（分析化学专业论文）山竹黄酮的提取、合成、分析及性质研究.pdf

山竹黄酮的提取、合成、分析及性质研究中文摘要山竹黄酮具有抗氧化活性、抗菌、抗癌以及抗艾滋病毒等药理活性，近年来引起越来越广泛的关注。本文以仅一山竹黄酮( 0 【m a g ) 和丫山竹黄酮( 丫- m a g )作为研究对象，做了以下几方面工作：( 1 ) 利用萃取和重结晶等多种方法，从含0 c m a g 的粗品中分离提纯得到了高纯度的o c m a g ，并通过红外光谱( r ) 、核磁共振( n m r ) 和质谱( m s ) 等方法鉴定其结构，同时利用高效液相色谱( h p l c ) 对其纯度进行了检测，其纯度可达9 6 3 6 以上；( 2 ) 利用本实验室提纯的0 c m a g 为原料，合成了抗氧化性更强的丫m a g ，通过瓜、n m r 和m s 等方法鉴定其结构，并利用卸? l c 测定其纯度，纯度可达9 6 8 3 ：( 3 ) 基于0 【m a g 和丫m a g 的紫外吸收光谱和荧光光谱的研究，建立了测定混合物中丫- m a g 的荧光光度法。结果表明，在1 o 1 0 o 1 0 5 m 0 1 l 1 范围内，丫- m a g 的荧光强度与浓度呈良好线性，最低检出限为4 7 l o 7 m 0 1 l - 1 ；( 4 ) 研究了0 【一m a g 和丫m a g 在玻璃碳电极上的电化学行为，建立了同时测定两者含量的差分脉冲伏安法。实验表明，在一定浓度范围内a m a g 和丫m a g的氧化峰电流与其浓度呈良好线性关系，其线性范围分别是5 0 1 0 击2 o 1 0 。4m 0 1 l 1 和2 o 1 0 。6 “o 1 0 4 m 0 1 l - 1 ，最低检出限分别为1 7 1 0 气n o l l - 1 和7 。5 1 0 。6 m o l l - 1 ；( 5 ) 建立了高效液相色谱一紫外检测法同时测定0 【一m a g 和丫- m a g 含量，选择适当的流动相和适宜的检测波长，对二者进行分离和测定。结果表明，仅m a g和丫m a g 的峰面积在一定范围内与其浓度成正比，线性范围分别是0 3 4 om f l - 1 和o 8 0 4 4 0m g l ，最低检出限分别为o 1 6m g l 1 和o 2 1m g l 1 ；( 6 ) 实验采用紫外可见分光光度法，研究了d 环糊精对m a g s 的包合作用，以改善其水溶性和生物利用度。结果发现，p c d 与m a g s 容易形成2 ：1 型的包合物，包合稳定常数分别是k 0 m a g = 7 5 7 1 0 4l 2 m 0 1 。2 ，k ，- m a g = 9 2 3 1 0 6l 2 m o l 。关键词：0 c 山竹黄酮，y 山竹黄酮，荧光光度，瑚? l c ，差分脉冲，p 环糊精a b s t r a c ts t u d yo nt h ee x t r a c t i o n ，s y n t h e s i sa n da n l y s i so fm a n 9 0 s t i n sa n dt h e i rp r o p e r t i e sm a i l g o s t i l l sh a v ea m i o x i d a l l t ，a i l t i b a c t 耐a l ，a i l t i i n f l 锄衄a t o a l l t i t u m o l趾t i t h r o m b o t i ca c t i v 咄a i l da l s oc 觚i n h i b i th v i i u s d u et ot 1 1 e s eb i 0 1 0 百c a l l ya c t i v i 坝m a i l g o s t i n sw e r ep a i dm u c hm o r ea t t e n t i o na th o m ea 1 1 da b r o a di i lt l l er e c e i l ly e a 玛o u rr e s e a r c hf o c u s e do nm ep r 印a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n dd e t e n i l i 彻a t i o no fa m a n g o s t i na n d1 ，- m a l l g o s t i n t h em a i nc o m e n t sa 1 1 dc o n c l u s i o n sa r ea sf o l l o w i n g ：( 1 ) h i 曲l yp u r ea m a n 9 0 s t i nw 豁p r 印a r e d 丘o mr a wm a t 谢a lo fp e r i c a po lm a i l o s t e e i l 伽- o u 曲d i s s o l u t i o n ，e x 仃a c t i o n ，d i s t i l l a t i o na n dc 巧s t a l l i z a t i o n m e a n w h i l ei t ss t m c t u r ew a si d e n t i f i e db y 己，1 h n m 吸a 1 1 dm s ，a l l dt h ec o n t e n tw 弱d e t e n n i l l e db yh p l c ，t h ep u r i t yr e a c h e dt o9 6 3 6 ( 2 ) 丫- m a l l g o s t i nw a ss y i l m e s i z e d 丘o m0 c - m a l l g o s t i nb yad 锄e t h y lr c a c t i o n t h ep r o d u c tw a si d e i l t i f i e db y 弋1 h 】伽之a 1 1 dm s ，a 1 1 dm ec o n t e mw a sd e t e n n i n e db yh p l cw i t ht h ep u r i t yo f9 6 8 3 ( 3 ) an o v e ln u o r o p h o t o m e 仃yf o rd e t e m i n a t i o no f 丫- m a i l g o s t i ni nt h em i x t u r eo f0 【a i l d 丫- m 锄g o s t i nw 嬲e s t a b l i s h e db a s e do nm es t u d yo fi v i sa n dn u o r e s c e n c es p e c 仃a t h en u o r e s c e l l c e 缸e i l s 埘w 硒p r o p o r t i o n a lt 0m ec o n c e n t r a t i o no ft l l e丫- m a l l g o s t i ni l lt h em g eo f1 o 1o - 6a 1 1 d6 0 1o - 5m 0 1 l 1 ，t h ed e t e c t i o n1 i m i tw a s4 7 1o - 7m o l l - 1 ，n l er e c o v e r yt e s ta 1 1 dm ec o i n p 撕s o no fm er e s u l t sw i t ht h eh p l cm e t h o ds h o wm a tt l l ep r o p o s e df l u o r o p h o t o m e t l yi ss i m p l ea n dr e l i a b l e ( 4 ) a - m a l l g o s t i l la i l d 丫m a i l 9 0 s 劬w e r ed e t e m i n e ds 洫u l t a n e o u sb y 肿l c u v d n l ec o m p o u n d sw e r ea l l a l y z e db yac18c 0 1 u i 皿w i t ht h em o b i l ep h a s eo fa c e t o n i t r i l e ：0 1 h 3p 0 4 ( 9 0 ：1 0 ) ，t h en o wr a t ew 硒1 om l m i n - 1a n dt h ed e t e c t i o nw a v e l e n g t hw a ss e ta t3 0 8 砌t h ec o r r e s p o n d i n gp e a l 【a r e a sw e r ep r o p o n i o n a lt ot h ec o n c 黜l t r a t i o nw i t h i n0 3 m 4 4 0 m g l - 1f o ra m a n g o s t i i l 锄dw i t h i no 8 0 4 4 om g l - 1f o r 丫- m a l l g o s t i n 7 n l el i m i td e t e c t i o n sw e r eo 16m g l 。1a i 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db yu va b s o 印t i o ns p e c 仃o m e t 】ya 1 1 d之s p e c 仃o m e t d r t h es t o i c l l i o m e t r ya n df o r m a t i o nc o n s t a n t so fp c y c l o d e x t r i ni n c l u s i o nc o m p l e x e sw i n l 仅一m a l l g o s t i na 1 1 dp m a n g o s t i nw e r ee v a l u t e db yu 、厂s p e c t r a la 1 1 a l y s i s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h em 0 1 a rr a t i o so fi n c l u s i o nc o m p l e x e so fp - c y c l o d e x t r i nt o0 一m a l l g o s t i no r 丫- m 柚g o s t i nb o ma r e2 ：1 ，t l l ei n c l u s i o ne q u i l i b r i u mc o n s t a n t sa r e7 5 7 1 0 4l 2 m o l 。2a l l d9 2 3 1 0 6 l 2 m 0 1 k e yw o r d s ：o c m a l l g o s t 地丫- m a n g o s t i n ，u 、，s p e c 仇l i i l ，n u o r e s c e n c es p e c t n l i i l ，d i f f e r e n t i a lp u l s ev 0 1 t 锄m e t h p l c ，p c y c l o d e x t r i l li i l西北大学学位论文知识产权声明书本人完令丫解矿巧北人学关于收集、保存、使j f j 学位论文的规定。学校有权保留并向凼家何父部门或机构送交沦文的复印f ，f ：和iuf 版。本人允许论文被畲阅和f 剐弼。本人授权西北入学可以将本学f 移沦文的全部或部分内容编入行天数据库进行检索，可以采用影印、缩【= l j 或 描等复制手段保存和汇编本学位论文。l 司时授权中国科、二技术信息研究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库或其它相天数据库。保密论文待解密后适用本声明。学位论文作者签名：鱼焦指导教师签名：壅鲤d 多年莎月p 日洲盼6 月f o 日西北大学学位论文独创性声明本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：起住p p 年月矽日单子叶植物姜科的少数植物中，双子叶植物中分布较普遍，在豆科、蔷薇科植物中也较多；查尔酮类大多分布在菊科、豆科、苦苣苔科植物中，在玄参科、败酱科植物中也有发现；双氢查尔酮在植物界分布极少；异黄酮类主要分布在被子植物中，如豆科植物中( 约占7 0 ) ，其余分布在鸢尾科、桑科植物中；口山酮又称苯骈色原酮，结构如图1 2 所示，0 【和丫山竹黄酮是口山酮其中的两种衍生物，常存在于龙胆科、藤黄科植物中，在百合科植物中也有分布。气76o图1 12 一苯基色原酮( 黄酮)f i 9 1 12 - p h e n y l - c h r o m o n e ( n a v o r l e )1 3 黄酮类化合物的性质1 3 1 黄酮类化合物的溶解性。图1 2 口山酮f i 9 1 2x 锄t h o n e黄酮类化合物的结构及存在状态使溶解度有显著差异。一般游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。多数苷类因以离子形式存在，具有盐的通性，故亲水性较强，有较大的水溶性。黄酮类分子中具有的羟基可提高其在水中的溶解度，它们多数都具有酚羟基，因此纯的苷或苷元都较易溶于碱性有机溶剂吡啶、二甲基甲酰胺等。羟基经甲基化后，则增加其在有机溶剂中的溶解度。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶或不溶于苯、氯仿等有机溶剂，糖链越长，则在水中的溶解度越大。1 3 2 黄酮类化合物的特征反应各类黄酮化合物与镁粉盐酸、锌粉盐酸、钠汞齐盐酸、硼氢化钠、五氯化锑、乙酸镁、三氯化铝、氢氧化钠等试剂产生特征颜色。黄酮的颜色反应多与分子中的酚羟基及p 吡喃酮环有关。在早期的研究工作中，常以这些特征颜色反应定性地判断黄酮类化合物的存在和类别。1 4 黄酮类化合物的生物活性2黄酮类化合物是药用植物中主要活性成分之一，具有消除氧自由基、抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、类似雌激素的作用、保护心脑血管系统和抗病毒以及杀虫等广谱的生理活性【7 。1 4 1 ，除这些作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪氧化酶等方面也有显著效果。而且由于黄酮类物质毒性较低，因此还可用作食品、化妆品的天然添加剂，如甜味剂、抗氧化剂、食用色素等。1 4 1 黄酮类化合物在心脑血管系统中的作用黄酮类化合物具有减轻心脏工作负荷，以降低心肌耗氧量；扩张冠状动脉，促进侧枝循环的形成，以便增加心脏耗氧量两方面的作用。许兰之等【1 5 】研究了淫羊藿总黄酮( t f e ) 对肾上腺素能受体阻断的作用，为临床应用淫羊藿治疗冠心病、心绞痛提供了理论依据。姜华等【1 6 1 的实验研究表明，以淫羊藿为主的成药“心复康能显著降低心肌耗氧及心脏氧摄取率，能轻度、短暂降低血压，对心率无影响。银杏叶提取物中的总黄酮及白果总内酯【1 7 1 对冠心病、心绞痛有良好的效果。乙氧黄酮、葛根黄豆甙元【1 8 】也均能显著地增加冠脉血流量，降低心肌耗氧量，从而达到对冠心病的治疗。1 4 2 黄酮类化合物的抗癌作用异黄酮作为黄酮类化合物中的一种，具有广谱抗肿瘤生长、分化诱导和化学预防的作用。异黄酮的典型代表化合物染料木素【1 9 1 具有明显的分化诱导作用，可抑制动物肿瘤、人体皮肤癌、乳腺癌和淋巴癌的生长。甘草查尔酮a 能抑制人乳腺癌细胞( m c f 7 ) 和人白血病细胞( h l 6 0 ) 生长，有诱导上述2 种细胞株凋亡的作用。从松树皮提取得到的黄酮类化合物能诱导m c f 7 细胞凋亡【2 0 1 。人工合成的黄酮类抗癌药物黄酮乙酸在多种实体瘤模型上实验，发现能抑制哺乳类的多种酶，有很强的抑制作用【2 1 1 。1 4 3 黄酮类化合物对神经、内分泌、免疫系统的作用张黎等【2 2 2 3 1 的研究表明黄酮对急性炎症有抑制作用和明显的镇痛作用。于晓红等【2 4 】研究发现蜂胶黄酮能够增强免疫功能，提高溶血含量，增强单核吞噬细胞功能。淫羊藿总黄酮对老年大鼠神经内分泌有调节作用2 5 1 ，它以提高神经内分泌系统的整体功能而抗衰老。1 4 4 黄酮类化合物对消化呼吸系统的作用，甘草黄酮对多种溃疡模型引起的药物性溃疡均有明显抑制作用，已作为消化3液中黄酮类化合物，以8 0 乙醇提取的总黄酮的含量最高。其它有机溶剂法是根据相似相溶原理，对不同性质的黄酮选择最佳的有机溶剂进行提取。由于黄酮类化合物大多具有酚羟基，因此可用碱性水或碱性稀醇浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化合物。稀氢氧化钠水溶液浸出能力较大，但浸出杂质较多。石灰水的优点是使含有多羟基的鞣质，或含有羧基的果胶、粘液质等水溶性杂质生成钙盐沉淀，有利于浸出液的纯化。石灰水的缺点是浸出效果可能不如稀氢氧化钠水溶液，有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质，不被溶出。例如：从槐米中提取芦丁【3 2 悃碱性较强的饱和石灰水作溶媒，有利于芦丁成盐溶解，选用硼砂缓冲饱和石灰水的碱性可保护芦丁的黄酮母核不受破坏，用亚硫酸氢钠为抗氧剂可保护芦丁的邻二酚羟基。用极性由小到大的溶剂依次提取，可以提取出大多数游离的黄酮化合物，但此法目前仅用于实验室，很难工业化。1 5 2 超滤法控制超滤膜孔径大小能有效除去煎液中大分子物质，选用适宜孔径的超滤膜是提高产品收率和质量的关键。黄酮类化合物的分子量多在1 k d a 以下，而多糖、蛋白质等其分子量多在5 0 k d a 以上，使用超滤法能除去这些杂质，提高药液澄清度和有效成分含量。张效林等【3 3 1 用超滤法提取侧柏叶总黄酮时，可以有效的分开脂溶性叶绿素和鞣质。超滤技术的主要特点是分离过程无相变化，有效成分理化性能稳定，结果重复性好，准确性高，耗能低，分离率高。选用超滤法可以提高提取物的纯度，并且在提取生产过程中，可以减少废水排放，避免臭水、污水的产生，能降低生产成本。1 5 - 3 酶解法在黄酮提取过程中，通过加入适当的酶发生转糖反应和酶解反应而使产品黄酮类化合物得率和含量大大提高。对于一些黄酮类物质被细胞壁包围不易提取的原料可以采用酶法提取。孟志芬等【3 4 1 用酶法提取香椿叶中黄酮，总黄酮得率大大提高，且避免大量有机溶剂的使用，这给后续的提纯工艺带来了很大方便。1 5 4 超声提取法超声波具有空化、粉碎、搅拌等特殊作用，对植物药材的细胞有破坏现象，使溶媒渗透到药材的细胞中，以便使药材中的化学成分溶于溶媒之中，并且能使提取液不断震荡，有助于溶质扩散，同时超声波的热效应使水温基本保持在5 7 ，对原料有水浴作用【3 5 】。该法【3 6 1 具有实验设备简单、操作方便，与常规提取法相比，提取时间短、产率高、无需加热等优点。郭青枝【3 7 佣正交试验对苦瓜黄酮的超声波提取工艺进行了优化，与传统提取法进行了比较，结果表明，超声波提取苦瓜黄酮优于传统提取法。据报道【3 8 1 ，用l9 5 8 k h z 超声波处理银杏叶，在相同温度、相同时间下提取黄酮苷，其提取率与常规水浸提法相比大大提高，两者相差2 6 倍左右。郭孝武【3 9 】发现超声波辅助萃取不会破坏芦丁成分结构，能够缩短提取时间，提高有效成分的提出率和药材的利用率。从槐米中提取芸香苷，用超声波提取与热碱提取一酸沉淀相比，提出率提高了4 7 6 。阳文斌等【删用超声波法提取了花生壳总黄酮，测得样品中总黄酮其纯度和产率均较高。杨喜花等【4 1 】还研究了超声循环方法提取沙棘叶的总黄酮，超声循环技术是在料液循环流动的过程中施加超声波，这种改进方法的提取效果远高于普通超声法。1 5 5 微波提取法微波具有高效选择性、波动性、高频性和热特性等基本特性，因而将微波应用于中草药和天然产物的提取中具有操作简便，副产物少，产率高，提取时间短等优点。微波可直接作用于分子，使分子的热运动加剧，从而引起物质温度升高。微波的这种热效应使其穿透到介质内部，可以快速破坏细胞壁，使中草药中有药效的成分更快更有效的分离提取出来。因此，微波辅助提取技术的应用对中草药提取方法的改进和提取效率的提高具有很大意义。g a n z l e r l 4 2 ，4 3 1 等首次将大功率微波应用在浸取方面，用微波浸取了羽扇豆、玉米等中的油脂、棉籽酚等有效成分。实验表明微波浸取最多只需2 m i n ，而传统方法( 索氏提取法) 则需3 h 才能提取完全。将微波加热应用于植物细胞是一种快速、高效、安全、节能的提取胞内耐热物质的新工艺。与传统的中药煎煮法相比，微波加热法可以得到更高的产物提取率，而且大大缩短浸取时间，杂质含量显著减少【4 4 1 。大连化学物理研究所的李嵘等【4 5 】人曾用微波法提取过银杏叶中的黄酮甙，他们发现，溶剂萃取前对原料和水的混合液进行短时间微波处理，能大大提高黄酮提取率和缩短溶剂萃取所需的时间。该技术对于中药的精制、天然保健品的制备和生产都将有着重要的应用价值和广阔的应用前景。1 5 6 超临界流体萃取法近1 0 年来，随着超临界流体提取( s f e ) 技术的迅速发展【蛔，该技术在天然药6用植物有效成分提取中的应用越来越广泛。与上述提取工艺相比较，具有提取效率高、无溶剂残留、天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点，同时还可以通过控制临界温度和压力的变化，来达到选择性提取和分离纯化的目的【4 7 】。1 6 黄酮类化合物的分离提纯方法黄酮类化合物的分离包括黄酮类化合物与非黄酮类化合物的分离，以及黄酮类化合物之间的单体分离。常用的分离方法溶剂萃取法、碱提酸沉法、柱层析法、铅盐法、硼酸络合法、p h 梯度萃取法等，在黄酮类化合物的分离纯化中得到了广泛的应用4 8 4 9 1 。随着现代科学技术的发展，一些新的提取分离技术应用于天然产物的研究和生产也取得了很好的效果，如双水相萃取法( a r p e ) 、大孔吸附树脂柱层析( m a r c ) 、高效逆流色谱法( h s c c c ) 、高效液相色谱法( ，l c ) 、分子蒸馏技术( m o l e c u l a rd i s t i l l a t i o n ，m d ) 等。1 6 1 铅盐沉淀法在中药的乙醇或甲醇提取液中加入饱和的中性乙酸铅水溶液，可使具有邻二酚羟基或羧基的黄酮类化合物沉淀析出；如果中药的乙醇或甲醇提取液中所含的黄酮类化合物不具有上述结构，则加中性乙酸铅发生的沉淀为杂质，过滤除去，再向滤液中加碱式乙酸铅，可使其它黄酮类化合物沉淀析出。滤取黄酮类化合物的铅盐沉淀，悬浮于乙醇中，通入h 2 s 进行复分解，滤除硫化铅沉淀，滤液中可得黄酮类化合物。由于初生态的硫化铅沉淀具有较高的吸附性，故多不用h 2 s脱铅，而用硫酸盐或磷酸盐，或用阳离子交换树脂脱铅。1 6 2 柱层析法分离黄酮类化合物常用的吸附剂或载体有硅胶、聚酰胺及纤维粉等。此外，也有用氧化铝、氧化镁及硅藻土的。硅胶柱层析：此法应用广泛，主要适于分离异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、高度甲基化( 或乙醚化) 的黄酮及黄酮醇类。少数情况下，在加水去活化后也可用于分离极性较大的化合物，如多羟基黄酮醇及其苷类等【5 0 】。聚酰胺柱层析：聚酰胺是由酰胺键聚合形成的高分子化合物，常用的聚酰胺尼龙6 是由己二酸和己二胺聚合而成，既亲水又亲脂，性能较好。聚酰胺的酰胺基可与羟基形成氢键而发挥吸附作用，它的脂肪链又可作为分配层析的载体。聚7定法测定黄酮、异黄酮、黄酮醇及双氢黄酮含量的方法，此法具有微量、快速、简便、准确及不需标准品等优点。张鹤鸣等【5 5 1 报道了银杏提取物中总黄酮的含量测定，结果表明，与紫外分光光度法结果无显著性差别( 9 9 置信度) ，且具有仪器简单，操作方便，测定快速淮确，可避免色素和其它杂质的干扰等特点。胡卫兵等【5 6 悃乙醇回流法提取银杏叶中的总黄酮，死停法确定滴定终点，测定精密度高，回收率好。极谱分析法是在对试液进行电解时，根据极谱仪上得到的电流一电压曲线( 极谱图) 来确定待测组分及其含量，是一种特殊条件下的电解分析。它的特殊性表现在两个电极的面积差别很大，即采用一个面积很大的参比电极和一个面积很小的滴汞电极进行电解，主要用于测定黄酮类的某一种化合物。孙仕萍【5 7 佣单扫示波极谱法快速测定保健食品中的总黄酮含量，研究发现，黄酮化合物产生灵敏的极谱还原波，以芦丁为对照品，该波的二阶导数峰电流与芦丁浓度在一定范围内呈良好的直线关系，检出限较低。汪乃兴等【5 剐采用差示脉冲极谱法测定高良姜中的槲皮素，灵敏度高，方法简便，毋须分离手续，可以在样品提取液中直接测定，结果良好。1 7 2 光谱分析法1 7 2 1 分光光度法紫外分光光度法被一些药典所采用，但不专属，可大约估计总黄酮含量，不可能细致的定量测定单个黄酮类成分，但操作简单方便，是一种简易可行的测定方法，也可用于企业生产环节中初步的质量控制。巫军等例以槲皮素为对照品，在3 6 8 i l i i l 波长处对银杏叶提取物中的主要成分黄酮类化合物的含量进行测定，结果表明，在一定浓度范围内呈良好线性，方法回收率高，精密度好。李星海【删等用聚酰胺薄层一紫外分光光度法分别测定了秦岭地区三种金丝桃属植物药中金丝桃苷的含量。络合分光光度法也是测定黄酮类化合物含量的主要方法之一。多采用硝酸铝显色法。其基本原理是：黄酮类化合物在n o 五存在条件下与a l ( n 0 3 ) 3 络合显色，以芦丁为标准溶液，在5 1 0 i l i l l 波长处测定显色液的吸光度来确定黄酮类化合物的含量。邓桂春等【6 l 】利用该法测定了银杏叶中黄酮的含量，许钢等【6 2 1 利用该法测定了竹叶提取物中黄酮的含量。但硝酸铝比色法专一性较差，测定受处理过程颜9色变化的影响。为了提高硝酸铝比色法的准确度，人们对该法进行了多项改进。曾凡骏等【6 3 】采用过滤法( 即显色后过滤，测定滤液的吸光度) 对银杏黄酮紫外分光光度检测方法进行改进，结果能大大提高测量稳定性且准确度较高、重现性良好。黄酮类化合物的测定也用三氯化铝显色法。陈丛瑾等【删建立了a l c l 3 显色分光光度法测定香椿叶提取液中总黄酮含量的测定方法。实践证明，采用分光光度法测定黄酮类化合物含量重复性好、准确、简便、易掌握、不需复杂的仪器设备，所需试剂也便宜易得。因此，选用此法作为药品生产中质量检测是有效的。1 7 2 3 荧光光度法利用黄酮类化合物与某些金属离子的络合物在紫外线照射下可产生荧光，在一定条件下，荧光强度与该物质的浓度成正比的性质可建立黄酮类化合物的荧光光度法。廖声华掣6 5 荆用桑色素和舢3 + 形成二元荧光络合物，在激发波长和发射波长分别为3 6 5 m 和4 9 9 m 时测定该二元络合物的发射荧光强度。发射荧光强度和桑色素的浓度在一定范围内呈线性关系，其检出限数量级可达到1 0 一，并且成功的运用于测定银杏叶中总黄酮的含量。张敏等【6 6 6 7 1 根据黄酮类化合物能与a 1 3 +形成稳定的荧光络合物，以芦丁为标样，建立了一种测定银杏叶总黄酮的荧光分光光度法，结果令人满意。1 7 3 色谱分析法1 7 3 1 薄层扫描法薄层扫描法是将样品先经薄层分离后，然后用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化达到定量的目的。应用薄层扫描仪可同时对各种复杂的样品进行分离和测定，简便快速、灵敏准确、专属性好。章崇仪等【6 8 谰聚酰胺薄膜为固定相，双波长反射法锯齿扫描测定了黄芩中黄芩苷的含量。丁晨光等【6 9 】还用柱分配层析法薄层色谱法紫外分光度法分离其中淫羊藿苷并测定了它的含量。薄层扫描法是传统的含量测定方法，其简便易行，重现性好，但与h p l c 相比，其操作还是比较繁琐的，而且准确性也较差。1 7 3 2 高效液相色谱法( h p l c )随着对黄酮类化合物的深入研究和不断开发利用，其分析方法近年来也得到了迅速的发展。利用先进的分离分析技术和仪器，建立快速、准确、适用的分析l o方法定性、定量分析天然药用植物中的黄酮类化合物就成了非常有意义的工作。由于黄酮类化合物的特点：不易挥发、对热不稳定、有紫外吸收和荧光、分子离子峰稳定。游离苷元一般难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中，黄酮苷极性大、难气化、不稳定、一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂，难溶或不溶于苯、氯仿等有机溶剂。因此高效液相色谱就成了重要的方法而被广泛用于黄酮类化合物的分离和含量测定。目前关于h p l c 法测定黄酮类化合物含量的研究报道很多，肿l c 为药材的品质评定、药材的采收时间、提取工艺的筛选、有效成分的含量测定及制剂的质量控制等提供了简便、快速、高效的测试方法。瑚? l c 法技术成熟，灵敏度高、重现性好、操作简单、快速高效，己逐渐成为含量测定的标准。微柱高效液相色谱是在高效液相色谱法的基础上，针对其缺点，并随着新材料的出现和微加工技术的不断进步于2 0 世纪末期新开发出来的一种色谱微分离技术。高效液相色谱法流动相消耗大，所用溶剂大多有毒且价格昂贵，特别是对于一些较复杂样品的分析，用单相分离分析方法往往很难完成，虽然可以采取高效液相色谱与质谱等检测器联用的技术来解决，但由于流速匹配的问题使其推广和应用受到一定限制，微柱高效液相色谱以其较低的最佳流量、易与其他仪器线联用、分析样品少、消耗溶剂少、环境污染小等优点而引起人们的极大兴趣。高翠芬等【7 0 佣微柱高效液相色谱法测定了贯叶连翘中芸香苷。1 7 3 3 超临界流体色谱法( s f c )s f c 法是近年来出现的一种新方法，在分析领域得到了广泛应用。该法用超临界流体或添加了改性剂的超临界流体做流动相使黄酮单体分离后测定，目前该法测定黄酮含量的报道不多。王学军等【7 1 1 建立了超临界流体色谱法同时测定银杏叶提取物中槲皮素和芦丁的含量。1 7 3 4 高效毛细管电泳法( 日p c e )近几十年来发展很快的h p c e 是一种高效的分离技术，它具有高效、快速、进样体积小、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点。它以高压产生的强电场为驱动力，以小内径的石英为分离通道，依据各组分之间电泳淌度或分配系数的差异来实现分离。最近几年用于黄酮类物质的分析较多的是毛细管区带电泳( c e c ) 和胶束电动毛细管色谱( m e c c ) 。c e c 对样品的分离是由于各组分的淌度不同，从而形成一系列的区带，它相当于色谱法中的洗脱色谱【7 2 1 。m e c c 是在缓冲溶液中加入表面活性剂( 十二烷基硫酸钠，s d s ) ，当其浓度大于临界胶束浓度( c m c ) 时，形成有疏水内核、外部带电荷的胶束。在m e c c 中，被分析的物质在水相和胶束相中进行分配，溶质在水相中的迁移受电渗流和本身电泳迁移率的支配，而在胶束中的迁移是电渗流和胶束电迁移共同作用的结果，不同物质由于电迁移率及分配系数不同而被分离。佘佳红等【7 3 】用超临界流体萃取( s f e 卜胶束电动毛细管色谱法测定银杏叶粗提物中槲皮素和山奈素的含量。其它含量测定方法如气相色谱法、高速逆流色谱法、热喷雾m ，l c m s 法、固相微萃取法和超临界萃取色谱法等也有报道，但应用还不很普遍。1 8 黄酮类化合物的结构鉴定1 8 1 利用紫外光谱分析黄酮类化合物的结构近二十年来对黄酮类化合物的紫外光谱研究较多，各类黄酮的光谱均具有特征的吸收谱图，当环上具有含氧取代基，如羟基、甲氧基和糖苷等时，其吸收带的波长与强度变化往往与取代基的数目和位置有关，并有一定的规律性。此外，这类化合物在甲醇钠或乙醇钠( 或氢氧化钠) 、乙酸钠、三氯化铝、三氯化铝盐酸、硼酸乙酸钠等试剂作用下，紫外光谱的吸收带改变亦与结构有一定的相关性，因此紫外光谱对黄酮类化合物结构鉴定有重要的价值。大多数黄酮类化合物在甲醇( 或乙醇) 中的紫外吸收光谱由两个主要吸收带组成，出现在3 0 0 4 0 0 衄之间的吸收带i ，出现在2 4 呲8 0 衄之间的吸收带称带i i ，不同类型的黄酮类化合物的带i 或带i i 的峰形和吸收强度不同。1 8 2 利用小n 很光谱分析黄酮类化合物的结构利用1 h n 瓜低和1 3 c 很分析黄酮类化合物结构，简便而快速。多将黄酮类化合物作成三甲基硅醚衍生物，溶于四氯化碳中进行测定。该衍生物的核磁共振信号一般发生在9 o p p m 之间。黄酮类化合物作成三甲基硅醚衍生物后，可在四氯化碳中任意混溶，可直接送检，无干扰信号，不需要价格昂贵的氘代溶剂，供试后的样品经用含水m e o h 处理，即可定量回收，对比完全三甲基硅烷化和部分三甲基硅烷化( 5 o h 基游离) 衍生物卜m 偶波谱，可以帮助了解c 3 ，c 6 及c 一8 取代基的情况。1 8 3 利用m s 分析黄酮类化合物的结构1 2在测定黄酮类化合物的配基和苷的结构方面，电子轰击质谱法是一种有效的方法。特别是在可利用的化合物样品量很少( 即低于1 m g ) 的时候，这种方法成功地用于各种黄酮化合物的配基。多数黄酮类化合物甙元因分子离子峰( 呐较强，往往成为基峰，故一般无须作成衍生物进行测定，但是当采取气相一质谱( g c m s )联用手段进行分析时，为了提高样品的挥发度，则须制成甲醚衍生物等。黄酮类化合物的甙类如不制成衍生物，则其分子离子峰一般难以看到。除了分子离子峰外，黄酮类化合物甙元也常常生成 m 1 】+ ， m h 主峰。2 山竹黄酮的研究概况2 1 山竹黄酮的植物来源山竹黄酮主要来自山竹子的坚韧的外壳。山竹( g a r c i l l i am a l l g o s t 锄al ) 又称山竹子、莽吉柿、凤果和倒捻子素，是藤黄科( g 眦i f e r a e ) 藤黄属( g a r c i n i a ) 常绿乔木山竹的果实。原产于印度尼西亚和马来西亚，是一种典型的热带水果，主要分布于泰国、越南、马来西亚、印度尼西亚和菲律宾等东南亚国家，在中国广西、海南等地区也广泛栽培。山竹寿命长达7 0 年之久，但生长缓慢，从栽培到结果需要七、八年的时间，果实成熟期为5 1 0 月，以8 1 0 月产量较高。山竹树高达1 0 米；叶长椭圆形，厚革质，先端渐尖，全缘；花径约5 厘米，萼片4 片，花瓣2 片，肉质，粉红色；果实球形，直径p 8 厘米，深紫红色，果壳厚而韧，含单宁，可以入药；果柄处有4 片硬而内卷的大型革质萼片；果顶有星状花纹，有4 8 瓣不等。剖开果实，内有5 8 瓣色雪白、柔软多汁的果肉，是食用的主要部分；果肉内还有可食用种子。山竹果实中碳水化合物的含量约为1 4 7 ，含丰富的维生素c 、维生素b 以及多种氨基酸，还富含铁和钾等矿物质，具有较高的食用价值。山竹果实主要作为水果鲜食，其果肉占整个果重的1 4 左右，柔软多汁，甜而略带酸味，具独特香味，质地细腻，入口即溶，鲜美爽滑，有人认为是世界上最细腻可口的果品，被誉为“果中皇后 【7 4 】。山竹果皮一直作为泰国传统医药用于腹痛、腹泻、痢疾、感染性创伤、化脓、慢性溃疡、白带、淋病等疾病治疗【7 5 伪1 。而且许多研究发现，山竹具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化活性，并对金黄色葡萄球菌、志贺痢疾杆菌、弗氏去贺菌、大肠杆菌、霍乱弧菌和幽门螺杆菌等细菌具有抗菌活性8 0 】。所以，近年来，山竹特别是山竹果皮中的主要成分及其生物活性成为人们的研究热点。山竹外壳含有大量的癌、心血管疾病、骨质疏松、绝经综合症等【1 1 5 1 。0 【一m a g 具有植物雌激素样作用，与1 7 p 雌二醇结构相似，与1 7 p 一雌二醇竞争性结合雌激素受体( e r ) ，但结合e r的亲和力比1 7 p 雌二醇低，因此可发挥微弱雌激素效应，但同时使得雌二醇不能产生雌激素效应，表现出雌激素拮抗作用。因此，仅m a g 对激素相关疾病具有治疗作用【1 1 6 1 。2 2 3 细胞凋亡作用0 c m a g 对p c i 2 老鼠嗜铬细胞瘤细胞死亡具有强有力的作用。用其处理p c i 2细胞，可导致典型的细胞凋亡。流式细胞检测显示仅m a g 诱导的细胞凋亡作用具有时间和浓度的依赖性1 1 7 ，1 18 1 。0 【m a g 抑制白血病h l 6 0 细胞的生长，为白血病免疫治疗提供了新的途径【1 1 9 1 。2 2 4 抑制神经鞘磷酯酶( s m a s e ) 作用神经鞘磷脂酶( s m a s e ) 是神经鞘磷脂( s m ) 的水解酶，参与调节细胞的生长，分化，凋亡等过程。从大量调查癌细胞化学疗法得到，0 【m a g 是获得的一个新的活性物资，它引起的癌细胞凋亡现象与抑制酸性神经鞘磷脂酶( a s m a s e ) 的活性有密切关系，a m a g 对a s m a s e 有非常高的选择性的抑制活性。2 2 5 组胺h l 受体拮抗作用抗组胺药物主要通过阻断组胺h l 受体而起作用，临床上用于治疗组胺释放所致的过敏性疾病。0 【一m a g 具有阻断组胺h l 受体活性的作用1 2 0 1 ，药理学活性证明0 c m a g 是组胺h l 受体选择性和竞争性拮抗剂。2 2 65 羟色胺2 a 受体抑制作用5 羟色胺2 a ( 5 h t2 a ) 受体与心血管疾病有关，5 一h t 具有很强的收缩血管和促进血小板凝聚的功能1 2 1 1 。c h a i m g s r i l e r dn 等【1 2 2 m 6 】人经过实验研究发现丫- m a g 是5 一h t2 a 受体显著的选择性和竞争性抑制剂。0 【m a g 和丫- m a g 没有类似于组胺和5 h t 受体拮抗剂通常结构的氮原子，但对组胺h l 和5 h t 受体具有明显的抑制作用，它们将会成为一个有前途的组胺和5 h t 受体拮抗剂。2 2 7 其他作用除了以上药理活性外，0 【m a g 和y m a g 还具有其他一些作用。例如，抗艾滋病【1 2 7 ，1 2 8 1 作用，在抗艾滋病毒的复制中，对h 1 蛋白酶具有强有效的抑制作用；抗氧化作用，0 c m a g 是一个自由的激进分子清道夫【1 2 9 1 3 ，保护低密度脂异戊二烯化口山酮：m a i l g o s t i n 9 0 n e 和8 - h y d r o x y c u d r a x a i l m o n eg ，以及1 2 种已知的口山酮，其中包含仅m a g 。s u m ts u l 【s a m r a n 】等人【1 4 3 1 通过萃取及多次硅胶柱色谱，从7 0 6 蚝山竹果壳中得到了4 0 0 m g - m a g 和1 8 m gd m a g 。s u k s 锄r 锄等【1 4 4 1 人利用柱层析和制备薄层层析法从未成熟山竹及其果皮中提取分离出六种新的( m a l l g o s t a n o l 和m a l l g o s t i l l o n e s a e ) 和十六种已知口山酮。d h a m a r a 舡l e 掣1 4 5 1 人从未成熟山竹的根皮、树皮、果皮分泌物中分离得到了0 【- m a g ，丫- m a g ，藤黄酮e ，甲氧基p 倒捻子素和一种新的栊牛儿基联苯衍生物( 3 羟基4 栊牛儿基一5 甲氧基联苯) 。c h a i m n g s r i l e r d 【1 4 6 未成熟的山竹果实用乙醇提取，过滤、离心分层、干燥，得到水不溶部分进一步通过柱层析，以正己烷氯仿甲醇洗脱，分离得到a 和丫- m a g 。同时有人从其他植物中也分离得到了各种山竹黄酮。a z e b a z e 等人【1 4 7 1 从多穗闭花木的叶子中提取得到了0 c m a g 。p h u w 印r a i s i r i s a i l 等人【1 4 8 】从黄牛木中分离得到了0 【m a g 。l a p h o o k l l i e o 等【1 4 9 】从黄牛木中分离得到了一种含异戊二烯基的口山酮、仪和p m a g 。g r a l l 锄等人【1 5 0 】也从黄牛木中萃取得到了0 【和p m a g 。2 4 山竹黄酮的测定方法山竹黄酮因为其独特的药效，目前已经成为营养品上市，因而对于它所含有效成分的定性或定