（森林培育专业论文）栽培南方红豆杉紫杉醇分析提取与指纹图谱研究.pdf

摘要栽培南方红豆杉紫杉醇分析提取与指纹图谱研究硕士研究生杨宪指导老师杨水平副教授摘要- 、南方红豆杉( t a x u sc h i n e n s i sv s r m a i r e i ) ，又称美丽红豆杉，为裸子植物f - j ( g y m n o s p e r m a e )红豆杉科( t a x a c e a e ) 红豆杉属( t a x u s ) 植物。为红豆杉属植物中分布最广泛的一种，主要分布于长江流域、南岭山脉山区及河南、陕西、甘肃、台湾等省的山区或溪谷，它是亚热带常绿阔叶林、常绿落叶阔叶混交林的特征种，常与其他阔叶树、竹类以及针叶树混生，分布于海拔8 0 0 - 1 6 0 0 米，资源储量相对较红豆杉其它各种多。自1 9 7 1 年从红豆杉中分离出紫杉醇后，它已成为研究抗肿瘤天然药物的重点，南方红豆杉更成为我国紫杉醇药物生产的主要树种。南方红豆杉中紫杉醇含量甚微，其含量范围仅仅在0 0 0 3 - 0 0 0 8 之间，含有大量的植物腊、色素和树胶等杂质，特别是其中共存许多分子结构和理化性质与紫杉醇极其相近的紫杉烷系列化合物，而这些成分会严重干扰紫杉醇的反相高效液相色谱法( r p h p l c ) 测定。为了能准确测定紫杉醇含量，试验优选了r p h p l c 测定紫杉醇含量的色谱条件，即：用s h i m a d z uc 1 8 色谱柱( 2 5 0 m m x 4 6 m mi d ，5 t t m ) ；甲醇- 水一乙腈( 2 2 ：3 2 5 ：4 5 5 ) 为流动相，紫外检测波长为2 2 7 锄。紫杉醇对照品溶液浓度在o 0 0 0 4 3 7 6 m g m l 。1 0 0 0 4 3 7 6 m g m l 1 范围内，线性方程为：y = 2 1 5 2 9 6 8 1 0 7 x + 1 7 7 3 ( r - - 0 9 9 9 9 ) ( n = 5 ) ；相关系数r - - 0 9 9 9 9 ( n = 5 ) 时，与峰面积线性关系良好；通过检测限( 紫杉醇进样量为o 0 0 1 0 5 0 p g 时) 和定量限( 紫杉醇进样量为0 0 0 3 5 0 1p g 时) ，确定了紫杉醇对照品溶液最小浓度也符合i 心一h p l c 的检测要求。对南方红豆杉人工林材样品制备优化处理如下：将采集的南方红豆杉整株样品干燥，用6 倍量( w v ) 的乙醇浸提两次，合并提取液，减压浓缩至干；再用6 倍量( w ) 的二氯甲烷液液萃取三次，合并萃取液，减压浓缩至干，残渣加色谱甲醇溶解，制成南方红豆杉样品溶液；用加样回收方法考察了该方法的可行性。同时随机采集了1 0 批南方红豆杉药材样品，进一步验证了建立的r p - h p l c 检测紫杉醇含量方法的可行性，结果表明该方法快速、简便、可靠，重现性好，能作为人工种植南方红豆杉中紫杉醇含量检测方法。在对重庆市忠县的南方红豆杉人工林材各部位紫杉醇含量变化规律研究过程中，以紫杉l两商大学硕士学位论文曼曼量曼曼曼蔓曼曼曼! 曼岂曼曼曼! 蔓曼曼曼! ! 曼鼍曼葛曼曼曼曼曼曼曼曼曼曼ii i 曼皇曼! 曼曼曼曼皇皇! 蔓曼蔓曼曼! 曼! ! 曼曼置曼曼皇舅曼曼量皇! ! 曼鼍醇含量为指标，采用正交试验，通过4 因素5 水平交表( l 1 6 ( 4 5 ) ) ，对南方红豆杉影响因素年龄、季节( 以随机选取各季节的一个月份作为代表) 、不同部位3 因素进行了优选试验。结果表明：南方红豆杉中紫杉醇含量主要影响因素是年龄，其次是不同部位，采收季节对紫杉醇的含量影响也是显著的；通过多重比较，确定t 9 ( a 3 8 1 c 4 ) 效果最好，即在1 月份时采用6 年生人工种植南方红豆杉叶，为优化选出的紫杉醇最佳采集时机，再结合红豆杉生产实际情况，采集6 年生的枝叶作为紫杉醇的试验对象。干燥方法对南方红豆杉中紫杉醇含量的影响研究中，采用自然风干、减压干燥和微波干燥3 种干燥方法，综合各干燥方法中的不同干燥条件，试验结果表明：减压干燥宜选用6 0 c ；微波干燥低火；而自然风干和其它干燥方法可能造成紫杉醇显著降解，均不宜取。优化并建立红豆杉枝叶中紫杉醇的提取工艺，充分考虑了工业化生产的可行性。以使用r p h p l c 测定的紫杉醇含量为指标，采用正交试验法对提取过程中乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间4 因素进行优选试验。结果表明：从红豆杉中提取紫杉醇的最主要影响因素是乙醇浓度及乙醇用量，高浓度、适当多的用量有利于提取；提取时间和次数也极为重要；单因素效果分别以每次提取2 h 和共提取2 次为最佳。最终t 9 ( a 3 8 3 c 2 d 1 ) 和t s ( a 3 8 2 c l d 3 ) ，即采用8 倍量( w ) 9 5 乙醇提取2 次，每次提取2 小时，或采用6 倍量( w v ) 9 5 乙醇提取1 次，提取4 小时，均为优化选出的紫杉醇最佳提取工艺条件。在中药的开发过程中，色谱指纹图谱研究工作是国内中药现代化研究的热点之一，为中药材建立相应的指纹图谱是现阶段控制中药内在质量的有效手段。试验中共收集到人工种植南方红豆杉枝叶药材l l 批、研究过程中考察了色谱条件的优化，包括色谱柱、检测波长和流动相的优化选择；同时参照国家食品药品监督管理局对中药材指纹图谱的要求，对色谱条件进行了方法学验证，即仪器精密度试验、样品重复性和稳定性试验；在此基础上构建了色谱指纹图谱，包括：共有峰的标定、参照峰的选择、共有峰相对保留时间及积分相对比值的确定、非共有峰占总峰面积的百分比、共有峰的相似度计算，色谱条件的优化结果表明，选用c 】8 柱，检测波长为2 2 7 n m ，以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱，为最佳色谱条件。根据色谱条件的优化结果，对仪器精密度、样品重复性和稳定性进行试验，高效液相色谱测定结果中，共有峰相对保留时间和相对峰面积的r s d 都小于3 o ，表明采用高效液相色谱法进行色谱指纹图谱的研究是切实可行。通过色谱指纹图谱的构建，确定了1 7 个共有峰，以9 号峰作为参照峰；共有峰相对保留时间和相对峰面积的平均r s d 都小于2 0 ，说明试验结果可靠；共有峰面积百分比在4 1 8 - 3 ，符合指纹谱研究规定小于1 0 的检测要求；l i摘要采用相关系数法和夹角余弦法对共有峰的相似度进行了计算，两种计算方法结果全图谱相似度均芝9 3 ，表明所建立指纹图谱的技术指标稳定。选定的指纹图谱可对人工种植南方红豆杉枝叶药材组分群体特征的一致性作出可靠的判断。关键词：南方红豆杉；紫杉醇；反相高效液相色谱法；提取；高效液相色谱指纹图谱i i i两南火学硕十学位论文! l ，一i a bs t r a c tt h ep l a n to ft a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i ，w h ow a sa l s on a m e dt a x u sm a i r e i o r i g i n a t e df r o mg y m n o s p e r m a ea n dt a x a c e a ea n dt a x u s i ti sd i s t r i b u t e da so n eo ft h em o s tw i d ep l a n ti nt h et a x u s t a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e id i s t r i b u t e dm a i n l yi ny a n g t z er i v e rb a s i n ，n a n l i n gm o u n t a i n s ，h e n a np r o v i n c e ，s h a a n x ip r o v i n c e ，g a n s up r o v i n c ea n dt a i w a np r o v i n c ee t c i nm o u n t a i n so rv a l l e y a n di tw a st o oc h a r a c t e r i s t i cs p e c i e si ns u b t r o p i c a le v e r g r e e nb r o a d l e a v e df o r e s ta n de v e r g r e e na n dd e c i d u o u s b r o a d l e a v e dm i x e df o r e s t t a x u sc h i n e n s i sv a t m a i r e im i x e da n dg r e wi no t h e rb r o a d l e a v e dt r e e ，b a m b o oa n dc o n i f e r t a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e id i s t r i b u t e da t8 0 0 m - 1 6 0 0 ma l t i t u d e r e s o u r c e sr e s e r v e so ft a x u ac h i n e n s i sv a r m a i r e i w a sm o r et h a nt h eo t h e rs p e c i e s p a c l i t a x e lw a si s o l a t ef r o mt a x u si n19 71y e a ro l d i tb e c a m et h ee m p h a s i so na n t i t u m o rn a t i o n a ld r u g t a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e ib e c a m et h em a i nt r e es p e c i e sw h i c hc o n t a i n e dp a c l i t a x e l p a c l i t a x e lw a sv e r yl i t t l ei nt a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i t h ec o n t e n tr a n g eo fi t sw a s0 0 0 3 - 0 0 0 8 ，i ti n c l u d et h ei m p u r i t i e so fp l a n tr a p ，p i g m e n ta n db a l s a me t c e s p e c i a l l ym a n yt a x o i d sw e r es i m i l a rw i t hp a c l i t a x e li nm o l e c u l a rs t r u c t u r ea n dp h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e s 1 1 1 e yi sas e r i o u si n t e r f e r e n c et od e t e r m i n a t i o no fp a c l i t a x e lb yr e v e r s e d - p h a s eh i 【g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y i no r d e rt oa c c u r a t e l yd e t e r m i n et h ec o n t e n t so fp a c l i t a x e li nt a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i o p t i m i z a t i o no fc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw a sf o l l o w ：s h i m a d z uc l sc o l u m n( 2 5 0 m i n x 4 6 m mi d ，5 岬) ，u s i n gm e t h a n o l - w a t e r - a c e t o n i t r i l ea sm o b i l ep h a s e ( 2 2 ：3 2 5 ：4 5 5 )a n du l t r a v i o l e td e t e c t i o nw a v e l e n g t h2 2 7 n m l i n e a re q u a t i o no fp a c l i t a x e lw a sy = 2 15 2 9 6 8 10 7 x + 17 7 3 ( f o 9 9 9 9 ) ( n = 5 ) i tp r e s e n t e dag o o dl i n e a rr e l a t i o nw i t ht h ep e a ka r e ai nt h er a n g eo f0 0 0 0 4 3 7 6 m g m l d o 0 0 4 3 7 6 m g m l 。( n = 5 ) t h ed e t e c t i o nl i m i tf o rp a c l i t a x e lw a s0 0 0 1 0 5 0 g a n dt h el i m i to fq u a n t i f i c a t i o nw a s0 0 0 3 5 0 1 g r e s u l t ss h o wt h a tt h em i n i m u mc o n c e n t r a t i o no fp a c l i t a x e lc a nm e e tt h er e q u i r e m e n to fr p - h p l cd e t e r m i n a t i o n t h eo p t i m i z e dm e t h o dw a su s e dt oh a n d l et h es a m p l eo ft h et a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i w h i c hw a sp l a n t e di na r t i f i c i a ls y s t e m a f t e rt h ec o l l e c t e ds a m p l e so ft a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i w e r ed r i e d t h e yw e r ee x t r a c t e d2t i m e sw i t h6t i m e s ( w ) a m o u n to fe t h a n 0 1 t h e ne x t r a c ts o l u t i o nw a so b t a i n e da n dm e r g i n g a f t e ri tw a sc o n c e n t r a t e d t h e yw e r es o l v e n te x t r a c t i o n3t i m e sw i t h6t i m e s ( w v ) a m o u n to fd i c h l o r o m e t h a n e t h e ne x t r a c ts o l u t i o nw a sd i l u t e db ym e t h a n 0 1 t h em e t h o dw a sv e r i f i e db yr e c o v e r yr a t e a tt h es a m et i m e10b a t c h e ss a m p l e sw e r ed e t e r m i n e db yr p h p l c t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h i sm e t h o dw a sr a p i d ，s i m p l ea n dr e l i a b l e v a r i a t i o n a lr u l eo ft h ep a c l i t a x e lw h oe x i s t e di nd i f f e r e n tp a r t so ft a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i a r t i f i c i a l l yp l a n t e d p a c l i t a x e lw a sr e g a r d e da st h ep a r a m e t e ro fq u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o n b yu s i n gf o u rf a c t o r sf i v el e v e l so r t h o g o n a le x p e r i m e n t ( l16 ( 4 5 ) ) t h et e s to fa g e ，s e a s o n ( ar a n d o mi va b s t r a c tm o n t ho ff o u rs e a s o n sw a ss e l e c t e d ) a n dd i f f e r e n tp a r t sw e r eo p t i m i z e da n dc h o s e ni nt a x u 8c h i n e n s i sv a r m a i r e i t h er e s u l ts h o w e dt h a ta g ew a st h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r , d i f f e r e n tp a r t sw a ss e c o n d l yi m p o r t a n tf a c t o r , s e a s o n a li n f l u e n c ew a sa l s os i g n i f i c a n t ( p = 0 0 5 ) m u l t i p l ec o m p a r i s o ns h o w e dt h a tt 9 ( a 3 b i c 4 ) w a st h eb e s t w h e n6 一y e a r - o l dl e a v e so ft a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i 、 ，h i c hw e r ec o l l e c t e di nj a n u a r yw a st h eb e s tc h o i c e t oe v a l u a t et h ec o n t e n to fp a c l i t a x e li nt a m e sc h i n e n s i sv a r m a i r e ip r o c e s s e db yd i f f e r e n td r y i n gm e t h o d s n a t u r a ld r y i n g ，d e c o m p r e s s i o nd r y i n ga n dm i c r o w a v ed r y i n gw e r ea d o p t e d b yt h ec o m p r e h e n s i v es u r v e yo fd r y i n gm e t h o d sa n dv a r i o u sd r y i n gc o n d i t i o n t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts u i t a b l et e m p e r a t u r eo fd e c o m p r e s s i o nd r y i n gw a s6 0 c t h eb e s tc h o i c eo fm i c r o w a v ed r y i n gw a sl o wf i r e h o w e v e rt h eo b v i o u sd e g r a d a t i o no fp a c l i t a x e lw a sc a u s e db yt h eu s i n go fm e t h o do fn a t u r a ld r y i n g ，o rt h eo t h e rd r y i n gm e t h o d s t h e ys h o u l dn o tb es e l e c t e d t oo p t i m i z ea n de s t a b l i s ht h ee x t r a c t i v et e c h n o l o g yo fp a c l i t a x e lf r o mt a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i m e t h o d sr p h p l cw a sa p p l i e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to f p a c l i t a x e l t h eo r t h o g o n a lt e s tw a sa d o p t e dt oe x a m i n et h ee f f e c t so ft h e4f a c t o r sc o n s i s t i n go fe t h a n o lc o n c e n t r a t i o n , e t h a n o lv o l u m e ，e x t r a c t i v et i m e sa n de x t r a c t i v et i m e r e s u l t se t h a n o lc o n c e n t r a t i o na n de t h a n o lv o l u m ew e r ee s s e n t i a lf a c t o r si n f l u e n c i n gt h ee x t r a c t i o no fp a c l i t a x e l h i 。曲c o n c e n t r a t i o na n da m o u n to fe t h a n o lf a c i l i t a t e dt h ee x t r a c t i o n 。e x t r a c t i v et i m e sa n de x t r a c t i v et i m ew e r ea l s oi m p o r t a n t b ys i n g l e2f a c t o r i a le f f e c t ，2ha n d2t i m e si ne a c he x t r a c t i o no f t a x o l w e r et h eb e s t c o n c l u s i o nt h eo p t i m u me x t r a c t i v ec o n d i t i o ni st 9 ( a a b a c 2 d i ) a n dt s ( a 3 8 2c i d 3 ) d u r i n gt h ed e v e l o p m e n tt h et r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e t h er e s e a r c ho fc h r o m a t o g r a p h i cf i n g e r p r i n ti so n eo ft h eh o ts p o t so ft h et r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n em o d e r n i z a t i o n i nt h ep r o c e s so ft e s t 1 1b a t c h e sa r t i f i c i a lp l a n t i n go ft a x u se h i n e n s i sv a r m a i r e iw a sc o l l e c t e d ，s t u d i e dt h ec h r o m a t o g r a p h yc o n d i t i o no p t i m i z i n gi n c l u d e dc o l u m n ，d e t e c t i o nw a v e l e n g t ha n dm o b i l ep h a s e a n dv e r i f i e dt h em e t h o d o l o g yo fc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n ss u c ha si n s t r u m e n tp r e c i s i o n ,r e p e a t a b i l i t ya n ds t a b i l i t y a tt h eb a s i s ，c o n s t r u c t e dc h r o m a t o g r a p h i cf i n g e r p r i n t , i n c l u d i n gc a l i b r a t i o no fc o m m o np e a k ，s e l e c t i o no fs t a n d a r dp e a k , d e t e r m i n a t i o no ft h er e l a t i v er e t e n t i o nt i m ea sw e l la st h a to ft h er e l a t i v ep e a ka r e a t h eo p t i m i z e dc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n ss h o w e dt h a ts h i m a d z uc l zc o l u m n ( 2 5 0 m m x 4 6 m mi d ，5 r t r n ) ，u l t r a v i o l e td e t e c t i o nw a v e l e n g t h2 2 7 n m u s i n ga c e t o n i t r i l e - w a t e r - a sm o b i l ep h a s ea n dg r a d i e n te l u t i o n a c c o r d i n gt ot h er e s u l to fc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s ，t h ei n s t r u m e n tp r e c i s i o n ，s a m p l ee p e a t a b i l i t ya n ds t a b i l i t yw a st e s t e d i nt h er e s u l to fh i g he f f i c a c yl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , t h er s do ft h er e l a t i v er e t e n t i o nt i m ea sw e l la st h a to ft h er e l a t i v ep e a ka r e ao ft h es h a r e dp e a kw a sl o w e rt h a n3 o s h o w e dt h a ti tw a sf e a s i b l em e a s u r e s a c c o r d i n gt oc h r o m a t o g r a p h i cf i n g e r p r i n t , 1 7s h a r e dp e a k sw e r ed e t e r m i n e d ，a n dn o 9w a st h er e f e r e n c ep e a k t h er s do ft h er e l a t i v er e t e n t i o nt i m ea sv两南大学硕十学位论文w e l la st h a to ft h er e l a t i v ep e a ka r e ao ft h es h a r e dp e a kw a sl o w e rt h a n2 0 ，t h em e t h o da t t a i n e dt h er e l i a b l er e s u l t s t h ep e r c e n t a g eo fs h a r e dp e a ka r e aw a sm o r et h a n4 1 a n dl e s st h a n8 3 ，c o i n c i d e dw i t ht h er e q u i r e m e n t s t h es i m i l a r i t yw a sa n a l y s i sb yt h ei n c l u d e da n g l ec o s i n em e t h o da n dc o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n tm e t h o d ，a n dw e r ea l l 9 3 ，s h o w e dt h a tt h et e c h n i c a li n d e xo ff i n g e r p r i n te s t a b l i s h e dw a ss t a b i l i t y s e l e c t e dc l l r o m a t o g r a r n sc a nm a k ear e l a i b l ej u d g e m e n tt ot h eg r o u pc h a r a c t e r i s t i c so f t h el e a v e sa n db r a n c h e so f a r t i f i c i a lp l a n t i n go f t a x u sc h i n e n s i sv a r m a i r e i k e yw o r d s ：t a x u sc h i n e n s i sv a t m a i r e i ；p a c l i t a x e l ；r p - h p l c ；e x t r a c t i o n ；h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cf i n g e r p r i n tv l独创性声明本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止) 。学位论文作者签名：枷窆导师签名：样嘲：1 钉肛日料嘲：中m 圳第2 章引言1 1 红豆杉第1 章文献综述红豆杉( t a x u sb a c c a t al ) 又名紫杉、赤柏松，植物分类为裸子植物亚门，松杉纲，紫杉目，红豆杉科，红豆杉属常绿乔木，是第四纪冰川遗留下来的世界珍稀濒危古老树种，至今已有2 0 0 多万年的历史，属于国家一级保护树种忆该属植物全世界共1 1 种，产于北半球，我国有4 种和1 个变种，分别为西藏红豆杉、云南红豆杉、南方红豆杉和东北红豆杉，变种为曼地甄红豆杉】。虽然分布广泛，但数量稀少，较为分散，极少成林且生长缓慢。1 1 1 南方红豆杉概述南方红豆杉( t a x u sc h i n e n s i sv a t m a i r e i ) ，又称美丽红豆杉，为红豆杉属植物中分布最广泛的一种，主要分布于长江流域、南岭山脉地区及河南、陕西、甘肃、台湾等地，是常绿树种，分布于海拔8 0 0 一- 1 6 0 0 m ，资源储量相对较红豆杉其它各种多。其中重庆产于忠县、巫山、巫溪等1 6 , 7 1 。南方红豆杉己成为我国抗癌药紫杉醇药物生产的主要树种。1 1 2 红豆杉化学成分红豆杉中化学成分包括紫杉烷类化合物和少量非紫杉烷类化合物。1 1 2 1 紫杉烷类化学结构分类到目前为止，从红豆杉属分离得到的紫杉烷类化合物已近2 0 0 个，除少数例外，它们大都具有三环或四环骨架，属二萜类化合物，少数具有含n 侧链，( 注：r - 凡分别代表不同化学基团，下同) ，据吴楠等他1 的研究，部分结构如下：6 8 6 环系训：c 。位环外双键取代的体系( 图卜1 ) 。h 1 8 r 7 1 2、。一+ 。r ，1 4图1 - 1l两南大学硕十学位论文此外，在c 一位双键取代6 8 6 环系化合物还有一种c 9 - o h 取代的的化合物( 图卜2 ) 及6种c 。位取代的的化合物( 图卜3 ) 。h 3 c 1 2伯0 a c ，、1 4：h o图1 2r 3 旦2；ih a c , , , 巡1 0 一9h 。1 61r 1 1 4 1 。圈1 3c t c 环氧乙烷取代的体系( 图1 - 4 ) 和g - c 。- c 趵环氧丙烷取代的体系( 图卜5 )图1 - 4“r 3c 4 位有有饱和取代基的体系( 图卜6 )5 7 6 环系1 3 1 ；1 8h夕2时1 1 4r1 8c h3 1 2f跗。1 4阿1 6r 云图1 - 55c ；位环外双键取代的体系( 图卜7 ) 和c 4 c 2 0 环氧乙烷取代的体系：只有一种，如图1 - 8所示。2一一r第2 章引言图1 7图1 8c t c s c 2 0 环氧乙烷取代的体系( 图卜9 ) 和c t 位有饱和取代基的体系( 图1 - 1 0 ) ：h 3 c 、1 2，r 5 1 、1 4h 36 1 2 环系1 钔：圈1 9图1 - 1 0只有c 。位有饱和取代基的化合物( 图1 - 1 1 a 和图1 - 1 1 b ) ：h 3 c 、1 27a c o 1 3i1 4t a x a c h i t r i e n e sb图1 1 1ah 3 c 1 271 31 4图1 1 1bo h多环体系1 6 1 ：c ，位环外双键取代的体系：包括c - - 位与c 。位相连的体系( 有3 个化合物如图卜1 2 所示)及c 。z 与c t s 相连的体系( 图卜1 3 ) 。3两南大学硕十学 ) = 论文睇1|o = 1 3l1r 暖1 1 3c 4 一c s c 2 0 环氧丙烷取代的体系( 图1 - 1 4 a 、图1 - 1 4 b 和图卜1 4 c ) ：h 3 c oh o 11 1 2 2 非紫杉烷类化合物h ，严7 。l。h 骧1 3红豆杉中的非紫杉烷类化合物包括黄酮类、多糖类化合物等。k a z u y a s a 等认为n 剐，南方红豆杉总黄酮同其它总黄酮一样，也是有效的抗癌物质之一，对肿瘤有化学预防和治疗的双重作用，存在很大的开发潜力，目前，已发现具有抗癌抗肿瘤作用的黄酮类化合物比较多，主要有槲皮素、杨梅素和芹菜素等。近二十多年来，国内外出现的各类多糖药物不断引起人们的重视，发现具有抗肿瘤、提高免疫等重要的生理作用 1 9 - 2 1 如香菇多糖、灵芝多糖、虫草多糖及黄芪多糖都已进入临床，而当前的红豆杉多糖，经初步药理试验表明也具有抗肿瘤、提高免疫和保护肝脏等作用，这方面，郑宝华和吴绵斌等乜铂对红豆杉多糖进行了详细的研究。1 2 紫杉醇1 2 。1 紫杉醇性质4 | 尝一目仆抓第2 章引言ohhh图1 1 5 紫杉醇的化学结构式f i g 1 15c h e m i c a ls t r u c t u r a lf o r m u l ao fp a c l i t a x e l紫杉醇( p a c l i t a x e l ) ，分子式c 4 7 h 5 l n o l 4 ，分子量8 5 3 9 1 ，化学名称为：2 s ，5 r , 7 s ，1 0 r ，1 3 s ) 1 0 ，2 0 双( 乙氧基) 2 苯甲酰氧基1 ，7 二羟基9 氧代5 ，2 0 环氧紫杉烷1 1 烯1 3 基( 3 s )3 苯甲酰氧基3 苯基d 乳酸酯，其化学结构式( 见图1 1 5 ) 。紫杉醇为白色结晶粉末，无臭，无味。本品在甲醇、乙醇或氯仿中溶解，在乙醚中微溶，在水中几乎不溶。其分子是一个极其复杂的四环二萜类化合物，为白色结晶性粉末，具有高度亲脂性，易溶于有机溶剂乜螂1 。1 2 2 紫杉醇药理作用2 0 世纪8 0 年代美国和欧洲的科学家相继揭示出紫杉醇的抗癌疗效，认为它能与微管蛋白质结合，形成稳定的微管束，并使被解聚促进微管聚合，抑制微管降解，使细胞分裂受阻，将癌细胞停止在g 2 晚期或m 期，最终导致癌细胞死亡啪1 。1 9 9 2 年底，美国f d a 首先批准紫杉醇作为治疗晚期卵巢癌新药p a c l i t a x a e l 上市。在美国、法国进行的临床试验证明，以红豆杉植株为主要原料提取的紫杉醇可用于晚期乳腺癌、晚期卵巢癌、鼻咽癌、膀胱癌、淋巴癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤和头颈部肿瘤、上胃肠道癌、小细胞性和非小细胞性肺癌的治疗，被称为“晚期癌症的最后一道防线”，被认为是近十年来发现的一种最有希望的抗癌药物乜引。1 2 3 药用紫杉醇来源当前，紫杉醇的来源主要是红豆杉的树皮和枝叶，也有通过细胞进行培养，但是，无论在红豆杉的植物体内，还是在细胞培养物中，其含量相当低，即使是目前公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也只0 0 0 6 0 0 0 8 的含量乜 。1 3 红豆杉中紫杉醇检测方法自从紫杉醇上市以来，关于其分析检测研究有多种方法：5两南大学硕 + 学位论文1 3 1 毛细管电泳法c h a n 等1 将高效毛细管电泳( h p c e ) 对紫杉醇的检测。h e m p e l 等h 则将m e k c 用于生物体液中紫杉醇的含量测定，检测限可达2 0 n g m l ，仍具有广泛的应用前景。1 3 2 免疫学方法1 9 9 1 年j a z i r i m l 等报道了用酶联免疫分析法( e l i s a ) 半定量测定紫杉烷类化合物，结果h p l c 检测结果与e l i s a 结果较致，说明e l i s a 作为紫杉烷类化合物的检测很有前途( 见表1 - 2 ) 。梅兴国n 们等以紫杉醇牛血清白蛋白( b s a ) 为抗原免疫家兔，获得特异性抗紫杉醇抗体，结果表明其有较高的滴度( 3 。2 1 0 2 ) 。e l i s a 法的测定范围是0 6 2 5 4 0 0 n g 心1 ，回收率为9 2 8 1 0 8 8 。而单克隆抗体( m c a b ) 的应用则更是实现了紫杉烷类化合物研究开发的彻底创新。研究表明，m c a b 在e l i s a 中比多抗有更灵敏的特异性，且远t l h p l c 灵敏度高，检测限可达0 6 n g m l ，且样品处理远不如h p l c 复杂，更值得进一步深入研究。表卜2 免疫学方法用于紫杉醇的分析t a b l e1 - 2a n a l y s i so fp a c l i t a x e lb yi m m u n o l o g i c a lm e t h o d s1 3 3 色谱法m a t y s i k 等报道了一种薄层色谱鉴别结合光密度扫描定量测定紫杉醇的方法，该方法采用混合溶剂两步梯度展开，获得满意结果。采用薄层色谱鉴别方法，不同入操作对结果影响较大，而高效液相色谱法测定紫杉醇及烷类组分，仪器的精密度高、结果相对准确的多，近2 0 多年来得到了广泛应片j ( 见表卜1 ) 。但紫杉醇与其伴生的紫杉烷化合物在化学结构和极性很相似，因而分离纯化非常难。主要应用的普通填料有o d s ( c t s ) 柱、苯基柱和氰基柱。表1 - ! 紫杉烷类化合物的高效液相色谱分析t a b l e l - 1a n a l y s i sb yh i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h yf r o mt a x o i d s供试品色谱柱固定相流动相参考文献树皮，针叶多孔石墨碳柱二氧环己烷一水( 4 6 ：5 4 )【2 9 6第2 章引言血浆，尿液o e t y l ( c 8 )细胞培养物血浆，尿液细胞培养物血浆细胞培养物注射针剂愈伤组织愈伤组织注射针剂o d s ( c 1 8 )o d s ( c 1 8 )o d s ( c 1 8 )o d s ( c 1 8 )o d s ( c 1 8 )o d s ( c i 8 )o d s ( c 1 8 1o d s ( c 1 8 )p h e n y l ，d i p h e n y l ，p f p树皮，叶c y a n o ( c n )树皮，叶注射针剂愈伤组织细胞培养物m e t a e h e mt a x s i lm e t a c h e mt a x s i lp h e n o m e n e xt a x s o lz o r b a xs wt a x s i l乙腈一甲醇- 水( 4 ：1 - 5 ) _ 卜0 2 t o o l l 。1醋酸铵( p h5 1 0 )乙腈水( 5 2 5 ：4 7 5 )甲醇水( 1 3 ：7 )乙腈水( 4 9 ：5 1 )甲醇- 0 0 2 5m o l l 1 二