体培养基：含0.30.5琼脂，用于观察细菌的动力、保存菌种等。固体培养基：斜面、平板。含22.5琼脂，平板：多用于细菌的分离培养。斜面：多用于纯培养、保存菌种等。,（三）培养基的种类(按成分分类)1基础培养基（basedmedium）2营养培养基（nutrientmedium）3鉴别培养基（diferentialmedium）4选择培养基（selectivemedium）5特殊培养基（specialmedium）6.增菌培养基：可提高检出率。,1基础培养基含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，俗称肉汤（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。,2营养培养基最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板等。,3鉴别培养基糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-镁蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培养基等。,4选择培养基SS琼脂使致病的沙门菌、志贺菌容易分离到。,5特殊培养基疱肉培养基、巯基乙醇酸钠培养基,（四）培养基的选择根据标本来源和可能存在的病原菌，确定选用各种分离培养基。如：伊红美蓝/麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌。,（四）培养基的选择从血液、骨髓中分离病原菌用血液增菌培养基,二、细菌接种方法,接种环境：严格无菌环境中进行接种工具接种的基本程序接种方法,（一）接种工具接种针和接种环：由三部分组组成，即环（针）、金属柄和绝缘柄。接种前后都要过火灭菌。接种针：用于穿刺接种细菌，接种环：用于固体、液体培养基的细菌接种。L型玻璃棒：用于琼脂平板涂布接种细菌。,（二）细菌接种的基本程序,取菌种试管和待接种的斜面试管,灭菌接种环,沾取标本,接种管宜放在菌种管上面,接种,接种后灭菌接种环,（三）细菌接种方法,1平板划线接种法：分离细菌目的：使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌。曲线接种法：适用于含菌量较少的标本。分区划线接种法：适用于含菌量较多的标本。棋盘格划线接种法：用于分离肠道菌科细菌。平板涂布接种法：用于活菌计数和药敏实验。倾注培养：用于细菌计数。,连续划线法,分区划线法,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,涂布接种法：用于测定标本中活菌数和药敏实验细菌接种。,倾注培养法：用于细菌计数。,2.斜面接种法：用于鉴定和保存菌种。,3.半固体培养基：穿刺接种法，用于保存菌种或观察细菌动力。,4.液体培养基接种法可观察细菌在培养基中的生长现象或用作生化反应实验。,三、细菌培养方法1需氧培养法(一般培养法)培养温度：37（采用恒温培养箱）培养时间：1824h2二氧化碳培养法：烛缸法、二氧化碳培养箱3厌氧培养法厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐疱肉培养法、硫乙醇酸盐法等,四、细菌在培养基上的生长现象,(一)细菌在固体培养基中的生长现象,菌落（colony)定义：指单个细菌在平板培养基上生长繁殖，形成单一肉眼可见的细菌集团。菌落特征：大小、形状、边缘、颜色、表面、透明度、湿润度、黏度、溶血性。菌苔(lawn)：指多个菌落融合在一起形成的细菌堆积物。,菌落与菌苔,Samplesweretakenfromthenumberedcoloniesandexaminedmicroscopically,(二)细菌在液体培养基中的生长现象,混浊：沉淀：多见于链状排列的细菌。菌膜：多见于厌氧菌。其他：色素等。,细菌在液体培养基中的生长现象,(三)细菌在半固体培养基中的生长现象,有鞭毛细菌：在培养基中沿穿刺线并向外扩散生长，穿刺线边缘模糊。无鞭毛细菌：只沿穿刺线生长，穿刺线边缘清晰。,细菌在半固体培养基中的生长现象,有动力现象,无动力现象,第三节细菌的形态学检查法,1.包括不染色标本检查法和染色标本检查法。2.镜检可以了解有无细菌及大致的菌量。3.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类。4.通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义。,一、显微镜检查普通光学显微镜自然光的波长为0.4m；显微镜的最大分辨率为0.2m（前者的一半）；肉眼的分辨率为0.2mm，故放大1000倍，使0.2m放大到0.2mm。使用油镜(100倍物镜)观察细菌。常用于染色标本检查。暗视野显微镜常用于不染色标本检查。观察动力。,一、显微镜检查相差显微镜利用相差板的光栅作用，使光波穿过标本中密度不同的部位时，引起位相差，显出光的强度的明暗对比。即可观察细菌动力，又能观察内部结构。荧光显微镜以紫外光或蓝紫光作光源，因其波长比自然光短，故分辨率比普通显微镜要高。,透射电镜,扫描电镜,一、显微镜检查电子显微镜以强大的电子流代替光源，因电子流的波长仅为0.005nm，（仅为可见光源的几万分之一），故其放大倍数可达10万-100万倍，可看清1nm的物体。透射电镜：因电子的透射作用，可观察细菌，virus内部结构，通过荧屏显示。扫描电镜：因电子流对物体的表面进行扫描，可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构，可用于对细菌，virus的结构观察。,一、显微镜检查电子显微镜以强大的电子流代替光源，因电子流的波长仅为0.005nm，（仅为可见光源的几万分之一），故其放大倍数可达10万-100万倍，可看清1nm的物体。透射电镜：因电子的透射作用，可观察细菌，virus内部结构，通过荧屏显示。扫描电镜：因电子流对物体的表面进行扫描，可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构，可用于对细菌，virus的结构观察。,（一）不染色检查主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况。常用的方法有：压滴法悬滴法毛细管法,1、压滴法,镜检,2、悬滴法,镜检,3、毛细管法,镜检,方法：选用孔径0.5-1.0mm，长约60-70mm毛细管，以此管轻取细菌培养物，待液体进入后，两端火焰封融。应用：主要用来检测厌氧菌的动力。,二、不染色检查法结果观察：有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显的方向性位移。无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无位置的改变。注意：区别细菌的运动与布朗运动。,有些病原菌通过不染色标本的动力检查可作出初步鉴定如疑似霍乱患者，镜下观察到来回穿梭似流星状运动的细菌，制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。,三、染色检查法细菌标本经染料染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类。,染料大多是人工合成的含苯环或苯的有机物。色基：即连接在苯环上带双键的有色化学基团，它使染料带颜色，其色基越多，颜色越深。如-NO2(硝基）,-N=N-（偶氮基）。助色基：不显色，它决定了染料与被染物之间的亲和性，且有酸、碱之分，决定了染料的酸碱性。-NH2（碱性）-OH（酸性）,（一）常用染料单纯染料：多为偶氮化合物，亲和力低，不溶于水，而溶于脂溶剂。如：苏丹染料。碱性染料：色基带正电，易与带负电的被染物结合着色。如：碱性复红、结晶紫、美蓝等。酸性染料：色基带负电，如：伊红、刚果红等。复合染料（中性染料）：可与cell浆结合。如：瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等。荧光染料：有荧光标记的抗体。,（二）涂片制备,涂片：取菌涂成菌膜。干燥：固定：通常用火焰加热固定，将已干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳。,（三）常用染色方法单染色法复染色法（鉴别染色法）：最常用。革兰染色法；抗酸染色法。特殊结构染色法负染色法荧光染色法,细菌染色法:,涂片,干燥,固定,染色1min,水洗、吸干,镜检,1.单染色法用一种染料染色，细菌及周围部分都染成同一种颜色。主要用于观察细菌的形态、大小、排列及简单的结构，如美兰染色，复红染色。方法：制备涂片标本染色,复染色法：用两种以上的染料，将不同的细菌或同一细菌的不同结构染成不同的颜色。主要用于观察细菌的形态、大小、排列及简单的结构，还可根据其染色性鉴别细菌。类别：革兰染色法；抗酸染色法。,2.革兰染色（gramstain）,由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立。最经典、最常用的染色方法。通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类。,1）染色步骤,2）革兰染色结果,紫色革兰阳性菌G+菌红色革兰阴性菌G菌,革兰阳性菌,革兰阴性菌,3）染色原理,细胞壁通性学说：与肽聚糖结构有关。革兰阳性菌cellwall因肽聚糖厚，脂类少，通透性低，酒精不易进入脱色，相反革兰阴性菌肽聚糖少，含脂多，易被酒精溶解，使cellwall通透性升高。,革兰阳性菌细胞壁的肽聚糖结构,革兰阴性菌细胞壁的肽聚糖结构,3）染色原理,化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关。革兰阳性菌含大量核糖核酸镁盐。等电点学说：与细菌所带电荷有关。革兰阳性菌pI2-3，低于革兰阴性菌pI4-5。,4）影响革兰染色的因素,操作因素涂片的厚薄；脱色时间的长短。染液因素卢戈碘液放置时间过长；95乙醇挥发；结晶紫与草酸铵混合时间太长。细菌因素细菌种类；细菌菌龄等。,5）革兰染色的意义,鉴别细菌选择用药与细菌致病性有关,3.抗酸染色法（acid-faststain）,原理分枝杆菌一般不易着色，若用5%石炭酸复红加温并延长染色时间，可染上红色，又因其菌体中含有分枝菌酸，可抵抗3%盐酸酒精的脱色，仍保持红色，故称为抗酸菌。意义用于结核杆菌、麻风杆菌的鉴别。,步骤：涂片固定酸性复红初染3%盐酸酒精脱色美蓝复染镜检,3.抗酸染色法（acid-faststain）,结果:抗酸菌红色；非抗酸菌蓝色。,特殊染色法：细胞壁染色染液：10鞣酸溶液、0.5结晶紫溶液方法：涂片自然干燥鞣酸染15min，水洗结晶紫染35min，水洗待干，镜检。结果：细胞壁（细菌的周边）染成紫色，内部无色；无细胞壁的细菌（L型菌）整个菌体染成紫色。,特殊染色法：荚膜染色法鞭毛染色法芽胞染色法异染颗粒染色法,4.鞭毛染色可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。5.异染颗粒染色用于白喉棒状杆菌染色。,6.芽胞染色：绿色部分为芽胞。,7.墨汁染色:一般用于新型隐球菌检查。,8荧光染色荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。,第四节细菌的生化反应检查法,生化反应：由于细菌各自的酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别细菌的类别，这种试验称为。注意：取可疑纯培养物接种不同的生化反应培养基。培养后观察结果。,一、糖类代谢试验1.糖（醇、苷）类发酵试验是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。培养基：糖发酵管。指示剂：溴甲酚紫(酸性：无色；碱性：紫红色)倒置小管：用于观察产气。结果观察：黄色+；黄色+气泡+；紫色（不变色）,糖发酵试验,2氧化发酵试验（O/F试验）主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。,3甲基红(MR)试验主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌。培养基：葡萄糖蛋白胨水。指示剂：甲基红(pH4.5：红色；pH4.5：黄色)结果观察：红色+；黄色,+,4VP（Voges-Proskauer）试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇碱性条件下二乙酰胍基化合物红色化合物+培养基：葡萄糖蛋白胨水。结果观察前加入：VP试剂结果观察：红色+；不变色,+,5半乳糖苷酶试验（ONPG试验）迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。ONPGONP（黄色）培养基：乳糖肉汤琼脂。试剂：ONPG结果观察：黄色+；不变色,6.七叶苷水解试验主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。分解七叶苷产生七叶素，七叶素与培养基中的柠檬酸铁起反应生成黑色化合物。培养基：七叶苷培养基。结果观察：黑色+；不变色,二、氨基酸和蛋白质代谢试验,1吲哚（indol）(靛基质)试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。培养基：蛋白胨水试剂：吲哚试剂结果观察：红色+；不变色,2硫化氢试验应用：主要用于肠杆菌科中属及种鉴别培养基：醋酸铅培养基结果观察：黑色+；不变色,硫化氢试验,3尿素酶试验主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。4明胶液化试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。明胶20时为固体，35时为液体。,尿素酶试验,5苯丙氨酸脱氨酶试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗菲登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。须在5min内作用判断。绿色为阳性。6氨基酸脱羧酶试验主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,三、有机酸盐和铵盐代谢试验,1枸橼酸盐利用试验用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。2.马尿酸钠水解试验用于B群链球菌的鉴定。3丙二酸盐利用试验肠杆菌科中属间及种的鉴别。,马尿酸钠水解试验,四、酶类试验,1氧化酶试验主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。2过氧化氢酶试验（触酶试验）用于革兰阳性球菌的初步分群。,3硝酸盐还原试验本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。4.过氧化物酶试验,5DNA酶试验在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷氏菌和变形杆菌产生此酶。6血浆凝固酶试验作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。,IMViC试验I-吲哚（indol）试验M-甲基红（methylred）试验V-VP（Voges-Proskauer）试验C-枸橼酸盐利用（citrateutilization）试验,IMViC试验大肠埃希菌+-产气杆菌-+,复合生化反应,克氏双糖铁（KIA）或三糖铁(TSI)试验糖：葡萄糖（1份）、乳糖（蔗糖）（10份）硫酸亚铁指示剂：酚红为固体斜面培养基接种时需：先穿刺底层，再斜面上划线。,2019/12/11,127,KIA/TSI反应结果,结果记录方式斜面：产酸（A）或碱（K）底层：A或K？是否产气？是否产H2S？如：KA-/AA+-,复合生化反应,动力吲哚尿酶（MIU）试验含蛋白胨尿素指示剂：酚红为半固体培养基，采用穿刺接种法结果记录方式：+-,第五节细菌的血清学检验,免疫学检测抗原检测血清学鉴定抗体检测血清学诊断,（一）抗原检测免疫荧光技术在细菌鉴定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、间接法和免疫荧光菌球法。玻片凝集试验,（二）抗体检测抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价的升高。因此用已知的细菌或其特异性抗原检测病人血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。主要适用于抗原性较强的致病菌和病程较长的感染性疾病。,第六节细菌毒素的检测,一、内毒素内毒素的测定，主要用于确诊病人是否发生革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。方法：鲎试验。,鲎试验原理：鲎是一种海洋节肢动物，其血液及淋巴液中有一种有核的变形细胞，胞浆内有大量的致密颗粒，内含凝固酶原及凝固蛋白原。当内毒素与鲎变形细胞冻融后的溶解物（鲎试剂）接触时，可激活凝固酶原，继而使可溶性的凝固蛋白原变成凝固蛋白而使鲎变形细胞冻融物呈凝胶状态。应用：可用于尿液、脑脊液、体液中革兰阴性细菌感染后内毒素的检测，以协助临床诊断。,二、外毒素外毒素的测定可用于待检菌的鉴定，同时可区分产毒株与非产毒株。方法：1.体内毒力试验2.体外毒力试验,三、动物实验1.用途：分离和鉴定病原微生物。测定细菌的毒力。制备免疫血清。建立致病动物模型。动物的血液是配制细菌培养基必须的实验材料。用于生物制品或一些药物的安全、毒性、疗效检验。,三、动物实验2.常用的接种方法：皮下注射、皮内注射、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射和脑内注射等。,第七节细菌数量的测定,一、物理计数法Breed计数法借助显微镜观察测定优点：快速缺点：