（生理学专业论文）rpn4的生理功能及其降解研究.pdf

华东师范大学博士论文 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名；兰至 日期：兰：! ：! ：! 。 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅。有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 学位论文作者签名：王互 日期：! ! ：兰：皇 导师签名； 日期；兰! ! ：! ：! ? 华东师范大学博士论文 脑功能基因组学研究所 r p n 4 蛋白的生理功能及其降解研究 摘要 泛素- 蛋白酶体降解系统一直是胞内用来清除异常的蛋白质和选择性降解各 种生化过程巾调控蛋白的执行者，它可以降解错误折叠的蛋白也可以及时更新细 胞周期过程中的调控因子，对细胞的各种生化过程进行精密的调节，从而可以将 胞内的蛋白质总量维持在一个相对恒定的水平，保证正常生命活动的规律性 【l 一3 】。 芽殖酵母的r p n 4 ( r e g u l a t i n g p a r t i c l e n o n ea t p a s e 4 ) 基因，亦称s o n l 和 u f d 5 ，最开始是作为温度敏感株的抑制子s u p p r e s s o r 被发现的，即p r n 4 的失 活突变可以恢复s e e 6 3 1 0 1 在限制温度下的生长缺陷。后来发现，r p n 4 基因的 突变还可以稳定泛素融合底物( u f dp a t h w a y 的底物) l i b v - bg a l ，在不影响 其多聚泛素化的情况下，阻碍2 6 s 蛋白酶体对它的降解因此亦被命名为u f d 5 。 以前的研究表明在蛋白酶体的3 2 个亚基中有2 6 个基因的上游启动子区域含 有p a c e ( p r o t e a s o m e a s s o o i a t e dc o n t r o le l e m e m ) 序列，而r p n 4 正是这段顺式 转录元件的反式转录因子，并且其自身的降解也必须靠蛋白酶体来实现。这暗示 了一种负反馈调控机制的存在：r p n 4 上调蛋白酶体亚基的水平，上调的亚基组 装成有活性的蛋白酶体又反过来降解自身的转录激活因子，从而将其f 游转录产 物蛋白酶体亚基维持在一个相对恒定的水平，保证细胞正常的生命活动。 本论文的结果提供了直接的证据证明负反馈调控机制的存在，首先在两种不 同的蛋白酶体活性受损的菌株内观察到r p n 4 蛋白的半衰期大大延长，稳定性明 显升高，随后检测受其调控的下游蛋白酶体亚基的水平，发现与野生型相比，在 蛋白酶体活性受损的突变型酵母菌株内其各个亚基的丰度都有大幅度提高 n o r t h e r n 检测证实这种升高是由转录水平的增强引起的并且随着r p n 4 稳定性的 增加而增加。这些结果都表明在蛋白酶体活性受损的菌株内由于对r p n 4 的降解 能力减弱，增加了r p n 4 在细胞内的丰度，上调了其各个弧基的转录水平，从而 在数量上对胞内受损的蛋白酶体给与补充，使其达到新的动态平衡，维持细胞正 常的蛋白酶体活力水平。之后我们做了大量的酵母菌株表型测试试验，结果与预 想的一致，在蛋白酶体单亚基突变造成的活性受损菌株中酵母的存活率与生长速 度都与野生型相差无几，但是当在实验中同时损伤蛋白酶体的活性并去除r p n 4 介导的负反馈调控机制之后，菌株就表现出强烈的合成致死效果，存活率大大降 低，生长速度也十分缓慢，可见在r p n 4 缺失的情况f ，受损的蛋白酶体无法在 数量上得到补给，给菌株的生长带来了毁灭性的灾害。此外，为了研究蛋白酶体 华东师范大学博士论文脑功能基因组学研究所 各个亚基对上游转录因子r p n 4 的应答，我们选用位于2 0 s 核心颗粒的不同亚基 做标记，正是这个偶然的机会使我们发现当采用目前普遍使用的纯化2 6 s 蛋白酶 体的方法来做体外活性实验时，其蛋白酶体的活性在纯化过程中就已经受到了损 伤，从表型上看，在r p n 4 缺失的情况下，2 6 s 蛋白酶体的表达量虽然不如野生 型，但是仍然可以足够维持酵母细胞的存活和生k ，如果同时在蛋白酶体亚基 p r e 2 的末端加上t a g ，就严重影响了菌株的存活率和生长速度，表现出强烈的 合成致死。说明由来端加上t a g 的p r e 2 组装的2 6 s 蛋白酶体的活性已经大大 不如野生型，这些结果都为将来的蛋白酶体体外活性实验提供了很好的指导。由 于最新的报道表明，2 6 s 蛋白酶体以及一些r p n 4 的下游基因都参与了d n a 的 修复过程，这种相关性使我们想进一步探求在d n a 损伤试剂的作用下，r p n 4 蛋白酶体负反馈调控机制是否在整个d n a 复制后修复过程中起了芙键的作用。 实验结果证明，在m m s 作用之后，蛋白酶体的活性有所损伤，但是其在细胞内 的丰度明显增加并且这种增加表现出强烈的r p n 4 依赖性。有可能在d n a 损 伤试剂作用之后，很多压力敏感的蛋白由于表现异常，无法形成正确的构象执行 功能，需要被2 6 s 蛋白酶体降解。而r p n 4 正是介导了在此应激状态下蛋白酶 体总量最大程度的提高。 鉴于酵母细胞内蛋白酶体的总量始终受以r p n 4 为核心的负反馈机制的调 控，所以对转录因子r p n 4 降解途径的研究就显得尤为重要。之前的工作表明， r p n 4 存在两条相互独立且蛋白酶体依赖的降解途径一条是与底物的多聚泛素 化有关的泛素依赖性降解，而另一条则是与n 端的前1 0 个氨基酸有关的泛素非 依赖性降解。为了将底物的这两条降解途径分开，我们在已经报道的1 5 种e 3 缺失突变的酵母菌株中表达了去除其泛索非依赖性降解信号的底物 n 端缺 失的r p n 4 ，结果显示只有在“6 门d 的酵母菌株中才能够检测到底物的存在，丰目 应的p u l s e - c h a s e 试验结果也表明，u b r 2 的缺失致使细胞中的底物蛋白完全稳定 了。之后，当我们用全长的r p n 4 做同样的实验时也得到了类似的结果，虽然全 长蛋白的泛素非依赖性降解途径仍在继续，但是由于其泛素依赖性降解途径的阻 断，蛋白底物的半衰期大大延长，稳定性有明显的提高。据此推测u b r 2 极有可 能参与了r p n 4 的多聚泛素化降解过程。根据以前酵母双杂交实验的报道，u b r 2 可以与n e n dr o l e 信号通路的e 2 - r a d 6 相互结合，因此我们推测r a d 6 极有可 能在r p n 4 的泛素依赖性降解途径中也行使e 2 的功能。从理论上讲，含有r i n g 结构域的e 3 可以作为媒介将e 2 与底物蛋白在空间上聚拢在一起，以晟优化的 方式使底物直接从e 2 获得u b i q u i t i n 。为了证实以上对r a d 6 蛋白功能的推测， 我们做了免疫共沉淀实验，结果表明r a d 6 和底物r p n 4 都可以与u b r 2 发生特 异性结合，而且在r a d 6 a 的菌株内，n 端缺失的r p n 4 蛋白泛索依赖性降解途 华东师范人学博士沦文脑功能基困组学研究所 径也被完全阻断了。这些实验结果都从不同的侧面向我们描绘山细胞内r p n 4 多 聚泛素化反应的基本过程，为了证实以上所有对r p n 4 降解途径的推测，我们 在体外重建了整个泛素化反应过程，发现只有在e l ，r a d 6 ，u b r 2 ，r p n 4 都存在 的情况下，才可以看到多聚泛素链形成。说明底物r p n 4 的多聚泛素化反应确实 需要特异的e 3 u b r 2 的参与。 由于蛋白酶体的丰度和活性大小与酵母细胞的生长状况密切相关，而r p n 4 又是蛋白酶体亚基转录所必需的反式转录因子，所以酵母细胞内u b r 2 的缺失必 然会导致r p n 4 的降解受到抑制，在细胞内的丰度增加，从而进一步促进下游 2 6 s 蛋白酶体的转录，提高其在细胞内的整体水平。为了研究r p n 4 的累积对酵 母细胞生长的影响，我们做了菌株的表型测试结果发现无论是否在野生型还是 在u b r 2 缺失裂的酵母中过量表达r p n 4 ，菌株的生长速度和存活率都没有明显 的差异。推测可能是因为泛素非依赖性降解途径的存在，使得由u b r 2 缺失而 稳定的r p n 4 又很快在细胞内被2 6 s 蛋白酶体降解，所以无法发挥转录因子的作 用；又或者酵母细胞本身就可以在正常的生长条件下忍受高于普通水平的r p n 4 和蛋白酶体。之后，为了进一步确证在蛋白酶体活性受损的情况下，累积的r p n 4 是否会对酵母细胞的生长产生影响。我们在蛋白酶体活性受损以及同时伴有 u b r 2 缺失的酵母菌株内过量表达r p n 4 ，发现其生长速度和存活率都明显低于 同源的野生型菌株并且这种表型的缺陷呈现出很强的r p n 4 剂量依赖性。相比 之下在同样背景的酵母菌株内过量表达丧失了转录活性的r p n 4 ( c 4 7 7 a ) ，由 u b r 2 缺失而稳定的r p n 4 却没有对菌株的表型产生任何影响。所有这些结果都 证明在蛋白酶体活性受损的菌株内u b r 2 缺失引起的r p n 4 蛋白的累积对菌株生 长的毒性，有可能是由其下游的转录产物- 受损的蛋白酶体贬基引起的，这些功 能有所欠缺的蛋白酶体也许无法及时地将那些从底物上切除的多聚泛素链释放 到细胞质中成为可被循环利用的自由的u b q u i t i n 所以打破了细胞内合成与降解 的平衡，使得很多对细胞有毒性的蛋a 以及调控细胞周期的蛋白无法得到及时的 降解，造成细胞的死亡。当然具体的毒性机制还有待进一步的后续研究。 关键词： r p n 4 蛋白酶体泛素依赖性降解u b r 2 r a d 6负反馈调控 华东师范大学博士论文脑功能基因组学研宄所 s t u d i e so nt h ef u n c t i o na n dd e g r a d a t i o no fr p n 4 a b s t r a c t t h eu b i q u i t i n - p r o t e a s o m es y s t e mp l a y sk e yr e g u l a t o r yr o l e si n m a n ya s p e c t so f c e l l u l a rr e g u l a t i o n ，s u c ha sm e t a b o l i ca d a p t a t i o n ，c e l ld i f f e r e n t i a t i o n ，c e l lc y c l ec o n t r o l a n dr e m o v a lo fa b n o r m a lp r o t e i n s t h e2 6 sp r o t e a s o m e ，t h em u l t i s u b u n i te n z y m e c o m p l e xr e s p o n s i b l ef o r t h ed e s t r u c t i o no fu b i q u i t i n - p r o t e i nc o n j u g a t e sa n do t h e r p r o t e i n s ，a p p e a r st ob ep r e s e n ti na l le u k a r y o t i cc e l l s ，i t ss u b u n i tc o m p o s i t i o nb e i n g h i g h l yc o n s e r v e da m o n gs p e c i e s i n19 9 9 ，g m a n n h a u p ti d e n t i f i e dan e w , u n i q u eu p s t r e a m a c t i v a t i n gs e q u e n c e ( 5 - g g t g g c a a a - 3 。) i nt h ep r o m o t e r so f 2 6o u to ft h e3 2p r o t e a s o m a ly e a s tg e n e s c h a r a c t e r i z e dt od a t e ，w h i c hi sc a l l e dp r u t e a s o m e - a s s o c i a t e dc o n t r o l e l e m e n t b y u s i n g t h e o n e - h y b r i dm e t h o d , t h e ys h o wt h a tt h ef a c t o rb i n d i n gt ot h e p r o t e a s o m e 。a s s o c i a t e dc o n t r o le l e m e n ti sr p n 4 p ，ap r o t e i nc o n t a i n i n gac 2 h 2 一t y p e f i n g e rm o t i fa n dt w oa c i d i cd o m a i n s ，w h o s et r a n s - a c t i v a t i n gc a p a c i t yi sw e l li n a g r e e m e n tw i t hj t ss e q u e n c ec h a r a c t e r i s t i c s e a r l ys t u d i e ss h o w e dt h a tr p n 4 ( a l s on a m e ds o n la n du f d 5 ) i sat r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t o ro ft h es a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ep r o t e a s o m eg e n e s ，a n dt h a tr p n 4i sr a p i d l y d e g r a d e db yt h e2 6 sp r o t e a s o m e t h e s eo b s e r v a t i o n ss u g g e s t e dt h a ti nv i r e p r o t e a s o m ea b u n d a n c em a yb er e g u l a t e db ya t lr p n 4 - d e p e n d e n tf e e d b a c kc i r c u i ti n w h i c ht h er p n 4p r o t e i nl e v e la p p e a r st ob eak e yd e t e r m i n a n t i nt h i se x p e r i m e n t ，w ep r e s e n td i r e c te v i d e n c et os u p p o r tt h er p n 4 - p r o t e a s o m e f e e d b a c km o d e l f i r s t ，p u l s e - c h a s ea n a l y s i ss h o w e dt h a tr p n 4w a ss t a b i l i z e di nt w os c e r e v i s i a ep r o t e a s o m em u t a n t s p r e l ia n dc i m 5 一1 p r e l li sat e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e ( t s ) m u t a n tw i t hd e f e c t i v ep r e l ，as u b u n i to f t h e2 0 sc o r e t h ec i m 5 一m u t a n tb e a r sa i sm u t a t i o ni nr p t l ，a l le s s e n t i a la t p a s eo f t h e1 9 sp a r t i c l e s e c o n d ，w ef o u n dt h a t t h el e v e lo fr p n l a n dp r e 6 ，s u b u n i t so ft h e2 6 sp r o t e a s o m e 。w e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e ri nt h ep r e l 一，m u t a n tt h a ni nt h ec o n g e n i cw ts t r a i n t h eh i g h e rs t e a d y - s t a t e l e v e l so fp r e 6a n dr p n lw e r en o td u et ot h e i rs t a b i l i z a t i o ni nt h ep r o t e a s o m em u t a n t s b e c a u s et h e s ep r o t e a s o m es u b u n i t sa r el o n g - l i v e de v e ni nw tc e l l s i na g r e e m e n tw i t h t h ei n c r e a s ei np r o t e i nl e v e l s ，n o r t h e r na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h em r n al e v e l so f r p n la n dp r e 6w e r eh i g h e rf 一2 - f o l d ) i nt h ep r e l - ia n dc i m 5 - ，m u t a n t st h a ni nt h e w lc e l l s t h u s ，t h ep r o t e a s o m ee x p r e s s i o ni su p - r e g u l a t e di nt h ep r o t e a s o m em u t a n t s 4 华东师范大学博士论文 脑功能基固组学研宄所 p r e v i o u ss t u d i e sa l s os h o w e dt h a tt h ev i a b i l i t yo fr p n 4 am u t a n ti ss i m i l a rt ot h o s eo f w tc e l l s ，s u g g e s t i n gt h a ts u b n o r m a la b u n d a n c eo fp r o t e a s o m ei sl a r g e l ys u f f i c i e n tf o r c e l lg r o w t ha n dv i a b i l i t yu n d e rn o r m a lg r o w t hc o n d i t i o n s t h ec o m p e n s a t o r yi n c r e a s e o fp r o t e a s o m ee x p r e s s i o ni nt h ep r o t e a s o m em u t a n t si m p l i e st h a tt h er p n 4 一d e p e n d e n t f e e d b a c kc i r c u i tm a yb ee s s e n t i a lf o rp r o t e o s o m em u t a n t s w et h e ne x a m i n e dt h e g r o w t ho fp r o t e a s o m em u t a n t si n t h ea b s e n c eo fr p n 4 t h ec o l o n yf o r m a t i o n e f f i c i e n c yo f p r e l 一，w a sf o u n dt ob ec o m p a r a b l et ot h a to ft h ec o n g e n i cw ts t r a i n , b u t t h ed e l e t i o no f r p n 4i nt h ep r e l 一，m u t a n ts i g n i f i c a n t l yi m p a i r e dt h ec e l lg r o w t h t h e c o l o n yf o r m a t i o ne f f i c i e n c yo ft h ep r e l jr p n 4 ad o u b l em u t a n tw a sl e s st h a n7 5 o f t h a to f t h e p r e l - m u t a n ti np l a t i n ga s s a y s t h u s t h ed e p l e t i o no f r p n 4a n dt h e p r e l - ， m u t a t i o ne x h i b i tas t r o n gs y n t h e t i cd e f e c ti nc e l lg r o w t ha n dv i a b i l i t y i n t e r e s t i n g l y , t h es y n t h e t i cg r o w t hd e f e c to fr p n 4 aa n dm u t a t i o n so fp r o t e a s o m es u b u n i t sw a sa l s o o b s e r v e di na l lr p n 4 am u t a n tt h a te x p r e s s e sac - t e r m i n a l l yf l a g t a g g e dv e r s i o no f p r e 2 ( p r e 2 f ) ，ac a t a l y t i cs u b u n i to ft h e2 0 sc o r e t h es i m p l e s te x p l a n a t i o nf o rt h e s e o b s e r v a t i o n si st h a tm o d i f i c a t i o no fp r e 2w i t ht h ef l a ge p i t o p em a yc a u s eas u b t l e d e f e c to ft h ep r o t e a s o m e w h i c hi sn o tr e c o g n i z e di nr p n 4 、tc e l l sd u et oa c o m p e n s a t o r yi n c r e a s ei nt h ep r o t e a s o m ea b u n d a n c e h o w e v e r ) t h es u b t l ep m t e a s o m e d e f e c ti sa u g m e n t e di nr p n 4 ac e l l s ，w h i c hh a v el o wa b u n d a n c eo fp r o t e a s o m ea n da r e u n a b l et oi n d u c et h ep r o t e a s o m eg e n e si nr e s p o n s et ot h ep r o t e a s o m ed e f e c t ，t h e s e o b s e r v a t i o n sr e v e a lt h ei m p o r t a n c eo ft h er p n 4 - d e p e n d e n tf e e d b a c kr e g u l a t i o no f p r o t e a s o m ee x p r e s s i o nt o t h ec e l l s t h a th a v eac o m p r o m i s e dp r o t e a s o m ea c t i v i t y r e c e n tr e p o r t ss h o w e dt h a tt h ep r o t e a s o m ei si n v o l v e di nd n ar e p a i r , a n dt h a ts o m e o ft h et a r g e tg e n e so fr p n 4a r er e q u i r e df o rd n ar e p a i r t h i sp r o m p t e du st o i n v e s t i g a t et h eb e h a v i o ro ft h er p n 4 - p r o t e a s o m ef e e d b a c kl o o pi nr e s p o n s et od n a d a m a g e w ef o u n dt h a tt h ep r o t e a s o m ea b u n d a n c ei nw tc e l l sw a si n c r e a s e d 一3 - f o l d a f t e rm m st r e a t m e n t t h ep r o t e a s o m ea b u n d a n c ew a sa l s oh i g h e rb u tl e s ss i g n i f i c a n t ( 1 6 - f o l d ) i nt h em m s t r e a t e dr p n 4 ac e l l st h a ni nt h eu n t r e a t e dc o u n t e r p a r t s t h e s e r e s u l t si n d i c a t et h a tp r o t e a s o m ee x p r e s s i o ni si n d u c e db ym m s ，a n dr p n 4i sr e q u i r e d f o ram a x i m a li n d u c t i o n w et h e na s k e di ft h er p n 4 一p r o t e a s o m ef e e d b a c kc i r c u i ti s t r i g g e r e di nr e s p o n s et om m s s p e c i f i c a l l y , w ew i s h e dt o t e s ti ft h ep r o t e a s o m e a c t i v i t y i si m p a i r e d b ym m st r e a t m e n t ，l e a d i n g t os t a b i l i z a t i o no fr p n 4a n da c o n s e q u e n ti n c r e a s ei np r o t e a s o m ee x p r e s s i o n t oe x a m i n et h ee f f e c to fm m s o nt h e r p n 4s t a b i l i t y , w em e a s u r e dt h et u r n o v e rr a t eo fr i ： n 4 i nm m s t r e a t e dc e l l sb yp u l s e c h a s ea n a l y s i sa n df o u n dt h et u r n o v e ro fr p n 4w a ss l o w e ri nt h em m s - t r e a t e dc e l l s 5 堂查鲤垄i 茎兰堕生堡壅 堕望堡兰里望兰塑塞堕 t h a ni nt h eu n t r e a t e dc e l l s s i m i l a r l y , t h et u r n o v e rr a t eo ft h eu f dp a t h w a ys u b s t r a t e ( u b ”6 - v - p g a i ) w a sa l s od e c r e a s e di nr e s p o n s et om m st r e a t m e n t t h e r e f o r e t b e p r o t e a s o m ea c t i v i t yi si n d e e di m p a i r e db yt h em m st r e a t m e n t ，w h i c hs u b s e q u e n t l y t r i g g e r st h er p n 4 一p r o t e a s o m ef e e d b a c kc i r c u i t a s w ed e m o s t r a t e d ，t h eh o m e o s t a t i ca b u n d a n c eo ft h e p r o t e a s o m e i a s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei sc o n t r o l l e db yaf e e d b a c kc i r c u i ti nw h i c ht r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t o rr p n 4u p r e g u l a t e st h ep r o t e a s o m eg e n e sa n di s d e s t r o y e db yt h ea s s e m b l e d ， a c t i v ep r o t e a s o m e r e m a r k a b l y , t h ed e g r a d a t i o no fr p n 4c a nb em e d i a t e db yt w o i n d e p e n d e n tp a t h w a y s o n ep a t h w a yi si n d e p e n d e n to fu b i q u i t i n ，w h e r e a st h eo t h e r i n v o l v e su b i q u i t i n a t i o no ni n t e r n a ll y s i n e s t oe l u c i d a t et h em e c h a n i s mu n d e r l y i n gt h e u b d e p e n d e n td e g r a d a t i o no fr p n 4 ，w ew i s h e dt oi d e n t i f yt h ec o g n a t eu bl i g a s ef o r r p n 4 w ef i r s tt e s t e dw h e t h e rt h ed e g r a d a t i o n o f r p n 4 1 1 - 2 2 9i sm e d i a t e db yo n eo f t h e k n o w ne 3 s a m o n gt h el5e 3m u t a n t st e s t e d r p n 4 l1 - 2 2 9 f l a gw a sd e t e c t e do n l yi n t h eu b r 2 & m u t a n t c o n s i s t e n tw i t ht h ei m m u n o b l o t t i n gr e s u l t s ，p u l s e - c h a s ea n a l y s i s s h o w e dt h a tr p n 4 11 - 2 2 9 f l a gw a ss t a b i l i z e di nt h eu b r 2 am u t a n t m o r e o v e r , t h e d e g r a d a t i o no fi n t a c tr p n 4e x p r e s s e df r o mt h en a t i v er p n 4p r o m o t e ri nal o wc o p y v e c t o rw a sa l s os l o w e ri nt h eu b r 2 am u t a n tt h a ni nt h ew ts t r a i n t h ei n c o m p l e t e s t a b i l i z a t i o no fr p n 4i nu b r 2ai n d i c a t e st h a tu b r 2i sn o ti n v o l v e di nt h e u b i n d e p e n d e n td e g r a d a t i o no fr p n 4 t a k e nt o g e t h e r , t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a t et h a t u b r 2m e d i a t e st h eu b d e p e n d e n td e g r a d a t i o no fr p n 4 e a r l yw o r ku s i n gt w o - h y b r i d a n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eb a s i cr e s i d u e - r i c hd o m a i no fu b r 2i n t e r a c t e dw i t hr a d 6 ( a l s o t e r m e du b c 2 ) t h ee 2e n z y m et h a ta c t st o g e t h e rw i t hu b r lt ou b i q u i t i n a t et h en e n d r u l es u b s t r a t e s c o n s i s t e n tw i t h t h et w o h y b r i da n a l y s i s ，g s tp u l l d o w na s s a yf u r t h e r d e m o n s t r a t e dt h a tf u l l l e n g t hu b r 2i sp h y s i c a l l ya s s o c i a t e dw i t hr a d 6 t h e s e o b s e r v a t i o n ss u g g e s t e dt h a tr a d 6m a yf u n c t i o ni nc o m p l e xw i t hu b r 2i nm e d i a t i n gt h e u b d e p e n d e n td e g r a d a t i o no fr p n 4 t ot e s tt h i sp o s s i b i l i t y , w ec o m p a r e dt h es t a b i l i t y o fr p n 4 出一1 0 h ai nr a d 6 aa n dw tc e l l sb yp u l s e c h a s ea n a l y s i s r p n 4 & l 一1 0 h aw a s i n d e e ds t a b i l i z e di nt h er a 撕m u t a n t w h e t e a si tw a sr a p i d l yd e g r a d e di n t h e c o n g e n i cw ts t r a i n t h u s r a d 6i st h ee 2e n z y m er e q u k e df o r t h eu b d e p e n d e n t d e g r a d a t i o no fr p n 4 t a k i n ga d v a n t a g eo ft h eb i n d i n go fu b r 2t or r ，n 4 a n dt h e i d e n t i f i c a t i o no fr a d 6a st h ee 2e n z y m ef o rr p n 4 a l 一1 0d e g r a d a t i o n ，w es e tu pa p u l l d o w nu b i q u i t i n a t i o na s s a yt oe x a m i n ew h e t h e rr p n 4 a , 一t oc o u l db eu b i q u i t i n a t e d b yu b r 2i nv i t r o r e m a r k a b l y , al a d d e ro f u b i q u i t i n a t e ds p e c i e s o f g s t - r p n 4 a i 一1 0w a s f o r m e di nt h ep r e s e n c eo fu b r 2a n d u b i q u i t i n ( 1 a n ej ) b u tn o ti nt h ea b s e n c eo fu b r 2 6 望蛋! 坐翌查兰曼主堡苎 些兰壁薹里望兰堕塞塑 o ru b i q u i t i n t h e s ed a t aa l l o wu st oc o n c l u d et h a tu b r 2i st h ec o g n a t eu bl i g a s ef o r r p n 4 d e l e t i o no fu b r 2p r o d u c e dn on o t i c e a b l ep h e o o t y p e su n d e rn o r m a lc o n d i t i o n s t h ef i n d i n go f u b r 2a st h ec o g n a t eu bl i g a s eo f r p n 4p r o m p t e du st oi n v e s t i g a t ei f t h e p r o t e a s o m ea b u n d a n c ei sh i g h e ri nu b r 2 ac o m p a r e dw i t hw tc e l l s i m m u n o b l o t t i n g a n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a tt h es t e a d y - s t a t el e v e lo fp r e l “w a so n l ym o d e s t l yh i g h e r i nu b r 2 at h a ni nt h ew t c o u n t e r p a r t t h i so b s e r v a t i o ni sn o te n t i r e l yu n e x p e c t e da s r p n 4i ss t i l ld e g r a d e de v e nw i t hal o w e rt u r n o v e rr a t eb y t h eu b - i n d e p e n d e n tp a t h w a y i nu b r 2 a o v e r e x p r e s s i o no f r p n 4c l e a r l yp r o d u c e d m o r ep r e l “i nu b r 2 ac o m p a r e d w i t ht h ew ts t r a i n s e r i a ld i l u t i o na s s a y sw e r ec a r r i e do u tt oc o m p a r et h eg r o w t ho f t h e s et r a n s f o r m a n t si nt h ep r e s e n c eo ra b s e n c eo fc u 2 + i