（水生生物学专业论文）中国东南沿海五种拟菱形藻形态、遗传多样性与系统进化研究.pdf

中文摘要 中文摘要 拟菱形藻( p s e u d o n i t z s c h i a ) 是广泛分布于世界各地的潜在产毒赤潮藻。本 研究首先从我国东南沿海分离并建立拟菱形藻各个种的纯种株系；然后利用光 学显微镜、透射电子显微镜和扫描电子显微镜对其进行形态学观察、特征描述， 并进行分类研究；再选择核糖体s s un r d n a 、l s un r d n a 、和5 8 sr d n a 及转 录间隔区( i t s l 、i t s 2 ) 基因对其进行分子生物学分析，包括基因序列差异性分析、 遗传多样性分析和系统进化分析。旨在对分布于我国东南沿海的拟菱形藻进行 形态学分类和分子鉴定，并分析其种间、种内、不同地理株系的地理遗传差异 性和系统进化关系，探明我国东南沿海主要拟菱形藻的种类和遗传多样性水平。 主要结果如下： 1 分析了采白海南、香港、广卅l 、厦门、台湾海峡和长江口等地的1 2 株拟 菱形藻。根据其形态学特征，鉴定为5 个种：尖刺拟菱形藻僻p u n g e n s ) 、尖细拟 菱形藻( pc u s p i d a t a ) 、多纹拟菱形藻( pm u l t i s t r i a t a ) 和巴西拟菱形藻( p b r a z i l i a n a ) 、柔弱拟菱形藻( 尸d e l i c a t i s s i m a ) 。其中除巴西拟菱形藻外，其它四 种均为潜在产毒藻。除分析了从我国东南沿海分离的拟菱形藻外，还综合比较 了来自加拿大的6 株有毒多列拟菱形藻( 只m u t i s e r i e s ) 。 2 分析了上述1 2 株拟菱形藻基于s s u m d n a 、l s u i 曲n a 和5 8 sr d n a 及 转录间隔区( i t s l 、i t s 2 ) 序列的遗传多样性。结果表明：s s u n r d n a 序列平均长 度为1 7 4 5 b p ，含有1 0 3 个变异位点和4 4 个简约信息位点；l s u n r d n a 平均长度 为8 2 2 b p 含有5 0 个变异位点和3 2 个简约信息位点；5 8 sr d n a 及转录间隔区 ( i t s l 、i t s 2 ) 的平均长度为7 2 9 3 b p ，有4 3 9 ( 1 2 0 9 ) 个变异位点和4 0 1 ( 1 2 0 9 ) 个简约信息位点。总体来说，拟菱形藻的s s u n r d n a 和l s u n r d n a 较为保守， i t s n r d n a 变异性较大。柔弱拟菱形藻( 尸d e l i c a t i s s i m a ) 的l s u n r d n a 存在较 明显的种内差异。其他4 种拟菱形藻的s s u n r d n a 和l s u n r d n a 的种内差异性 不大。 3 通过软件预测i t s 序列的二级结构并计算补偿性碱基改变( c b c s ： c o m p e n s a t o r yb a s ec h a n g e s ) 。通过对拟菱形藻的i t s - 1 和i t s 一2 二级结构的c b c s 中文摘要 分析表明，来自长江口和来自厦门胡里山的尖刺拟菱形藻可能存在生殖隔离。 4 在系统发育的研究中，从用邻位相接法州j ) 、最大简约法( m p ) 和最小进 化法( m e ) 所构建的系统进化树来看，多列拟菱形藻和尖刺拟菱形藻各为为单系， 而尖细拟菱形藻( pc u s p i d a t a ) 和伪柔弱拟菱形藻( 户p s e d u d o d e l i c a t i s s i m a ) 存 在一个复合体，在基于三种基因的系统进化树中都无法区分出来。并通过对系 统进化树的构建，探讨了拟菱形藻、菱形藻和拟脆杆藻的亲缘关系。结果表明 拟脆杆藻与拟菱形藻之间的亲缘关系比拟菱形藻和菱形藻的之间亲缘关系更 近。 关键词：拟菱形藻；多样性；n r d n a ；d n a 二级结构；系统进化 i i a b s t r a c t a b s t r a c t p s e u d o n i t z s c h i ai sad i a t o mg e n u sw i t hs p e c i e sw h i c ha r er e dt i d ec a u s a t i v e s p e c i e sw i t hw o r l d w i d ed i s t r i b u t i o r i - 1 1 1 ep s e u d o n i t z s h c i as t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o m s o u t h e a s tc h i n as e aa n dc u l t i v a t e di nl a b m o r p h o l o g i c a ls t u d i e so np s e u d o n i t z c h i a s p e i c e si n c l u d et h em o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o nu n d e rl m ，s e ma n dt e m ，a n dt h e d e s c r i p t i o no fm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n dc l a s s i f i c a t i o n a sf o rt h em o l e c u l a r s t u d y , t h es s un r d n a 、l s un r d n a a n d5 8 s i t sr d n ag e n es e q u e n c e sw e r e c l o n e s ，s e q u e n c e d a n dt h e nu s e da sd n am a r k e r sf o r g e n e t i ca n a l y s i s a n d p h y l o g e n e t i cs t u d i e s t h em a i np u r p o s eo f t h i sd i s s e r t a t i o nc e n t e r e do nf o l l o w i n gf i v e a s p e c t s t h em o r p h o l o g i c a lc l a s s i f i c a t i o n ，m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n ，t h ei n t e r s p e c i e s a n di n t r a s p e i c e s d i f f e r e n c e s a n a l y s i s ，g e o g r a p h i c a lg e n e t i c d i f f e r e n c ea n d p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n t h em a i nr e s u l t sw e r es h o w e da sf o l l o w s ： 12s t r a i n so fp s e u d o n i t z s c h i ai s o l a t e df r o mt h ec o a s to fs o u t h e a s tc h i n as e a i n c l u d i n g ，h o l i d a yb a y o f h a i n a n ，h o n g k o n g ，d a y a b a y o f g u a n g z h o u , x i a m e n , t a i w a ns t r a i ta n dy a n g t s er i v e re s t u a r y a c c o r d i n g t ot h e m o r p h y l o g i c a lc h a r a t e r s ，f i v es p e i c e sw e r ei d e n t i f i e d ：pp u n g e n s 、pc u s p i d a t a 、p m u l t i s t r i a t a 、pb r a z i l i a n aa n dpd e l i c a t i s s i m a e x c e p tf o rpb r a z i l i a n a ，o t h e rf o u r s p e i c e sa r ep o t e n t i a lt o x i cs p e c i e s b e s i d e st h e s e12p s e u d o n i t z c h i as t r a i n s ，s i xt o x i cp m u l t i s e r i e ss t r a i n sf r o mc a n a d aw e r ea l s os t u d i e di nt h i sd i s s e r t a t i o n t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fs s u n r d n a ，l s u n r d n a ，5 8 sr d n aa n di t sw e r e a n a l y s e da n dt h ep h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do nt h e s eg e n es e q u e n c e sw e r ec o n s t r u c t e d n er e s u l t ss h o wt h a t ：t h ea v e r a g el e n g t ho fs s u n r d n ai sa b o u t17 4 5 b pw h i c h c o n t a i n s10 3v a r i b l es i t e sa n d4 4i n f o r m a t i v ev a r i b l es i t e s ；t h ea v e r a g el e n g t ho f l s u n r d n ai sa b o u t8 2 2 b pw h i c hc o n t a i n s5 0v a r i b l es i t e sa n d3 2i n f o r m a t i v ev a r i b l e s i t e s ；t h ea v e r a g el e n g t ho f5 8 sr d n aa n di t sg e n es e q u e n c ei sa b o u t8 2 2 b pw h i c h c o n t a i n s4 3 9v a r i b l es i t e so f1 2 0 9 b pi n c l u d i n gg a p sa n d4 0 1i n f o r m a t i v ev a r i b l es i t e s o f12 0 9 b pi n c l u d i n g g a p s a s aw h o l e t h es s u n r d n aa n dl s u n r d n ag e n e s e q u e n c e sa r em o r ec o n s e r v a t i v ea n d5 8 sr d n a ，i t sg e n es e q u e n c ei sm o r ev a r i b l e i np s e u d o n i t z s c h i as p e c i e s t h el s u n r d n ao fd e l i c a t s s i m ae x i s tr e l a t i v e l yh i g h d i v e r s i t yw i t h i nt h es a m es p i e c e s e x c e p tf o rpd e l i c a t i s s i m a ，t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo f i i i a b s t r a c t s s u n r d n aa n dl s u n r d n aw i t h i nt h es a m es p e i c e so fp s e u d o n i t z s c h i as p i e c e si n t h i ss t u d ya r er e l a t i v e l yl o w a c c o r d i n gt ot h ec b c sa n a l y s i so ft h ei t s - - la n di t s - 2o f s t r a i n si nt h i ss t u d y , t h ep p u n g e n sf r o mx i a m e na n dy a n g z ee s t u a r ym a yf o r m r e p r o d u c t i v ei s o l a t i o n 1 1 1 es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fi t ss e q u e n c e sw e r ef o r c a s t e db ym o l ds o f t w a r eo n l i n ea n dt h e i rc b c sw e r ec a l c u l a t e db yc b c s a n a l y z e rs o f t w a r e a c c o r d i n gt ot h ec b c s a n a l y s i so ft h ei t s - 1a n di t s 一2 0 fs t r a i n si nt h i ss t u d y , t h epp u n g e n sf r o mx i a m e n a n dy a n g z ee s t u a r ym a yf o r mr e p r o d u c t i v ei s o l a t i o n i nt h ep h y l o g e n ys t u d y , t h epm u l t i s e r e i sa n d 尸p u n g e n sf o r mm o n o p o l y r e s p e c t i v e l yi na l lp h y l o g e n e t i ct r e e a n dt h epc u s p i d a t aa n dp p s e d u d o d e l i c a t i s s i m a c a n n o tb ed i s t i n g u i s h e di na l lp h y l o g e n e t i ct r e ea n df o r mac o m p l e x i t y a c c o r d i n gt o t h e p h y l o g e n yt r e e ，t h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h en i t z s c h i a ， f r a g i l a r i o p s i sa n dp s e u d o n i t z s c h i aw e r ea l s oe x p l o r e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nf r a g i l a r i o p s i sa n dp s e u d o n i t z s c h ii sc l o s e rt h a n t j l a to fn i t z s c h i aa n dp s e u d o n i t z s c h a k e yw o r d s p s e u d o n i t z s c h i a ；n r d n a ；d i v e r s i t y ；t h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo fd n a ； p h y l o g e n y i v 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明 确方式标明。本人依法享有和承担由此论文产生的权利和责任。 声明人 ( 签名) ：棚 砂口沪6 月日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( 厂 ( 请在以上相应括号内打) 作者签名：才卉日0 撕埽 日期：2 矽缸6 月7 日 日期：沙盼f 月1 日 第一章前言 第一章前言 拟菱形藻( p s e u d o n i t z s c h i a ) 是一类常见的海洋微藻，属于硅藻门 ( b a c i l l a r i o p h y t a ) ，羽纹硅藻纲( p e n n a t a e ) ，管壳缝目( a u l o n o r p h i d i n a l s ) ，菱形藻 科( n i z s c h i a c e a e ) ，广泛分布在两极、温带、亚热带和热带海域。1 9 8 7 年在加拿大 的爱德华王子岛发生了第一起由拟菱形藻赤潮引发的中毒事件，造成3 人死亡， 1 0 0 多人中毒。经研究发现拟菱形藻能产生一种神经性毒素一软骨藻酸 ( d o m o i c a c i d ，简称d a ) ，它能通过食物链进入贝类中，由d a 引起的贝毒称为 记忆缺失性贝毒( a m n e s i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，a s p ) 。人类食用了被软骨藻酸污染 的贝类和鱼类引发呕吐、腹泻、神智不清、丧失记忆甚至死亡。在此之前人们仅 发现蓝藻和甲藻能产生毒素，这是第一次发现硅藻也能产生毒素。自此又相继出 现拟菱形藻产软骨藻酸报道和软骨藻酸引起海洋中毒事件。人们意识到拟菱形藻 赤潮是一种潜在的威胁，因此加强了对拟菱形藻的研究，在拟菱形藻形态和分子 研究方面也有了较大的发展。 1 1 拟菱形藻的形态分类研究 “拟菱形藻 最早出现在在1 8 9 9 年p e r a g a l l oh 编写的书中，归入菱形藻属 ( n i t z s c h i a ) 。但是由于拟菱形藻中的n i t z s c h i as e r i a t a 和n i t z s c h i a f r a u d u l e n t a 与菱 形藻属其他种相比细胞末端更尖锐，细胞相叠呈链状，所以把它们独立出来成为 拟菱形藻属。后来因为其他形态学上的争论，h u s t e d t 又在1 9 5 8 年把它们重新归为 菱形藻属的一部分。因为拟菱形藻和拟脆杆藻( f r a g i l a r i o p s i s ) 之间在形态上具 有很大相似性，h a s l e 在1 9 7 2 年把f r a g i l a r i o p s i s 也归为菱形藻的一个部分，而 r o u n d 等因为f r a g i l a r i o p s i s 在形态上和菱形藻仍存在一定的差别，所以建议还是 将其保留为单一属。h a s l e 在比较了拟菱形藻和菱形藻某些亚属( 包括n i t z s c h i a s i g m o i d e a e 、n i t z s c h i as p a t h u l a t a e 和n i t z s c h i ad i s s i p a t a e ) 的形态学特征后，重新 建议将拟菱形藻作为一个单独的属。直到1 9 9 4 年，本属又重新恢复了属的分类地 位( h a s l e ，1 9 9 4 ) 。由此可见，拟菱形藻的分类地位一直存在争议。拟菱形藻的 形态上的细微差别是进行分类的重要依据，也是引起分类争议的重要原因。 拟菱形藻在属水平的鉴定在光学显微镜下就可以完成，但是拟菱形藻属种间 的形态分类必须利用硅质壳上细微结构的差别来区分的。主要的形态学区别特征 是：群体间细胞相连部分的比例，壳面外形，点条纹的组成特征，肋纹、孔纹和 第一章前言 肋突的密度，壳端形状，有无中央较大船骨点，孔纹形状、密度和内部结构( 李 扬，2 0 0 6 ) 。这些细微结构无法在光学显微镜下区分，必须由熟练的专业人员利 用电子显微镜，对拟菱形藻进行鉴定。细胞壳面的宽度被作为一个重要的拟菱形 藻的种间鉴定特征，根据壳面的宽度拟菱形藻可分为两个类群( s k o vj 1 9 9 9 ) 宽度 3l am 的为p s e u d o n i t z s c h i as e r i a t ag r o u p 包括：ps e r i a t a s e r i a t a ， 户s e r i a t a f o b t u s a ，pa u s t r a l i s ，pp u n g e n s ，pm u l t i s e r i e s ，尸p u n g i f o r m i s ， pf r a u d u l e n t a ，ps u b f r a u l e n t a ，月p a c i f i c a ，ph e m i i ；壳面宽度 7 0 ，一般都认为构建的进 化树较为可靠。如果b o o t s t r a p 的值太低( 如小于5 0 ) ，则有可能是进化树的拓 扑结构有错误，所得的进化树是不可靠的。 随着新的计算机软件的开发，分子系统学的分析手段也得到了不断的发展。 常用的系统树构建程序有：m e g a 、p h y l i p 、p a u p 等。其原理和用法见参考 文献( 赵国屏等，2 0 0 2 ；李衍达等，1 9 9 9 ) 。 1 3 3 4 与系统发育系统学相关的概念 分类单元( t a x o n ) ：是一个具有名称的生物类群。在系统发育系统中，有两 类基本的分类单元：物种( s p e c i e s ) 及单系群( m o n o p h y l e t i cg r o u p ) 。一个物种是 一个支系( 1 i n e a g e ) ，物种和称为种化( 物种分化) 的一系列过程相关。单系群 是一群物种，包括一个祖先及其全部后代。 自然分类单元( n a t u r a lt a x o n ) ：由进化而来，存在于自然界的生物类群，包 括单系群和物种。 分支( c l a d e ) ：一个分支就是一个单系群，即一个自然分类单元。 祖先分类单元( a n c e s t r a lt a x o n ) ：一个祖先分类单元是一个物种，该物种通 过分支进化( c l a d o g e n e s i s ) 或网状种化( r e t i c u l a t es p e c i a t i o n ) 的种化过程产生至 少一个以上的新种。分支进化是指系统发育树的一个分支通过种化过程产生两个 或更多分支。网状种化是指两个物种经过杂交产生一个新物种。 人为分类单元( a r t i f i c i a lt a x o n ) ：与进化过程或进化历史无关的分类单元， 包括并系群( p a r a p h y l e t i cg r o u p ) 和复系群( p o l y p h y l e t i cg r o u p ) 。并系群是指祖 1 4 第一章前言 先的一个或数个后代并没有包括在该类群中。复系群是其共同祖先被放到了另一 个分类单元中。 内类群( i n g r o u p ) ：研究者实际研究的类群。 姐妹群( s i s t e rg r o u p ) ：与某一类群在系谱上具有最近亲缘关系的类群，它 们享有一个共同的祖先。 外类群( o u t g r o u p ) ：是分析过程中所用到的除内类群以外的任何类群。最重 要的外类群是姐妹群。 1 3 3 5 分子系统学同形态学的关系 随着分子系统学的发展，收集分子数据的收集与应用方面开始产生了一些争 论。争论集中在如何评价分子数据和形态学数据的相对价值。例如在估计系统进 化方面，可遗传信息的更好来源是分子学特征还是形态学特征。经研究证明，在 进化过程中，自然选择能导致形态的迅速分歧，即使当两个种群享有一个共同祖 先或一直存在着基因交流；自然选择可引起在进化上不同祖先的种群承袭特征的 趋同，造成形态上的相似性。而形态学特征也会受到环境因子、生物因子以及种 群进化的影响。 虽然分子系统学的发展并没有导致对形态学产生进化假设产生巨大的动摇。 但是分子学途径在产生和验证有争议的系统进化假设上，具有潜在的强大说服 力。形态学特征可以从古代化石中得到，且可广泛地保存收集，而分子学特征都 有一个明显的遗传基础，得到的特征仅受到基因组大小的限制，并且在许多情况 下，依据分子比较而决定的关系，应该是与由形态学和行为学特征得到的关系一 致的。但是由单个导出的分子系统相互之间却经常不一致。形态学同分子学不一 致主要是由不同的样本数不同的分析方法、同源性的估计问题以及人为误差等方 面的原因造成的。分子系统学中，取样问题比在形态学中更为严重。有经验的形 态学家主要基于众多的样本群体的研究；而分子系统学家则被迫用有限的样本， 且测定一个或两个种作为代表来产生系统树。如果单从分子学角度来说，分子系 统树间的不一致如同形态学上的不一致一样的显著和普遍。但在一些形态学数据 不完整、或存在缺陷、或很难分析的情况下，分子系统学就显示出强大的应用能 力。 所以在实际工作中，形态学特征与分子学特征是相互补充的。只要用适合的 分析方法进行研究，就会得出一致性的结论。而如果把形态学待征与分子学特征 第一章前言 结合起来研究，将会对生物系统进化过程提供一个更完美的解释( 李明等，19 9 7 ) 。 1 4d n a 二级结构在生殖隔离和遗传多样性研究中的应用 d n a 的一级结构分析即d n a 序列碱基组成分析在微藻遗传多样性研究中较 常使用，但是对于微藻d n a 或者r n a 序列的二级结构研究较少。d n a 的二级的 概念源于1 9 5 3 年w a t s o n _ ； d c r i c k 等人根据x 线衍射图谱和c h a r g a 黼化学分析结 果。他们提出d n a 双螺旋结构的模型，即由两条相互平行而方向相反的( 一条 由3 _ 5 ，另一条由5 _ 3 ) 脱氧核糖核苷酸链，围绕同一中心轴旋转构成的双螺 旋结构，即是d n a 的二级结构。 如果从进化与功能的角度看问题，每个碱基所扮演的角色不可能是完全相等 的，这点是d n a 或者r n a 一级结构序列分析不能显示的。r r n a 的高级结构是以 一级结构为基础的，但在执行蛋白质合成等各项功能时，高级结构的稳定性更为 重要。同理，d n a 结构也有类似的现象。如果一级结构的碱基发生突变，最终 高级结构却没有改变，则不影响其功能。如果高级结构发生变化，其功能也将发 生变化。因此，d n a 高级结构的分析应该更具有分类意义。不过高级结构的分 析远比一级结构分析困难得多，核心问题是难于定量。因此一级结构全序列分析 与二级结构分析相结合有可能起到取长补短的作用，从而使分类更加接近客观实 际。分子生物学中有个指导性的原则就是结构比序列本身要保守。虽然d n a 序 列发生了变化，但是d n a 的二级结构是保守的。在d n a - - - - 级结构中通常能发现 一对配对的碱基中其中一个发生了改变，另外与其配对的碱基同样发生了改变， 这样它们形成的二级结构就是稳定的。这种现象称为补偿性碱基改变( c b c s ： c o m p e n s a t o r yb a s ec h a n g e s ) 。相对于c b c s j 还有h e m i c b c s ，h e m i - c b c s 是指配对 的碱基中一个碱基发生了改变但是另外一个碱基没有改变，但是它们仍然维持配 对。 c b c s 在指示种之间的生殖隔离方面有着重要作用。生殖隔离广义的概念是 指因生殖方面的原因使亲缘关系相近的类群间不杂交，或杂交不育，或杂交后产 生不育性后代的现象。对于硅藻来说，也就是在有性生殖配对时，两性细胞是否 能够配对成功，形成复大孢子。生殖隔离和生物学中物种的概念密切相关，一般 来说，如果不同的物种间会有生殖隔离的现象。这个概念对较为高等的生物适用， 对于较为低等的藻类来说并不尽然，因为有些同一个种的藻类也会发生生殖隔离 现象。生殖隔离与物种这个概念密切相关，更为重要的是生殖隔离是隐形种之间 1 6 第一章前言 遗传差异的重要指标。隐形种是指形态上差异很小，但是在遗传物质、生活史、 生理指标上确有明显差异的种群。a l b e r t oe ta l ( 2 0 0 7 ) 对pd e l i c a t i s s i m a 研究发 现：遗传学上不同但形态学上几乎完全相同的种间存在着生殖隔离。这一隐形的 差异性有着重要的生态学意义，有数据证明不同的隐形种占据不同的生态地位。 例如，在浮游的有孔虫类o r b u h n au n i v e r s a 不同基因型的大规模空间分布与水文 地理有关的省份和海洋表面的初级生产力有关，这种变更与过去海洋环境的重建 具重要的因果关系。 c b c s 和生殖隔离存在密切的关系。c b c s 可以在某种度上是对高级结构的一 种定量。研究显示，对绿藻和纤毛虫p a r a m e c i u ma u r e h ae h r e n b e r g ( f a b r ye t a 1 ，1 9 9 9 ；c o l e m a n ，2 0 0 0 ，2 0 0 5 ) 的研究显示：如果两者之间具有生殖兼容性即不 存在生殖隔离，它们的i t s 2 序列没有补偿性碱基改变现象( c b c s ) 或者半补偿 性碱基改变现象( h e m i c b c s ) 。但是反过来未必是符合这个规律：一些草履虫 ( p a r a m e c i u m s y n g e n s ) 存在生殖隔离，但是它们有着相同的序列，更没有补偿 性碱基改变c b c s 现象( c o l e m a n ，2 0 0 5 ) 。来l 刍n a p l e s 湾的尸d e l i c a t & s i m a 1 i k ea n d p p s e u d o d e l i c a t i s s i m a 1 i k e 株系同样符合这个规律( a m a t o e ta 1 ，2 0 0 7 ) ：存在生 殖隔离的株系属于不同的c b c s 群组，即同属于一个群组的株系之间没有没有补 偿性碱基改变现象( c b c s ) 。 目前对于c b c s 和生殖隔离的研究上属于起步阶段，随着研究的深入将会有 更多的数据来证明c b c s 和生殖隔离之间的关系。 1 5 本论文研究的目的和意义 近年来，有害藻华( h a r m f u la l g a lb l o o m s ，简称h a b s ) 发生的频度、强度 和地理分布都在增强，受到了全球的关注与重视。由拟菱形藻引发的有害赤潮对 人们的生活健康和公共卫生安全产生很大的威胁。在世界各地很多地方都发现了 能产生d a 的有毒拟菱形藻藻株，在加拿大和美国更是采取了拟菱形藻赤潮的预 警措施，以确保人民的生命安全不受到拟菱形藻赤潮的影响。 中国目前还没有检测到有毒的拟菱形藻藻株，但是这并不意味着中国海域的 拟菱形藻藻株就是无毒的。因此，很有必要对我国沿海存在的拟菱形藻的种类组 成、生态地理分布、种间和种内遗传多样性水平做一全面系统的研究。单就拟菱 形藻的形态进行研究有着一定的局限性，只有结合拟菱形藻分子生物学的研究才 能得出更准确的结果。由于目前我国国内对拟菱形藻分子分类的专题尚未少见， 1 7 第一章前言 这一工作就显得更为重要。在此基础上能在一定程度上揭示有毒种和无毒种的遗 传差异，不同地区的拟菱形藻的遗传差异，为进一步揭示拟菱形藻的产毒机理奠 定基础。 不同地区同种拟菱形藻在基因序列上存在一定的差异性，合成特异性强的分 子标记，对全世界范围的种内遗传多样性进行彻底的筛选，揭示不同株系的基因 特征有着很重要的作用。因此，针对不同的拟菱形藻种找出合适的分子标记，对 同一种拟菱形藻在不同国家和地区的株系进行遗传物质的分析，并且建立对应的 分子检测手段是十分重要和必要的。这不仅对丰富我国的海洋浮游植物和海洋硅 藻研究有重要的理论意义，而且可以为我国拟菱形藻赤潮的防治和实时监测提供 科学依据和理论基础，并对保障人民生活和水产养殖业的健康发展，具有重要的 理论和实际意义。 此外，拟菱形藻作为一个从菱形藻属分出来的独立的属，其系统分类地位一 直也存在些争议，利用d n a 序列分析的结合其形态特征，分析拟菱形藻系统 进化地位也是有着重要意义的。 最后，本文并尝试用d n a 的二级结构中的补偿性碱基改变现象( c b c s ) 分 析拟菱形藻的遗传多样性，为以后更深入的研究拟菱形藻，将更多的生物信息学 的方法引入拟菱形藻遗传多样性研究中奠定基础。 1 8 第= $ # 料i 珐 第二章材料和方法 2 1 自然样品的采集与藻株的分离、纯化 2 1 1 样品的采集 本文选择我国东南沿海具有代表性的海区作为采样点，包括长江口、厦r 港 海区、台湾海峡海区、广东太亚湾海区、香港海区、海口海区( 见蚓2 。从自 然海区采集水样，迅速运回实验室，直接刷于藻种分离或在水样中加入艘培 养基，置于光照培养箱中培养段时间后，进行目标藻株的分离。 黼 跫搿可海? p 门丫i ： 图2 1 我们东南沿海五个代表性采样海域 f i g 2 1 f i v er e p r e s e n t a t i v es a m p l i n gl o c a t i o n si ns o u t h e a s tc h i n as e a 2 1 2 藻株的分离、纯化和培养 藻种分离的具体方法参考张上璀( 1 9 9 7 ) 的方法并加以改进，主要采用了以 下2 种： 1 ) 微吸管分离法：选直径5 r n m 的细玻璃管，杠酒精灯上加热见熔时 快速拉成u 径极细的微玻管，微吸管另一端套接医用乳胶管。分离操作时， 用于指压紧乳胶管以控制吸取动作。将稀释的水样置于载玻片上，在显微镜 下把微吸管1 对准耍分离的单个藻丝或者单个藻细胞，放松于指，藻丝被吸 入微吸管：接着把吸出的水滴放在载玻片另一淌i f 2 ( 已灭菌) 水滴l ，显微 镜仔细检查水滴中是否只吸到藻丝。如果吸到所需要的藻，再重新吸出放存 另一滴艘( 已火菌) 水滴里，这样洗3 次，然后把分离出的藻吸到预先装柏 1 q 第二章材料和方法 f 2 培养液的5 m l 试管内。如不成功，再反复分离，直至达到单种分离的目的。 放在适宜的光照下培养。过5 天后在光镜下检查是否是目的藻种的单种藻， 如果不是重新分离纯化。 2 ) 稀释水滴分离法：先在显微镜下观察水样中目标藻的浓度大小，然后相 应的稀释，大约估计每滴水中含有一个藻体，用微吸管将藻液滴到消过毒的载玻 片上，液滴要尽量小，然后在显微镜下观察每个液滴中是否为单种藻，若是就可 转移培养，若不是则重复操作。 光镜检查为单种藻，培养用舵培养液，培养温度为2 0 1 ，光照4 0 0 0l u x ， 光暗比( l ：d ) 1 2 h ：1 2 h 。长到指数期时，取5 m l 藻液到5 m l 冻存管中，加入鲁 格氏液( l u g o l ss o l u t i o n ) 进行固定，用来制作光镜和电镜样品。剩余的藻液离 心收集提取d n a 。 2 2 主要试剂和仪器 2 2 1 主要试剂 1 ) r n a s ea 、蛋白酶k 、t r i s 饱和酚购自上海生工生物工程公司 2 ) d n a 分子量标记物：入d n a h i n d1 i i + e c o rim a r k e r ，d l 2 0 0 0 ，1 k p m a r k e r 大连宝生物公司。 3 ) g o l d v i e w t m 核酸染料购自北京赛百胜基因技术有限公司。 4 ) 啊s ( 三羟甲基胺基甲烷) 购自上海生工生物工程公司。 5 1n a 2 e d t a ( 乙二胺四乙酸二钠) 购自上海生工生物工程公司 6 ) r a q 酶、d n t p s 、m 9 2 十、1 0 b u f f e r 、p m d l 8 - tv e c t o r 购自大连宝生物公 司。 7 ) 琼脂糖购自上海生工生物工程公司和北京赛百胜基因技术有限公司。 其他试剂为进口或国产分析纯试剂。 2 2 2 主要培养基及溶液配制 1 ) 培养藻的培养基为铊培养基( g u i l l a r d1 9 7 5 ) ，见表2 1 。 第二章材料和方法 表2 - 1f 2 培养基配方 t a b l e2 一lt h ef o r m u l ao ff 2c u l t u r es o l u t i o n m a j o r n u t r i e n t sc o n t e n t n a n 0 3 n a h 2 p 0 4 h 2 0 n a 2 s i 0 3 9 h 2 0 n a 2 e d f e c l 3 6 h 2 0 c u s 0 4 - 5 h 2 0 z n s 0 4 7 h 2 0 c o c l 2 6 h 2 0 m c l 2 4 h 2 0 n a 2 m 0 0 4 2 h 2 0 t 1 1 i a m i nh c l b i o t i n b 1 2 s e a w a t e r 7 5 m g 5 m g 1 5 - 3 0 m g 4 3 6 m g 3 1 5 m g o 0 1 m g 0 0 2 2 m g 0 0 1 m g 0 1 8 m g o 0 0 6 m g 0 1 m g 0 5 9 9 o 5 9 9 t oo n e1 i t e r 2 ) 总d n a 提取缓冲液： 提取缓冲液a ( b u f f e ra ) ：3 c t a b ，1 0 0 m m o l lt r i s h c l ( p h8 0 ) ， 2 0 m m o l le d t a ( p h8 0 ) ，1 4 m m o l ln a c l 。 提取缓冲液b ( b u f f e rb ) ：3 c t a b ，1 0 0 m m o l lt r i s h c l ( p h8 o ) ， 2 0 m m o l le d t a ( p h8 0 ) ，1 4 m m o l ln a c l ，0 2 ( v v ) 巯基乙醇，l gp v p 。 酚氯仿异戊醇：按2 5 ：2 4 ：1 的比例混匀酚、氯仿、异戊醇，存放于棕色玻 璃瓶中，上覆盖一层1 0 m m o l lt r i s h c l 缓冲液，p h 8 0 ，4 0 c 储存备用。 t e 缓冲液( p h = 8 o ) ：1 m t r i s h c ll m l + 0 5 me d t a0 2 m l ，蒸馏水定容 到1 0 0 m l 。 3 ) 电泳缓冲液： t a e 缓冲液( p h = 8 0 ) ：5 0 ：2 4 2 9 s 碱，5 7 1 9 冰乙酸，1 0 0 m l o 5me d t a ( p h = 8 0 ) ，蒸馏水定容至l l 。 2 1 第二章材料和方法 2 2 3 仪器 本实验所用的仪器见表2 2 。 表2 - 2 实验所用的仪器 t a b l e2 - 2t h ei n s t r u m e n t su s e di nt h i se x p e r i m e n t 仪器名称 生产厂家 t g 卜1 6 g 台式高速离心机 国华s k 1 快速混匀器 立式压力蒸汽灭菌器 d k 8 d 型电热恒温水槽 z t p 8 0b 2 双门食具消毒柜 2 5 0 d 恒温光照培养箱 格兰仕w d 7 5 0 a s l 2 3 微波炉 星星s d 1 6 1 冷冻陈列柜 d y y - 8 b 型稳压稳流电泳仪 d y c 3 3 a 型电泳槽 w d 9 4 0 3 c 型紫外分析仪 o 删p u sb 2 光学显微镜 隔水式电热恒温培养箱p y x 光照培养箱l r h 15 0 g b e c k m a nd u 6 0 0 紫外分光光度计 f a l 0 0 3 型电子分析天平 凝胶成像系统u v p ( g d s 8 0 0 0 ) 型 p e 4 8 0 型p c r 扩增仪 上海医用分析仪器厂 常州国华电器有限公司 上海华线医用核子仪器有限公司 上海精宏实验设备有限公司 广东康宝电器有限公司 常州国华电器有限公司 顺德市格兰仕电器公司 浙江星星电器工业公司 北京市六一仪器厂 北京市