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中山大学博士学位论文新的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究 陈志胜 新的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究 专业：细胞生物学 博士生：陈志胜 导师：刘林教授 摘要 哺乳动物孤雌胚胎发育至着床后不久就死亡，主要原因是基因印迹异常和胎 盘缺陷。但成熟卵子孤雌激活后可形成发育完全的囊胚，从这种囊胚中可获得孤 雌胚胎干细胞( p a r t h e n o g e n e t i cs t e mc e l l ，p e s ) 。孤雌胚胎干细胞来自于没有完整 发育潜能的卵子，从而避免了伦理学问题。并且孤雌胚胎可取自女病人卵巢，体 外分化后得到的细胞与病人自身没有组织相溶性抗体的免疫排斥问题，是再生医 学的理想组织材料。对孤雌胚胎干细胞的早期研究认为p e s 仅仅具有有限的发育 能力，在嵌合体中不能发育为某些组织器官，如肌肉组织和胰脏。但对于它们自 身的发育能力是否像正常受精的胚胎干细胞( f e r t i l i z e ds t e mc e l l ，f e s ) 具有多能性， 可发育到什么程度仍然不得而知。， 前期工作表明，s p 激活卵子孤雌发育的胚胎与受精激活的胚胎在囊胚期没 有差别。我们用杂交品系小鼠m i i 期卵子采用s ，激活方法成功获得多株p e s 细 胞系，并对这些新建系的p e s 的生物学特性及其多能性进行鉴定，结果表明： 1 b 6 c 3 f 1 以及b 6 d 2 f 1 杂交品系小鼠m i i 期卵子用s r 激活后可成功获得 p e s 细胞系，呈现典型e s 样细胞形态和传代特性。与相同品系来源的f e s 细胞的 建系比较，孤雌胚胎有更高的建系效率。我们进一步对与建系效率有关的 e r k m a p k 和w n t 信号通路的作用进行了探讨，发现在孤雌胚胎中e i 表达量 降低，诱导内细胞团分化的因素减少，这可能是提高建系效率的原因之一。 2 我们获得的p e s 细胞系体外传代至5 0 代时仍持续表达o c t 4 、s s e a l 和碱性 磷酸酶等多能性标记，并且维持正常的4 0 ，x x 核型，表明它们具有持续增殖能 力并维持多能性不变。p e s 在体外分化时，可形成球状拟胚体，并且分化分三胚 中山大学博士学位论文新的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究 陈志胜 层来源的不同形态的细胞。在裸鼠皮下也能形成畸胎瘤，瘤体生长迅速，并且具 有神经组织，肌肉组织和腺体样组织，充分显示其外、中、内三胚层分化能力。 3 p e s 与8 细胞胚胎融合或将其注入二倍体正常囊胚后，它们参与二倍体受 体囊胚发育形成嵌合体，且嵌合体小鼠发育正常，雌雄个体都可正常生殖产生后 代。在其体内，p e s 分化为各种类型组织器官，并且没有分化缺陷和偏好性。证 明我们所得到的p e s 与前人建系的p e s 不同，具有体内分化为三胚层细胞的广泛 多能性。 4 把p e s 注入四倍体囊胚后形成四倍体补充( t e c ) 胚胎，移植入假孕母鼠后， 令人惊讶的是，最终得到1 只发育至出生的孤雌小鼠，突破了孤雌胚胎发育的局 限性，进一步证实p e s 发育的多能性。分析p e s 印迹基因表明，由于体外培养过 程的影响，基因印迹发生部分改变，尤其是一些对发育有关键作用的基因改变， 可能是其具有比孤雌胚胎更广泛的多能性的原因。 综上所述，我们的实验结果表明新的p e s 的体外培养改变了他们的印迹基因 的表达状况，证实- j p e s 与f e s 一样具有形成嵌合体所有组织的多能性并且具有 发育为完整胎儿至出生的能力。这为哺乳动物生殖发育理论提供了新的思路，打 破了孤雌细胞仅具有有限发育能力的结论。同时为建立人孤雌发育胚胎干细胞 系，并进行医疗应用提供了实验前提，也为动物克隆，再生医学等应用领域提供 了理论基础。 关键词：小鼠，孤雌激活，孤雌胚胎干细胞，多能性 中山大学博士学位论文 新的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究陈志胜 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fn e w p l u r i p o t e n tm o u s e p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o n i c s t e mc e l ll i n e s m a j o r ：c e l lb i o l o g y n a m e ：z h i s h e n gc h e r t s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl i n l i u a bs t r a c t m a m m a l i a np a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o sa r en o tv i a b l ea n dd i ef r o md e f e c t si n p l a c e n t a ld e v e l o p m e n ta n dg e n o m i ci m p r i n t i n g p a r t h e n o g e n a i ce m b r y o n i c s t e mc e l l s ( p e s c s ) d e r i v e df r o mp a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o sm i g h ta d v a n c er e g e n e r a t i v em e d i c i n e b ya v o i d i n gi l n n l u n o - r e j e c t i o na n de t h i c a lr o a d b l o c k s h o w e v e r ，p r e v i o u sr e p o r t s s u g g e s tt h a tp e s c sm a y f a i lt od i f f e r e n t i a t ea n dc o n t r i b u t et os o m eo r g a n si nc h i m e r a s ， i n c l u d i n gm u s c l ea n dp a n c r e a s ，a n di tr e m a i n su n c l e a rw h e t h e rp e s c s t h e m s e l v e sc a n f o r ma l lt i s s u et y p e si nt h eb o d y p r e l i m i n a r yw o r ks h o w st h a tr a t e so fb l a s t o c y s td e v e l o p m e n td on o td i f f e r b e t w e e np a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o sd e r i v e df r o ma c t i v a t i o no fo o c y t e sb ys ，+ a n d f e r t i l i z e de m b r y o s s e v e r a lp e sc e l ll i n e sh a v eb e e ns u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e du s i n g h y b r i ds t r a i n so fm i c ea n ds r 2 + a c t i v a t i o nm e t h o d s t h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d p l u r i p o t e n c yo ft h e s en e wp e s c e l ll i n e ss h o w e dt h a t ： 1 f o u rp e sc e l ll i n e sw e r ed e r i v e df r o ms r z + - a c t i v a t e dm i ie g g sf r o mb 6 c 3 f1 a n db 6 d 2 f1 h y b r i ds t r a i n so fm i c e ，e x h i b i t i n gt y p i c a lm o r p h o l o g yo fe sc e l l s c o m p a r e dw i t hf e s c sf r o mt h es a n l es t r a i n ，t h eh i g h e re f f i c i e n c yi nt h ei s o l a t i o no f p e s c sm i g h ta t t r i b u t et ot h ed e c r e a s e de r ks i g n a l i n gi np a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o s ， r e d u c i n gt h ed i f f e r e n t i a t i o no fl c m 2 t h eu n d i f f e r e n t i a t e dp e s c sr e t a i n e dan o r m a ll ( a i y o t y p ee v e nt h r o u g h5 0 p a s s a g e s ，e x p r e s s e ds s e a 1a n do c t 4 ，a n dw e r ep o s i t i v ef o ra l k a l i n ep h o s p h a t a s e t e r a t o m ag e n e r a t e df r o mt h e s ec e l l se x h i b i t e dt h ed e v e l o p m e n to fav a r i e t yo ft i s s u e t y p e se n c o m p a s s i n ga l lt h r e ee m b r y o n i cg e r ml a y e r s i na d d i t i o n ，t h e s ec e l l ss h o w e d t h ep o t e n t i a lf o ri nv i t r od i f f e r e n t i a t i o ni n t oe n d o d e r m ，n e u r o n a l ，a n dm e s o d e r m 中山大学博士学位论文 新的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究 舅志胜 l i n e a g e s 3 h e a l t h ya n df e r t i l ec h i m e r a sw e r ep r o d u c e db ya g g r e g a t i o no rb l a s t o c y s t s i n j e c t i o n m i c r o s a t e l l i t ea n a l y s i s s h o w e dt h a tp e s c sc o n t r i b u t e ds i g n i f i c a n t l yt o v a r i o u st y p e so ft i s s u e sa n do r g a n s ，d e m o n s t r a t i n gt h ep l u r i p o t e n c yo fp e s c si n n a t u r e 4 s u r p r i s i n g l y ，p e sc e l l si n j e c t e di n t ot e t r a p l o i db l a s t o c y s t sw h i c ho n l y c o m p l e m e n tp l a c e n t ad e v e l o p m e n tl e dt o t h eb i r t ho fap a r t h e n o g e n e t i cp u pw i t h g e n o t y p i co r i g i nf r o m t h ep e sc e l l sb ym i c r o s a t e l l i t ea n a l y s i s f u r t h e r , nv i t r oc u l t u r e m o d i f i e dt h em e t h y l a t i o na n de x p r e s s i o no fi m p r i n t e dg e n e s ，a n dt h i sm a yh a v e c o n t r i b u t e dg r e a t l yt ot h ee n h a n c e dp l u r i p o t e n c yo fp e s c s t os u m m a r i z e ，w es h o wt h a ti nv i t r oc u l t u r em o d i f i e st h ee x p r e s s i o no f i m p r i n t e dg e n e si np e s c sa n dt h a tt h e s ec e l l s ，b e i n gf u n c t i o n a l l yi n d i s t i n g u i s h a b l e f r o mf e s c s ，c a nc o n t r i b u t et oa l lo r g a n si nc h i m e r a s r e m a r k a b l y ，o n ep u pd e r i v e d f r o mah y b r i dp e sc e l ll i n ew a sb o r nv i at e t r a p l o i de m b r y oc o m p l e m e n t a t i o n ， d e m o n s t r a t i n gt h a tp e s c sa r ec a p a b l eo ft e r md e v e l o p m e n t , a n d c a l ld i f f e r e n t i a t ei n t o a l lc e l lt y p e sa n df u n c t i o n a lo r g a n si nt h eb o d y k e yw o r d s ：m i c e ，p a r t h e n o g e n e t i ca c t i v a t i o n ，p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y o n i cs t e m c e l l ，p l u r i p o t e n c y i v 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位敝作者签名： 传侈胆 日期： 妒莎年月护日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 保密的学位论文在解密后使用本规定。 学位论文作者签名： 确讲 i 洲懿：彳让 h 期：抄场年岁月扩臼 r 1 期：加疆年爹月彳h 中山大学博士学位论文新的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究 陈志胜 i 希喜 日 i青 0 1 胚胎干细胞及其研究进展 2 0 世纪是生命科学和医学飞速发展的一百年，生命科学已经成为自然科学 中最为引人注目的领域。1 9 9 8 年人胚胎干细胞系( e m b r y o n i cs t e mc e l l ，e s c ) 成功 建立的报道更是轰动了整个生命科学界，同时也掀起了干细胞研究的新热潮。在 2 l 世纪之初，干细胞研究曾连续两年被美国s c i e n c e 杂志评为十大科学进展之一， 并被推举为2 l 世纪最重要的十项研究领域之首。目前，干细胞相关技术的研究 已经成为各国科技竞争的焦点，而在我国刚刚颁布的国家“十一五”规划纲要中， 也明确提出重点支持干细胞研究。干细胞是人体内最原始的细胞，具有较强的再 生能力和分化潜能。医学界乃至整个科学界之所以对干细胞产生极大的兴趣和研 究热情，是因为人们希望通过干细胞的研究来寻找或建立丰富的健康组织库，用 来替代一些被疾病损伤的组织或器官。目前认为，干细胞最有可能在下列疾病的 治疗中发挥其潜能：帕金森氏病，糖尿病，心脏病，肿瘤，烧伤，脊髓损伤， a l z h e i m e r s 病等，而这些疾病目前均无有效的根治手段。 0 1 1 胚胎干细胞的来源 e s 细胞来源于哺乳动物着床前囊胚( b l a s t o c y s t ) 的内细胞团( i n n e rc e l lm a s s ， i c m ) ，是最原始的干细胞，它位于个体发育的顶端，具有发育的多能性 0 a l u r i p o t e n t ) ，能够分化为组成机体的所有类型的细胞，进而形成机体的任何组织 和器官，并具有发育成完整个体的能力 1 3 】。在哺乳动物的胚胎发育过程中，卵 子经过受精后产生一个能发育成完整有机体的全能性细胞受精卵。受精卵经 进一步分裂，形成由多个完全相同的细胞聚集在一起构成的桑椹样球体一桑椹 胚( m o r u l a ) ，此时所有的细胞都被认为具有全能性。桑椹胚进一步分裂，发育形 成一个中空的环形细胞群囊胚，囊胚由两种细胞类型分两层组成。里面的一 前言 层细胞称为内细胞团，具有多能性。多能性细胞在正常胚胎的发育过程中，只出 现一至两天的时间，随后则不断渐进分化，首先分化为内、中、外三个胚层 ( e n d o d e r m ，m e s o d e r m ，e c t o d e r m ) ，然后发育成胚胎各个组织器官，可形成成熟个 体中的2 0 0 多种细胞类型；外面的一层细胞称为滋养层( t r o p h o b l a s t ) ，这些细胞 丧失了多能性，将来发育成一些胚外的支持性组织。分离囊胚的内细胞团，在合 适的体外条件下培养，可以阻止正常的分化过程，使其仍保持多能性的状态并可 以无限增殖，这种多能性干细胞就称为胚胎干细胞【4 】。 0 1 2 胚胎干细胞的生物学特性 e s 细胞区别于其他类型的细胞最为突出的三个生物学特性为：( 1 ) e s 细胞 能够无限制地进行忠实的自我复制( s e l f - r e n e w a l ) ：( 2 ) 适当条件下，在自我分裂 增殖过程中能够永久维持多能性；( 3 ) 将e s 细胞注射到哺乳动物发育早期的胚 胎中，它能够整合到胚胎中并随着胚胎的发育分化成任何可能的胚胎组织。早在 1 9 7 5 年，m i n t z 等人就发现，将经过多次体外传代培养后的小鼠胚胎瘤细胞( e c ) 注射到囊胚中，该细胞能随着胚胎发育形成任何可能的胚胎组织，这也是第一个 证明细胞多能性的例子【5 】。e s 细胞建立后，研究者发现e s 细胞不仅能够整合 发育，更重要的是能够形成生殖细胞，这些生殖细胞将来又可以发育成个体小鼠， 进一步证明e s 细胞的多能性，并为其应用提供重要的保证。目前，在生物研究 领域被广泛应用的基因敲除( k n o c k o u t ) 技术，正是利用了e s 细胞的这一特性来 实施的 6 】。 在e s 细胞的体外培养过程中，需要将其置于经丝裂霉素处理过的鼠胚胎 成纤维细胞饲养层( m e ff e e d e r ) 上进行传代培养才能维持其多能性。另外，培养 液中还必须含有适当浓度的胎牛血清( f b s ) ，非必需氨基酸( n e a a ) ，3 - 巯基乙 醇，白血病抑制因子( l i d ，碱性成纤维细胞生长因子( b f g f ) 等成份。e s 细胞呈 集落式生长，细胞排列紧密，形态呈圆形或棱形，核质比高，胞浆少。e s 细胞 碱性磷酸酶染色阳性，端粒酶活性高，特异性表达s s e a 1 、s s e a 3 、s s e a 4 和t r a 1 6 0 、t r a 1 8 l 等细胞表面标志，以及多能性细胞转录因子o c t 4 和 n a n o g 7 。在没有饲养层细胞和分化抑制因子存在的情况下，e s 细胞能够发生 分化，在培养液中形成有内、中、外三个胚层细胞组成的拟胚体( e m b r y o n i ci x ) d y ， 中山大学博士学位论文祈的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究陈志胜 e b ) 。拟胚体经进一步培养分化后，可检测到心肌细胞、造血细胞、毛细血管的 内皮细胞、腺体细胞和骨骼肌细胞等的特异性抗原。培养液中还可检测到甲胎蛋 白，绒毛膜促性腺激素等分泌型的信号分子。另外，将未分化的e s 细胞注射移 植到免疫缺陷鼠( 裸鼠) 体内可形成畸胎瘤样组织( e m b r y o n i cc a r c i n o m a ) ，该组织 包括源于三个胚层的不同细胞类型。这些研究都说明e s 细胞具有多向分化潜能。 o 1 3 胚胎干细胞的体外建系及其发展 人们对e s 细胞的研究是从小鼠e s 细胞的体外培养开始的，迄今已有2 0 多 年的研究历史了。通过对小鼠e s 细胞的研究，人们已经积累了许多e s 细胞的 生物学特性，体外培养及诱导分化等方面的知识。近年来，随着胚胎干细胞多能 性相关因子o c t 4 、s t a r 3 ，n a n o g 等基因相继被克隆，研究者们在e s 细胞分化多 能性维持、定向分化机制等多方面展开了深入研究，在优化培养条件、无血清培 养，以及无滋养层细胞培养方面取得了长足的进展，甚至在用于组织修补的临床 试验上也迈开了步伐。人e s 细胞的研究起步较晚，但也取得了突破性进展。研 究者己成功的在体外建立了人的e s 细胞系，并且能够使其在体外成功的进行增 殖并保持未分化状态【8 】。 目前将e s 细胞应用于临床的细胞替代治疗，需要解决如下问题：( 1 ) 研究 e s 细胞的体外复制机理，在确保足够细胞数目的同时防止其致瘤性；( 2 ) 摸索 e s 细胞的分化条件，提高定向分化效率；( 3 ) 克服e s 细胞衍生物移植导致的免 疫排斥。( 4 ) 克服e s 细胞研究所带来的伦理问题。目前，胚胎干细胞的制备离 不开胚胎操作，胚胎在一些不同的国家和宗教界被视为是生命的起点，与活着的 婴儿没有什么不同，所以在许多国家被严格禁止，一些国家纷纷出台了一系列关 于人e s 细胞研究的规章制度，对人e s 细胞的研究权限作出了一定的限制。 为解决以上问题，研究者开辟了多种e s 细胞临床应用的新方法。治疗性克 隆是其中之。把已分化体细胞的核注入到一个卵细胞中，重新启动已分化的供 体细胞核的原始发育程序，使其发育形成囊胚后，再从中分离e s 细胞 9 】。这种 技术制造的e s 细胞与供核的体细胞具有相同的基因组，因此，利用此技术可以 建立与宿主遗传背景几乎完全相同的e s 细胞。用它们作为移植细胞的来源，就 能从根本上克服免疫排斥。目前，已经用体细胞核移植技术克隆了牛、羊、猫、 前言 狗和大小鼠等多种哺乳动物【1 0 1 4 】。世界各国的科学家都在努力，用克隆技术建 立灵长类动物，包括人类的e s 细胞系，但直到目前还没有成功。而那些已经克 隆的多种动物总的成功几率都是非常小的，而且其基因表达不正常。 自体的成体干细胞既可避免免疫排斥问题，又不存在伦理争论，但是成体干 细胞不如e s 细胞那样具有无限增殖性及多能性。随着成体干细胞研究的深入， 研究者观察到成体干细胞可以突破其“发育限制性”，跨系甚至跨胚层分化为其 他类型组织细胞。例如，骨髓来源的干细胞在特定环境中可向肝脏、胰腺、肌肉 及神经细胞分化；肌肉、神经干细胞也可向造血细胞分化。人们称这种现象为“干 细胞的可塑性 。但是关于成体干细胞可塑性仍然存在争议，其中成体干细胞“异 质性假说”和“细胞融合假说分别对干细胞的可塑性提出了质疑，并有相关的 实验证据支持这种质疑 1 5 ，1 6 ，因此其应用范围受到很大的限制。 另一替代方案则是由孤雌生殖的胚胎建立e s 细胞系。孤雌生殖 ( p a r t h e n o g e n e s i s ) 是一种单性生殖，指的是卵母细胞不经过受精而发育成胚胎。 用孤雌生殖方法获得的灵长类动物的e s 细胞系已经显示了多方向的分化能力 【9 】。这些研究结果提示，对于育龄期的女性患者，用其自身的卵母细胞获得孤 雌生殖胚胎，再分离得到e s 细胞用于定向分化，也是获得无免疫排斥反应的供 体细胞的方法之一。 2 0 0 7 年，体细胞重编程多能干细胞即诱导的多能干细胞( i p s ) 的报道引起世 界生物医学界的振动，是继体细胞克隆动物后又一次引发各国强烈反响 1 7 ，1 8 。 生产这种干细胞，既不使用人类胚胎，也不需要克隆技术。在体细胞内诱导细胞 核发生重编程，使其变成一个具有多能性的干细胞，并已证明它具有与胚胎干细 胞同样的形态学、细胞增殖特性、细胞表面抗原、基因表达、表观遗传和端粒酶 活性的特征。同时，这些细胞在体外能形成拟胚体。在体内，如免疫高度抑制小 鼠或裸鼠体内能形成畸胎瘤，并能分化成原始三个胚层的各种衍生物。诱导的多 能干细胞能通过嵌合体进入生殖系统。所以，这种诱导的治疗细胞系，可为患者 筛选适宜的药物和制定治疗方案。当然，诱导多能干细胞技术还有许多问题尚待 进一步解决，如由这种诱导多能干细胞构建的小鼠，肿瘤发生率高达2 0 。此外， 诱导的多能干细胞在不同克隆之间分化能力不同，譬如人包皮细胞诱导的多能干 细胞在体外拟胚体和体内畸胎瘤分化中，形成很多神经细胞。而有的克隆的细胞， 中山大学博士学位论文新的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究陈志胜 分化的细胞中神经细胞很少见，主要是圆柱状上皮细胞群。推测这可能是由于插 入位点不同所致。所以，在诱导的多能干细胞应用于临床之前还有许多问题等待 解决。相信在以后的研究中将会出现大批突破性的研究成果，解决一系列深层次 的问题。但传统的胚胎干细胞研究还是必要的，因为它仍然是衡量其它干细胞的 参照标准。 0 2 哺乳动物孤雌胚胎干细胞研究进展 由于胚胎干细胞技术涉及早期未着床胚胎的使用，因此，有关此研究的道德 伦理问题的争论一直没有停止。因为胚胎在一些不同的国家和宗教界被视为是生 命的起点，所以在许多国家被严格禁止其应用于实验研究。孤雌胚胎来源于卵子， 正常条件下不具有形成个体的能力，因此也不被认为是一个生命体 1 9 1 。对于使 用孤雌胚胎进行分离胚胎干细胞的研究在法律上和伦理上都没有过多的限制。而 且女性病人自体卵子产生孤雌胚胎干细胞可避免免疫排斥，因而可作为胚胎干细 胞应用的替代途径之一。观察孤雌胚胎以及孤雌胚胎干细胞的发育能力，分析雄 性和雌性基因组在个体发育中的作用等，对阐明哺乳动物卵的激活、受精和发育 的机理，对这些重要的生命现象的解答及技术的应用具有重要意义。 0 2 1 哺乳动物孤雌胚胎的发育障碍 自然界中，孤雌生殖现象在无脊椎动物和低等脊椎动物中较常见，哺乳动物 卵母细胞自发激活( s p o n t a n e o u sa c t i v a t i o n ) 生成畸胎瘤的现象也时有发生，但是哺 乳动物自然状态下无法进行孤雌生殖。 卵母细胞的孤雌激活的实验研究起步较早，到2 0 世纪9 0 年代更是随着哺乳 动物细胞核移植研究的开展，得以进行较为系统地研究，在实验动物、家畜及人 卵母细胞激活方面均取得较大进展，激活后在体外发育至着床前囊胚获得很好的 结果。但孤雌激活囊胚移植入子宫后，在体内发育总是出现早期死亡，可发生在 着床后的各个时期，激活方法的改进也只能使之发育到前肢芽时期，即约2 0 体 节期【2 0 】。孤雌胚胎来源的细胞只能发育为胎儿组织和胚外中胚层，而不能发育 为滋养层来源的组织。但当孤雌囊胚内细胞团与正常囊胚滋养外胚层细胞 ( t r o p h o e c t o d e r m ，t e ) 融合成重构囊胚后植入子宫，孤雌细胞可延长发育至4 0 前言 体节期，仍然无法发育至出生。说明孤雌囊胚除了滋养层发育异常外，i c m 也 有某种发育缺陷 2 1 ，2 2 1 。而孤雌胚胎与正常胚胎融合后，这种融合胚胎可发育 成出生小鼠，即嵌合体小鼠，且其中具有孤雌来源的细胞。这些孤雌细胞在嵌合 体胚胎发育1 2 天以前可与正常胚胎来源细胞平衡分布。但由于孤雌胚胎来源的 细胞分化细胞增殖能力不强，在嵌合体鼠中面临极大的选择压力，在胎儿期、新 生鼠和成年鼠中孤雌细胞的数量逐步减少 2 3 。2 4 。而且在嵌合体中它们有发育 成某些特殊器官的偏好，如脑、心、肾和脾，在有些组织如骨骼肌中分化能力则 很弱，并可能由于孤雌胚胎细胞的参与造成嵌合体发育缓慢 2 5 2 8 1 。 孤雌胚胎的死亡以及其衍生细胞在嵌合体中的异常发育是由于孤雌核存在 某种程度的功能缺陷而引起的。二倍体孤雌胚胎的两个染色体组都来源于亲本雌 鼠，带有母系基因印迹，而缺乏父系来源的印迹，现在普遍认为这是孤雌核功能 异常的原因所在 2 9 3 1 1 。采用核移植技术，把未生长的卵母细胞核( 被认为母系 印迹未建立而呈现部分父系印迹的特性) 与完全生长的卵母细胞核融合在一起， 得到了同时含有两个雌性卵子的孤雌胚，这种胚胎的发育能力要比m i i 期卵子 激活后的胚胎强，可发育至1 7 d 的胎儿，但仍不能完全发育至出生。在此基础上， 把未生长的卵母细胞基因组中的印记基因h 1 9 敲除，则胚胎发育至出生，并可 正常生长，创造出了真正的孤雌小鼠k a g u y a ，它是世界上首例通过孤雌生殖而 诞生的哺乳类动物 3 2 ，3 3 。 目前，关于卵母细胞孤雌生殖的研究资料仅限于小鼠，卵母细胞孤雌激活条 件、激活后培养及其继续发育潜能的改善均是目前亟待解决的问题。虽然多数学 者认为孤雌生物生长发育困难的最主要原因是基因的印迹异常，但其确切机制尚 未阐明，仍有待于进一步研究。同时，孤雌激活小鼠k a g u y a 的诞生改变了发育 生物学内容，打破了人们认为孤雌哺乳动物不能存活的传统观念，从而使孤雌生 殖技术在受精过程的基础研究、人类自体胚胎干细胞系的建立和应用等方面有广 阔发展前景。 o 2 2 孤雌胚胎干细胞的建系及其多能性研究 孤雌胚胎不能完全发育至出生胎儿，但在体外可充分激活形成囊胚。这种囊 胚内细胞团可用于分离e s 细胞，即是孤雌胚胎干细胞( p a r t h e n o g e n e t i ce s ，p e s ) 。 p e s 具有e s 细胞的生物学特征，在体外形成具有三个胚层分化能力的拟胚体， 中山大学博士学位论文新的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究陈志胜 并可以分化成多种组织细胞类型。在体内，用小鼠孤雌胚胎干细胞制造嵌合体可 以得到生殖系嵌合 9 ，3 4 ，3 5 。孤雌胚胎干细胞的这些特征说明p e s 可以具有作 为种子细胞进行细胞诱导、组织和器官构建的潜力，用来治疗某些退行性疾病和 进行组织器官再生。 目前研究孤雌胚胎干细胞的报道还是很少的。1 9 9 5 年以前，认为孤雌胚胎 干细胞的很多性质与受精胚来源的胚胎干细胞( f e r t i l i z e de s ，f e s ) 有很多差异， 而与孤雌胚胎i c m 细胞的生物学性质相当，结论是孤雌胚胎干细胞具有有限的 分化潜能并且引起嵌合体发育缓慢 3 5 1 。1 9 9 8 年人类e s 细胞建系之后，由于其 涉及到的伦理问题使得人们转而探寻胚胎干细胞研究的其他替代途径。正是由于 孤雌胚胎研究的限制较少，再一次吸引了部分学者重新开始p e s 的研究。但是 直到2 0 0 2 年才首次报告得到了非人灵长类孤雌胚胎干细胞，从2 8 个猴的激活卵 子中最终得到了一个p e s 细胞系，呈现典型e s 细胞样形态，体外传代了l o 个 月，并可在体外诱导其分化为三胚层来源的细胞，可形成具有三胚层细胞的畸胎 瘤，表明其具有多潜能分化能力【9 】。接着在2 0 0 3 年，采用与人类卵子相同的激 活方法即钙离子载体和蛋白合成抑制剂联合运用的方法，重新激活并分离得到了 小鼠p e s ，证实其具有在体外分化为三胚层细胞的能力，并且具有与其供体雌鼠 相同的免疫原性，为人类孤雌干细胞系的建立提供了实验前提【3 4 】。2 0 0 4 年孤雌 小鼠k a g u y a 的出生更是给本领域的研究者注入了动力，h 1 9 基因的敲除被认为 在孤雌小鼠的生长发育上起到关键性的作用，因此关于基因印迹问题及其与孤雌 发育的关系也成为研究的新热点。2 0 0 7 年从人卵子的体外受精过程意外获得人 的纯合孤雌胚胎干细胞，通过多种分子生物学包括全基因组扫描方法鉴定确定其 为孤雌胚胎衍生而来。之后陆续有人类的p e s 建系成功的报道 3 6 3 8 】【3 9 ，这些 结果证实从人类孤雌激活囊胚获得多能性p e s 的可行性，但其基本生物学特性、 体外分化能力及其临床应用前景仍需要继续深入的研究。 0 2 3p e s 的分化发育潜能及其影响因素 孤雌胚胎干细胞应该在受体动物上形成分化细胞并且长期驻留，只有这样 p e s 细胞才具备种子细胞的性质。因此研究p e s 的分化发育能力尤为重要，而 1 9 9 5 年以前的研究都没有把重点放在这一方面，因此资料非常少。2 0 0 2 年非人 灵长类孤雌胚胎干细胞建系后，越来越多的研究者开始注重p e s 的应用潜力研 前言 究，因此对于其分化和发育能力的研究获得了一些进展。 1 ) 基因印迹的影响 通过孤雌胚胎的发育潜能研究，得出的结论是基因印迹影响了其发育， k a g u y a 的出生也进一步证明了正常的基因组印记状态对哺乳动物发育的重要 性，可以说印记基因的表达是否正常与动物个体发育状态是直接相关的。从体细 胞克隆实验上看，小鼠克隆胚胎囊胚期的o c t 4 表达及其分布发生异常，另外克 隆胚胎的d n a 甲基化异常，基因印迹不能重新恢复到正常受精胚胎的水平。目 前已经证实，经体细胞克隆而产生的囊胚存在比较严重的表观遗传重编程 ( e p i g e n e t i er e p r o g r a m m i n g ) 缺1 驺 4 0 1 ，从而使得体细胞克隆的囊胚形成率较低，克 隆动物成功率以及克隆e s 细胞建系率也相当低。这种异常一方面会影响克隆胚 胎的进一步发育，另一方面从这种异常囊胚内细胞团分离的e s 细胞也必然存在 缺陷。这些情况显示，相对于体细胞基因组的克隆发育，来源于生殖细胞基因组 的孤雌生殖发育有利于胚胎发育的基因表达与调控。有关胚胎发育各时期h 1 9 和i g f 2 表达分析的研究结果表明，在发育过程中他们的印迹状况会发生改变， 而且呈现出组织特异性的表达模式，这不仅说明印迹基因参与了胚胎发育的重要 过程，而且说明基因印迹模式在体内正常发育过程中不是一成不变的，而是呈现 复杂的表达状况。 那么，孤雌胚胎干细胞与孤雌胚胎的分化发育能力是否一样呢? 胚胎干细胞 是来源于囊胚i c m 的原始未分化细胞，被认为具有和i c m 相同的发育能力，因 此常用来体外模拟胚胎在体内的分化发育模式。研究者发现此时无论是诱导其进 入分化状态或者维持其未分化状态而进行传代过程中，基因印迹表达状况都与体 内状况存在差异。例如孤雌和孤雄胚胎干细胞体外传代早期时，部分印迹基因的 表达在这两类细胞有相同的印迹模式，而不是维持其来源细胞的母系或父系印迹 的模式 4 1 1 。也就是说这些细胞从孤雌或孤雄囊胚取出后，在体外传代的早期， 基因印迹就发生了改变，已经与体内的模式不一样。而p e s 体外分化成拟胚体 时，印迹基因表达及其甲基化状况的研究也证实，分化后的细胞并不是维持其母 系来源的印迹状况，而会发生变化。这可能与分化过程中某些因子对这些基因的 重编程有关 4 2 ，4 3 。研究正常胚胎干细胞体外培养时的印迹状况时同样发现， 由于体外传代，酶消化，冻存等影响，印迹基因尤其是与发育相关的印迹基因是 不稳定的 4 4 1 。这种印迹改变在猴和人的胚胎干细胞中都已得到证实【4 5 ，4 6 1 ，而 中山大学博士学位论文新的小鼠孤雌胚胎多能性干细胞的分离和鉴定研究 陈志胜 对于不同的人e s 细胞系，在不同来源和方法建系的各细胞株表观基因状况并不 一样，但有些印迹基因是很稳定的，而h 1 9 、i g f 2 和m e g 3 等与生长发育密切相 关的基因则对体外培养条件很敏感【4 7 】。 以小鼠孤雌胚胎干细胞为核供体进行核移植，并再次分离得到的孤雌胚胎干 细胞发育为脑组织的潜能在新生小鼠上得到显著的提高，说明核移植对其基因组 重编程后，p e s 的发育能力有所提高，但在其他脏器则没有多大的改变【4 8 】，这 说明核移植的重编程过程很可能改变孤雌胚胎干细胞的印迹基因表达，从而有利 于其分化发育。n i w a 采用以孤雌与正常胚胎融合所构建的嵌合体胎鼠中的未成 熟卵子的细胞核，进行核移植后，发现所得的克隆小鼠具有完全发育至出生的能 力，再次证明孤雌核具有发育的全能。| 生 4 9 1 。2 0 0 7 年，e c k a r d t 报道将嵌合体胎 鼠中的孤雌胚胎干细胞来源的肝细胞分离后，移植到肝损伤后的受体小鼠，可重 构成能长期增殖的并具有多潜能性的造血系统【5 0 】。这说明有功能的造血干细胞 是由孤雌胚胎干细胞独立分化而来的而不是在嵌合体中由正常细胞辅助发育而 来。这一点对孤雌干细胞在组织工程移植中的作用尤其具有实践意义。由此也可 看出，孤雌胚胎干细胞带有的母系印迹，即使对哺乳动物的整个胚胎发育完成有 影响，但一旦器官建成，孤雌胚胎干细胞在分化形成成体各组织的能力上与正常 胚胎干细胞是相等的，因此也就具有更大的应用价值。 综上所述，孤雌胚胎干细胞与孤雌胚胎相比经历了体外建系和培养传代过 程，不可避免的发生了印迹的改变，造成其发育潜能的改变。因此，进一步探讨 p e s 中印迹基因的改变方向与其多能性的关系就格外重要。2 0 0 8 年，在孤雌胚 胎干细胞嵌合体( p g e sc h i m e r a ) 和孤雌胚胎嵌合体( p gc h i m e r a ) q b 对孤雌来源细 胞的印迹基因表达比较中发现，在体细胞中，p e s 细胞的母系印迹在有些嵌合体 中丢失了，而p g 细胞的母系印迹几乎全部保留下来，但是在生殖细胞中这两类 来源的细胞都建立了正确的基因组印迹，说明生殖细胞形成过程中对基因组的重 编程不管其来源细胞的印迹如何都会重建新的正确印迹模式。同时也证明了p e s 虽然来源于p g 胚胎但其印迹模式与后者不一样，且能够在随后形成嵌合体的体 内分化发育过程中进一步纠正其母系印迹，从而对细胞发育潜能发生有利影响， 这也是p g e sc h i m e r a 的发育能力好于p gc h i m e r a 的原因之- - 5 l 】。 2 ) 其他影响因素 前言 孤雌囊胚是由卵子体外激活发育而来的，因此其培养条件和激活方法必然对 孤雌囊胚中的细胞状况产生影响，从而影响由此建系的孤雌胚胎干细胞的分化发 育潜能。早期( 1 9 9 5 年以前) 用于孤雌胚胎干细胞建系的囊胚都是由乙醇或电 激活后产生的孤雌囊胚，这些激活方法对孤雌胚胎的着床前发育阶段的影响已有 若干报道，但其对囊胚i c m 和t e 的细胞数量、遗传特性以及发育潜能的影响则 研究甚少。 对受精激活的卵细胞内的生物化学变化的相关研究表明，卵子的充分激活和 正常分裂发育需要有节律的c a ”振荡的发生 5 2 5 4 】。用电脉冲刺激兔卵母细胞可 得到孤雌胚胎，且随着电刺激强度的增加，卵母细胞的激活率明显上升。但是单 个电脉冲会导致染色体分解，出现核和染色体构建不正常，特别是产生非整倍体， 从而影响孤雌胚的进一步发育 5 5 ，5 6 】。乙醇可改变卵母细胞膜的稳定性，使钙 库的c a 2 + 释放出来并增加细胞p h c a 2 + 的内流。7 - 8 乙醇能够成功激活小鼠卵母细 胞，而且激活率较理想。分析激活时卵母细胞内部生化变化时可观察到细胞内出 现c a 2 + 浓度规律性升高，但胞内c a 2 + 脉冲升高的次数却与正常受精激活不完全一 致，虽波形相似，但幅度大、持续时间长。由此可见这两种激活方法产生的卵细 胞内生化改变尤其是c a 2 + 振荡的效果并不与精子激活效果完全一样。这些激活方 法还容易产生单倍体孤雌胚胎 5 7 】。另外，通过研究c a 2 + 载体激活小鼠卵母细胞 的电生理，发现经过钙离子载体a 2 3 1 8 7 处理的小鼠卵母细胞的细胞膜内电位增 高，膜发生超极化反应，从而促发卵母细胞激活，且研究表明老龄卵母细胞的激 活效率优于幼龄卵母细胞。这种方法也可有效激活人类卵子，成为人类卵子激活 的首选方法。但小鼠和人类卵子激活的细胞内生化反应是不一样的，用到的方法 也就不一样，因此很少用这种方法激活小鼠卵子。 s p 可进入钙库置换c a 2 + ，释出内质网中的c a 2 + ，使胞质内c a 2 + 浓度升高，进 而介导了依赖c a 2 + 的皮质反应，导致卵母细胞激活。s r c l 2 处理引起的c a 2 + 脉冲较 上述刺激方法引起的脉冲频率低、幅度小、持续时间长，能较好的模拟精子激活 时卵细胞内的c a 2 + 离子振荡变化。因此对于小鼠来说，s r c l 2 是一种更加有效的激 活方式，优于乙醇激活和电激活。研究