（细胞生物学专业论文）拟南芥器官发生及体细胞胚发生相关基因的表达模式分析.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 植物细胞具有全能性，任何一个细胞都有发育成完整个体的潜在能力。其主 要体现在植物组织培养中的脱分化、分化、器官形成或胚胎发生直到完整植株的 形态建成等一系列过程中。离体器官发生是指培养条件下植物的组织或细胞团 ( 愈伤组织) 分化形成不定芽，不定根或花芽等器官的过程。体细胞胚胎发生是 指离体条件下植物的体细胞通过与合子胚发生相类似的途径发育成新个体的过 程。目前，有关不定芽再生及体细胞胚发生的分子机理和基因调控研究还很少， 有待展开系统的研究。 本研究以发育成熟的拟南芥种子为外植体，建立了高频率不定芽再生的离体 培养体系。详细地研究了离体器官发生和不定芽再生的形态学和组织学变化，分 析了器官发生相关基因m i r l 6 5 a ，m i r l 6 6 a ，e , e v - f f 该发育过程中的时空表达模式， 并分析了生长素极性分布在离体器官发生过程中的作用，为理解离体器官发生和 不定芽再生的发育过程及其分子机理提供重要信息。 另外，利用拟南芥成熟种子获得分化与非不分化的愈伤组织，并分析体细胞 胚发生相关基因在上述愈伤组织中的表达变化，为深入研究体细胞胚发生的分子 机制奠定了基础。 主要研究结果如下： 1 高频率不定芽再生培养体系的建立 利用c 0 1 0 生态型拟南芥成熟种子为外植体，通过施加一定浓度的2 ，4 一d ， 从茎顶端分生组织区诱导产生器官原基( 叶原基) ，并可进一步发育形成叶片状 结构，还可在生长素的作用下，形成次级叶原基。去除生长素之后，上述器官原 基和叶片状结构可进一步发育为不定芽。 2 器官发生相关基因的时空表达模式分析 利用m i r l 6 5 a ：g u s ，m 识j 6 缸? ? g 泌，r e 玢：g u s 转基因拟南芥种子，建立 了相同的不定芽再生培养体系，并通过g u s 染色法分析了这些基因的时空表达 模式。结果显示，m i r l 6 5 a 在球形突起形成早期不表达，而在膨大的突起单侧或 两侧表层一至几个细胞中表达，随后其表达区域扩展至整个侧面，故推测它们在 体外叶原基起始中起作用，m i r l 6 6 a 过表达可促进不定芽的发生，进一步说明它 们在不定芽再生中起重要作用；m i r l 6 5 a 1 6 6 a 在叶片状结构和不定芽的背侧表 山东大学硕士学位论文 达，表明其与器官腹背极性建立有关；m i r l 6 5 a 亦在叶片状结构外侧一至几个 细胞中表达，该处产生新的叶原基，表明其与次级叶原基的起始有关。以上结果 表明其在不定芽的起始及发育中均起重要作用。 r e v 在整个器官原基中表达，亦在不定芽子叶尖端和整个维管组织中表达， 说明其在叶器官起始、发育和维管组织发育中起重要的作用。 3 生长素极性分布方式 利用能够反映生长素最大积累量的d r 5 ：g u 嗽告子，来研究生长素在离体器 官发生和不定芽再生过程中的分布情况。结果表明，生长素在叶原基、幼叶顶端 的部分细胞中积累，最后集中分布在不定芽的基部细胞中，从而在该处产生大量 不定根。这些结果说明，在不定芽的发育过程中，生长素的集中积累与器官发生 的位置和不定根的产生有关。 4 拟南芥分化与不分化愈伤组织的获得及职泣体细胞胚发生中的表达分析 获得了三种不同类型的拟南芥愈伤组织，即绿色粉粒状、非胚性愈伤组织， 其不能分化再生新植株；淡黄色、颗粒状和黄绿色、瘤状胚性愈伤组织，这二者 能够再生植株。为了进一步研究肌赃体外培养中对愈伤组织分化的作用，利用 r n a 原位杂交分析了肌赃分化与不分化组织中的表达变化。结果表明，在分 化愈伤组织中，肌赃体细胞胚发生过程中的表达模式呈规律性变化，而在不分 化愈伤组织中未检测到其表达，故推测其在体细胞胚发生中起重要作用。 关键词：拟南芥；不定芽再生；器官发生相关基因表达模式；生长素极性分布； 愈伤组织；体细胞胚发生；分化 2 a b s t r a c t c e l lt o t i p o t e n c yi so n eo ft h ec h a r a c t e r i s t i c so f p l a n tw h i c hm e a n st h a ta n yp l a n t c e l lh a st h ep o t e n c yt od e v e l o p ei n t oa ni n t a c tp l a n t l e t t h ep r o c e s st h a tc u l t u r e d t i s s u e so rc e l la g g r e g a t e sd i f f e r e n t i a t ei n t oa d v e n t i t i o u sr o o t ，a d v e n t i t i o u ss h o o i to r f l o w e rb u di sn a m e di nv i t r oo r g a n o g e n e s i s ，w h i l et h ep r o c e s st h a to n es o m a t i c c e l li n v i t r od e v e l o p si n t oaw h o l ep l a n ts i m i l a rw i t hz y g o t e e m b r y oi sn a m e ds o m a t i c e m b r y o g e n e s i s u pt ot h ep r e s e n t ，t h em e c h a n i s mi na d v e n t i t i o u ss h o o tr e g e n e r a t i o n a n ds o m a t i ce m b r y o g e n e s i si ss t i l ln o tw e l lu n d e r s t o o d t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a r yt o i n v e s t i g a t es y s t e m a t i c a l l y i nt h i s s t u d y ，w ee s t a b l i s h e dar a p i da n dh i g hf r e q u e n c ys y s t e mo fs h o o t r e g e n e r a t i o n d i f f e r e n tf r o mt h es o m a t i ce m b r y o g e n e s i ss y s t e m , t h ee x p l a n t sw e r e m a t u r es e e d s ，a c t u a l l yp o s t - g e m i n a t e ds e e d l i n g si nm sm e d i u m c o n t a i n i n g2 ，4 - d t h em o r p h o l o g i c a la n dh i s t o l o g i c a lc h a n g e so fa d v e n t i t i o u ss h o o tr e g e n e r a t i o nw e r e e x a m i n e di nd e t a i l w ea n a l y z e dt h et e m p o r a la n d s p a t i a le x p r e s s i o np a t t e r n so fg e n e s i n v o l v e di no r g a n o g e n e s i s ，i n c l u d i n gm i r l 6 5 a ，m i r l 6 6 aa n dr e kt h er o l eo fa u x i n p o l a r i t yd i s t r i b u t i o ni ns h o o tr e g e n e r a t i o nw a sd i s c u s s e d t h er e s u l t s p r o v i d e d i n f o r m a t i o nf o ru n d e r s t a n d i n gt h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fi nv i t r oo r g a n o g e n e s i sa n d s h o o tr e g e n e r a t i o n 。 i na d d i t i o n ，u n a b l e d i f f e r e n t i a t e da n dd i f f e r e n t i a t e dc a l l u sw e no b t a i n e df r o m a r a b i d o p s i sg e r m i n a t e d s e e d s ，t h ee x p r e s s i o no fg e n e sr e l a t e dw i t hs o m a t i c e m b r y o g e n e s i sw a sd e c t e c t e d t h er e s u l t sp r o v i d e di m p o r t a n ti n f o r m a t i o nf o rf u 吡e r r e s e a r c ho fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s t h em a i nr e s u l t si nt h i ss t u d ya r es u m m a r i z e d a sf o l l o w s ： 1 e s t a b l i s h m e n to fc u l t u r es y s t e mw i t hh i g hf r e q u e n c yo fs h o o t r e g e n e r a t i o n t oi n d u c ei nv i t r oo r g a n o g e n e s i sf r o mt h es h o o tm e r i s t e ma n dp r o d u c e s e c o n d a r y o r g a n s ，m a t u r es e e d sw e r ec u l t u r e di nl i q u i dm e d i u mc o n t a i n i n g2 ，4 - d a f t e r r e m o v i n ga u x i n ，t h ee x i s t i n gs h o o tp r i m o r d i u ma n dl e a f - l i k es t r u c t u r ed e v e l o p e di n t o a d v e n t i t i o u s s h o o t l o n g i t u d i n a l s e c t i o no fa na d v e n t i t i o u ss h o o ts h o w e dt h e r e g e n e r a t i o ns t r u c t u r ew a sd i r e c t l yc o n n e c t e dw i t ht h ee x i s t i n gv a s c u l a t u r eo f e x p l a n t s t h r o u g hp r o c a m b i u m ，w h i l ea b s e n to fr o o tm e r i s t e m 2 e x p r e s s i o np a r e r no fs e v e r a lg e n e si n v o l v e di no r g a n o g e n e s i s t h es a m ec u l t u r es y s t e mo fs h o o tr e g e n e r a t i o nw a s r e s p e c t i v e l ye s t a b l i s h e dw i t h h o m o z y g o u ss e e d so f m i r l 6 5 a ：g u s , m i r l 6 6 a ：g u s , r e e ：g u s , a n dt h ee x p r e s s i o n o fm i r l 6 5 a ，m i r l 6 6 a ，r e vi no r g a n o g e n e s i si nv i t r oa n ds h o o tr e g e n e r a t i o nw e r e d e t e c t e db yg u sa c t i v i t y i nt h ep r e s e n c eo fa u x i n ，m i r l6 5 aw a sn o te x p r e s s i o ni ne n l a g e ds a m ，t h e n e x p r e s s e di no n ea n ds e v e r a lc e l l si ni t si n l a t e r a la n db i l a t e r a l t h i ss u g g e s t st h a t m i r l 6 5 am a yf u n c t i o ni no r g a ni n i t i o n o v e r e x p r e s s i o no fm i r l 6 6 ap r o m o t e ds h o o t g e n e s i sw i t hl u t h e rd o m e n s t r a t e dm i r l6 5 16 6p l a y e di m p o r t a n tr o l e s i ns h o o t r e g e n e r a t i o n t h e ya l s of u n c t i o ni na d a x i a l - a b a x i l ep o l a r i t yc d e v e l o p m e n to fl e a f - l i k e s t r u c t u r ea n da d v e n f i o u ss h o o tp r e s u m e df r o mt h e i re x p r e s s i o ni nl a t e r a lo ft h e s e s t r u c t u r e s i na d d i t i o n ，m i r l6 5 aw a sr e l a t e dw i t hs e c o n d a r yl e a fo r g a n o g e n e s i s r e vw a se x p r e s s e db o t hi no r g a np r i m o d i u mi n d u c e db y2 ，4 一d ，a n dl e a ft i po f a d v e n t i t i o u ss h o o t a d d i t i o n a l l y , i ts e e m st h a tr e v p l a y sm o r ei m p o r t a n tr o l e i n v a s c u l a rt i s s u ed e v e l o p m e n tf o ri t ss t r o n ge x p r e s s i o ni nt h ec e n t r a lp r i m o d i u mc e l l s a n dl e a fv e i n 3 a u x i np o l a r i t yd i s t r i b u t i o n d r 5 ：g u s , a sas y n t h e t i cr e p o r t e ro fa u x i n - i n d u c e dt r a n s c r i p t i o n ，m a r k sa n a u x i np e r c e p t i o nm a x i m u mi nl o c a lr e g i o n m a x i m u ma u x i na c c u m u l a t e da tt h et i p d u r i n go r g a nf o r m a t i o ni n d u c e db ya u x i n ，a n da l s o a tl e a fp r o m o r d i u mt i po f a d v e n t i t i o u ss h o o t o nt h eb a s eo fr e g e n e r a t i o ns h o o ta n di t sp e r i p h e r a lr e g i o na l s o a c c u m u l a t e da u x i n i t sc o n c e n t r a t i o ng r a d u a l l yr e d u c e dw i t ha d v e n t i t i o u ss h o o t d e v e l o p m e n t e v e n t u a l l y ，a d v e n t i t i o u sr o o t s d i f f e r e n t i a t e df r o mt h i sr e g i o n t h e r e s u l t si n d i c a t et h a ta u x i np o l a r i t yd i s t r i b u t i o ni sr e q u i r e df o ro r g a n o g e n e s i si nv i t r o a n da d v e n t i t i o u ss h o o td e v e l o p m e n t a d v e n t i t i o u sr o o tr e g e n e r a t i o na l s or e q u i r e s l o c a la u x i na c c u m u l a t i o n 4 e x p r e s s i o no fg e n e sr e l a t e dw i t hs t e mc e l li na r a b i d o p s i sc a l l u s t h r e ep h e n o t y p e so fc a l l u sw e r eo b m i n e df r o ma r a b i d o p s i s o n et y p eo f c a l l u sw a sg r e e n - p a r t i c l ea n di n c o m p a c t ，t h es e c o n do n ew a sy e l l o w i s ha n dc o m p a c t ， a n dt h et h i r do n ew a sg r e e nw i t ht u m o r - l i k es t r u c t u r e t h eg r e e n p a r t i c l ec a l l u sc a n n o t d i f f e r e n t i a t ei n t op l a n t ，w h i l et h eo t h e rt w oh a v et h ec a p a b i l i t y i no r d e rt oa n a l y z et h e m o l e c u l a rm e c h a n i s mf o rt h e i rd i f f e r e n tp h e n o t y p e ，w u se x p r e s s i o nw a sa n a l y z e db y i n s i t ur n a h y b r i d i z a t i o ni nt h et h r e et y p e so fc a l l u s t h er e s u l ts h o w e dt h a tw u s 4 山东大学硕士学位论文 m r n aw e r ed e t e c t e di ns o m a t i ce m b r y o si ny e l l o w i s ha n dc o m p a c tc a l l u s ，b u ta b s e n t f r o mg r e e n - p a r t i c l e ，i n c o m p a c tc a l l u s t h i ss u g g e s t sw u sm a yf u n c t i o n si ns o m a t i c e m b r y o g e n e s i s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；a d v e n t i t i o u s s h o o tr e g e n e r a t i o n ；e x p r e s s i o n p a t t e r no fg e n e sr e l a t e dw i t ho r g a n o g e n e s i s ；a u x i np o l a r i t yd i s t r i b u t i o n ；s o m a t i c e m b r y o g e n e s i s ；c a l l u sd i f f e r e n t i a t e 5 山东大学硕士学位论文 英文缩写 2 ，4 一d 6 b a b p b s a c 甜订v 3 5 s c d n a d d h 2 0 d e p c d i g d m s o d n a d n t p e b e d t a g u s i a a i p t g k a n l b 符号说明 英文名称 2 ，4 一d i c h l o r o p h e n l x y a c e t i a c i d 6 一b e n z y l a d e n i n e b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n 3 5 sp r o m o t e ro fc a u l i f l o w e rm o s o i cv i r u s c o m p l e m e n t a r yd n a d i s t i l l e da n dd e i o n i z e dw a t e r d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i g o x i n d i m e t h y ls u l p h o x i d e d e o x y r i b o n u l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d p - g l u c u r o n i d a s e i n d o l e p a c e t i ca c i d i s o p r o p y l t h i o - p - d g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n 1 u r i a b e r t a n im e d i u m m i r n am i c r o r n a m m l v r tm o l o n e yr o u t i n el e u k e m i av i r u s p b p h o s p h a t eb u f f e r p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r n ar i b i n u c l e i ca c i d r n a s e ar i b o n u c l e a s ea 6 中文名称 2 ，4 二氯苯氧乙酸 6 苄基腺嘌呤 碱基对 牛血清白蛋白 花椰菜花叶病毒3 5 s 互补d n a 双蒸水 焦碳酸二乙脂 地高辛 二甲基亚砜 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核昔三磷脂 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 p 一葡萄糖昔酸酶 d 一萘乙酸 异丙基一p d 一硫代半乳 糖苷 卡那霉素 l b 培养基 小分子r n a 鼠白血病病毒逆转录酶 磷酸缓冲液 聚合酶链式反应 核糖核酸 核糖核酸酶a 山东大学硕士学位论文 r t p c rr e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r s d ss o d i u md o d e c y ls u l f a t e s s cs t a n d a r ds a l l i n ec i t r a t e t r i s x - g a l p f a t r i s h y d r y x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 一i 1 1 d o l y l ( b - d - g a l a c t o s i d e ) p a r a f o r m a l d e h y d e 反转录p c r 十二烷基硫酸钠 标准柠檬酸盐 三羟甲基氨基甲烷 5 - 溴_ 4 - 氯- 3 吲哚- p - d - 半乳糖苷 多聚甲醛 7 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：车j 壶一 日 期：二趔丑上厶鸱 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 秀 节导师签名：f 动9 日 期： 卅弓 山东大学硕士学位论文 前言 1 顶端分生组织的结构及功能维持 植物的显著特征之一就是能够从顶端分生组织( s h o o ta p i c a lm e r i s t e m ，s a m ) 边缘不断的产生新的器官和组织，如叶片和花器官。因此，植物茎顶端分生组织 细胞具有较强地表达全能性的能力，被称为植物胚胎干细胞。 s a m 最早形成于合子胚发育到鱼雷胚时期。s a m 中最早的分子标记是 附吣慨( 改愿) 基因，它编码一个同源异形域转录因子，最早在1 6 细胞原胚 的中央4 个细胞中表达，鱼雷胚时期表达区域下移到3 层细胞，在胚胎晚期以及 胚后茎尖分生组织中，w u s 的表达逐渐局限于中心区原体的一簇细胞中( m a y e re t a 1 ，1 9 9 8 ) 。研究表明，w u s - x 于于茎顶端分生组织中干细胞的起始和维持起着重 要的作用。 s a m 的结构在纵向上包括一个外面分层的区域，称为原套，内层区域称为 原体。在径向上，包括由相对较大、分裂缓慢的细胞组成的中心区( c e n t r a lz o n e ， c z ) ，以及由相对较小、分裂迅速的细胞组成的周缘区( p e r i p h e r a lz o n e ，p z ) ， 周缘区是叶原基的起始位点。在中心区下，有一个称为髓分生组织的区域，是茎 髓的起始位点( 图1 1 ) 。随着s a m 不断进行细胞分裂，以及器官原基在侧缘的起 始，为了实现茎的连续发育，s a m 必须不断维持其大小和结构。因此，中心区 细胞的生长和增殖必须与周缘区或中心区向髓分生组织转运的细胞相平衡。同 时，周缘区和髓分生组织中细胞的生长和增殖，也必须与器官起始所消耗的细胞 相平衡。由此可见，茎顶端分生组织是不断改变的动态结构，干细胞群的维持依 赖于周围组织细胞和s a m 本部细胞提供的各种外源性和内源性信号分子( s h a r m a e ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 植物干细胞群包含三层细胞，周缘分生组织和侧生器官原基也由三层细胞构 成。表层为l 1 层，向下依次为l 2 层和l 3 层，其中l 1 和l 2 层细胞进行垂周分裂， 而l 3 层细胞既可以进行垂周分裂也可进行平周分裂。组织中心位于这三层干细胞 之下( 图1 1 ) ，肌赃组织中心表达。翮粥突变后引起顶端分生组织不能正常维 持，表现出重复起始一终止的发育模式，并且花有基本正常的萼片和花瓣，但往 往会提前终止发育成一个单个的中心雄蕊。由此可见，w u s 的功能是通过维持 中心干细胞库来保持茎和花分生组织的活性( l a u xe ta 1 ，1 9 9 6 ) 。w u s 异位表达 诱导异位干细胞的形成，表明w u s 表达区域必须受到严格的调控以维持干细胞 的正确位置和数量。 在野生型拟南芥中，皿订c 己 基因的表达只限于顶端分生组织顶端轴心附 近的几层细胞中，其作用是维持顶端分生组织的功能( 图1 1 ) 。c l v l 编码一个 受体蛋白激酶，表达区域是在w u s 的表达区域之上。c l v 2 编码一个受体样蛋白， 它是维持c l v l 的受体激酶活性所必需的( j e o n gs ，1 9 9 9 ) ，可能通过二硫键与 c l v l 形成一个分子量为1 8 5k d 的异二聚体e y o u n ga n d c l a r k , 2 0 0 1 ) 。皿 主 要在分生组织中央区域的l 1 和l 2 层表达，编码一个小分子量的多肽( f l e t e h e r e t a l ， 1 9 9 9 ) ，该蛋白能够在细胞之间移动，c l 订被认为是干细胞的标志基因( r o j oc t m ，2 0 0 2 ；l c n h a r d a n d l r u x ，2 0 0 3 ) 。 门翻n 圈1 - 1s a m 结构和相关的关键基因的表达区域 血列在c z 的l 2 和l 3 层表达，c l 付主要在l i 和l 2 层表达。r e v s 仅在l 3 层袁达，晰：艨 边所表达的区域称为组织中心( o r g a n i z i n gc e n t e t ) ，p z 为周缘区o d 删n f i e r s 2 0 0 7 ) 。 c l v 3 作为配体与c l v i c l v 2 ( 在干细胞之下表达) 组成的受体复合体相互作 用，激活c l v 复合体启动下游信号事件，导致所赡达区域受到限制。在拟南芥 中，干细胞稳态受到正负信号的反馈调节。皿订是一个负调控信号，将；v u s 的 表达限定在分生组织中心的范围内。在血订突变体中，肌臁达区域向两侧及 向上扩展。皿 过表达的植株表型类似隔嗾变体，说明w u s 的活性受到c l v 信号通路的负调控。然而，诱导明，饼位表达却能促进口 转录，说明明卿 口啪成了一个反馈调节环。当干细胞后裔脱离干细胞区域，成为器官原基的一 部分后，干细胞数量减少引起c l v 3 信号水平降低。负控信号水平降低引起w u s 山东大学硕士学位论文 表达区域扩展，通过这个正调控途径使干细胞数量增加。干细胞数量增加到一定 程度时反馈激活c l v 3 信号表达，限制肌譬表达区域进一步扩大，保持干细胞数 量的恒定，因此茎顶端分生组织的活性是通过w u s - c l v 的反馈调节机制来维持 的。 另外，正常茎顶端分生组织功能的维持还需要k n o x 家族的基因的参与。 s 懈一个k n o x 家族基因，它编码一个与玉米k n o t t e d l 蛋白相关的同源异性 域转录因子。从球形胚后期开始，它在将要产生s a m 的中心位置表达( l o n ga n d b a r t o n ，1 9 9 8 ) 。s 臁达的激活需要n a c 转录因子c u c 的作用。在胚胎发生过程 中，c 啪制器官的分离，并受m i r l 6 4 基因调控( a i d ae ta 1 ，1 9 9 7 ；a i d ae ta 1 ，1 9 9 9 ； v r o e m e ne ta 1 ，2 0 0 3 ；l a u f se ta 1 ，2 0 0 4 ) 。随后，m 粥c u c 的表达限制在胚胎 s a m 的周边区的边缘。在胚后期，。9 办疮所有营养性茎顶端分生组织、花序分生 组织和花分生组织中表达，但在叶的生成细胞( f o u n d e rc e l l s ) 、叶原基或成熟叶 片中均不表达，这表明彪v ( ) 见基因的表达与叶的起始具有非协同性( l o n ge ta 1 ， 1 9 9 6 ；l o n ga n db a r t o n ，1 9 9 8 ) 。s 瞒位基因的功能发生弱突变的突变体，可以 产生茎，但随着茎顶端分生组织细胞液泡化、分裂停止，茎停止生长。通常在终 止的分生组织中心，形成一个异位的叶原基，或者一串融合的叶原基。同样，在 一个完整的花产生之前，突变体的花分生组织常常形成一串融合的花器官，这些 表型说明，s 嗽维持茎顶端分生组织正常功能方面起着作用。在叶原基可见前 不久，s 嗍表达会从每个叶原基的生成细胞中消失。在拟南芥中还有另外两个 圈忆l 蹲因，即幻啊刀和k n a i 2 ，与s 脯似，这两个基因在茎顶端分生组织中 表达活跃，但是在起始的叶原基中不表达( l o n ge ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 s 嗍过与a s l 相互作用来维持茎顶端分生组织的发育。在发育着的叶中抑 制圈、硷蹦表达需要金鱼草p h a n 同源基因。这些基因编码m y b 类转录因子，表 达模式与剧忆) 燧因互补，即在叶的起始位点和叶原基位点表达，但不在茎顶端 分生组织的其他部位表达。在拟南芥中，a s l 基因是p h a n 的一个同源基因( b y m e e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。a s l 突变体形成深裂的叶片，上面有时可以发育出茎；在突变体的 叶原基中异位表达蒯? v _ r ，和幽脚，但不表达s t m o 这说明，a s l 抑制觑删和 k a n t 2 的表达。相反，野生型的胚胎只在子叶原基中表达a s l ，但是s t m 强突变体 的胚胎，也在预测的茎顶端分生组织位点表勘跚。这说明s 嗍制4 s 珀勺表达。 1 0 在咖la s l 双突变体中，s m 的表型几乎完全受到抑制，形成了具有活性的茎 顶端分生组织，而且有与a s l 单突变体几乎相同的表型( b y m ee t a l 2 0 0 2 ) 。这些 数据证明，埔过抑s n s 的表达来维持茎项端分生组织的活性。在s 加功能缺 失突变体中，a s l 在茎顶端分生组织异位表达，抑制咒l _ v 丌和k a n t 2 的表达，引 起办，d 艏性完全丧失，从而破坏了茎顶端分生组织的发育。但在，拥a s l 双突变 体中。尼删和尼彻继续在茎顶端分生组织表达，因此茎顶端分生组织可以 正常发育形成茎。这些结果说明，在叶起始位点s t i v i 的表达受到抑制，a 酗的表 达受到正调控，从而抑制k a n t l 和尼彻在叶片中表达。s t m 和a s l 相互颉颃。 使茎顶端分生组织和叶的发育过程分开进行。 2 叶器富的发生发育及调控 典型双于叶植物的单叶由棒状的叶柄和宽大的叶片组成。形态学上，成熟叶 片具有三个不对称轴：基- 项轴；腹- 背轴( 亦称近- 远轴，面向茎的为近轴面，背向 茎的为远轴面) 和中边轴。体内遗传机制和体外环境因子正是沿着这些轴向来调 控叶片发育和形态建成f r s u k a y a , 2 0 0 2 ) 。 2 1 叶原基的起始及调控 尽管叶原基的起始是一个持续的过程，但其可被人为的划分为几个阶段( 图 1 - 2 ) ( c a r r a r o 时a l ，2 0 0 6 ) 。 会 国 国 磁 o q f o 岫d p r 时 o q 图i - 2 叶原基发育过程中基因表达模式的变化和形态发生 第一阶段包括原基生成细胞在内的一小群细胞在分生组织周边区的募集( r e c m l t ) ，但 山东大学硕士学位论文 是这些细胞命运还没有被决定，仍能够获得其他命运；第二阶段原基生成细胞被严格地限定 在分生组织的周边区，此时细胞开始表达原基的标志基因如l f y 和a n t ，原基的边界区形成， 并表达边界基因c u c ；第三阶段这些细胞向外生长形成原基；第四阶段开始出现极性。 叶原基起始过程包含一群将要形成侧生器官的生成细胞( f o u n d e rc e l l s ) 的 确定。r e d d y 等示踪了不同原基的生成细胞，结果表明，原基能够追踪至分生组 织周边区l 1 层的大约4 1 0 细胞( r e d d ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 。需要指出的是这些前体细胞 的后代并不仅局限于原基中。因此细胞分化的潜能并没有被严格的限定，在向分 生组织周边区渐渗和原基向外生长的过程中，细胞的命运能够被重新限定。一旦 原基向外生长，细胞就会进一步加快增殖，鳓l l r e d d y 等发现拟南芥中的花原基 第三阶段细胞增殖速度是原来的三倍( r e d d ye ta 1 ，2 0 0 4 ) 。圈雠因对于分生 组织的建立和维持具有重要的作用。在分生组织起始叶原基过程中圈忆被沉 默，同时激活其他一系列不同的基因。早在位于靠近分生组织项端的位置时就已 经有一小群细胞表现出向原基分化的迹象，因为它们专一性上调表达一些基因， 如z w i l l e p i n - h e a d ( m o u s s i a ne ta 1 ，1 9 9 8 ) ，p i n l ( v e m o u xe ta 1 ，2 0 0 0 ) 和 r e v ( o t s u g ae ta 1 ，2 0 0 1 ) ，这种表达一直持续到原基发育的后期。至少其中一部 分原生成细胞( p r e f o u n d e rc e l l s ) 会形成真正的器官原基生成细胞。圈雌因 的下调就是一个标志。器官原基生成细胞也开始表达其他的原基标志基因特别是 a i n t e g u m e n t a ( e l l i o t ta n dwq ，19 9 6 ；k l u c h e r ，19 9 6 ) 和花器官身份基因 三尉，y ( w e i g e le ta 1 ，1 9 9 2 ) 。在原基生长细胞募集的同时伴随着器官边界的建立 以将原基与周围其他组织分开。分界区表达一些特异的转录因子如c u c l ，c u c 2 ， c u c 3 基因等。随后器官开始鼓起形成一个对称的穹形结构，在起始之后这一辐 射对称的结构很快向平行于分生组织周边区的平面伸展，同时出现腹背或近远 轴极性，最终导致成熟器官中不对称分布的细胞类型。在腹背轴建立时，伴随着 特异转录因子的表达。h d z i p i h 家族的p h b ，p h v ，r e r - 在_ 叶原基腹侧表达而 船忪d 琊y a b b y 在背侧表达。 1 2 田l o 叶原基发育的调控因子示意圈 p i n i 信号分布在分生组织( m ) 的外表皮细胞中引导生长素向分生组织的顶端运输 ( 虚线箭头所示) 。k n o x 基因在整个茎顶端分生组织中表达，而且受生长素调节。在叶原 基停成垃程中生长素和甜共同抑制k n o x 基因家族的b p 基因，促进叶的发育此 外, f f l 负调控k o x 基因家族的丘t 胛2 和丘t 搿的表达但这两十k n o x 蓦因与生长 素活性的关系仍不大清楚k n o x 基因家族的s 负调控a s l 在分生组织区的表达。t 标识表示负调控( b a r k o u l 拈e ia 1 2 0 0 7 ) 。 目前，对拟南芥、玉米和金鱼草的分子遗传学研究，已经揭示叶原基发育 的两个机制( 图1 3 ) ：第一个机制是k n o x 与含m y b 结合域的a r p 蛋白 a s y m m e i cl e a v e s l ( a s l ) ，r o u g hs h e a t h 2 ( r s 2 ) ，p h a n t a s t i c a ( p h a n ) 相互抑制( l o n ge tm ，1 9 9 6 ；l o n ga n db a r t o n , 1 9 9 8 ；w a k e sdm ，1 9 9 8 ； t i m m e r m a n s m c ，1 9 9 9 ；t s i e a t i s n a l ，1 9 9 9 ；b y m ee t 札，2 0 0 0 ；o de ta 1 ，2 0 0 0 ) - 在单子叶和双子叶植物中，脚岫坞 因都参与了茎顶端分生组织的维持。在拟 南芥中，在茎顶端分生组织中表达的_ l 【 岣堪囡