（细胞生物学专业论文）不同生精周期大鼠支持细胞核孔数量的变化.pdf

摘要 使用冰冻蚀刻技术研究发现支持细胞核孔数量可能与生精周期相关，然而该技术不仅 操作技术繁琐，而且只能针对细胞核的部分区域进行研究，为了阐明支持细胞核孔数量与 生精周期的关系，本实验使用维生素a 缺乏饲料建立了大鼠睾丸同期化模型，对生糖周期 早期期，中期期，后期x 期的睾丸组织采用免疫荧光技术标记，使用激光 扫描共聚焦显微镜三维扫描，获得单个支持细胞核的系列扫描数据，对所得数据进行合成 处理和统计学分析，检测大鼠不同生精周期的细胞核孔数量及变化状态。结果表明， x 期的支持细胞核孔数量显著地高于其它两组( p 7 5 ) 某期的同期化指数限s ) = 实验组该期曲细精管所占恢复总数的百分比( 超过1 0 ) 正常对照组相应期的曲细精管所占百分比1 0 0 同期化曲细精管数量超过恢复数量的1 0 的周期算作出现了同期化，也可计算其 中的部分周期。如：在一只同期化大鼠中，期为8 ，期为3 8 ，期为5 2 ，那么 这只动物被认为在期发生了同期化，在正常的未处理大鼠中期曲细精管占 3 5 ，那么这只同期化大鼠的同期化指数就是( 3 8 + 5 2 ) 3 5 = 2 5 7 。也可以只计算 期或者期的同期化指数。第一组统计了v 期的同期化指数，第二组统计- 期，第 三组统计x 期，统计结果见表一。 表一 2 模型中曲细精管生精周期的形态学观察 在模型建立失败的3 只大鼠中观察到绝大多数损伤的曲细精管已经不能恢复生精，管 周生精上皮仅剩下支持细胞。在恢复的模型中也有部分曲细精管未能恢复生精，生精上皮 仅剩下支持细胞( 如图6 ) 。 细胞。 图6 ：髓染色图片( 4 0 ) e 所示为损伤后未恢复的曲细精管，管腔的生精上皮仅剩下支持 3 模型中曲细精管生精周期的分布 在同期化的模型中除了被确定为同期化周期外，还存在少量的其它生精周期的曲细精 管。通过形态学的观察看到：在第一组一期的模型中还存在i 期、一期的曲细精管； 第二组一期的同期化模型中还存在和一x 期；第三组一x 耀的模型中也还有一 x 期。 二、支持细胞的核孔图像采集及分析 1 支持细胞的双标记效果 管腔内包括各级精细胞、支持细胞在内的所有细胞核核孔都被标记( 图7 a ) ，因此要 对支持细胞细胞核进行放大和采集首先需要在镜下定位支持细胞的细胞核。本实验采用的 抗体特异性很强，双染效果良好( 图7 a c ) 。在低倍镜下观察到的支持细胞的特异细胞骨 架标志物v i m 伽血( 图7 b ) ，可见被绿色荧光抗体染成亮绿，而m 助缸围绕的亮红的细胞 核便是被抗核孔蛋白的抗体复染的支持细胞的细胞核( 图7 c ) 。 2 支持细胞细胞核的系列扫描图 通过1 0 0 倍油镜，将单个支持细胞的细胞核放大，并电子放大8 倍( z 0 0 m 8 ) ，至能 清晰地看到标记的单个细胞核核孔，用r o i 的扫描方式将细胞核外的背景图像隔离，确 定该核孔的扫描起点和终点逐层进行系列扫描。由于细胞核在z 轴方向的厚薄不同，以 0 瓤m 步距对单个细胞核断层扫描的图片数大致在1 0 - 1 8 张。本实验共扫描了约3 8 0 0 张 系列图。下列图8 ，9 分别为两个支持细胞不同焦平面下的系列扫描图( 图8 ，9 ) 。可清 晰地看到核孔呈点状分布在核膜上，在皱褶丰富或者核孔密集的部分表面，核孔连成线( 图 8 ) 或者呈斑状分布( 图9 ) 。 图7 支持细胞的核孔和细胞骨架蛋白- v 曲m t j n 的双标记 九标记核孔复合物旧标记细胞骨架蛋白m 陆c 与b 的合图。核孔蛋白被标记成红色，标记的绿 色v i m 妇所围绕的细胞核为要采集的支持细胞的细胞核。标尺为3 7 5 m 图3 支持细胞的细胞核的n 缸湖系列扫描图 1 9 为同一支持细胞的细胞核以步距o 3 1 1 日q 进行的系列扫描，呈现出不同焦平面下核孔在核膜上的分 布状态。标尺为2 i i n l 图9 ：支持细胞细胞核的n 岛c a l 系列扫描图 1 1 2 为同一支持细胞的细胞核以步距o 3 岬进行的系列扫描图片标尺为2 舯 3 核孔数量的计算和分析 主要的图像处理软件为l e i c o n 触l r w 孤，l 础目g ep mp l 哪，h a g ej 。主要数据 处理和分析软件为e x i ，s p s s 。软件使用具体方法详见各软件说明。 应用i m a g ep r op h 玲中f i l t 盯和c o - 1 0 c a i i z 毗i 中的相关计算。共定位计算结果表明，同一 3 0 核孔在连续五张图片中都有出现，所以在计算单个核孔的荧光强度时，共累计计算了连续 五张图片中同一核孔光密度。参照上述实验方法中的计算方法，单个细胞核的主要参数计 算方法概括如下： 乱总荧光强度( d e 璐i t ys u m ) = 系列图的荧光强度值( d 衄s 时) 的累加 b 单个核孔荧光强度总和( n p cd e 璐i 哆) - 单个核孔连续五张图片中荧光强度总和 c 相对核孔数量( m cn 岫) = 总荧光强度( d c 璐i t y 飘m ) 单个核孔荧光强度总和( n p c d e 璐i t y ) 按照以上方法对三实验组大鼠的核孔数量分别进行计算，结果见表二a ：计算所得的 支持细胞的总核孔数量在2 0 0 叽4 0 0 0 左右，与以往研究资料中哺乳动物核孔数量范围相 符。 表二a ：支持细胞的核孔数量统计 表二b ：支持细胞的核孔数量分析 m m p i c o m p a r 跏憾 m e a n d r e n c e 9 5 c on f i d e n c el n l e m i c i ) 生糊稍生精翮 s i de r s 溉 l o w e rb o u n d u 口口e r 日0 u n d l s d2 缶7 毋 - 1 2 49 4 锄1 加8 4 2 93 7 64 0 2 1 3 5 6 41 5 22 4 阳2 1 1 1 4 电7 加4 2 1 4 2 2 2 9 7 咖脚晒1 7 43 7 & 日帕1 1 阳撕 1 2 49 4 稍1 加b 4 2 93 7 61 5 2 2 4 日| 3 24 0 2 1 3 5 6 4 1 1 1 45 3 37 8 6 7 6 t1 柏1 0 0即95 1 7 7 92 啮7 4 ”1 42 占 嘲7 3 叫2 5 。1 4 2 挖盯叩d啪9 1 19 3 b 晒1 7 4 阳 锄7 8 6 7 6 2 1 柏1 0 02 唧4鲫5 1 7 7 9 lt h em e a nd 舶r e n c ei 8s j g 嘶c a n la it h e 0 5i m | _ 对三实验组得到的核孔数量进行单因子方差分析，多重比较结果见( 表二b ) ，分析 结果显示，第三实验组( x 期) 的核孔数量( 3 6 5 4 8 2 7 个) 与期、期都 存在显著差异( p 0 0 5 ) 。第一组( 期) 与第二组( 期) 相比核孔数量没有明 显差异。 3 1 4 支持细胞核孔在核膜表面的分布 用激光扫描共聚焦显微镜图像处理软件对系列图进行处理，得到支持细胞核核孔分布 的三维合成图像。图1 0 显示了9 张合成后的细胞核，从图中可以看到支持细胞的核膜高 度皱褶，形态多样化，核孔沿高度皱褶的核膜表面分布。通过对大量核孔图片采集观察到， 支持细胞在近腔核表面核孔更密集一些。对三实验组支持细胞核孔总体形态进行比较观 察，发现三实验组的支持细胞核形态都丰富多样，没有出现规律性变化，至少肉眼观察没 有发现形态学上的差异。 5 支持细胞核形态变化 支持细胞核的形态变化可能与皿e n 妇的牵拉有关，n t i n 主要围绕在支持细胞核周 围，在不同形态的细胞核周围，也伴随v i m e m i n 相应的变化( 图1 1 ) 。支持细胞核形态的 高度变化，可能也与其所处生精周期有关。因为在生精过程中，支持细胞的m 即t i n 骨 架形态处在周期性的变化中。 图l o 大鼠支持细胞核的三维合图 1 _ 9 为9 个支持细胞的细胞核。a l af l 固5 勰标记核孔，通过系列图叠加合成。核膜高度皱褶， 形态多样。标尺为2 呻1 图a 绿色荧光标记衄( 箭头标示) ，b 红色标记核孔( 箭头指示支持细胞核) ，从合图c 可 见支持细胞核的形态变化与、，i m m 血变化趋势相同( 箭头：支持细胞的骨架包绕的细胞核) 。标尺1 6 岫1 。 第四部分讨论 一、动物模型的建立与检测 1 维生素a 缺乏模型的选用 在以往研究中，为取得不同生精周期的组织材料也常采用曲细精管透视分割法。透视 分割法是根据不同生精周期的曲细精管透光度不同，在立体显微镜下将拉直的曲细精管分 割成小段，来得到不同生精周期的曲细精管。其优点是不需要组织切片形态观察，可比较 直观地获得不同生精周期的组织材料；缺点是采集样本量少，在后续的组织处理如浸蜡包 埋中容易丢失。曲细精管透视分割时常使用冷却的p b s 防止组织干燥，这种做法取得的 曲细精管冰冻时容易形成大量的冰晶，对组织的细胞结构破坏较严重，不适于做冰冻切片。 维生素a 缺乏模型的优点是模型建立的方法简单易操作，可得到大量的处在所需生 精周期的睾丸组织，可为形态学研究中大量的切片观察提供足够的实验材料。维生素a 缺乏模型建立成功的个体生精周期被同期化在3 4 个生精周期。同期化的组织可直接冻 存，冰冻切片后细胞及相对结构保存完整。不足的是维生素a 缺乏模型的建立需要的周 期较长。 2 大鼠维生素a 缺乏模型的建立 早期人们发现了维生素a 缺乏的大鼠生精停滞，补充后生精上皮出现同期化现象。 而补充高剂量的视黄酸不能使生精恢复。当时人们认为睾丸不能利用视黄酸。由于只用视 黄醇的缺乏和补充来建立维生素a 缺乏的动物模型死亡率较高，有些研究者就在维生素 a 缺乏后用一定剂量的视黄酸维持一段时间，再补充所需的视黄醇，这样可以缓解除睾丸 外其它器官的缺乏症状，从而提高了动物的存活率。但随后的研究证明睾丸可以利用视黄 酸，只是在维生素a 严重缺乏时，睾丸精细胞要通过支持细胞的渗透和传递才能得到， 因此补充低剂量的视黄酸不能缓解睾丸的维生素a 缺乏症状删。同时研究表明用视黄酸 维持的动物模型的同期化效率要低于仅用视黄醇补充的动物。 本实验采用只补充视黄醇的方法建立模型，动物的死亡率2 7 左右，并没有出现早 期研究中出现的绝大多数动物死亡或未恢复的现象。因为实验中所用的动物体重在4 5 9 左右。根据以前的研究体重太小( 小于3 5 9 ) 的动物容易死亡，而体重太大( 大于5 0 9 ) 3 4 。 的动物的缺乏和处理点难以控制例。 与早期的实验相比嗍，本实验动物维生素a 缺乏症状出现的较晚。他们的研究中第 9 1 1 1 3 周出现了缺乏症状，而本实验是第1 m 1 5 周才出现，可能是由于与之前相比断奶 2 1 日龄大鼠的体重增加，实验动物比早期实验动物的最初体重增加了5 9 左右。 大鼠对维生素a 缺乏较敏感，在饲养实验动物时要每天更换垫料和水瓶，并观察通 过观察动物的体毛、体态、呼吸状况及粪便来判定动物的健康状况，对于出现问题的动物 隔离单笼饲养。 由于动物个体之间的差异，维生素a 缺乏点出现的时间不同。从本实验来看从第1 0 1 5 周内动物陆续出现缺乏症状，时间点分散使模型的建立增加了难度和不利因素。 3 大鼠维生素a 缺乏模型的检测： 3 1 恢复程度 从实验结果来看第三组的恢复度最差7 7 2 ，因为处理动物时补充维生素a 后酮时间最 短为5 4 天。在实验的取材阶段，发现3 只大鼠左右睾丸均有异常，睾丸内液体较多，睾丸 的整体硬度小，经验证这3 只大鼠睾丸中绝大多数曲细精管未能恢复生精。维生素a 缺乏将 a 1 型精原细胞阻滞在有丝分裂前的阻滞点，如果维生素a 缺乏的阻滞点维持的时间较短， 即有部分a 1 型精原细胞没有达到阻滞点，就开始补充维生素a ，那么生精的重新启动就不 能完全同步，同期化程度就低；如果维生素a 缺乏点维持的时间过长，a 1 型精原细胞出现 凋亡，生精将无法启动，而造成永久性的损伤，曲细精管内仅剩下支持细胞。 3 2 同期化程度 从上述同期化指数的计算方法来看，指数越大说明同期化的程度越高，模型建立的越 好。当然，正常大鼠每个生精周期的百分比相对恒定，所以同期化指数有一个上限。比如 模型被同期化在期，正常大鼠中- 期占2 5 3 0 ，那么同期化指数的上限为4 对于正常大鼠中所占比例较小的生精周期，同期化指数的上限会更大一些。本实验所采用 的这种计算方法考虑到了正常生精周期不同周期的出现频率的不同，是一种有用的简便的 统计方法。 与b 枷甜等人的同期化指数( 1 2 1 3 6 3 ) 相比【7 1 1 ，本实验组的第一组同期化指数为 1 9 7 2 4 5 ，第二组为1 3 5 2 4 6 ，而第三组为2 5 1 3 3 7 ，同期化效果相当。三实验组中，第 三组同期化程度稍好。与前两组相比，第三组在维生素a 补充后的第5 4 天( 早于其它两 组) 被处死，恢复率略低为7 7 2 。在维生素a 缺乏模型的建立中，补充维生素a 后的 3 5 的5 3 6 1 天取材最合适，如果取材时间过早会因为恢复率太低，而影响同期化结果；取材 时间越长，则生精周期就越趋于正常的非同步化状态，也会因为同期化比率过低而影响同 期化结果【碉。即补充维生素a 后随着时间的延长，恢复指数( r i ) 会增加，但同期化指 数会有所降低。 二、支持细胞的核孔采集 1 支持细胞核孔的采集 在早期的生物膜结构研究中，曾采用冰冻蚀刻来研究支持细胞核孔的数量变化。冰 冻蚀刻中所处理组织小，操作步骤繁琐，而且仅能得到支持细胞核部分表面核孔分布情况， 不能全面地获得整个细胞核核孔数量的信息。 本实验使用激光共聚焦扫描显微镜对支持细胞核进行系列断层扫描，可获得整个细 胞核表面核孔分布情况，并用软件对所得图像进行数据分析，从而得出整个细胞核核孔数 量变化规律。 2 支持细胞的核孔标记 2 1 切片厚度 核孔并非支持细胞的特有结构，因此必须先在镜下找到支持细胞的细胞核，这给组织 水平上的核孔采集带来很大困难。支持细胞核的正确采集首先依赖于对其特异细胞骨架一 m e n t i n ( 哺乳动物支持细胞骨架的主要成分) 的成功标记。有些细胞核在切片过程中 会被部分切掉，因此切片需要达到适当的厚度，才能保证镜下视野中有足够多的完整细胞 核；但切片不能太厚，否则在细胞核的采集过程中会因组织过厚而增加在镜下观察确定的 难度。从我们之前研究来看1 年m 较好。因此本实验中采用1 年m 冰冻切片。 2 2 抗体的选择 要同时使用两种抗体进行双标，需要在选择抗体时特别注意抗体的种属来源，除避免 抗体与组织其它部分的非特异结合外，还应避免抗体间的交叉反应。本实验用山羊血清对 切片进行封闭，以避免抗体的非特异结合。标记v i m e m i n 的一抗是兔源抗v i m c n t i n 的多 克隆抗体，二抗使用f r r c 标记的羊抗兔i g g ；而在核孔复合物的标记中本实验采用了小 鼠抗核孔蛋白的单克隆抗体( i g g l ) ，二抗灿懿an u o r 5 6 8 是特异性标记小鼠i g g li g g 2 | 或i g g 2 b 的小分子探针；从而得到了良好的复染效果。 由于本实验要对实验结果进行定量分析，抗体必须有更良好的特异性。实验中，每个 细胞核的系列采集约需要1 5 分钟，长时间进行系列断层扫描，需要抗体有很好的光稳定 性，荧光强度不会在长时间照射过程中衰减。本实验经过摸索和比较，选用了h i o g 吼公 司的z c n 伽l m o u i g g l a b d i n g k i t 系列中的舢c x af 1 u o r 5 6 8 。实验证明，该抗体更符 合本实验要求。 2 3 高密度核孔的重叠 核孔标记后，能够在显微镜下看到细胞核孔星点状分布。为了观察精子头部形态来确 定生精周期，实验中还用细胞核染料d | a p i 与核孔抗体一起标记在核孔密度较大，或皱 褶较多的区域，核孔不呈点状分布，而是连成一线。高密度核孔之间的距离过小，小于光 学显微镜的最小分辨率。对于较小的点的或空间距离太近的两个点，共聚焦显微成像时， 不能将它们分开。 三、核孔数量的分析 1 核孔数量的计算 普通显微镜所观察到的焦平面图像不仅包含着来自于相邻平面杂散光的信息，而且混 杂了多个焦平面的信息，因此普通显微镜不能准确地重现细胞核的三维结构。而共聚焦显 微镜( c c m 触lm i c m s p e ) 使用共聚焦针孔q i n h o l c ) 来阻挡非焦面来的杂散光，只有焦平面 的光可以通过共聚焦针孔并被记录下来。 灰度( g m yl c v d ) 是图像分析中的一个重要概念，它指图像各种颜色的深浅程度。荧 光图片上反应着色的深浅即可用灰度来表示。最亮的点灰度值为2 5 6 ，最暗的点灰度值为 0 。有的系统将灰度分成为2 5 6 级，也有的只能分成6 4 级( 总之为2 n ) 。本实验采取的 灰度为2 5 6 级。能将一张图片上不同染色深度区分为2 5 6 个等级，这是人眼所不及的。 因此，某些实验的结果，如用光学显微镜作一般的观察，实验组与对照组似乎无明显差异， 而用图像灰度法经统计学分析，则可反映出显著性差异，说明仅仅用显微镜观察是不够的。 在光学显微镜下看到的是光学图像，而用成像系统采集到的是电子图像，因此在显微 图像分析中，最关键的工作就是要保证得到的电子图像能最精确地反映光学图像，这个过 程由图像扫描器和计算机共同完成。正确地测量和处理图像已成为测量技术中的重要课 题。图像可通过光学显微镜转化为电信号传到电脑屏幕上进行分析。图像在屏幕上是由许 3 7 多像素( 口i 】【d ) 构成的，单位面积屏幕上像素愈多图像愈清晰，即分辨率愈高。每个像素 含有两方面的信息，即此像素的灰度及其在标本中的位置，两种信息决定了图像的形状和 颜色深浅。人的视觉察觉不到客观存在的较小差异，所以仅仅用一般观察法实际上已经丢 失掉了许多可贵的信息。因此需要有更精密的标准，即将所得的电信号通过计算机统计处 理转化成各种数据，从而分析图像之间的差异。 支持细胞是哺乳动物细胞中典型的极性细胞。极性细胞的核孔数量及分布的研究目前 还非常少。在以往的研究中如3 b 成纤维细胞r 硎、m d c k ( m a d i n d a r b y 啪i 】d d 北y ) 细胞，都是非极性细胞。非极性细胞的细胞核形态规则，为球型或椭球型，核孔在细胞核 膜上呈均匀分布。在计算核孔数量时，对于形态规则且核孔均匀分布的细胞核，先统计每 平方微米核孔的数量及细胞核的表面积，这两个值的乘积就是细胞核核孔的总数量。目前 还不能确定支持细胞的核孔在核膜上的分布情况，同时支持细胞的核膜高度皱褶，细胞核 的表面积计算复杂。因此本实验中核孔数量的计算是基于细胞核所有系列图中光密度总和 ( d c n s i t y 鳓m ) 与单个核孔光密度总和( 卜m c d e i t y ) 的比值。以往文献中，哺乳动物每 个细胞的核孔大约在2 0 0 0 删个【7 4 】。而实验所得的核孔数量值在此范围内，说明该计算 方法是可取的。 除核孔数量外，核孔在核膜表面的分布也是人们一直感兴趣的问题。这个问题的研究 需要在图像分析中，通过系列扫描图重建立体原形，统计分析核膜不同部位单位面积上核 孔数量的变化。由于显微镜在z 轴比x y 轴的分辨率低，因此要想获得更多三维空间的 信息，还需要在采集图像时减小步距，使单个核孔在连续五张或更多的系列图中成像。如 何从二维结构推导出三维结构与图像分析密切相关。因为显微镜下观察到的是平面图像， 而这些平面图像是从立体结构中切下来的，单凭平面图像不能反映组织的真实结构。将三 维结构与免疫细胞化学标本观察联系起来，可以获取更多信息。通过三维空间上的图像分 析，可测得切片上获得的数值与空间结构中相应数值间的精确关系。对于平面图形进行三 维层面的计算需要更好的图形运算软件，由于目前我们还没有这样的软件。对于计算细胞 核表面积和推算立体结构中核孔的相对密度还有待于进一步努力。 2 支持细胞核孔在核膜表面的分布 生精是一个连续的动态过程，各级生精细胞在自身基因调控及支持细胞的营养支持和 引导下向精子方向增殖分化，并从曲细精管底部向管腔移位，最后释放进入管腔。支持细 胞是精予发生的支架，在各级生精细胞的移位过程中起到主要的推动作用。从多个细胞核 鹅 3 d 合成图可见，支持细胞核没有规则的形状，表面皱褶，细胞核的大小不一致。但是从 形态学观察发现在支持细胞的近腔面核孔分布可能较多。具体数据还有待进一步分析。 3 支持细胞核形态的变化 m t i n 是支持细胞的特异细胞骨架，随着生精周期的不断变化，v i m c n t i n 骨架形态 也不断变化1 7 习。同时，从本实验中细胞核与v i m t i n 双染的片子结果中可以推测，细胞 核的变形可能与细胞骨架的运动有关，m t i n 在核周围高度组装且与细胞核的趋势相 同。因此推测，在不同的生精周期中，由于支持细胞的骨架不同，细胞核的形态也随细胞 骨架的变化不断变化。本实验三实验组中第三组x 期是骨架形成期，其它两个实验 组也是m 比血发达的时期，肉跟并不能观察出形态学的变化规律。而在损伤未恢复的 曲细精管中，v i m 姐t i n 已经没有了骨架支撑结构，支持细胞核的形态也变得简单化。 4 核孔数量与生精周期的关系 支持细胞是哺乳动物睾丸中最重要的体细胞，常位于曲细精管生精上皮的基底膜， 占整个睾丸细胞的1 5 ，它参与生精细胞的增殖和分化等生理过程。细胞形态是细胞生 理功能的体现，对于支持细胞的核孔数量及分布的研究有助于揭示支持细胞的不同的生理 功能。 在支持细胞核孔数量研究中也曾采用冰冻蚀刻电镜技术【7 q ，虽然其精度较高，其缺 点是只能对一个细胞核的部分表面核孔数量进行研究，对于形状极不规则的支持细胞核来 说，这种方法不能全面揭示整个核的信息，而且其电镜观察的前期处理繁琐、耗时。而激 光扫描共聚焦显微镜断层扫描技术可以得到整个细胞核的数据，实验材料充足的情况下免 疫组化简单易行。 在本实验中，用维生素a 缺乏的方法建立模型，从而得到生精周期处在期， 期，x 期的大鼠睾丸组织，分别对三组材料做冰冻切片免疫组化，扫描采集抗体 标记的支持细胞核孔统计得到的结果显示：第三组( x 期) 核孔数量( 3 6 5 4 个) 与其它两组相比显著增多。生精过程是一个复杂的连续的过程，也是一个周期性变化的过 程。x 期的核孔数量明显多于其它两组，在一定程度上说明了支持细胞在x 期 处于更活跃的状态。 支持细胞所处的位置特殊，其核孔数量的变化也是多方面影响的共同结果。支持细胞 核受体及其分泌蛋白的变化可能是x 期核孔数量变化的重要因素。曲细精管中的雄 激素受体主要分布在支持细胞的细胞核内，i s 咖勰等人的通过分离纯化不同周期曲细精 管中的雄激素受体发现，查- 期和x - i 期雄激素受体的含量明显多于一期或- 期吲。m g a s n i 锄i 等人通过对不同生精周期曲细精管中特异结合的f s h 进行的定量研 究，发现在x i 期曲细精管中特异结合的f s h 量显著多于其它期，是期的3 5 倍。 而其它期无显著差掣7 8 】。砒皿l i k k o 等人用透视分割法和n o r t h 哪杂交首次测定了成年大 鼠不同生精周期中f s 卸l ( f s hr e c e p t o r ) 基因的表达水平，发现期的f s h r 基因表达水 平最低，而x i 期是期的6 倍多，其它期该基因的表达水平处于这两者之间。在不 同的生精周期血清中f s h 的水平相对恒定，但支持细胞膜上f s h 受体的数量，却随着生 精周期的变化而变化巨大，x 期f s h 受体数量最多，是- 期f s h 受体数量最少 时的三倍多例。此外0 1 咖m 等人的研究发现抑制素b 的分泌在i 期达到最高点，而 在期分泌量最少。b h 船i n 等人的研究表明，在不同生精周期与精子发生密切相关的抑 制素m 卧渔的表达量不同，抑制素的两个不同亚基d 、b 的m 盼醴在x i 表达水平 最高，而在是最低的【删。 核孔数量的增多也可能受到关系最为密切的各级生精细胞的影响。x 期是精子 生成过程长形精子形态变化最为剧烈的时期，随着精子形态的变化，其表面抗原及其与支 持细胞之间的特化结构也在不断变化中，与支持细胞之间的信号和物质转导更加频繁。而 且次级精母细胞的减数第二次分裂就发生在这一阶段的x 期，细胞分裂是一种极其繁琐 复杂的细胞事件。早期研究发现组成细胞骨架的中间纤维的分布与生精周期密切相关。在 i 期，支持细胞的中间纤维骨架从支持细胞核的核周一直延伸到支持细胞近前室的顶 端；在期中间纤维开始变短，到期，则只能在支持细胞的核周观察到中间纤维的 存在；在- 期中间纤维开始重新形成，从核周开始向近腔方向延伸，并且在x 一x 期延伸到支持细胞近腔室的顶端【8 1 】。可见细胞骨架的重建主要发生在x 期，细胞骨 架的重建涉及到多种且大量蛋白的合成和组装，支持细胞应处于较为繁忙的状态中。 此外p a r v i i n 等人通过对凋亡精细胞d n a 的研究发现，在i 、x 期精细胞的凋亡 最多【铋。这说明x 期和i 期精原细胞和精母细胞更容易凋亡。在x 期，支持细 胞除了清除部分受损伤细胞或因染色体异常凋亡的细胞外，还要维持生精细胞数量平衡， 保证支持细胞能支持最适数量的生殖细胞，维持生精环境的平衡。在这一时期支持细胞除 了支持营养正常的生精细胞，还要诱导并清除凋亡的细胞。 支持细胞和精细胞细胞间的关系密切。从实验中损伤的曲细精管中可观察到，由于维 柏 生素a 的缺乏使精原细胞损伤，生精不能重新启动，曲细精管的生精上皮中只剩下支持 细胞。在镜下支持细胞的m e n t i n 骨架形态已消失，支持细胞的细胞核形态也变得单一 化。 此外，细胞对于核孔的调控，除了改变核孔数量外，还可以在保持核孔数量不变的情 况下，通过提高或降低转运效率，来应对不同生理变化的需求。然而，核孔转运效率的调 节需要涉及细胞内各种信号水平的精细调节，因此需要在分子水平上重新设计其他实验来 做进一步的研究，不在本文的涵盖之中。 四、不同生精周期中支持细胞核孔数量差异的生物学意义 真核生物的细胞都具有内含遗传物质的细胞核，核孔( 复合体) 则是细胞核与细胞质 之间信号转导和物质运输的唯一通道。不同细胞周期为了应对细胞的分裂和重新组装，细 胞核孔复合体的数量也在发生变化；细胞可能通过调节不同的核孔复合物的数量，也可能 ： 通过调节现有核孔的效率来应对不同的生理状态，或者两种调节方式并存。而细胞不是独 立存在的。细胞核孔数量的变化或者其转运效率的提高在一定程度上反映了该细胞的生理 状态及其受其它临近细胞影响状况。 生精细胞与支持细胞之间关系极其密切，相互作用非常复杂。虽然生精细胞的分化周 期主要由其自身基因所决定，但又依赖于支持细胞提供细胞环境及体内激素环境。支持细 # 胞为生精细胞提供支持及营养，但生精细胞通过蛋白及相关因子的分泌、表面蛋白表达、 细胞骨架及生精细胞数量本身连接在精子形成过程中不断变化。在生精周期的不同阶段， 抑制素、f s h 与其支持细胞受体的结合能力和作用亦不同。而在大鼠性成熟后，支持细 胞的细胞周期变化缓慢，已有研究表明影响支持细胞功能的诸多因素并不改变支持细胞本 身的数量。每个支持细胞所支持的精细胞的数量是相对恒定的( 约5 0 个) 。支持细胞在其 自身数量不变的情况下，只有调节其自身的功能状态来应对生精细胞复杂多变的影响，其 中包括核孔的数量变化。在生精周期的x 期精细胞凋亡增多，长形精子变形剧烈， f s h 受体基因及受体表达上调，抑制素表达上调，这些周期性变化的事件在该时期对支 持细胞的影响较大，支持细胞的核孔数量增多，表明其功能变得更加活跃。支持细胞通过 调节自身核孔数量来调节核质转运，可能是支持细胞应对生精周期变化的一个重要方面。 虽然本研究以大鼠睾丸的支持细胞为对象，但是推测其他细胞在应对周围环境变化时 应该也会采用相应的对策，即通过自身细胞核孔数量的调节来改变自身的活跃状态。然而， 这究竟是不是一个普遍现象则需要其他实验作进一步的验证。 4 1 一、结论 第五部分结论与展望 以维生素a 缺乏的大鼠睾丸组织为实验材料，利用免疫荧光和激光扫描共聚焦显微 技术，分别检测在生精周期的早期( 期) ，中期( 期) ，后期( x 期) 支持 细胞核孔的数量变化，来研究生精细胞如何对支持细胞的状态施加影响。其中后期( x 期) 细胞核孔数量显著多于与其它两期( p o 0 5 ) ，早期与中期的支持细胞核孔数量 无显著差异。可见在不同的生精周期，不仅支持细胞的体积、f s h 受体及抑制素等呈周 期性变化，而且本实验使用同期化动物模型发现支持细胞核孔的数量随着生精周期的变化 而呈现周期性变化，说明x 期为支持细胞功能最活跃的时期。此外，使用共聚焦显 微镜三维重建技术还发现支持细胞核孔在核膜上的分布具有非均一性，即在近管腔侧多于 基底膜侧，这也许是支持细胞具有极性的重要表现形式。 = 、展望 核孔复合体结构及核质转运机制是近年来细胞生物学的研究热点之一。核孔复合物作 为细胞核质之间的信号转导及物质运输的唯一途径，其数量变化及转运效率的研究具有重 要的生物学意义。但核孔数量调控方面的研究资料还相当匮乏。核孔的数量在一定程度上 反映了该细胞的功能状态。 核孔复合物由多种蛋白组成，结构复杂，而且始终处在动态的变化过程中，这给研究 其蛋白的组装及分子水平上的物质转运机制带来了很大的困难。对核孔数量的研究在一定 程度上揭示了细胞生理状态的不同核孔数量不同，为进一步研究和孔复合物组装与去组装 提供研究模型及一定的理论基础。 支持细胞核孔数量与生精周期相关。支持细胞核的形态可能也不是随意变化的，可能 与细胞骨架的周期性变化相对应。本实验把生精周期分为相对较大的三个时间段，虽然 在一定程度上揭示了在不同生精周期支持细胞核孔复合物数量变化，反映了不同生精周期 下支持细胞的功能状态不同，但更明确的规律还有待于对生精周期更精细分期及分子水平 的研究，特别是分子水平上对核孔转运效率的研究。 参考文献 【1 】b a r d i nw gc h e n gc y ，m u 咖wn aa n d0 i ：m s a h 琏g l i ks e 删伽，i nt kp h 州o i o g yo f 黜：p r o d u c t i ( e 出e 勋o b n 柚dj d i 1 1 ) p p 9 3 3 9 7 tr a v p r 瞄，1 9 9 4 ，wy o r k 【2 】史小林等人类生殖学科学出版社2 唧，| b 京 【3 】r 惦础l dp r c a ：1 ks e r t o l h 础( e d s l d r l l s n 缸l dm d g 曲蝌o i d ) p p i - c a c h er i v 盯 p | 崩略1 9 9 3 a r w 舢盯f l 【4 1 s 虬m ，h a l l ，s 且，协0 n ，e 乩，柚d f 岫血f s a n d r o 霉g i l l a t i o n o f s e 删l l s ，缸1 k s 豇t 0 h c c u ( e d s l d r i i s 辩u 衄dm d o l d ) 印5 0 9 - 5 1 6 c a c h e 脚盯p r e 鹤1 9 9 3 ，a 韶r 哪t e ff l 【5 】g b s h 【j 】胁咖m e m c a ls c i e n 嘲f 锄n yp l 枷崦缸c i c i e 1 9 9 4 ，1 3 ( 4 ) ：l 蚪1 吼 【6 】s 柚黼蚰av ，b c i i g o 嘣f 伊柚dm c a i 助d o t b e 血一1s 血“岫d 鲫咖u c l e i ca d d8 y n t h 醯 a n d 妇甜i nt e 鲥l 缸p e m u b 山缸m y o i d 【j 】b i o l 黜帆1 9 9 6 ，5 4 3 ) ：5 8 3 5 9 0 阴c i i p p a s ，l 【i m g 也s 】d 盯m k “a le 】【p 陀吲d a 翻彻o f n e 啪n o p i n - 3 d n e e g r o w t h f a c 幻ri ne m b r y o n i c 柚de a d yp o s 协a t a lr 砒蛐i v e l o p n 瑚t 田b i o l 2 r e p i o d ，2 0 0 0 ，6 3 ( 6 ) ：1 6 1 7 - 1 6 2 8 【8 】p e e 妇rm ，b y s w p 】m i c r c s 亿h ，1 9 9 2 ，2 0 ( 1 ) ：3 2 3 3 【9 】k 研t ，碰s h n 硪腑y a n d o 耳c ta 1 e 】【p r 嚣s i 。咀o f 胁粕df 嬲“g a d 如n c m l a l 卸d i s c h e m i a - r e p e r f i l s i t e s l 部：m v o l v e m to fn f 勰s y s 锄ni nn 坞h “c t i 吼o fg 锄c e ua p o p 啪i s 缸n 圮 d 锄a g e d m t e s 血p 】b i o i r 印r o d ，2 0 0 1 ，6 4 ( 3 ) ：9 妊9 5 4 【1 0 】s e l 删r yhp ，w 蛐血g i o nk e x t e n d c da l l o 掣a f t 鲫r v i v a lo fi s l e t sg r a f i 酣i n t 0i n 仃a a b d 伽l i n a l l yp l e d t c s 凼川d i a b 啦s 1 9 既3 3 ( 4 ) ：4 0 5 枷6 f 1 1 】s k 妯胁m kc e u 啦ui n 衙a c i i o 璐i nl h et e s 凼川e n d 噼，r ，1 9 9 1 ，1 2 ：4 5 【1 2 1 肖爱娇，王晶磊睾丸问质细胞睾酮生成的影响因素及作用机理【j 】实用临床医学，2 0 0 2 3 ( 3 ) 【1 3 】m n l l 【如dc y 壮c h e n g s e r l 0 h 西啪l i 锄ds e 哟l i 萨珊础i n 胁c t i sa n dt b c i rs i 印i 矗啪i n 铲衄 nm o v e 蚴ti nm e 鲫玎i | l i f e m 惦印i m i ：l i 呦d u r 啦s p 如m t o 擘如i s 阴e i l d o 口r e v 2 0 0 40 _ c t ；2 5 ( 5 ) ： 7 4 7 8 0 6 1 1 4 】a l l a nd j ，i i a 曲彻b 、锄dr o b e r t ss as p 锄a t o l r 伽越a p 叩1 0 s i sh 鸫t h r 的q ，h o l 0 霉蛔y m 粤血a b i ep h 嬲卸ds h o w sn o 商r c a d i 粕r h y t b md u d n gn 讲m a i 叩盯m a t o g e n 讧缸t h cr a t c e p 1 0 i 近 1 9 9 2 ，2 5 ( 3 ) ：2 4 1 彩0 【1 5 】s h e t 哆j ，m a f a 血e g kc ta 1 s p 墒c i m 棚n 彻e u t r a l i z a i i o n0 f f s h k a d s t 0a p 叩t o n c n d e a 山0 f 也e p a c h y t e s p c 加a t o c y t e s 柚ds p e 加a t 0 9 0 n i a lc e u s nt h ef a t 【j 】e n d o c r i n o l o 鲚1 9 9 6 ，1 3 7 ：2 1 7 9 4 3 【1 6 】h 锄啦加k m k o v 妇l i ，p a r v i 枷m ，e ta 1 t e s t o s t e r 锄e 劬i b i 协锄d i n d u 鲫a p 叩t o s i s i n n t s e m i n i f e m 惦t l l b u l 讳i nas t a g c 掣m cm a 衄e r ：i ns i t i iq 岫n t i 丘c a t i o nj ns q 哪hp r e p a 珀虹。衄a f t e f a d m i n i s t f a 如no f c m 锄ed i m e t h a 8 u l 五a t em e n d o c r i n o l o 鳜1 9 9 5 ，1 3 6 ：3 2 8 5 【1 7 】c 如n s h a w j m a n d r e wn ，w 毫n z h uz h 妯岛ha 1 m i c 柚a l y s i s0 f t h e m a m m a l i 柚n u d e 盯p 0 倒n p k x 川jc e nb i o l ，2 0 吆1 5 8 ：9 1 5 【1 8 】r 0 u tm e t c h i s 彻j d ，s u 阳忡ae ta i n ey e a s tn u c l w p o i ec o 唧i l e x ：c o m p m ，a r c h i t e 咖蝻 锄dn a n s p o nm e c h 雏i 锄【j 】c e ub i 乩，2 0 吣1 4 8 ：6 3 5 口9 】s 蛐t h 砌l i n g a m m 柚d b n t e s p e c f i n g 血伽g h 吐艟雕e ：n u d e 盯p o r e 啪p 】懿s 咖c t 噼，勰蜘删弘 锄dt i | n c i i p 】d w 伽，2 0 0 3 ，4 ( 6 ) ：7 7 5 - 7 8 9 【2 0 】w 铀e ym ，y a md ，髓蛐勰日c ta 1 n u d e 缸附ec b m p l 懿n u m b c r 矩dd i g 耐b u d t h r o u 曲o u tn ” s a o c h 卸呻1 y s 碥蛐c e c y c l eb y l h r 一d i 珊m s i o l 埘r 伽鼬呻蚵o n 丘d me i e c 呻n m 咖鲫p h so f n u d e a re n v e l 叩啊m o lb “c c i ，1 9 睨8 ：2 1 1 9 【2 1 】b u r l e b d e u c n b 哪j 黜脚0 d e u j 玎g 也e w a l l so f t h c n u d 咄即n a t r e v m o lc e n b i d l ，2 0 | 0 2 ，3 ： a 鼢胡 【2 2 】m a 咖h y c 粗d f b r b e sd j a s 鲫蝴y o f 也e 仰d e a r p o m ：b i o c h e m i c a l l y d i s 曲ds t c 】p s 陀v e a l c d 喇t h n l 姒，g 口g m s ，锄d 酗删c e n b i 0 1 ，1 9 9 6 ，1 3 2 ：5 【2 3 】d r u m m o n d s p 锄d m n k l h t e r 断如w i t h 也cc y l o p l 砌i c t a 丑o f g p 2 1 0 啦叽i p 协”d o a p p o s m ”o f n 嘣e 盯m c 沏如嚣锄d b l o d 晤n 咖p 0 i ed j l 撕锄【j 】c e n b i 0 l ，2 0 0 2 1 5 8 ：5 3 【2 4 】g gm a u l n u c l e 盯邮唧l 能e l 蛐硝柚d 脚璐奸i l 州彻d i n gn l i t o s i s j c e b i 0 1 ，1 9 亿7 4 ： 4 9 2 【2 5 】w 酊t h e l ! l 柚伪a p i c k c 嘲皿he ta 1 m n s e n 蜘n u p l 0 7 1 印鲫n p i c x i sc r i d c a l f o r n 叫掰畔 唧i e xa s s 咖m y 册，q n ，2 0 0 3 ，1 1 3 c 2 ) ：1 9 5 7 2 甑 【2 6 】f r a n zc ，a s k j 珊e a n 蛐i n we t a ln u p l 5 5 g i l l a t e s 仰d w v e l o p c d n u c l c 缸p 咐c 0 呷l e x 如咖d o n 缸n 锄t o d e s 柚d v e n e b r a t e s m e m b oj ，2 0 0 5 ，2 4 ( 砌：3 5 1 9 - 3 5 3 1 【2 7 】r a b u tg ll e n a ne 柚d 聊b e i gj d y n a m 妇o f 舢【c l e 盯p o r ec o m p i c xo r g a n 妇哝mt h r o u g h 也e 础