（细胞生物学专业论文）人溶菌酶转基因山羊中抗性基因删除的研究.pdf

独创声明 本人声明所里交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得 ( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材 料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文作者签名：辞士矗 导师签字：捌 01 7 。v 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂燕有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅 本人授权! 坠可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 学位做作者签名：唧盎 签字日期：2 0 0 7 年5 月1 7 日 聊繇雩乏 签字日期：2 0 0 7 年5 月呷日 山东师筢大学砸士学位论文 人溶菌酶转基因山羊中抗性基因删除的研究 摘要 转基因动物是通过遗传工程手段对动物基因组的结构或组成进行人为的改 造，并使改造后的基因在世代问可以传递和表达的动物。大部分转基因动物制备 过程中不可避免的会使用来源于病毒或细菌的抗牲基因，这些序列对目的基因的 表达、受体动物以及转基因生物的安全等带来复杂的负面影响。为消除这些不利 因素，本文以整合有n z p n 日r t 卜j 删框架( l n i 【l ) 的转基因山羊耳成纤维细 胞( g o a te a rf i b r o b l a s t ，g e f ) 为研究对象，探索了通过c r e o x p 系统删除 抗性基因的可行性，建立一套安全、高效的删除转基因山羊体内外源冗余序列的 技术体系。 首先，我们分离了乳汁内表达人溶菌酶的转基因山羊g e f ( g e f b l g 1 和 g e f - b l g - 2 ) ，纲胞大小、形态等未发现异常，抗性基因保留完整。通过电转和脂 质体两种转染方法发现，p b s l 8 5 质粒在g e f 内的瞬间表达c r e 重组酶能够引发 l n k l 的删除但效率仅为0 8 ，在挑取的5 1 5 个克隆中，最后经p c r 鉴定为抗性 基因删除的细胞克隆只有4 个。更重要的是所挑克隆，细胞老化严重，无法用于 后续核移植以制备转基因山羊。 随后，本文探索了通过蛋白转导c r e 重组酶的方法删除抗性基因的可能性。 包含有p e t - c r e 质粒的大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) ，经0 i m , li p t g3 7 c 诱导3 h 后， 表达了c r i ! t m ，最高约占菌体总蛋白的4 8 。龋。根据c r e 重纽酶的p i 瞧约为1 0 。3 的特性，我们通过s ps e p h a r o s e “和s o u r c e1 5 s 两步阳离子交换色谱纯化出 c r e t m ， s d s - p a g e 为单一条带。纯化的c r e ”经进一步缓冲液替换后进行体外活 性测定，结果表明该蛋白能够有效将线形的p l n k l 内的同向l o x p 位点间隔的序 列切除。 将纯化的c r e ”与g e f - b l g - 2 体外共同孵育，以介导g e f - b l c - - 2 内d n a 重组， 删除l n k l 序列。2l imc r e a 处理细胞，通过培养，挑克隆，6 4 1 8 敏感性实验， p c r 鉴定以及s o u t h e r n - b l o t 鉴定。最终获得抗性基因删除的且保留了人溶菌酶 基因表达框架的单细胞克隆。抗性基因删除效率为4 2 另外，所得细胞克隆在 增殖速度、形态、大小等方面，均与未处理细胞无明显差异。 山东师范大学硕士学位论文 最后，为评估c r e ”的处理是否会影响体细胞克隆重构胚的发育潜能，我们 将所得细胞进行体细胞核移植研究。研究发现，在融合率( 0 8 8 ) 、回收包埋卵 率( 0 。7 8 ) 以及囊胚发育率( 0 3 0 ) 等方面，c r e ”处理过的细胞均不低于未处 理组( 分别为0 6 4 0 5 2 ，0 0 9 ) 。 综上所述，我们已经建立了一套可安全、高效的删除转基因山羊体内抗性基 因的技术体系，即利用c r e l o x p 系统，通过蛋白转导的方法在体外删除细胞基 园组内同向 o x p 位点间的间隔序歹 f ，随后经体细胞克隆获得成活的动物。该方 法的特点是删除效率高、适用细胞类型广、操作简单且不影响体细胞克隆的效率。 目前，船无此类相关研究报道。 关键词：抗性基因，c r e l o x p 系统，e r e ”，蛋白转导 2 山末师范大学硕士学位论文 d e i e t i o no ft h ea e i e c t a b i ed r u g - r e s i s t a n tg e n ei n t r a n s g e n icg o a t se x p r e s sin gh u m a niy s o z y m e a b s t r a c t t r a n s g e n i ca n i m a l sa r et h o s et h a th a v eb e e ng e n e t i c a l l ym o d i f i e da n d c a nt r a n s f e rt h ee x o g e n o u sg e n e st ot h e i r o f f e ；p r i n g s e l e c t a b l e d r u g - r e s i s t a n tg e n e sa r eo f t e nu s e dd u r i n gt h ep r o d u c t i o no ft h e s ea n i m a l s t h e s es e q u e n c e su s u a l l yd e r i v ef r o mt h ev i r u so rb a c t e r i a t h e yc o u l db e h a r m f u lf o rt h ea n i m a lh e a l t ha n dr e d u c et h ee x p r e s s i o nl e v e lo ft h e t r a n s g e n e s i nt h i sp a p e r ，w ee x p l o r et h ef e a s i b i l i t yo fd e l e t i n g s e l e c t a b l eg e n e sb yc r e l o x ps y s t e mi ng o a te a rf i b r o b l a s t s ( g e f ) i n t e g r a t e dw i t h o x p - n e o - t k - l o x p ( i 埘k 1 , ) c a s s e t t e f i r s t w ec u l t u r eg e f _ b l g - 一1a n dg e f b l g _ 2i nv i t r o t h e s ec e l l s a r ei s o l a t e df r o mt h et r a n s g e n i cg o a t se x p r e s s i n gr e c o m b i n a n th u m a n l y s o z y m e ( r h l y z ) t h es e l e c t a b l eg e n e sc o u l db ed e l e t e db yt r a n s i e n t e x p r e s s i o no fc r er e c o m b i n a s ei nt h e s ec e l l s , b u tt h ee f f i c i e n c yi s r e l a t i v e l yl o w o n l y4c e l lc l o n e sw e r ef o u n dt oc o n t a i nn o 帆c a s s e t t e i n5 1 5c e l lc l o n e sa n a l y z e db yp c r i na d d i t i o n ，a l lt h ef o u rc e l lc l o n e s w e r es e n e s e e da n dc o u l dn o tb eu s e df o ra n i m a lc l o n i n g t h e n ，w ee x p l o r et h ep o s s i b i l i t yo fd e l e t i n gs e l e c t a b l eg e n e sb y p r o t e i nt r a n s d u c t i o n b l 2 i ( d e 3 ) t r a n s f o r m e dw i t ht h ep 耵- o r ev e c t o ri s c u l t u r e di n3 7 f o r3 ha n di n d u c e db ya d d i n gl m mi p t g c r e a p r o t e i nw a s h i g h l ye x p r e s s e da n dc o u l dc o n t a i n4 8 6 o ft h et o t a lp r o t e i n s c r p r o t e i n sw e r ep u r i f i e db yc h r o m a t o g r a p h yu s i n gx k - 1 6 一s ps e p h a r o s e m f o l l o w e db y 【- 2 6s o u r c e1 5 s t i ep u r i f i e dc r e f u s i o np r o t e i n sh a v e b i o l o g i c a la c t i v i t yb yi nv i t r ot e s ta s s a y c r e ”f u s i o np r o t e i n sw e r ei n t r o d u c e di n t og e f _ b l g - 一lo rg e f - b l g 一2c e l l sb ya d d i n gt h e md i r e c t l yi n t ot h ec u l t u r em e d i u n la f t e rs e v e r a l 山东师范大学确士学位论文 d a y s ，t h ec e l lc o l o n i e sw e r ei s o l a t e da n da n a l y z e d g 4 1 8s e n s i t i v e e x p e r i m e n t p c ra m p l i f i c a t i o na n ds o u t h e r n - b l o t t i n g w es u c c e s s f u l l y o b t a i ns e v e r a lc e l lc l o n e st h a tc o n t a i n e dl y s o z y m eg e n eb u tn os e l e c t a b l e g e n e s t h er a t eo ft h ed e l e t i o ni s 4 2 i na d d i t i o n ，t h ec e l l sd i dn o t s h o wa n ys i g n so fs e n e s c e n c ea n dt h e i rs h a p ei sn o r m a l t h e s ec e l lc l o n e sw e r eu s e di nn u c l e a rt r a n s f e ra n dt h eb l a s t u l a d e v e l o p m e n tr a t ao ft h e s ec e l l si s0 3 0 。w h i c hi ss i m i l a rt ot h er a t eo f g e f - b l g _ 一2c e l l s ( 0 0 9 ) i nc o n c l u s i o n ，w ee s t a b l i s has a f ea n de f f e c t i v es y s t e mw h i c hc a n d e l e t et h es e l e e t a b l ed r u g - r e s i s t a n tg e n ei nt r a n s g e n i eg o a t s c r e l o x p s y s t e mb yp r o t e i nt r a n s d u c t i o nc a nb eu s e dt oe f f e c t i v e l yd e l e t et h e d n a s e q u e n c ef l a n k e db yl o x p i nt r a n s g e n i ca n i m a l t h ec h a r a c t e r i s t i co ft h e m e t h o di se f f i c i e n t ，e a s yt oh a n d l e ，a n dc a nb eu s e di n 跏yd i f f e r e n t c e l l s u pt od a t e ，t h e r ei sn os i m i l a rr e p o r t k e yw o r d s ：s e l e e t a b l ed r u g - r e s i s t a n tg e n e ，c r e l o x p s y s t e m ，c r e t “，p r o t e i n t r a n s d u c t i o n 4 山东师范大学磺士学位论文 缩略词 g o a te b , rf i b r o b l a s t 山羊耳成纤维细胞) r e c o m b i n a n t - h u m a nl y s o z y m e ( 重组人溶菌酶) g e n e t i c i n ( 一种氨基糖苷类抗生素) g l a s g o wm i n i m u me s s e n t i a lm e d i u m ( 高糖基础培养基) f e t a lb o v i n es e r u m ( 小牛血清) b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ( 成纤维细胞生长园子) l e u - - k e m l ai n h i b i t o rf a c t o r ( 小鼠白血病抑制园子) d i m e t h y ls u l p h o x i d e ( = 甲基亚砜) l - g l u t a m i n e ( 乙- 谷氨酰胺) e t h l e n ed i a m i n et e t r a c e t i ca c i d ( 乙二胺四乙酸) i s o p r o p y l t h i o - b - i ) - g a l a c t o s i d e ( 异丙基硫代一b - d - 半乳糖苷) n e o m y c i n - r e s i s t a n c eg e n e ( 新霉素抗性基因) g e n e t i c i n ( 氨基糖苷类抗生素) 0 p t i c a ld e n s i t y ( 光密度值) s t a n ds a l i n ec i t r a t e ( 标准柠檬酸盐缓冲液) 5 - b r o m o - 4 一c h l o r o - 3 一i n d o l y l b d - g l a c t o s i d e ( 5 一溴一4 一氯一3 一 吲哚一口d _ 半乳糖苷) t a t 与c r e 的融合蛋白 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( 聚合酶链式反应) t r i s ( b y d r o x y m e t h y l ) a m i n om e f h a n e ( 三( 羟甲基) 氨基甲烷) y 8 m f f o 1 a g 8 a ” s 时州岫l童啉啦i宝h鲫m 脚 吼跚 h 琶| 眦m 山东师范大学硕士学位论文 文献综述 转基因动物及安全 转基因动物是在1 9 8 1 年由g o r d o n 和r u d d l e “定义，指基因组中稳定地整合 有外源基因( 或特定的d n a 片段) 的动物。自人类首次用转基因方法得到超级小鼠 嘲盾，动物转基因技术引起普遍关注并得到飞速发展，特别是以转基因动物生产 重组蛋白的乳腺生物反应器，己经由设想变为现实。随着产业化进程的加快，转 基因动物安全问题备受关注，国内国外都对此展开了一系列研究并制定了相关法 规政策。7 。转基因动物的研究及产业化正向着健康的方向蓬勃发展。 ( 一) 转基因动物研究历史 动物转基因技术是通过遗传工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人 为的改造，有目的地对生物的遗传物质基础进行修饰，并通过相应的动物育种技 术使得这些经修饰改造后的基因在世代间得以传递和表达。转基因动物制备的常 规方法一显微注射，早在1 9 6 6 年就已出现，世界上第一只转基因小鼠的诞 生却在1 5 年后。1 9 7 7 年，g o r d o n 首先用微注射的方法将m r n a 和d n a 注射到非 洲爪蟾胚胎，发现被注射入的核酸具有生物学功能。1 9 8 1 年，g o r d o n 等5 个研 究组相继报道获得了转基因小鼠；1 9 8 2 年，p a l m i t e rr d 等人把大鼠生长激 素基因导入小鼠受精卵获得了“超级小鼠”。，世界各国的科学家对转基因动物 产生了极大的兴趣。 迄今为止，已获得牛、山羊、绵羊、猪以及兔等种类的转基因动物，转基因 动物乳腺中高效表达的( 高于i m g m 1 ) 有活性的蛋自达2 0 种以上，其中至少有 1 0 种已开始进入临床试验，如人c 1 抑制因子( h u m a nc li n h i b i t o r ) 、组织型 纤溶酶原激活剂( t p a ) 等4 。更引人瞩目的是美国g t c 生物医药公司在转基因 山羊乳汁中表达的抗凝血酶i i i ( a n t i t h r o m b i n1 1 1 ，a t r y n ) 已经完成临床 研究，于2 0 0 b 年由欧洲医药评估局( e u r o p e a nm e d i c i n e se v a l u a t i o na g e n c y ) 批准上市。 分子生物学，胚胎学，细胞生物学等基础理论的不断发展以及新的研究手段 的出现，极大拓宽了转基因动物研究领域。转基因动物研究内容和研究方法不断 6 山东师范大学硕士学位论文 丰富和完善，使转基因技术逐渐显示出巨大的经济效益和社会效益。毫无疑问， 转基因动物正在改变农业、医学、生物制药甚至整个生命科学的研究和发展面貌。 ( 二) 转基因动物的制作方法 转基因动物的制作方法目前主要有显微注射法、逆转录病毒法、精子载体法、 体细胞核移植法、e s 细胞法等 1 显微注射 显微注射技术是利用显微操作装置和显微注射仪将外源基因直接注入动物 受精卵原核中，使外源基因随机整合到宿主动物基因组，再通过胚胎移植技术将 整合有外源基因的胚胎移植到受体的子宫内继续发育，进而得到转基因动物。 迄今利用显微注射技术已获得多种转基因动物，该方法的主要优点有；( 1 ) 外源基因整合效率较高；( 2 ) 外源基因长度和种类不受限制，长度可达l o o k b = c 3 ) 转入的外源基因稳定性好，可以代代相传。存在的主要问题有：( 1 ) 整合 的外源基因具有明显的位置效应；( 2 ) 容易剪断大片段d n a ，常导致插入位点附 近宿主d n a 片段缺失，重组等突变，造成动物严重的生理缺陷：( 3 ) 费用高，需 要昂贵精密的设备，显微注射操作复杂，需专门技术人员。 2 逆转录病毒 一逆转录病毒介导的转基因技术是先将目的基因替换病毒基因组的反式元件， 然后将其直接注射到胚胎或卵母细胞，或者给培养的动物细胞接毒，以使病毒感 染胚胎或卵母细胞，通过顺式元件的调控序列和感染成份，实现转基因过程。 该方法的主要优点有：外源基因的整合效率较高，几乎达蓟1 0 0 ，可是其 缺点也有根多：( 1 ) 外源基因整合多为单拷贝；( 2 ) 需要一个额外的步骤来制作 逆转录病毒，过程繁琐；( 3 ) 外源基因长度受限制，长度需小于1 5 k b ( 4 ) 嵌 合体的几率比较高；( 5 ) 同时转入的逆转录病毒序列干扰外源基因表达o o 3 精子载体 动物槽子作为外源d n a 载体是转基因的主要方法之一，外源d n a 可与糟子膜 上3 0 - 3 5 k d a 蛋白质特异结合，结合强度受精子膜上m h c i i 因子的调节，利用脂质 体法、电穿孔法、共孵育等方法提高精子细胞质膜通透性，使目的基因进入精于 胞质，最终获得转基因动物。 。 该方法的优点在于简单易行，对大量的精子细胞进行处理，不损伤卵母细胞， 山东师范大学硕士掌位论文 在短时间内生产转基因胚胎，缺点是并非所有外源d n a 都整合到宿主的基因组 中，有的则以附加体的形式存在于染色体之外，丢失的机率很高。 4 体细胞核移植 体细胞核移植技术成熟的标志是1 9 9 7 年，英国克隆绵羊“多莉”的出生”， 其原理为：把外源目的基因导入培养的体细胞中，体外培养条件下对整合外源基 因的体细胞进行大量扩增和筛选，外源基因的整合分析，然后将确定整合外源基 因的体细胞移植到去核母细胞内。出生的动物在理论上应该全部为阳性转基因动 物，而且外源基因的表达稳定。 体细胞核移植技术可以在转基因动物出生前就明确其必然是整合外源基因 的，大大减少了实验动物的数藿并且在大家畜转基因动物研制上具有优势，但是 其缺点也是显而易见的：( 1 ) 基因随机整合带来的基因表达位置效应，体细胞同 源打靶效率低以及很多位点至今无法证明是否能够整合外源基因。( 2 ) 克隆技术 的效率有待提高，现已经可以克隆许多动物，但是每获得一头克隆动物都需要大 量的时间和金钱，并且克隆技术并不普及“”。 5 胚胎干缅胞 胚胎干细胞，具有“发育全能性”，是一类具有自我复制和多向分化潜能的 细胞。胚胎干细胞技术支持的基因转移主要是指通过同源重组技术将外源基因定 点整合于细胞基因组内，体外培养条件下对整合外源基因的胚胎千细胞进行大量 扩增和筛选，外源基因的整合分析，确定整合外源基因的胚胎细胞移植入动物囊 艇中获得嵌合体小鼠，最终通过繁殖获得纯合的整合有外源基因的转基因动物。 利用这种方法可以获得基因敲入和基因敲除的转基因动物，而且采用同源重组的 打靶策略，可以对转基因动物的基因组进行精细调控。条件性同源重组等技术的 出现丰富了利用胚胎干细胞获得的转基因动物的种类，其广泛应用于疾病模型的 建立以及基因功能的研究等方面。现在已获得胚胎干细胞种类有限，这项技术的 应用仍然局限于小鼠，一大遗憾“。 除以上介绍的方法外，转基因动物还可以通过p g c s ，r n a 干扰等方法制备。 这些方法丰富了转基因动物的制各技术。 ( - - ) 转基因动物的应用 转基因动物的应用主要有以下几个方面；利用转基因动物生产药品、保健品 8 山东师蓖大学硕士学位论文 等，作为人类疾病的研究模型，生产人源化免疫球蛋白，做为人类器官移植的供 体其中现已知的转基因动物生产的医药产品已有4 5 种，批准上市的有抗血酶 i i i ( h n t i t h r o m b i ni i i ，a t r y n o ) ，处于临床三期的有c 1 抑制剂( c li n h i b i t o r ) ； 已有的动物模型以基因敲除为最多，其次为基因过量表达“。 ( 四) 转基因动物安全 转基因动物及其产品在2 1 世纪必将形成巨大的产业，带来无限的商机，影 响到人类社会生活的每个方面，极大地造福于人类社会。随着转基因动物产业化 进程的加快，转基因动物安全问题却各受争议。目前已发生的转基因生物的安全 事件主要有：1 9 9 6 年的巴西豆过敏事件；1 9 9 8 年苏格兰r o w e t t 研究所发现转 基因豆导致了大鼠好器官生长异常、免疫系统遭到破坏o ”；1 9 9 9 年康乃尔大 学一个研究组报道，普累克西普斑蝶食用转基因玉米花粉后4 4 死亡，引起对 转基因作物是否会破坏生态环境的争论；2 0 0 0 年美国的星联( s t a r - l i n k ) 玉米 事件表明转基因生物的控制比较困难；2 0 0 1 年自然发表的一篇关于墨西哥 玉米遭到转基因玉米污染的事件“；2 0 0 2 年英国进行的转基因食品d n a 的人体 残留试验表明7 名切除大肠组织手术的志愿者的小肠肠道细菌里面检测到了外 源基因残留“；e l 本政府宣布己无标签销售克隆牛肉两年；印度1 9 9 8 年1 1 月焚 烧了婵o n s a n t o 公司的两块试验地，反对该公司的终止技术( t e r m i n a t o r t e c h n o l o g y ) ，即转基因作物将雄性不育，农民不能自已留种。 转基因生物发生的安全问题使得转基因动物安全也受到越来越多的关注，国 内国外都对转基因动物安全展开了一系列的研究并制定了相关法规政策。1 结合 农业部 农业转基因生物安全评价管理办法( 农业部令第8 号) 国务院农 业转基因生物安全管理条例( 国务院令第3 0 4 号) 以及卫生部转基因食品卫 生管理办法( 卫生部令第2 8 号) 等相关条令法规，我们将转基因动物安全分 为以下四个等级：安全等级i ：尚不存在危险；安全等级：具有低度危脸；安 全等级：具有中度危险：安全等级；具有高度危险。本文从以下五个方面讨 论转基因动物安全的问题：( 1 ) 受体动物的安全；( 2 ) 转基因构件的安全；( 3 ) 转基因动物的安全和福利；( 4 ) 转基因动物的环境安全；( 5 ) 转基因产品的安全。 1 受体动物的安全 受体动物是指提供配子或胚胎千细胞的供体动物及受体动物，例如转基因小 9 山东师范大学颈士学位论文 鼠的受体动物为不同品系的小鼠，转基因山羊中的受体动物为不同品系的山羊。 受体动物安全性评价主要是在转基因实验前需要分析受体动物的详细情况， 这其中需要调查研究的有：野生种还是驯养种；对人类健康和生态环境是否发生 过不利影响；有无变成有害动物的可能性；繁殖方式和繁殖能力；迁移方式和能 力：建群能力。包括受体动物的竞争性和侵占性行为对其在环境中建群能力的影 响，种群大小对繁殖和迁移能力的影响；对生态环境影响的可能性；受体动物病 原体的状况及其潜在影响；是否具有某种特殊的易于传染的病原；受体动物的遗 传变异；受体动物的监测方法和监控的可能性。 2 转基因构件的安全 转基因构件是指为了制各转基因动物中我们实验中通过各种不同的方法导 入受体动物中的d n a 或者r n a 序列，转基因构件的安全主要包括以下两个部分： ( 1 ) 转基因的目的性状 转基因的目的通常不外乎两种：敲入基因和敲除基因。敲入基因往往把新的 性状引入转基因动物中，人们在引入新的性状之时对该性状有确切的了解，其能 够产生经济价值或者造福于人类的农业工业生产，医疗医药产业，科学研究。但 是在实验过程中，并非所有的事情都能按照我们预期的方向发展。在转基因植物 的研究中人们发现引入的目的基因意外的对其他生物造成危害，破坏了自然界原 有的生态平衡。同样在转基因动物的研究中也应该警惕如此事件的笈生。目前尚 无转基因动物引入的目的基因危害其他生物的报道，但是我们应该看到随着转基 因动物的大规模应用于生产，类似转基因植物产业中发生的事件也会在转基因动 物中重演，所以这就要求研究人员在选择目的基因时一定要谨慎再谨慎，充分的 科学论证后开始研制，盲目转入目的基因改造生物性状不仅给个人更给我们社会 甚至世界带来危害。 敲除基因是通过转基因的方法将受体动物原有的基因组中的基因删除，除了 使用的转基因载体外并不引入新的性状，但是敲除目的基因后同样会改变生物体 原有的性状引起意想不到结果，同样应该慎重。 ( 2 ) 整合入转基因动物的构件 转基因的目的构件大致可分为三部分组成：抗性基因，目的基因和转基因载 体。 山东疖箍大学疆士学位论文 抗性基因 在大多数转基因动物的制备过程，需要转入目的基因的同时将抗性基因整合 入体细胞，胚胎干细胞等，再通过筛选药物对细胞进行筛选，得到整合有目的基 因的细胞，基因敲除的转基因动物的制各也是同样的道理。这些细胞最终成为转 基因动物，而抗性基因整合于转基因动物基因组内，伴随转基因动物一生。 抗性基因根据其筛选方式分为正筛选和负筛选，总结如表l “ 表i 抗性基因 注：ag a n c2g a s c y c l o v i r , f i h u - i ( i - 2 - d e o r - 2 - f l m ：o - 9 一i ) - a r a b i n o f t n a n c s y l ) 十i o d 1 1 1 l _ 2 一脱氧一2 一i - b - 9 - 阿拉信蚨璃) 母碱代尿嚏啶 抗性基因为了能够在随机整合或是同源重组时均表达，除本身序列外往往带 有启动子，常用的启动子序列有磷酸甘油激酶i 启动子，r n a 聚合酶n 启动子， 单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子等。 抗性基因本身并无直接毒性，任何d n a 都由4 种碱基组合而成目前所用 的抗性基因在d n a 组成上并无异常。几乎所有的生物都含有d n a ，作为食物转基 因动物体内所携带的抗性基因本身d n a 在肠胃道中很快被降解，不会对人类或其 他生物产生危害 抗性基因作为一种夕 源基因水平转移的可能性很小，几乎可以忽略。 抗性基因随机插入和同源重组后定点整合入受体动物基因组所带来的复杂 的生物学效应是值得重点讨论的。抗性基因插入基因组后容易导致相邻基因的失 活；抗性基因本身序列多来源于细菌或者病毒，带有强启动子。根据研究表 明这些强启动能要严重得干扰相邻基因的启动子的水平，有报道l o o k b 远处 1 l 山东师范大学硕士学位论文 的基因都可能受到其影响。抗性基因的表达产物于受体动物中也会造成多方面 效应：直接的毒性效应，过敏效应，因蛋白的催化功能而产生的副作用或产生对 人类及其他生物体有害的物质。有研究报道抗性基因的表达产物能够在宿主细胞 中引起免疫反应”，例如潮霉素磷酸转移酶b ( h p h ) 的产物曾发现日i 起t _ 细 胞应答反应。 另外抗性基因对于我们的目的基因的表达水平影响很大，有实验表明不含有 抗性基因的载体中目的蛋白的表达要高于舍有表基因的；并且如果抗性基因与且 的蛋白选取相近的启动子或者其蛋白性质相似，抗性基因的表达产物可能污染目 的蛋自，鉴于以上情况。抗性基因对转基因动物的安全等级，目的蛋白的表达水 平等影响很大，我们在转基因动物中谨慎选择使用抗性基因，或者使用后予以删 除。 目的基因 目的基医同抗性基因一样都是由4 种碱基组台面成，基因水平转移的可能 性很小，不会对人类产生危害。 转基因载体 除逆转录病毒载体介导的转基因外其他转基因方案中都可以在转基因前切 除转基因载体。逆转录病毒载体需要特别注意，其表达产物同抗性基因一样可能 对受体动物，转基因产品，人类以及其他生物造成危害，其危害可能在开始的时 候并不显著，但是随着时间以及动物的增加而显现，需要严格的测试。 3 转基因动物的安全和福利 按照转基因动物的安全等级把转基因动物分为四类。第一类动物对实验者和 环境没有危害；第二类生物有一定的危险，但引起的危险不严重，能够预防和治 愈；第三类生物是高度危险性的；第四类则是非常危险的。 操作一类动物没有危险，可以在普通设施内饲养。但是，它们必须被标识。 饲养条件必须能够杜绝转基因动物与其他动物发生不可控的繁殖。实验结束后， 必须杀掉转基因动物以确保不会扩繁。转基因动物的繁殖必须根据不同物种的习 性加以限制。实验用啮齿类动物可以使用传统设施。特殊的物种必须进行环境模 拟，以确定所需的特殊设施，防止发生任何转基因漂移的可能。为防止转基因动 物的逃逸，水生动物必须使用滤器和栅格。含有生殖细胞或幼小动物的水体和气 山东师范大学硕士学位论文 体在排放前必须添加适当的化学药物进行消毒。 二类转基因动物( 携带有温和病原体) 必须在有盖的笼子内饲养，笼子要有 个滤嚣以阻止微生物的扩散。笼子必须在安全橱柜内才能打开。所有生物材料 和废物( 包括动物) ，必须通过高压灭菌或其他方法进行灭活。 三类转基因动物必须饲养在一种带有负压系统的设施内，空气必须通过能够 捕获所有微生物和病毒的滤膜才能从实验室内排放入大气中。实验室和其他的建 筑设施间通过气闸分离。实验者必须穿着无污染的衣服进入气闸，离开实验室时 要洗澡。所有的生物材料必须在实验室中通过过渡槽进行高压灭菌。 四类转基因动物必须带手套，使用负压实验区域必须在一个类似操作三类 生物的实验室内。实验者必须穿戴可提供完全隔离和保护的特制服装。 关于转基因动物福利，人们更多的是担心可能会制造出怪物，使动物受痛苦。 有些人坚绝反对制各转基因动物，因为他们认为这是对自然法则的侵害。他们反 对利用转基因动物制各药物或甚至反对利用在转基因动物身上获得的知识去制 备药物。不过绝大多数人本质上并不反对制备转基因动物，他们可能只是担心动 物生理功能的修饰会导致它们遭受苦难 转基因引发动物受苦，首先反应在转基因过程。胚胎的收集和胚胎移植等都 意味着外科手术或者是屠杀动物其次，转基因胚胎死亡率高和错误构件的表达 很差等因素。 为减少这些问题。欧洲替代方法验证中心( e u r o p e a nc e n t r ef o rt h e v a l i d a t i o no fa l t e r n a t i v em e t h o d s ( e c v a u ) 推荐了“3 r 规则”，建议研究者 要减少动物用量、实验要精细、尽量采用替代物，如果有可能应优先选择体外实 验和细胞培养。实验动物包括转基因动物的可应用的替代方法清单正在增长 转基因动物制各时，可靠的基因构件会减少不正确表达的动物数量。另外， 大部份转基因动物不能够产生所希望的结果，或不能够满足研究者的需要。这时， 研究者往往不予发表，这可能会导致其他研究者又独自制作出相似的动物。转基 因动物可能不符合研究者本人的需要，但是对于其它的研究者来说可能是个宝贵 的工具。因此，更好的认知这些材料，甚至是阴性结果，将会减少制造出无用转 基因动物的数量1 。 为减少转基因动物的使用量，许多a 建议使用“否除非”规则( n ou n e s s 山东师范大学瑚士学位论史 p r i n c i p l e ) ，而有些人则建议使用。可i l ，但是”规则( y e sb u tp r i n c i p l e ) 。 前者是转基因被全面禁止，除非申请被聘准。后者指允许转基因，但是必须相当 节约使用。当然，这些规则还相当概要，不能够实质性的帮助实验者确定他们的 选择。为了明确这种形势，转基因动物今后可能会被分成三类。 第一类包括实验动物。它们是基础研究所必需的，不带有赢利目的。这种转 基因对动物福利的影响是不可预知的。因此，可限定每个实验中的可使用的动物 数量。这时比较容忍动物所受的追害 第二类动物可生产高价值产品，服务于人类。其典型就是乳腺制药动物和器 官移植和细胞移植用动物。这时，转基因的副作用是可知的。且可复制。这些动 物除用于服务人类外还是工厂高额利润的来源。这类动物的所受的苦难是否可 被接受要基于个案分析，综合考虑它们对人和动物的好处和缺点。 第三类动物可包括农用动物。转基因的副作用了解得非常清楚，可重复。这 些动物可用作人类的食物，但是非必须的。这类动物必须证明它们具有恰当的好 处，否则不能养殖。这时动物如果受折磨是不可接受的。 4 转基因动物环境释放的安全 目前还没有发生转基因动物被故意释放到环境中的事 孛，但是劳不保证在未 来不会发生。因为这已在转基因植物中发生过 家畜动物( 禽类、兔、猪和反刍类动物) 通常在限定区域内饲养，很少有机 会同野生动物接触，发生杂交的几率很低。因此，一般认为饲养转基园家畜不会 对环境产生巨大的威胁。但对水生转基因动物来说却相当复杂。大多数的水生动 物能够在野生水体中中逃逸、生存和繁殖。其中没有进行专门选择的水生动物还 能够同野生种进行杂交。因此，这些动物的转基因发生扩散的几率较高。 人们对水生动物的转基因扩散的危险进行了许多研究。将转生长激素的美国 鲶鱼放养在一个严格控制的池塘内，然后观察转基因鲶鱼和野生鲶鱼的发展情 况，结果转基因鲶鱼的生长滞后。这很出人意料，因为生长激素本来是可以加速 鱼生长的。一种可能的解释是：由于额外的生长激素过度刺激了鲶鱼的代谢，使 其食物需求量比野生动物可能增多。但是他们却无法获得比野生鲶鱼更多的食 物，导致撮食量不足。这个试验似乎说明：任何逃逸的这种转基因鱼到野生水体 后不对环境造成威胁。 1 4 山东师范大学硕士学位论文 但是，用转基因青缔所作的实验却得出了不同的结论。转基因青鲋体内额外 的生长激素后加速了它们的生长和性成熟，结果使其性成熟时间比野生型要早。 如果将这种转基因鱼放入野生水体后可能会产生一种渐进性入侵，引起野生物种 的渐进性的局部灭亡”。真实情况可能比模型更复杂。不过，这强烈反映出带有 生长激素的转基因鱼的扩散可能会对野生动物产生有害的和不可控制的影响。 上述试验虽然不精确，但却能证明：在目前条件下，转生长激素基因的鱼还 不能释放到环境中。另外值得注意的是，超过3 0 的鲑鱼会从饲养的笼子中逃逸 ，说明必须建立更合适的转基因鱼饲养条件。 现今的鱼类的养殖条件同野生型的生活环境很相近，野生鱼可以同养殖鱼类 杂交。为防止这一问题，在理论上有许多方法可防止。一种方法是通过对单细胞 胚胎的高压或热激处理使之改造成三倍体。三倍体动物可正常生长但不孕。不过， 这种处理并非完全有效，仍有不少动物保留了生殖能力。因此，这种方法不能够 用于防止转基因在野生水体中的扩散。另外一种方法是转基因法。已表明，在鲑 鱼中直接表达促性腺激素m l i n 的反义r n 可以抑制该激素的合成这种鱼只能 够通过额外的促性腺激素的处理才能繁殖，而且这种特征是可遗传的。这种方法 有可能控制转基因的扩散，但可行性还未得到完全证实。 采用隔离的湖泊或海湾饲养转基因鱼也是一种解决方法。但是这种方法的生 物安全性并不适合任何个案，目前也没有实际的可遵照执行的方案。另外一种方 法可参照在密闭容器中饲养鱼的做法，使用一些类似的设施和可自我更新的水 体。虽然这种方法非常昂贵，但有可能会解决转基因扩散的诸多问题，保护因野 生鱼生活的天然水体。 虽然现有的研究成果不足以解决水生动物的转基因扩散的问题，但我们相信 不久的将来会有更加完备的方法解决该问题。 5 转基因产品的安全 如同已经发生在转基因植物和微生物上的一样，转基因动物将不可避免的 被推荐用于人类消费品。不过，外源基因的整台通常是非定向的，可能会灭活或 激活内在的基因。另外，外源基因的产物可能是有毒性或致敏性的。这些都可能 改变原材料的营养特性或安全性，因此有必要对转基因动物进行毒性和致敏性测 定。 山东师箍大学硕士学位论文 现在对毒性的评估是相当可靠的。所用手段采用的是测定药物毒性的常规操 作。应当指出，如果转基因产生了有毒物质首先会影响动物本身，直接通过转基 因动物就能够容易的观察到。 但致敏性的评估却不同。动物对转基因产物会产生免疫耐受，通过动物自身 无法评价这种产物的致敏性。而且化合物的致敏性目前也不容易确定，特别是当 其致敏性很微弱或仅对少部分人群是过敏源时风险评估委员会采用了实质等同 原则，对转基因生物与非转基因个体间的整体组成进行对比，寻找差异。应当说 这种方法相当不准确，是很表观的。未来的d n a 和蛋白质芯片技术可能会揭示出 两者的差别。但是，这些检测手段要变为现实可能需要等待很长的时间。另外， 预测因转基因引起的差异将会带来的什么样的影响是很困难的。 全球现在最主流的转基因安全评价方法应该就是基于毒理和致敏性的测定。 这些检测是目前通用于各种转基因生物的较好方法。 转基因动物的一个独特的生物安全问题是转基因有可能提高了动物对特定 病原体的敏感性，这可能会影响转基因动物的养殖，并可能威胁人类。转基因导 致某种新动物病毒的出现可能开始时不容易发现，仅当这种病毒达到流行规模时 才引起人们注意。这并非耸人听闻，事实上很有可能发生。这个问题的最好的解 决方法可能是加强遗传饰变动物的可追溯性和标识管理制度。 目前，克隆家畜数量的增加也已引出了新问题。虽然在大多数情况下克隆动 物不被认为是遗传饰变动物，但是他们事实上是表观遗传饰变动物。这种表观遗 传的变化可能会通过类似转基因的方式改变动物的特性。许多国家不允许消费克 隆家畜的制品( 如，肉和奶等) ，而在其他国家却没有这种限制。因为相当数量 的克隆动物有健康问题，但这些问题不会遗传给后代，所以克隆动物的管理在今 后可能会出现一种折中的方法，即允许消费克隆个体的后代，但禁止消费克隆动 物本身。 总之，转基因动物的应用还处于发展阶段，不会轻易就被消费者所接受。且 前公众对生物技术的敌意可