实验五 PCR扩增课件

1、实验四 PCR扩增技术1能在一个试管内将所要研究微量的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。 PCR使人们能通过试管内的数小时的反应将特定的DNA片段扩增数百万倍。该技术已成为分子生物学研究的重要技术体系，其建立极大地推动了生命科学的研究进展。在DNA重组与表达、基因结构分析与功能检测具有重要的应用价值。聚合酶链反应( Polymerase Chain Reaction, PCR)，体外核酸扩增技术2PCR技术的创建Kary B. Mullis（穆利斯，美国） Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，扩

2、增DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首，比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。31. PCR的基本原理 PCR的原理是根据待测DNA片段两端的核苷酸序列，设计并人工合成两个分别与DNA片段两端互补的寡聚核苷酸引物，在有过量的引物、过量的底物（4种dNTP）、DNA聚合酶以及模板的反应体系中，经过高温变性、低温退火和适温延伸三个阶段的循环周期，对DNA分子进行扩增。 由于新

3、合成的DNA双链能够作为下一循环的模板，所以模板DNA以几何级扩增。一般经过30-35次扩增循环，可使目的基因DNA片段放大数百万倍。42. PCR体系的主要成分 模板DNA（靶基因） 特异引物 底物dNTP 耐热性DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶） Mg2+缓冲液 5 1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增

4、效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。6（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶，特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度0.1-0.5 mol/L浓度过高易导致模板与引物错配, 反应非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。7（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l酶量过高可引起反应非特异性扩增;酶量过少则合成产物量减少。（4）dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等，如果有一种

5、浓度不同于其他几种，就会引起错配。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。8（5） Mg2+浓度Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。9Three steps:Denaturation (变性): 将反应体系加热至90-97，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物

6、之间存在的局部双链也得以消除。Annealing (退火): 当温度突然降低至45-65,引物与其互补的单链DNA模板在局部形成杂交链。Extension (延伸): 将温度升高至70-74下，在Taq DNA 聚合酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下引物沿着模板DNA延伸。 利用PCR仪来控制温度3. How PCR works10聚合酶链式反应1. Denaturation2. Annealing3. Extension 以上三个步骤构成一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（2530）次即可达到扩增DNA片段的目的。PCR动画115Primer

7、15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template DNA55 555 5 5512一、实验目的掌握PCR扩增技术。二、 实验原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模

8、板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。13三、实验步骤1、引物设计与合成 根据GenBank上发表的猪的UCP3基因（Uncoupling protein 3）第五内含子序列，设计引物，预期产物大小为463bp，引物序列为：上游引物：5GGTCAAAGTGCCATCAGC3下游引物：5AAGGGTAGGAAGCGGTAGA 3142、PCR扩增 引物的稀释将引物短暂离心后，进行稀释，保存于-20（引物贮存浓度为100mol/l，使用浓度为10mol/l）。15 PCR扩增反应体系 采用20l的反应体系DNA模板template 1lPrimer 1（10mol/l） 0.5lPrimer 2（10mol/l） 0.5 lrTaq 10 l超纯水 补至20l（8l）16 PCR扩增条件调整好反应程序，将上述混合物稍加离心，置于PCR仪上执行扩增。173、结果检测 琼脂糖凝胶电泳检测，取5l产物