（分析化学专业论文）含硫化合物自组装技术的压电免疫传感器研究.pdf

湖南大学硕士学位论文 摘要 f 压电传壁技巷因其灵敏度高、响应谱广、结构简单和成本低廉等特点已经被 推广应用于分析化学、生物化学、环境监测及分子生物学等众多领域。压电免疫 传感技术利用压电晶体与抗原抗体特异性免疫反应结合的特征，通常在压电石英 晶体表面先固定抗原( 抗体) ，响应溶液中抗体( 抗原) 引起的质量、密度和粘 度等性质的变化，它兼具有压电质量响应的高灵敏性和生物化学反应的高特异 性。其中，生物分子识别层即生物分子固定化技术是研制理想压电免疫传感器的 一个关键。通常将生物分子固定于石英晶体电极表面或石英晶体表面的惰性载体 涂层主要有直接固定法和间接固定法包括有硅烷化连接法，聚合物膜连接法， 非特异性吸附蛋白间接固定法，l b 膜技术，生物素亲和素体系( b a s ) 法以藏 自组装单分子层( s a m s ) 技术等等。在许多情况下，这些方法还可联合使用。j 本 文结合生物分子固定化技术的新发展，设计了一些新的压电免疫传感器，着重于 开展含硫化合物自组装技术固定生物分子的压电免疫传感器的研究。在下述几个 方面取得了一些新的成果： i 提出了一种新的基于巯基化聚丙烯胺自组装固定化方法，以克服传统小分子 硫醇自组装膜生物相容性差的缺陷。应用偶联试剂碳二亚胺( e d c ) 和n 羟 基琥珀酰亚胺( n h s ) 使聚丙烯胺( p h a ) 与巯基丙酸( m p a ) 偶合形成巯 基化的聚丙烯胺，应用这一新方法，实现了羊抗人 g m 抗体分子的固定，并 在o ，6 6 2 6 4 x g m l 范围内对人血清免疫球蛋白i g m 进行了测定。与巯基丙 酸自组装膜方法比较，应用该方法可在传感器表面固定更多的抗体分子，传 感器的响应灵敏度获得了显著提高。 2 提出了一种新的基于衍生化褐藻酸钠自组装膜固定蛋白的新方法，同样可以 克服传统小分子自组装膜生物相容性差的缺陷。f 应用e d c 和n h s 使褐藻酸 钠与胱胺偶合形成衍生褐藻酸钠作新的自组装 ! ! 料，用于蛋白固定，应用这 一新方法，( 1 ) 实现了转铁蛋白抗体分子的固定，并对转铁蛋白参考血清进 行了测定，该方法可在o 0 8 2 5 7j t g m l 范围内对转铁蛋白进行测定。与巯基 丙酸自组装膜方法比较，该方法可在传感器表面固定更多的抗体分子，传感 器的响应灵敏度亦显著提高。( 2 ) 研制了用于测定补体c ，成分的压电免疫传 感器，在o 0 7 2 2 1 6g g m l 范围内对补体c ，成分进行测定。同时对人血清 样品进行测定，将测量结果与酶联免疫吸附法( e l i s a ) 进行对照，以f 检 湖南大学硕士学位论文 验法考察显示二者无显著性差异。该方法是一种很有潜力的免疫传感器抗原 抗体分子固定的新方法，将这种传感器初步应用于临床诊断，取得了满意结 果。， 3 应用自组装技术，在石英晶振金电极表面自组一带氨基的胱胺自组膜，再通 过戊二醛交联实现蛋白质分子的共价固定。运用此方法成功地固定了抗胰蛋 白酶抗血清，研制成一种基于胱胺自组装测定抗胰蛋白酶的压电免疫传感器， 并在0 2 3 2 3 9i x g m l 范围内测定了抗胰蛋白酶。 关键词：压电免疫传基籍、自组装疆术、生物分手固定化 i i 湖南大学硕士学位论文 abstract p i e z o e l e c t r i c s e n s i n gt e c h n i q u eh a s b e e n a p p l i e d t o m a n yf i e l d s ，i n c l u d i n g a n a l y t i c a lc h e m i s t r y , l i f es c i e n c e ，e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n ga n ds u r f a c es c i e n c e s b e c a u s eo fi t ss m a l ls i z e ，h i g hs e n s i t i v i t y ，s i m p l i c i t y , l o wp o w e rc o n s u m p t i o na n d b r o a d s e n s i n gs p e c t r u m p i e z o e l e c t r i c i m m u n o s e n s o r s p o s s e s sh i g hs e l e c t i v i t y p r o v i d e db ya n t i b o d i e s o r a n t i g e n s a n d s e n s i t i v i t yr e s p o n s ed i r e c t l y t ot h em a s s c h a n g eo fp r o t e i n s i m m o b i l i z a t i o nt e c h n o l o g i e so fb i o m o l e c u l e sa r eo fp a r a m o u n t i m p o r t a n c e i no r d e rt o p r e s e r v e t h e i r b i o l o g i c a la c t i v i t y t h e r e a r e m a n g i m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sw ec a nu s ed i r e c t e do ri n d i r e c t e d t h eu s eo fs a mi nv a r i o u s f i e l d so fr e s e a r c hi s r a p i d l yg r o w i n g ，ai n t e r e s t i n gw o r ki s b a s e do nt h e s t r o n g a b s o r p t i o no fd i s u l f i d e s ( r - s - s - r ) ，s u l f i d e s ( r s r ) o rt h i o l s ( r - s h ) o nt h eg o l d s u r f a c e w h i l ei n t e g r a t i n gw i t ht h en e wi m p r o v i n gi nb i o m o l e c u l ei m m o b i l i z a t i o n ， t h i st h e s i s p r e s e n t s at h e o r e t i c a la n da p p l i e ds t u d i e so fs e v e r a ln e wp i e z o e l e c t r i c i m m u n o s e n s o r sb a s e do nt h ea u ss a m s t h em a i nw o r k sa r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： 1 an o v e l p r o t e i n i m m o b i l i z a t i o n a p p r o a c h b a s e do n m e r c a p t o - p h a s a mf o r p i e z o e l e c t r i c i m m u n o s e n s o r sh a sb e e np r o p o s e d ，w h i c hi sf o r m e db yc o u p l i n g m e r c a p t o p r o r i o n i ca c i d ( m p a ) t op o l y ( a l l y l a m i n eh y d r o c h l o r i d e ) ( p h a ) v i a1 - e t h y l - 3 - f 3 d i m e t h y l a m i n o p r o p l ) c a r b o d i i m i d e ( e d c ) a n dn - h y d r o x y s u c c i n i m i d e ( n h s ) a f t e rs e l f - a s s e m b l i n gam e r c a p t o - p h as a m o nt h eg o l de l e c t r o d eo ft h e q u a r t zc r y s t a l ，t h eg o a t - a n t i i g ma n t i b o d yi s i m m o b i l i z e dv i ac r o s s - l i n k i n gw i t h g l u t a r a l d e h y d e t h ed e t e c t i n g l i n e a r r a n g e o ft h e p i e z o e l e c t r i c i m m u n o s e n s o r e m p l o y i n gm e r c a p t o p h as a m i s0 6 6 2 6 4j t g m l 2 an o v e lp r o t e i ni m m o b i l i z a t i o na p p r o a c hf o rp i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o r sb a s e d o nt h es a mo fd e r i v a t i v ea ah a sb e e np r o p o s e d ，w h i c hi sf o r m e db yc o u p l i n g m e r c a p t o p r o r i o n i ca c i d ( m p a ) t oa l g i n i c a c i ds o d i u ms a l tv i ae d ca n dn h s ( 1 ) t h et ra n t i b o d yi si m m o b i l i z e dv i ae d ca n dn h s c o m p a r i n gw i t ht h em p a s a m m e t h o d ，t h i sn e wa p p r o a c hs h o w sg r e a t e rf r e q u e n c yr e s p o n s ea n dh i g hs e n s i t i v i t y t h e d e t e c t i n g l i n e a r r a n g e o ft h e p i e z o e l e c t r i c i m m u n o s e n s o r e m p l o y i n g d e r i v a t i v ea as a mi so 0 8 2 5 7p g m l ( 2 ) t h ep i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o r 1 1 1 一 塑堕查兰堡主兰垡笙兰 w a su s e df o rt h ed e t e c t i o no fc 3i nh u m a ns e r u mi nt h e r a n g eo fo 0 7 2 2 1 6 g g m l i td e m o n s t r a t e st h a tt h er e s u l t so fc l i n i c a l s a m p l e sb yt h i sd e v e l o p e d m e t h o da r ei d e n t i c a lt ot h o s eb yt h ee l i s a m e t h o d 3 - an o v e lp i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o rf o rt h ea n t i t r y p s i n i sd e v e l o p e db a s e do nt h e s e l f - a s s e m b l e dm e n b r a n e ( s a m ) o f c y s t a m i n e a f t e rs e l f - a s s e m b l i n gac y s t a m i n e s a mo nt h e g o l de l e c t r o d eo ft h eq u a r t zc r y s t a l ，t h eo l 广a ta n t i b o d yh a sb e e n i m m o b i l i z e dv i a c r o s s - l i n k i n g w i t h g l u t a r a l d e h y d e t h i sa p p r o a c h s h o w s s a t i s f a c t o r yf r e q u e n c yr e s p o n s ea n ds e n s i t i v i t y t h ed e t e c t i n gl i n e a rr a n g ei so 2 3 2 3 9p g m l k e yw o r d s ：p i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o r s ，s a m ，i m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e 、，j， 湖南大学硕士学位论文 第一章绪论 压电效应是指晶体受外界机械压力作用时，其对应表面出现正负束缚电荷的 现象。相反，施加电压于晶体时，产生机械形变的现象称为逆压电现象。压电 晶体就是利用这种正逆压电效应来构造滤波器、振荡器、电声换能器、加速度和 压力传感器等器件而广泛应用于电子、通讯、导航、超声和其他物理学领域。 压电生物传感将压电化学与生物传感结合，形成了一门新兴的分支学科。压 电生物传感器利用压电体声波器件在厚度剪切模式振荡过程中与周边环境的相互 作用，由器件超高频声波的声电阻抗谱、频谱或相位等参数变化来对环境介质的 质量、粘度、密度、介电常数、电导率等物理、化学性能做出相关应答，并转换 成相应传感检测信号，从而获得有关目标组分或体系的一维或多维信息。并通过 对信息进行解析以求得到对象的全面、动态、实时或在位的描述，从而用于化学、 生物学、药学、临床医学和环境科学等领域的传感检测。在众多的化学与生物 传感器中，压电质量传感器( q c m ) 1 2 1 以其独特的特点颇受欢迎，应用于很多方 面。早在1 9 7 2 年，s h o n s 等f 3 1 便将压电石英晶体用于溶液中抗体活性的测定。自 八十年代压电晶体在液相振荡获得成功后，压电免疫分析已引起了人们的广泛关 注并得到了迅速发展，其应用涉及环境监测、药物分析、生命物质测试等多个领 域【4 5 】。 本章将就压电生物免疫传感器的发展历程和研究现状，生物分子固定化方法 的新进展作一些综述。 1 1 压电传感器的基本原理及进展 通常，压电效应多发生在缺少对称中心的晶体中，许多类型的晶体都具有压 电效应，而石英的电学、机械和化学特性使它成为分析应用中展常见的晶体类型。 压电传感装置根据声波类型的不同主要可分成两类1 6 1 ：一类为体声波传感器 ( b a w ) ；另一类为表面生成声波传感器( s o a w ) 。通常所研究的传感器为体声 波传感器，都在压电基体内部传播，与压电材料的相对表面的外部环境发生作用， 而表面生成声波直接沿压电基体表面传播或者在表面附近传播或邻近的液相中传 播，在基体表面各种被测物的轻微扰动均可与表面生成声波发生作用。但是，一 般表面声波及一些具有较大剪切纵向位移的声波传播能耗很高，这种在液相中纵 岛 湖南大学硕士学位论文 向位移成分造成的高能量损失，不利于这些传感器在液相中应用。目前，有关压 电声波传感器的应用研究仍主要集中在厚度剪切模式( t s m ) 体声波传感器方面， 对分析仪器尤其重要的是共振频率与晶体总质量之间的比例关系，t s m 振动是 对质量改变展敏感的模式。a t 切割的晶体( a t 切割的晶体是指与z 轴成3 5 。1 5 切割的石英片，它的温度系数几乎为0 ，这表明在相当宽的温度范围内其振动频 率稳定) 定向完全以t s m 模式振动，本论文提及的压电传感技术即指这种以a t 切割的石英晶体的t s m 体声波传感技术。下面简单介绍一下有关压电传感技术 的一些基本原理及应用。 1 1 1 压电石英晶体气相传感及应用 压电石英晶体( p q c ) 在气相中振荡时，其性能与表面涂层的质量、物态、 性质及分布、体声波由晶体向涂层的传播及声阻抗等因素有关。此外，与压电晶 体自身振荡状态有关的一些因素( 如温度、晶体谐振器参数) 也可影响其传感响 应。 1 9 5 9 年，德国物理学家s a u e r b r e y t 7 1 导出了晶片表面均匀吸附的极薄层刚性 物质质量( a m ) 与厚度剪切压电石英晶体频移( f ) 之间的方程关系： a f ：一里塑( 1 - 1 ) 心p ， a 其中f 为检测到的频率漂移( h z ) ，f 。为p q c 的基频( h z ) ，p 口为p q c 的 密度( 2 6 4 8g l c m 3 ) ，为p q c 的剪切模量( = 2 9 4 7 1 0 “g ( c m s 2 ) ) ，a 为p q c 的面积( c m 2 ) 。 而o u i l b a u l t t 8 1 在s a u e r b r e y 工作的基础上，于1 9 7 7 年导出了仅适应于常用的 a t 切型p q c 的响应公式： a f ：- 2 2 6 1 0 一6 r 2 竺 ( 1 2 ) a 式中f pa f 、a m 和a 的单位分别为m h z 、h z 、g 和c m 2 。 对于刚性沉积物，只要a f 小于2 f ，溶剂的粘弹性不变，沉积物的厚度均 匀，则上述公式成立。 s a u e r b r e y 和g u i l b a u l t 的工作开启了p q c 的化学应用之门。从式( 1 - 2 ) 可知，f 与a m 之间存在一个线性关系，这个简单的关系式便成了压电传感器定量测试应 用的理论依据。对于一个9m h z 的石英晶体谐振器( 电极直径为6m m ) 来说， 其质量灵敏度约为0 6 6h z n g 。由此可见，p q c 可用做非常灵敏的质量检测工具， 其检测限能够达到纳克级，所以常称为石英晶体微天平( q c m ) 。q c m 分析应 2 湖南大学硕士学位论文 用的基础就是当分析物在p q c 表面物理或化学吸附( 解吸附) 时，它改变了每 单位石英晶体的表面质量，质量的改变即被晶体振动频率的相应改变所确认。 p q c 的广泛应用始于k i n g i ”的工作，1 9 6 4 年他将p q c 用于气相色谱体系中。 此后p q c 作为灵敏的石英晶体微天平( q c m ) 广泛应用于气相测定d o - d 。早期 因为石英晶体浸入溶液中会停振，因此那时对溶液中的测定只能采用间接法，将 待测物质转化为气体，或在液相反应后移至气相中测定。如用气透膜将溶液相隔 开，仅允许气体进入检测池i ，利用电极在溶液中对被测物质的物理化学吸附， 测定氰化物”5 1 、碘化物【】6 】和溴化物7 1 等。最近几年气相传感的应用也多限于非 极性蒸气、氯代烃、芳香烃等 18 , 1 9 1 的测定。1 9 8 3 年g u i l b a u l t t 2 0 1 首次将生物修饰 的p q c 用于气相的测定，他将酶修饰在p q c 的表面用来检测气体甲醛。此后气 相检测机制向有机化合物或生物物质修饰p q c 发展。 1 1 2 压电石英晶体液相传惑及应用 在s a u e r b r e y 理论方程的基础上经k i n g 和g u i l b a u l t 等的工作，压电传感 器被广泛用于气相分析，主要是大气污染的监测。但是由于压电声波在液相中的 能耗大，压电传感器于液相中的发展却比较缓慢。直到八十年代，p q c 在液相 中的停振问题最终通过改进振荡电路或采用单面触液型p q c 传感器得到解决 后，液相压电传感器才得以迅速发展，逐渐成为p q c 生物传感应用的重心。 1 9 8 0 年，n o m u r a 小组和k a n a s h 小组1 2 1 i 第一次成功的将压电晶体以单面触 液方式在溶液中稳定振荡，标志着压电传感器从此进入了液相时代。最初阶段， 由于未找到起振的关键，石英只能在少数液体中起振。1 9 8 5 年姚等口2 1 报道了保 证起振的关键，即p q c 在溶液中存在着停振温度点，进而实现了在水溶液和4 0 余种液体中的稳定振荡，提出了保证晶体稳定振荡的途径 2 3 - 2 6 】。 在p q c 的液相传感理论方面，探索者们也作了大量的研究工作。研究表明， 压电石英晶体传感器不仅对质量有灵敏的响应，还可灵敏地响应溶液中的许多其 他非质量因素，如粘度、密度、电导率、介电常数等。1 9 8 5 年，b r u c k e n s t e i n 和 s h a y t 2 ”k a n a z a w a 和g o r d o n t 2 8 1 等分别提出了能预测浸入液体介质中压电石英晶 体频率变化的两个简单物理模型。k a n a z a w a 和g o r d o n 等根据压电晶体剪切波与 流体阻抗剪切波耦和物理模型，认为压电晶体并不带动整个溶液振荡，实际上只 有很薄的液层( 1 u m ) 参与了晶体的振荡，他们将压电石英晶体看成无能耗的弹 性固体，将溶液看成纯粘性流体，在不考虑石英晶体与液相间界面效应影响情况 下，假设与p q c 接触的液体在p q c 表面形成了一个粘性边界层，此层质量被看 作p q c 上的附加质量负荷，导出了单面触液时压电晶体谐振频率变化( a f 。) 与 湖南大学硕士学位论文 溶液粘度( 1 1 l ) 吒= 一c “2 和密度( p 。) 的关系式 ( 1 - 3 ) 式中，p 。和比分别为压电晶体的密度和剪切模量。 b r u c k e n d t e i n 和s h a y 考虑到压电晶体泛频级次( b ) 与触液面数( n ，1 为单 面触液，2 为双面触液) ，同样忽略了界面效应的影响，利用量纲分析推导出可 用于单面或双面液相质量响应的关系式： 一 a f ：一2 2 6 1 0 6 n b f q 2 兰竺 f 1 4 1 a 与( 1 2 1 式相比，我们发现，p q c 在液相中的响应规律与在气相中的响应规 律基本一致。 s c h n e i d e r 和m a r t i n t 2 9 1 等考虑了石英晶体表面吸附层和接触的牛顿流体的同 时作用，应用连续机电耦合模型，在质量和溶液性质作用都比较小的情况下，也 得出了与s a u e r b r e y 及k a n a z a w a 相似的振动行为关系式。姚和周【3 0 】基于机电耦 合模型，建立了压电晶体振荡频率与溶液粘度、密度、电导率和介电常数的完整 的关系式。进一步的研究表明，p q c 在液相中的振荡行为还受许多与界面环境 的物理和化学性质相关的参数的影响如晶体表面的粗糙度1 3 1 】、表面应力d 2 、溶 液密度m 】、介电效应i ”】、表面气泡】、界面电容与界面能1 等。t o m p s o n 等从 分子粘度理论1 出发，研究了界面边界条件、液体粘度和密度对频率响应的影响， 提出了所谓的“四层理论”】，即固体传感器层、表面临近液体层、过渡层和液 相本体层。还研究了晶体在液相中的振荡行为【3 9 】。 p q c 传感器的响应信号的测定方法可归纳为主动法和被动法m 4 。主动法常 被称为振荡器法。该法中，压电晶体作为振荡电路的一部分，连接在振荡器放大 电路的输入端和输出端之间，通过引入正反馈电路产生自激振荡，用频率计数器 可测定此时的振荡频率。这种方法常用的是t t l 振荡电路，测定石英晶体的零 相移频率。与主动法相对应的是被动法，常被称为阻抗分析法。在阻抗分析法中， 压电晶体作为外部元件接在电学测量仪( 阻抗分析仪) 的测量端，阻抗分析仪测 定的是加在晶体上的电压与流过晶体的电流之比值即为阻抗，采用阻抗分析方法 可以获得液相中p q c 声波传感器的多维化学信息。本文将以t t l 振荡电路为基 础进行讨论研究。 自q c m 成功应用于溶液中，分析工作者对压电传感器在生物领域中的探索 性应用进行了大量研究。研究人员寻找有吸引力的生物反应体系，从蛋白质、酶、 陈 湖南大学硕士学位论文 生物素到免疫球蛋白、抗体、激素再到病毒、血细胞、单克隆、d n a 等等，形 成了压电生物传感热，包括有p q c 免疫检测分析 4 1 - 5 6 l ，d n a 传感器的构造 5 9 - 6 2 】， 压电酶传感器m 6 ”，压电微生物测定 6 8 - 7 5 】，环境监测m 4 1 等等。 1 2 压电免疫传感技术及应用 r o e d e r e r 和b a s t i a a n s i ”1 最早提出液相压电免疫测定，免疫分析、d n a 探针 以及细胞生长的检测等多方面的研究都应用了这项技术。压电免疫传感器很快成 为生物传感器的研究热点之一。压电免疫传感技术一般是在压电石英晶体表面先 固定上抗原抗体，响应抗原抗体特异性免疫反应结合的待测物质引起的质量、密 度和粘度等性质的变化。一种方法是气相压电免疫传感技术，将修饰了抗原或抗 体的石英晶体浸入待测溶液中温育反应一段时间，使待测物质与石英晶体表面修 饰的抗原( 抗体) 充分结合，洗涤干燥后测量免疫反应前后的石英晶体的谐振 频率变化。这种方法能定量测出固定抗原抗体和反应结合的待测物质的量，因而 该方法除了能测量待测物浓度、活性外，尚可用于免疫反应热力学常数的测量。 该方法的缺陷在于测量过程中需多次洗涤、干燥，比较繁琐，而且不能提供适时 数据。另一种是液相压电免疫传感技术，它弥补了上述的不足，将抗原( 抗体) 修饰的石英晶体置于检测池中直接响应结合的抗体( 抗原)引起的质量及界面 粘弹性变化，可适时监控免疫反应过程，但非特异性吸附较严重。 1 2 1 气相压电免疫传感技术及应用 气相压电免疫传感技术通常存在一个“d i pa n dd r y ”的过程，即压电免疫传 感器在溶液中进行免疫反应，洗涤干燥后于气相中测量免疫反应前后的谐振频率 变化。由于这种传感技术可精确测量结合的抗原或抗体的质量变化，目前己在免 疫诊断、环境分析及免疫反应的熟力学参数研究等领域中获得了较多的应用。 s h o n s 等1 2 1 于1 9 7 2 年最先将压电传感技术用于免疫分析领域，在5m h z 的p q c 上涂布白蛋白或y 一球蛋白，然后浸入含有不同浓度抗牛血清白蛋自抗体的溶液中 以测量抗体的活性，结果发现这种方法的灵敏度与传统的被动凝集法相当或略 高。o l i v e i r a 等i s 3 提出了一种选择性测定抗原的间接免疫分析专利方法。r i c e 8 4 】 发展了一种测定抗体亚类和抗体浓度的专利方法，用于抗蜂毒人i g g 和i g e 抗体、 抗磷脂酶a ，人i g g 抗体等各种类型抗体的分析。r i c e t ”1 在他的另篇专利中则 提出了一种克服非特异性吸附的夹心分析法，即在固定了抗原和第一抗体的压电 石英晶体表面再反应上与第一抗体特异性结合的物质以构成第三层。g u i l b a u l t 等 塑堕盔兰堡主堂堡笙苎 弘6 】在压电石英晶体表面固定抗对硫磷抗体，用于直接测定气态对硫磷。w u 和 w a n g 阻7 1 将嗅觉受体蛋白修饰于p q c 表面上，通过测定液体表面的气体对高粱酒 进行了质量评估。y o k o y a m a ”1 等提出了一种竞争压电免疫分析法。本室用竞争 压电免疫分析法检测了血样免疫球蛋白m t ”1 和甲胎蛋白【”1 的含量，并测定了免 疫反应的平衡常数、抗原及抗体的有效价数。目前，气相压电免疫传感器已被初 步应用于临床诊断及环境分析等方面。 1 2 2 液相压电免疫分析技术的应用 免疫检测是液相p q c 传感的重要应用领域之一。它多是基于固定在晶片上 的抗体抗原对溶液中的抗原抗体，或带有抗原的细菌和细胞等的特异性吸附所 引起的频移响应，可实时、连续监测抗原抗体免疫反应，在定量免疫分析以及免 疫反应的动力学分析和有关理论研究等方面得到了较多的应用。目前，液相压电 免疫传感器主要有质量型免疫传感器和非质量型免疫传感器。 r o e d e r e r 和b a s t i a a n s 等【8 2 1 首次应用表面声波( s a w ) 传感装置于溶液中直 接进行免疫测试，将羊抗人i g g 抗体固定于石英晶体表面，测定了溶液中i g g 浓度。t h o m p s o n 等n 6 1 研究了静止和流动体系中界面化学的变化及不同水相粘 度等条件下检测i g g 时的响应情况，并不符合经典的s a u e r b r e y 方程关系，这 可能与界面上抗原一抗体免疫反应不同于本体溶液反应有关。m u r a m a t s u 等【9 1 1 用被蛋白a 修饰的晶体来测定了溶液中的i g g 及其亚类的浓度，获得的频移 值比从s a u e r b r e y 方程导出的值要大，作者将它归因于界面效应。m u r a t s u g u 等【9 2 1 采用流通池直接检测了溶液中的人血清白蛋白，液相频移值亦大于 s a u e r b r e y 方程推导值，作者也将它归因于界面因素的影响。d a v i s 等m 1 研制了 一种用于动力学免疫分析的连续液相压电免疫传感器，可方便地观察免疫反应过 程及动力学特性。e b a t o 等】在压电石英晶体表面修饰荧光素半抗原，考察了抗 荧光素i g g 抗体及其f a b 片段的特异性结合情况，计算了两种不同结构的荧光素 类脂半抗原与其相应的i g g 抗体和f a b 片段在石英晶体界面上发生的免疫反应的 键合常数和正、逆反应速率常数。m i n u n n i 等【9 5 i 应用液相压电免疫分析法连续监 测了共价键合固定于石英晶体表面的半抗原除草剂2 , 4 二氯苯氧乙酸( 2 ，4 d ) 与其 特异性单克隆抗体的亲合反应。测定了体系的键合常数，通过键合曲线比较了两 种不同克隆的反应活性。 这些质量型压电免疫传感装置受晶体表面蛋白质非特异性吸附和抗原( 抗 体) 以单分子形式键合的限制，方法灵敏度不高，检测限在微克极或稍低。e b e r s o l e 等 9 6 1 发展了放大质量压电免疫吸附分析法，这种基于酶催化作用的方法使压电 6 湖南大学硕士学位论文 免疫分析的检测限可达到纳克级。w a r d 等1 发展了一种应用凝胶的放大质量方 法。k u r o s a w a 等发展了一种胶乳压电免疫分析方法，吸附了抗体的胶乳颗粒 因免疫反应发生凝胶和凝聚，引起溶液粘度和密度的变化，从而导致了晶体谐 振频率变化。这种方法不需在晶体表面固定生物活性物质，操作大为简化，但 检测限仍在微克级。本室m 1 发展了一种以羧甲基纤维素为乳剂和基于胶乳测定 相似的方法测定了人血清白蛋白。 目前，p q c 生物传感系统被用于解决很多分析问题，有很多的优点：在线 实时分析、高选择性、高灵敏度、干扰影响少、响应时间快、使用简单、仪器小 便于携带等。存在的缺点是：修饰过程需要完善，缺乏液相中的频移值和物质质 量的确切关系，对测定环境比较敏感。这些缺点需要在将来的研究中不断地得到 克服，以便p q c 能够用于更广泛的研究中。 1 3 压电免疫传感器中生物材料的固定 免疫反应1 9 9 1 有多种多样，参与反应的分子种类更多，这就决定了其在振荡 表面的固定化形式有很多种。这些固定化过程也是一种电极表面的修饰过程，但 它又有自身的特殊要求：修饰层粘弹性越低越好( 理想状态是刚性层) ，生物相 容性好，减少非特异性吸附等：而且固定化层的形成与电极材料、电极表面状态 的关系密切( 受温度、溶液性质等因素的影响) ，不同的电极材料决定不同的固 定方法。综上所述：压电免疫传感器制作中抗原抗体的固定方式、数量及活性 等直接影响传感器的重现性、检测限、灵敏度及循环使用等性能。由于固定化过 程首先是在石英晶片的电极表面( 以下简称电极或电极表面) 上进行的，因此在 许多情况下，不同的电极材料决定了不同的固定方法。如金电极最适合于硫醇分 子形成s a m ，另外金电极还易于吸附蛋白质，故可用于直接固定蛋白大分子；铅、 铝等的表面易于氧化并形成富含o h 的活性表面，有利于实现硅烷化方等间接 方法。通常将生物分子固定于石英晶体电极表面或石英晶体表面的惰性载体涂层 主要有直接固定法和间接固定法o “”，其中间接固定法最常用的包括( 1 ) 硅烷 化连接法，( 2 ) 聚合物膜连接法，( 3 ) 非特异性吸附蛋白间接固定法，( 4 ) l b 膜 技术，( 5 ) 生物素亲和素体系( b a s ) 法，( 6 ) 自组装单分子层( s a m s ) 技术。 在许多情况下，这些方法可联合使用。不管是那种操作，都应在修饰之前清洗电 极表面，以便除去任何可能干扰修饰过程的物质。本文的讨论重点将集中在s a m 技术的发展上。 湖南大学硕士学位论文 直接固定法 4 9 , $ 6 , 9 2 , 9 6 , 1 0 3 - 1 0 6 l 一般是将电极用含生物分子的溶液涂覆或浸泡，从 而使电极表面生成具有识别功能的生物膜。直接固定法步骤简单、快速，但是适 应性不好，许多生物分子直接固定后会导致特异性反应不能发生脚】。 硅烷化法 3 6 , 4 8 , 9 1 , 1 0 7 1 是一种比较成熟、应用较多的方法。一般方法是先使电极 表面氧化，然后与水等作用形成富含o h 的活性表面，再使用硅烷化试剂得到含 氨基或羟基的活性表面，最后直接进行生物体系的固定或使用双功能交联剂( 如 戊二醛等) 连接，所以通常使用电极表面氧化层容易得到的p d 、a 1 电极。 非特异性吸附蛋白间接固定法是利用蛋白a 、蛋白g 和b s a 等可以紧密牢 固吸附在电极上( 主要是金电极) ，而且本身又可以结合或标记上生物物质的特 点来实现的。如基于蛋白a 与免疫球蛋白i g g 的特异结合，研制出直接测定免 疫球蛋白i g g 等的蛋白a 修饰电极1 9 】_ ”】。高志贤等0 剐测定了c ，葡萄球菌肠霉素。 聚合物涂覆法主要采用聚乙烯亚胺( p e i ) 、甲基丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸 甲酯共聚物( h e m a m m a ) 、y 氨基丙基甲乙氧基硅烷( a p t e s ) 、羧甲基纤维 素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯 7 3 , 7 6 , 8 2 , 8 9 - 9 1 , 1 0 9 , 1 1 0 1 等等。这些方法的不足之处在于大多 采用涂敷成膜技术，一般须一个液相到气相的成膜过程，膜厚、均匀性较差或附 着力不强，尤其在气相免疫测定中，如果测量过程中洗涤时间或强度不均，都会 导致抗体( 抗原) 固定量的变化，从而使重复性、循环使用及灵敏度等都受到影 响。目前更多使用单体在电极表面的现场聚合新方法。何风娇等i 1 用电化学聚 合成膜法在石英晶体谐振器镀金电极表面形成一层m 一苯二胺一苯胺聚合膜，成 功固定了金葡球菌抗体。k a r u b e 研究小组2 1 将有机物等离子体聚合成膜技术用 于抗体固定和免疫传感器。这种膜极薄具有良好的机械强度和化学稳定性，而 且均匀度和重现性更好。但是抗体由于直接键合而使等离子体聚合膜修饰的传感 器不能再生本室吴等i i 提出了基于正丁胺等离子体聚合膜的可逆固定生物活 性物质的固定化方法，可使传感器实现简单再生。本室王等4 】基于等离子体聚 合膜的固定化方法，结合聚电解质设计了新型转铁蛋白压电免疫传感器，将其用 于实际样品中转铁蛋白的测定，结果与酶联免疫法基本一致。 l b 膜技术 6 0 , 1 15 , 1 1 6 i 在生化研究中具有重要的作用，它在压电传感器研究中可 以直接固定作为受体膜，也可以用作其他物质( 如蛋白质、d n a 等) 的固定层。 一般通过l b 膜拉膜设备，就可在洁净的电极表面得到l b 膜。这种l b 膜较通 常的涂敷成膜在成膜均匀性上有较大的改善。 b a s 体系 1 1 0 , 1 1 7 - 12 1 1 ( 生物素与亲和素) 具有结合速度陕、结合物稳定性高、 生物素分子易于活化、与蛋白质分子偶联率高而且不影响抗体的生物活性的优 湖南大学硕士学位论文 点，在压电免疫传感器研究中应用颇多，应用b a s 可以提高生物物质或体系的 固定化效率，在获得可更新的电极表面或晶片重复利用等方面也具有一定的潜 力。 自组膜1 1 2 z , 1 2 3 是分子通过化学键相互作用自发吸附在固液或气固界面形成的 热力学稳定和能量晟低的有序膜。它无论基底形状如何均可形成均匀一致的、分 子排列有序的、高密堆积和低缺陷的覆盖层，还可人为通过有机合成等方法来设 计分子结构和电极结构以获得预期的界面物理和化学性质，从而在分子水平上控 制界面微结构。与传统的化学修饰电极方法相比，s a m s 有更好的稳定性，更好 的化学和氧化还原活性，特别在控制由接着分子造成的微结构方面优越性极强， 被认为是研究有关表面和界面各种复杂现象的理想模型体系。自s a g i v 等【1 2 4 1 开 创性发现和研究了固，液界面上s a m s 形成以来，已发展了多种类型的s a m s 【】2 4 ”。其中金电极表面稳定，抗氧化还原能力强，是最常用的电极物质：而含硫 化合物( 包括硫化物、二硫化物和硫醇) 与金有很强的相互作用，成膜简单稳定 有序，因而s a m s 的研究工作多集中于此【1 2 “o i 。电化学研究表明硫醇类化合物 可能通过一个去质子化的过程形成金一硫键吸附到金表面【1 2 ”，该反应可表述如 下：r s h + a u = r s a u + e 。+ h + 。n u z z o 和a l l a r a i ”9 1 首先研究了含硫化合物分 子的自组装，发现二硫物能在金属( 尤其金) 表面形成排列和方向高度有序的单 分子层。p o r t e r 等m 6 1 发现长链硫醇( 亚甲基数 1 0 ) 自组方式类似于结晶，而且 链长变短会降低膜的有序性。不同硫化物还能在金表面同时吸附形成混合自组装 膜”。硫醇稀溶液在金电极表面的吸附动力学表明，成膜过程中存在两步动力 学过程m 2 】：第一步，一开始组装速率非常快，只需几分钟，接触角便接近其最 大值，膜厚达到8 0 9 0 ，这一步可认为是扩散控制的l a n g m u i r 吸附；第二步， 组装速率非常慢，几小时后接触角、膜厚达到其饱和值，这一步称为表面结晶过 程。s a m 生物分子固定途径主要有两种：( 1 ) 选择带合适的功能团( 如一n h ：，一 c o o h ，o h 等) 的含硫化合物先进行自组装，然后再通过活性功能基团来固定抗 体等；( 2 ) 先将生物分子标记上含硫基团，再通过自组装来达到固定的效果。如 b o w d e n 等1 1 4 3 , 1 4 4 先用一羧酸烷基巯醇修饰金电极，再用碳二亚胺活化来连接细 胞色素c 以研究它的电子转移动力学和电子传递机理。或者象刘芳等5 i 先将单 链d n a 探针5 1 末端标记上巯基醇，再自组装固定在石英晶体的镀金表面，制成石 英晶体d n a 传感器，并用该d n a 传感器进行了互补单链d n a 定量定性检测。含 硫化合物自组装单层膜已引起越来越多的传感器研究工作者的注意，在压电免疫 9 湖南大学硕士学位论文 传感器的研究中的应用也逐渐增多，此外将其用于抗原抗体的固定也已有不少文 献报道 4 4 1 1 4 6 - 1 5 8 l 。 1 4 q c m 压电免疫传感器基本装置及典型实验 石英晶体微天平( q c m ) 是一种非常灵敏的质量检测器，可以进行纳克级 的质量测定。q c m 的核心是一种沿着与石英晶体主光轴成3 5 。1 5 切割( a t - c u t ) 而成的石英晶体振荡片，其结构如图l ( q c m 正面图) 和图2 ( q c m 侧面图) 所示。由于a t c u t 切割方式在室温下q c m 温度系数接近于零，这样可以降低 温度对试验的影响。 f i g 1q c m 正面示意图 双面金电极 a t 切，9 h z 石英晶体 导线 q c m 侧面示意图 f i g 2q c m 侧面示意图 i o 几f 湖南大学硕士学位论文 由s a u e r b r e y 和g u i l b a u l t 的工作可知，q c m 的频移值f 与质量改变a m 之 间存在一个简单的线性关系，这个简单的关系式便是q c m 的基本原理，即当分 析物在p q c 表面物理或化学吸附( 解吸附) 时，每单位石英晶体表面的质量改 变了，质量的改变随即被晶体振动频率的相应改变所确认。 本实验室采用9m h za t 切型，双面镀金的压电石英晶体作为工作电极。在 液相压电免疫传感应用中，我们将晶体的一面用o 型橡胶圈和塑料片密封，这 样就形成了一个空气室，使晶振可以在溶液中稳定振荡，其基本结构如图3 ( q c m 基本装置图) 所示。 f i g 3q c m 基本装置图 将以上q c m 基本装置置于液相反应池中，与t t l 振荡电路及频率计数器连 接，就构成了液相压电免疫传感器的基本装置( 图4