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c f t r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 捅要 内容摘要：囊性纤维化跨膜转运调节因子( c y s t i cf i b r o s i st r a n s m e m b r a n e c o n d u c t a n c er e g u l a t o r ，c f t r ) 是一种受c a m p 激活的a 一通道蛋白，属于a b c 大家族中的一个成员，c f t r 在所有与分泌和吸收有关的组织的上皮细胞顶膜上 表达。对于跨上皮细胞的盐类运输、液体流动和离子浓度调节等都具有重要的决 定作用。最新研究发现，c f t r 还在血管平滑肌上表达，对机体血压调节具有重 要意义。c f f r 蛋白活性与许多病理生理现象密切有关，c f t r 功能障碍可导致 遗传性疾病囊性纤维化( c f ) ，还与慢性特发性胰腺炎、干眼病、习惯性便秘密 切相关。c f t r 活性过高则可导致多囊肾病、分泌型腹泻等疾病。因此c f f r 作 为重要疾病的药物靶点地位受到了极大关注。 近年来，从组合化合物库中筛选到多种能够促进c f - f r 通道开放的激活剂，这 些激活剂在研究c f t r 结构与功能之间关系、探讨c f 发病机理等方面发挥了重 要作用。但是由于对潜在的生物安全性担忧，国际上对应用这些合成小分子在临 床的应用持极端审慎的态度。寻找c f f r 天然小分子激活剂是相关领域研究的热 点问题之一。在结构多样、数量庞大的天然化合物中更容易筛选到对特定药物靶 点发挥调节作用的高效活性物质，以天然化合物为先导化合物开发新药也是近几 年新药开发的热点。 本文利用荧光细胞测定模型对3 8 6 种中药单体化合物进行了筛选，获得了 1 0 4 种新结构的c f t r 氯离子通道激活剂，进而结合短路电流测定实验及单粘膜 下腺体液体分泌速度测定实验等手段对具有降压活性的化合物香豆素类、木犀草 素、白鲜碱等进行了系统的分子药理学研究。结果显示它们具有激活c f f r 氯离 子通道活性。上述活性具有作用迅速、可逆、并且需要生理水平的c a m p 等特点。 研究还发现蛇床子素、木犀草素和白鲜碱对野生型和a f s 0 8 突变型c f f r 也具有 激活作用，蛇床子素对g 5 5 1 d 突变型c f t r 无激活作用。首次发现了蛇床子素 能以每秒3 3 3 x l f f x o n l 的速度高效率地促进小鼠气管单个粘膜下腺体液体的分泌 及大鼠肠粘膜中氯离子转运，其上述活性均能被c f t r 特异性抑制剂彻底阻断。 此外，初步研究结果表明蛇床子素、木犀草素，白鲜碱可能是通过直接与c f t r 蛋白相互作用发挥激活活性的。推定c f t r 可能是一些降压药物的作用靶点之 c f t r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 本研究为进一步探讨降压中药降压作用机理奠定了基础。这些化合物在阐明 c f t r 氯离子通道的调控机制以及作为先导化合物开发与c f t r 突变有关疾病， 包括囊性纤维化病、干眼病、慢性胰腺炎等疾病治疗药物方面具有重要用途。 关键词：囊性纤维化跨膜转运调节因子( c f t r ) ；中药单体化合物：激活剂；降 压：液体分泌 c f r r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 a b s t r a c t c o n t e n t ：c y s t i cf i b r o s i st r a n s m e m b r a n ec o n d u c t a n c er e g u l a t o r ( c r r g ) p r o t e i n ，a c a m p - a c t i v a t e dc i c h a n n e l ，i se x p r e s s e di na i r w a y , i n t e s t i n a l ，p a n c r e a t i c ，a n do t h e r s e c r e t o r ya n da b s o r p t i v ee p i t h e l i a ，w h i c hi st h eo n l yc i c h a n n e lf r o ma t pb i n d i n g c a s s e t t e ( a b c ) f a m i l y r e c e n ts t u d ym a n i f e s t e dt h a tc f t ri s a l s o e x p r e s s e di n s m o o t hm u s c l eo fb l o o dv e s s e l c f f rf u n c t i o ni s c l o s e l yr e l a t e d t o m a n y p h y s i o l o g i c a la n dp a t h o l o g i c a ld i s o r d e r s ，s u c ha sc y s t i cf i b r o s i s ( c d - t h em o s t p r e v a l e n th e r e d i t a r yl e t h a ld i s e a s ei nc a u c a s i a n s ，i d i o p a t h i cc h r o n i cp a n c r e a t i t i ( i c p ) ， k e r a t o c o n j u n c t i v i t i ss i c c a ，( k c s ) ，h a b i t u a lc o n s t i p a t i o n ，s e c r e t a r y d i a r r h e aa n d p o l y c y s t i ck i d n e y m a n ya t t e n t i o n sh a v eb e e np a i dt ot h ep o t e n t i a ld r u gt a r g e tr o l eo f c f r r m a n y c o m b i n a t o r i a ls m a l lm o l e c u l e sh a v e b e e ni d e n t i f i e dt os t i m u l a t c f t r - m e d i a t ec i - s e c r e t i o n t h e s es m a l lm o l e c u l e sm a yp l a yk e yr o l e si ns t u d y s t r u c t u r e f u n c t i o nr e l a t i o n s h i po fc f t ra n de l u c i d a t i o np a t h o l o g ym e c h a n i s mo fc e d u et ot h ep o t e n t i a lb i o l o g i c a ls a f e t yu n c e r t a t i n t yo ft h e s es y n t h e t i cm o l e c u l e s ，t h e r e i s l o n gw a yt og ob e f o r ec l i n i c a l u s eo ft h e s ec o m b i n a t o r i a lc o m p o u n d s a st h e c h e m i c a ls p a c e o c c u p i e db yn a t u r a lp r o d u c t si sb o t hm o r ev a r i e da n dm o r ed r u g l i k e t h a nt h a to fc o m b i n a t o r i a lc h e m i c a lc o l l e c t i o n s ，s y n t h e t i ca n db i o s y n t h e t i cm e t h o d s a l eb e i n gd e v e l o p e dt op r o d u c es c r e e n i n gl i b r a r i e so fn a t u r a lp r o d u c t l i k ec o m p o u n d s s ou s i n gt h en a t u r a lc o m p o u n d st ob el e a dc o m p o u n d st od e v e l o pn e wd r u g sb e c o m e ah o ts p o to ft h en e wd r u gd e v e l o p m e n t ar e n a i s s a n c eo fd r u gd i s c o v e r yi n s p i r e db y n a t u r a lp r o d u c t sc a nb ep r e d i c t e d c f r r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 i nt h i ss t u d y ，1 0 4c f t ra c t i v a t o r sw e r ei d e n t i y f i e df r o m3 8 6n a t u r a l c o m p o u n d sc o l l e c t i o n sb yu s i n g ac e l l b a s e df l u o r e s c e n c ea s s a y s h o r t c i r c u i tc u r r e n t s t u d ya n ds i n g l es u b m u c a s o lg l a n d f l u i ds e c r e t i o nm e a s u r e m e n ts t u d i e sw e r eu s e dt o s y s t e m a t i c a l l ye v a l u a t i o nm o l e c u l a rm e c h a n i s m so f s e v e r a la n t i - h y p e r t e n s i v e c o m p o u n d s ( i n c l u d i n gc o u m a r i n ，h t e o l i n ，a n dd i c t a m n i n e ) w ed e m o n s t r a t e dt h a tt h e a n t i h y p e r t e n s i v ec o m p o u n d s c o u l da c t i v a t ec f t r m e d i a t ei o d i d ei n f l u xi nt h e c e l l - b a s e df l u o r e s c e n c ea s s a y ，a n dt h ea c t i v a t i o nw a sr a p i d ，r e v e r s i b l ea n d c a m p d e p e n d e n t c o u m a r i n s ，l u t e o l i n ，d i c t a m n i n ea c t i v a t e dw i l d - t y p ea n d a f 5 0 8 m u t a n tc f t r ，c u r c u m i nc a nn o ta c t i v a t e dg 5 5 1 dm u t a n tc f t r t ob ee s p e c i a l l y m e n t i o n e d ，o s t h o l e ( ac o u m a r i nc o m p o u n d ) s t i m u l a t e df l u i ds e c r e t i o na tas p e e do f 3 3 3 x l f f l o n l si nt h es i g l es u b m u c o s a lg l a n df l u i ds e c r e t i o ns t u d y a n dt h ea c t i v a t i o n c o u l db er e v e r s e db yc f t r i n h 1 7 2 o u rs t u d ya l s os u g g e s t e dad i r e c tb i n d i n g m e c h a n i s mo fc f t ra c t i v a t i o nb yt h ea n t i h y p e r t e n s i o nc o m p o u n d s ，w h i c hs u g g e s t e d t h a tc f i rm a yb eo n eo ft h em o l e c u l et a r g e t e so ft h e s ea n t i h y p e r t e n s i o nm e d i c i n e s o u rs t u d i e sa l s o p r o v i d e c l u e sf o re l u c i d a t i o nm o l e c u l a rm e c h a n i s mo f a n t i - h y p e r t e n s i v et c m t h ec o m p o u n dm a yb eu s e f u lf o rp r o b i n gc f t rc h a n n e l g a t i n gm e c h a n i s m sa n da sal e a dc o m p o u n dt od e v e l o pp h a r m a c o l o g i c a lt h e r a p yo f c f f r r e l a t e dd i s e a s es u c ha sc y n i cf i b r o s i s ，i d i o p a t h i cc h r o n i cp a n c r e a t i t i ， k e r a t o c o n j u n c t i v i t i ss i c c aa n d h a b i t u a lc o n s t i p a t i o n k e yw o r d s ：c y s t i cf i b r o s i st r a n s m e m b r a n ec o n d u c t a n c er e g u l a t o r ( c f t r ) ；t r a d i t i o n a l c h i n e s em e d i c i n e ；a c t i v a t o r ；a n t i - h y p e r t e n s i o n ；f l u i ds e c r e t i o n c f t r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或 发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均 已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名：1 缓龋凇 日期： 学位论文版权的使用授权书 加呀蝈计圈 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文 被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：像砺秒 5 3 指导教师签名： 日 期： c f t r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 第一章文献综述 囊性纤维化跨膜电导调节因子( c f r r ) ，是一种重要的c l 一通道，属于a b c 大家族中的一个成员，也是该家族中唯一具有通道功能的成员。c f t r 主要为氯 离子跨上皮细胞运动提供了选择性通道，对于跨上皮细胞的盐类运输、液体流动 和离子浓度调节等都具有重要的决定作用。c f t r 主要在分泌性和吸收性上皮细 胞的项膜上表达。c f t r 蛋白活性与许多病理生理现象有关，例如c f t r 基因突 变导致在白种人中广泛存在的致死性常染色体隐性遗传病囊性纤维化，病变 累及多种组织，器官；活性过高则可导致多囊。肾病、分泌型腹泻等疾病。最新研 究表明，c f t r 在血管平滑肌紧张度的调节中也发挥重要作用。 c f t r 是一种多次跨膜的糖蛋白，由1 ，4 8 0 个氨基酸组成。整个分子由两个 跨膜结构域、两个核苷酸结合结构域和一个调节结构域组成。c f t r 主要调节跨 上皮细胞膜的c l 转运，此外还转运其它多种离子如r ，b r 。，f ，n 0 3 ，h c 0 3 ， 甲酸盐，乙酸盐等。c f t r 还具有调节其他离子通道及转运体的功能。 多年来通过对c f t r 离子通道结构与功能的研究，人们对c f t r 通道的门 控机制及活性的调节有了深入的认识。特别是在研究中对于c f t r 小分子调节剂 与c f t r 功能关系的认识，使人们意识到了对c f t r 相关疾病进行药物治疗的可 能性。从组合化合物库中筛选到几种能够促进c f t r 通道开放的激活剂。这些来 自于组合化学库中的小分子在促进通道开放方面的有效性已经得到了充分的肯 定，但是它们作为药品的潜在的副作用直受到质疑，因此它们在临床上的应用 前景令人担心。 近二三十年来，随着人类疾病谱的改变，西药抗药性及药源性疾病的增加，国 际上开始盛行人类回归大自然的潮流，因而天然药物的保健治疗作用受到人们的 青睐，中药以其天然属性无疑是更适于人类。从天然产物中寻找理想的先导化合 物也成为研究的一个热点。在一定程度上也带动了我国中药现代化的进程。中药 在我国的用药历史长达几千年，拥有完整的理论体系，传统中药的有效性毋庸置 疑，但是至今中药的药效物质基础、药物与靶点之i 日j 的关系还没有确立，其安全 性一直受到质疑，这极大地限制了中药的国际化。国际认可的药物必须是药物结 构、有效成分十分清楚，药理作用明确，临床疗效可靠，经得起反复验证的药物， 距离这点，我国中药制剂尚需努力。以阐明中药药效学、建立中药安全性标准 c f i r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 等为基础的中药现代化研究具有重要的现实意义。 1 1c f t r 概述 1 1 1c f t r 的结构 c f t r ( c y s t i cf i b r o s i st r a n s m c m b r a n er e g u l a t o r ) ，是一种c a m p p k a 依赖的 上皮氯离子通道，同时又是某些膜转运蛋白的调节因子。人c f t 堪因位二j ：7 q 3 1 位， 基因全长为2 3 0 k b ，有2 7 个外显子，编码1 4 8 0 氨基酸的膜蛋白，从结构上看，它属于 a b c t r a n s p o r t e r s 家族，该家族的成员还有s u r l a n d 2 ，m r p ，m d r 等，但仅有c f t r 有氯离子通道的功能【1 1 。c f f r 整个分子包括五个功能结构域1 2 】：两个疏水性的跨 膜区( m e m b r a n e - s p a n n i n gd o m a i n s ，m s d s ) ，每一个包括六个跨膜螺旋；两个亲 水性的核苷酸结合结构域( n u c l e o t i d e b i n d i n gd o m a i n s ，n b d s ) 和一个调节结构 域( r e g u l a t o r yd o m a i n ，r ) ，其中rd o m a i n 是c t t r 所特有的，它含有带电氨基酸 形成的多个磷酸化位点。这几部分整合在一起具有c f i rc 1 。通道功能。其中， m s d s 决定c l 一选择性孔的形成，而由n b d s 的a t p 水解作用控制通道的开闭，r d o m a i n 磷酸化控制通道的活性。另外c f r r 通过n ，c 末端与一些蛋白相互作用调 节它们的功能活动 s y n t a ：x i nl n 图1 p u t a t i v et r a n s m e m b r a n ea r r a n g e m e n to ft h ec y s t i cf i b r o s i st r a n m e m b r a n ec o n d u c t a n c e r e g u l a t o r ( c f t r ) ，s h o w i n gt w ot r a n s m e m b r a n ed o m a i n ，t w on u c l e o t i d eb m d i n gf o l d sa n dal a r g e c y t o s o l i cr e g u l a t o r yd o m a i n ( r - d o m a i n ) 1 1 2c f t r 的功能 1 1 2 1 c f t r 氯离子通道的门控机制 2 c f t r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 c f t r 的主要功能是调节c a m p 依赖的氯离子跨膜转运，该通道的开放可以 分为两步：首先，c a m p 介导的r 区磷酸化是c f t r 被激活的先决条件：其次，通道 开放依赖于a t p 的结合与水解。a t p 结合n b d s ，当n b d l 末端的磷酸基被剪 切，c f t r 立体构象改变，通道打开，氯离子流出。之后，当n b d 2 的a t p 被水解时， 通道关闭。而通道的关闭依赖于c 兀r 的去磷酸化【3 4 】。一种r 结构域缺失的c f t r 突变一r c f r r ，在a t p 存在的情况下，并不依赖磷酸化而使通道开放或关闭， r 结构域与n b d s 相互作用并调节其与a t p 的亲和力【5 1 。现在也有结果支持氯离子 浓度的改变会改变c f y r 的立体构象，从而影响c f t r 的磷酸化。 1 1 2 2c f t r 与其他离子通道间的相互作用 c f t r 不仅是氯离子通道，它还可直接或间接参与其他膜通道及转运体的调 节。研究结果表明c f t r 可参与调节另外两种氯离子通道：外向纠正性氯离子通 道以及钙依赖性氯离子通道。当c f t r 被激活时，a t p 被排入腺体管腔内，从而可 激活以上两种氯离子通道。另外，c f t r 还可调节上皮细胞a m i l o r i d e 敏感的n a + 通道，c l 。h c o 拱转运体以及r o m kk + 通道【6 l 。最新研究表明，c f t r 与水通道 蛋白( a q p ) 之间也有相互作用川。 c f t r 还与多种蛋白有着密切联系。s y n t a x i n1 a 可与c f t r 胞内n 端结构域结 合从而抑制c f r r 活性。据报道，p d z 结合蛋白家族与c f t r 相互作用，其中包括 n a + h + 交换蛋白调节因子( n h e r f ) ，e b p 5 0 ，d ( s m x l 和c a p 7 0 t 8 1 。可见c f t r 在细胞膜离子转运系统中的重要性。 1 1 3c f t r 在多种组织中表达 c f r r 几乎在所有具有吸收和分泌功能的上皮细胞的顶膜上表达【9 】，包括胆 管，肠道，呼吸道，汗腺，附睾，子宫内膜，心肌等【1 0 l 。最新研究表明，c f t r 在大鼠血管平滑肌上表达【1 1 j ，实验证明，血管平滑肌舒张与c f t r 氯离子通道开 放密切相关。 1 1 4c f t r 的突变 根据c f t r 突变产生原因，一般将其分为以下五类： 突变类型能否上膜通道活性临床比例( ) 基因无义、移码突变不能上膜 7 f 5 0 8 c f r r 上膜减少缺乏活性 7 0 g 5 5 1 d c f r rj 下常l 膜 无活性 2 5 c f r r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 i 调节途径异常上膜减少无活性较少 l 剪切错误上膜减少有活性 较少 其中a f s 0 8 c f f r 突变型所占比例最大，受到广泛关注。f 5 0 8 c f t r 是由 于第5 0 8 位p h e 缺失引起的突变，该突变由于c f r r 折叠错误或与分子伴侣相互作 用的障碍，使a f 5 0 8 c f r r 滞留在内质网而无法上膜，同时由于蛋白质结构异常， 导致通道开放频率降低，活性减弱【1 2 - 1 3 1 。 1 1 5o f t r 相关病理生理概述 c 兀r 是决定跨上皮膜盐分的运输、液体流动和离子浓缩的中心。在肠、胰 腺和汗腺分泌管中，c f i i 王在液体和电解质分泌中发挥关键作用，在汗腺导管和 呼吸道上皮细胞中，参与液体和电解质的吸收。因此，c f i i 王突变会影响单一器 官或多器官病理改变，对小肠、胰腺、气管上皮细胞以及肝脏、唾液腺、男性生 殖均有影响。另外，c f l l 王活性过高也会引发如分泌型腹泻，多囊肾等疾病。 1 1 5 1 o f t r 与胃肠道液体分泌 研究表明，肠道液体的分泌与c f f r 密切相关。一些带有突变型c f l l r 的人 患霍乱后死亡率降低。推测可能是因为c f i i l 突变后，患者肠道分泌功能降低， 减轻了霍乱毒素引起的脱水。c f l l r 敲除鼠由于肠道液体分泌障碍，以及液体吸 收增加，而表现出肠道阻塞【1 4 1 。霍乱毒素在c f l l 王敲除的小鼠中不能诱导腹泻 症状【1 5 】。霍乱毒素能分别诱导第二信使c p d v p 和c g m p 的增加，导致c f t rc i 一电流的增加。肠道组织的液体和c l 一分泌可以被g l i b e n c l a m i d e 和n p p b 阻断1 1 6 ， 1 7 】 o 胃食管反流病( g a s t r o - e s o p h a g e a lr e f l u xd i s e a s e ，g c r d ) ：婴儿c f 患者g e r d 发病率为2 0 ，成人高达5 0 。l e d s o n 等发现有g e r d 的成人c f 患者存在气 道酸化，肺功能也受影响。成人c f 患者易发生下食管括约肌壁压( l o s b p ) 下降 1 1 8 1 0 胎粪肠梗阻( m e c o n i u mi l e u s ，m i ) 和末端肠梗阻( d i s t a li n t e s t i n a lo b s t r u c t i o n s y n d r o m e ，d i o s ) ：在胃肠道大部分区域c f t r 因子是仅有的上皮氯离子通道，患 m i 的c f 患者c f t r 缺陷引起肠道内容物浓缩和淤积。大量干燥胎粪淤积于肠 内可致肠扭转，引起肠坏死、肠穿孔和腹膜炎。m i 有其相关的c f t r 调控基因， 位于染色体1 9 q 1 3 1 9 l 。患m i 的新生儿c f 患者体重和身高均低于无m i 的新生儿 4 c f i r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 c f 患者，后者平均寿命6 2 岁而前者仅3 2 岁【删。 1 1 5 2c f t r 与胆汁分泌 c f t r 主要在胆管上皮细胞和胆囊上皮细胞膜上表达。其缺陷可导致胆管分 泌阻塞和胆汁碱化。早期病理变化为胆管和胆小管中出现嗜酸性物质。浓缩的胆 汁淤积于各级胆小管中，损伤胆管细胞和肝细胞，引起肝脏局部纤维化。肝脏长 期纤维化可进展为肝硬化。在此进程中患者多无自觉症状，仅6 有相关临床症 状，但只有4 2 的c f 患者肝脏完全正常，3 5 患者肝脏b 超检查异常，4 2 生化指标异制2 1 1 。c f 患者常见的肝病征象为偶然发现的肝肿大伴轻度生化指 标异常和b 超提示脂肪肝。极少数患者会发生胆汁性肝硬化。肝功能衰竭为c f 的晚期表现，最严重的并发症是门静脉高压和食管胃底静脉曲张破裂出血。c f 患者肝病发生较晚，一项包括1 7 3 例c f 的调查，患者平均年龄为1 0 岁，发生 肝病平均年龄为1 1 岁，极少数患者在早期出现胆汁性肝硬化及其他并发症【2 2 1 。 c f 儿童患者发生胆囊异常很常见，主要包括胆结石、微小胆囊和胆囊缺失。 其中胆结石最常见。胆汁浓缩、胆汁酸吸收不良和粘蛋白蛋分泌异常都有利于胆 结石形成。 1 1 5 3c f t r 与呼吸道液体分泌 c f 病人都表现为i 、o 过度吸收和c l 一分泌不足1 2 3 2 8 1 。由此造成了气道表面液 体( a i r w a ys u r f a c el i q u i d ，a s l ) 变薄、粘稠，其结果是导致肺绒毛清洁能力丧失。 粘液在粘膜下腺导管产生后无法排出造成腺体阻塞、增生。c f 患者呼吸系统的 病理表现为反复的呼吸道感染，痰液粘稠，痰菌培养以铜绿假单胞菌，金黄色葡 萄球菌等感染为主。病程后期病人出现以上叶为主的支气管扩张和进行性呼吸衰 竭。尽管进行性肺功能病变是造成c f 患者发病和死亡的常见原因，但是患者发 病的年龄及症状的严重程度有很大差别。 1 1 5 4c f t r 与多囊肾病 1 1 5 4 1 常染色体显性多囊肾病( a d p k d ) 常染色体显性遗传性多囊肾病( a u t o s o m a ld o m i n a n tp o l y c y s t i ck i d n e y d i s e a s e ，a d p k d ) 是一种发病率最高的遗传性肾病。a d p k d 的主要特征是双侧肾 脏形成多个液性囊泡，囊肿进行性增大，造成肾脏结构和功能的损害，最终引起尿 c f r r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 毒症。a d p k d 除影响肾脏功能外，还累及全身多个器官，是一种危害人体健康的 系统性疾病【2 9 1 。 事实证明w t c f t r 对正常肾小管末端上皮细胞的c l 分泌起重要作用。而 a d p k d 囊肿衬里上皮细胞n a k - a t p a s e 分布在细胞的腔膜面，顶膜上的c f t r 与 非正常定位的n a k - a t p a s e 可导致非正常的液体分泌，而引发囊肿。s u l l i v a n 等【3 0 1 认为c f r r 介导的c l 分泌是囊肿上皮细胞异常分泌的机制。另外，目前已证实 c a m p 能促进囊液分泌及囊肿细胞增生。而c f i r 是一种c a m p 依赖的氯离子通 道，因此也可以推测，c a m p 是通过激活c f r r 而促进囊液分泌的。 1 1 5 4 2 常染色体隐性多囊肾病( a r p k d ) 常染色体隐性多囊肾病比常染色体显性多囊肾病发生几率较低，由于双侧肾 的严重增大，对肺造成破坏，使呼吸器官发育不全，经常引起胎儿和新生儿死亡。 该疾病的特点是集合管增大和伸长，形成多个小囊，伴有胆汁生成障碍。k o i c h i n a k a n i s h i 等【3 1 】利用一种c f i r 失活的鼠科动物模型研究c f f r 对于在体肾囊 肿的形成是否必需。这项研究旨在测定b p k 鼠模型a r p k d 的发生是否可通过 c f t r 基因敲除进行基因补偿而预防肾囊肿的发生。结果显示，囊肿基因纯合个 体( b p k ) c f r r 功能的丧失并不能阻止囊肿的增大以及后来的肾功能下降。双突 变鼠( b p k - - ：c f t r - ) 肾囊肿发生及死亡时间比非c f 鼠( 印乜- ；c f t r + + ) 平均 早7 天。这一研究结果显示a r p k d 与a d p k d 在液体分泌机制上的不同。 1 1 5 5c f t r 与生殖 c f t r 基因对男女两性生殖系统都有重要作用。目前认为，c f 女性患者生育 力低下主要是由于其严重的宫颈黏液黏稠，宫颈缺乏c f t r 表达，宫颈黏液没有 典型的月经周期【3 2 】，此外，内膜腺体上c f t r 蛋白缺乏可显著抑制精子获能。 c f i r 存在于附睾细胞顶膜，可介导阴离子( c 1 。和h c 0 3 ) 和水分分泌，在附睾 液的形成方面扮演重要角色。曾报道【3 3 i c f t r 和水通道蛋白一9 存在于附睾上皮腔 膜面，对附睾液形成和水的渗透能力有重要作用。细胞学及动物研究证实c f t r 蛋白与生精和精子成熟密切相关。 1 1 5 60 f t r 与高血压 最新的研究表明，c f r r 在血管平滑肌紧张度的调节中也发挥重要作用。 r o b e r t 等应用免疫组化和免疫荧光方法发现了c f i r 在大鼠血管平滑肌上表达， 6 c f r r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 并通过离体动脉血管环实验证实了c f t r 的非特异性激活剂m p b 0 7 和m p b 9 1 能显著降低异丙肾上腺素和高k + 引起的血管平滑肌的收缩1 3 4 1 。r o b e r t 等又通过 c f t r + + 和c f t r - 一小鼠的比较，进一步证实了c f f r 在调节血管平滑肌紧张度过 程中发挥重要作用。高引起c f t r + + 鼠血管平滑肌收缩的幅度显著低于c f t r - 一 鼠的血管平滑肌的收缩幅度。同时，血管活性肠肽( v i p ) 引起的c f t r + + 鼠血管平 滑肌舒张幅度也明显高于c f t r - 一鼠血管平滑肌舒张幅度，表明血管平滑肌舒张 与c f t r 氯离子通道开放密切相关【3 5 1 。 早期报道【3 6 c f 纯合青年患者血压一般较同龄同性别的正常人低，一般认为 是由于营养不良所造成的。 1 1 6c f t r 激活剂 c f 基因的破译以及基因型与表型间关系的建立为人们提供了很多的药物作 用靶点。c 兀r 小分子激活剂的研究已经成为相关领域的热点。目前发现的c f i r 激活剂主要有以下几类： 1 1 6 1 化学伴侣和分子伴侣 多元醇( 如甘油、山梨糖醇和肌醇) 、胺类( 如甜菜碱和三甲胺一n 一氧化物 t m a o ) 或d m s o 溶剂能够提高蛋白质的水合程度，因而具有稳定蛋白质的 作用1 3 刀，并能提高依赖于c a m p 的离子通道的活性【3 刚。 1 1 6 2 钠- 4 - 苯基丁酸 钠一4 一苯基丁酸( 4 p b a ) 是一种短链脂肪酸。它通过抑制组蛋白脱乙酰化 而激活转录，是一种转录调节因子。h e d a 等【3 9 】发现经过4 - p b a 处理后不但细 胞表面有功能的c f t r 数量增多，而且c f t rm r n a 水平也有所提高。另有研 究也发现，利用丁酸钠处理的细胞c f f r 的表达水平以及细胞表面有功能的 c f r r 数量也有所提高。进一步研究证实丁酸是通过提高蛋白质表达来发挥作用 1 4 0 l 。4 - - p b a 已被应用于i 期临床试验。 1 1 6 3 异丁基甲基黄嘌呤i b m x i b m x 激活c f t r 氯离子通道。i b m x 是通过c a m p 依赖和非c a m p 依赖途 径激活c f t r 的【4 2 4 3 1 。i b m x 通过减少c a m p 的降解来增加c f t r 的c a m p 依 赖的氯离子通道电流i 矧。另外，i b m x 还够通过抑制蛋白磷酸酶的活性，使c f t r 7 c f t r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 去磷酸化减少来激活c f i r 功能【4 5 1 。也有人认为i b m x 是通过直接作用激活了 c f t r 4 3 l 。 1 1 6 4 三羟基黄酮g e n is t e i n g e n i s t e i n 是一种蛋白酪氨酸激酶抑制剂( p t k s ) 【4 6 1 ，能显著的激活c f i rc 1 一 通道。有人认为其激活功能是通过防止c f i r 被p t k 抑制，而不是通过增加 c a m p 的活性来实现的i 钥。f o r s k o l i n ( f s k ) 能增加细胞c a m p 的水平，能显著 促进g e n i s t e i n 激活的c f t r 通道功能【铝1 。也有人认为g e n i s t e i n 能够延长通道 开放的时间【4 9 1 。另有研究表明，g e n i s t e i n 能够抑制丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶， 减少c f r r 去磷酸化，从而增加通道的功能1 5 0 i 。 1 1 6 5 新发现的几种c f t r 激活剂 多年来通过对c f t r 离子通道结构与功能的研究，人们对c f t r 通道的门 控机制及活性的调节有了深入的认识，特别是在研究中对于c f t r 小分子调节剂 与c f t k 功能关系的认识。v e r k m a n 等构建了稳定转染y f p h 1 4 8 q 1 1 5 2 l 与 w t c f t r 的f r t 细胞模型，采用高通量筛选的方法，获得了人野生型c f t r 的 小分子激活剂，它们在结构上与已知的黄酮类和黄嘌呤衍生物类激活剂不同。在 细胞水平上的研究表明，它们都具有较好的活性，且无毒性。 2 0 0 1 年，l u i sj 等【5 1 1 以f l a v o n o i dg e n i s t e i n 和b e n z o c q u i n o l i z i n i u mm p b 0 7 为先导化合物，用组合化学和平行合成法合成了2 2 3 个f l a v o n o i d ，q u i n o l i z i n i u m 以及相关的杂环化合物。其中的7 ，8 b e n z o f l a v o n e 家族的结构介于f l a v o n o i d s 和 b e n z o 一 c q u i n o l i z i n i u m s 之间，它们是有效的激活剂。其中最好的是u c c f 一0 2 9 。 2 0 0 2 年，t o n g h u im a 等【5 2 1 利用高通量筛选法分析了6 0 ，0 0 0 种结构多样的类 药的化合物，得到了5 7 强活性的激活剂和2 8 4 个弱活性的激活剂，他们在结构 上与已知的激活剂完全不同，活性最好的化合物有t e t r a h y d r o c a r b a z o l ， h y d r o x y c o u m a r i n 和t h i a z o l i d i n e 核心结构。这些化合物对野生型c f i r 的k d 小 于2 0 0n m 。 2 0 0 5 年，n i c o l e t t ap e d e m o n t e 等【5 3 l 发现抗高血压药物1 ，4 d i h y d r o p y r i d i n e s ( d h p s ) n i c a r d i p i n e ，f e l i d i p i n e 可齐u 量依赖性激活c f t r 氯离子通道，并且其对c f t r 通道的活性与亲和力都更高于g e n i s t e i n 。 8 c f i r 氯离子通道可能是降压中药的作用靶点之一 另外，近年来人们从中药单体库中也发现了许多活性较高的c f r r 激活剂， 如蒽醌类单体化合物芦荟大黄素、1 ，8 _ 二羟基葸醌，木质素类单体化合物木兰 脂素等。 1 2 中药现代化及其活性物质基础概述 中药是中华文化的瑰宝，是中华民族对天然药物及其人工替代品的独特使用 形式，是中华民族几千年与疾病作斗争的经验总结，曾为中华民族的繁衍昌盛做 出贡献几千年来，人们对中药的认识不断深入最近统计的数据表明，我国中草 药已有约1 2 0 8 0 种近二三十年来，随着人类疾病谱的改变，西药抗药性及药源性 疾病的增加，国际上开始盛行人类回归大自然的潮流，因而天然药物的保健治疗 作用受到人们的青睐，中药以其天然属性无疑是更适于人类。 中药之所以能防治疾病，是有物质基础的，并非空穴来风，其具有防治作用的 物质即是中药有效成分。但中药存在有效成分不清楚，作用靶点不明确的缺点 近几年来，对中药有效成分的研究与开发成为了一个热点 1 2 1 中药现代化研究内容 中药现代化是指在继承和发扬中医药优势和特色的基础上，充分利用现代科 学技术的理论、方法和手段，借鉴国际通行的医药标准和规范，对中药进行研究、 开发、生产和管理，提高中药的国际竞争力，适应当代社会发展需求【5 4 1 。 中药现代化实质上就是中药与现代科学技术和现代学术思想，以及现代文化 的结合，是在继承中医药传统理论、技术及应用经验基础上的发展。中药现代化 既是中药事业本身发展和国内市场经济及科学发明发展的需要，更是国际市场激 烈竞争的需要，世界经济发展的必然，是现代科学技术迅猛发展的大势所趋1 5 引。 但是，随着中药现代化的进一步推进和深入，有一些关键问题成为了中药现 代化发展的瓶颈，使中药的科学性难以实现，这个关键点就是中药药效物质。 1 2 2 中药药效物质基础是其中的有效成分 中药化学成