（生物化学与分子生物学专业论文）酿酒酵母st01的发酵特性与scar标记研究.pdf

扬州大学硕士学位论文 e d t a s d s n a a e e b m m h m l n i p t g x g a l d n a r a p d d n t p s s c a r r m l n g r n a s e 0 d r d f y p d l b 。p t r i s 符号说明 乙二胺四乙酸 十二烷基磺酸钠 醋酸钠 溴化乙锭 毫摩尔每升 小时 分钟 异丙基硫代半乳糖苷 5 溴4 氯一3 吲哚6 半乳糖苷 脱氧核糖核酸 随机扩增多态性d n a 组成d n a 的4 种核苷酸 特征序列区域扩增 转每分钟 重力加速度 核糖核酸酶 光密度值 真正发酵度 酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基 l u r i a b e r t a n i 培养基 p l a t o 三羟甲基氨基甲烷 4扬州大学硕士学位论文 摘要 本研究以酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 为研究对象，先进行常规啤酒 发酵试验，通过测定其发酵过程中的各项指标筛选到一株发酵性能优良的菌株 s t 0 1 ，再通过筛选r a p d 标记转化为s c a r 分子标记。克服了r a p d 标记的不 稳定缺点，同时保留了r a p d 标记的随机扩增多态性丰富、标记快速的优点，为 探索酿酒酵母快速准确标记提供了方法和数据，同时也为生产企业保护其专利菌 株提供了一个快捷、准确的方法。 以发酵性能具有代表性的不同来源的共8 株酿酒酵母进行啤酒发酵试验，比 较了不同菌株在发酵过程中的各项指标。试验结果显示：发酵试验重复性较好， 各项指标一致，其中s t - 0 1 菌株在啤酒发酵中具有凝聚性适中，产气能力强的感 官优势；在发酵第8 天出现双乙酰的峰值，其峰值为o 5 5m g l ，后又以较快的速 度发生双乙酰的还原，发酵结束时双乙酰的含量下降到0 0 5m g c l 左右，表明啤 酒快速成熟；酒精含量高达4 5 3 6g 1 0 0 m l ；发酵结束后发酵度达到了6 4 7 4 。而 其他7 株酿酒酵母的降糖能力远远小于s t - 0 1 菌株。相应的双乙酰和酒精含量的 变化也显示这7 株酵母的发酵性能低于s t - 0 i 菌株，预示s t - 0 1 是一株优秀的啤 酒酿造菌种。 将菌株s t - 0 1 和本实验室保藏的其他2 2 株酿酒酵母菌株分别进行分子比较， 寻找s t - 0 1 基因组特征序列作为分子标记。试用5 0 条随机引物对2 3 株酿酒酵母 基因组d n a 进行r a p d 扩增，优化后的r a p d 扩增体系为：模板d n a 为1 2 0 n g ， 2 5 m mm 9 2 + ，7 幻酶1 u ，2 0 0 p md n t p s ，1 0 p m o l 随机引物，反应总体积为2 5 1 a l p c r 热循环参数为9 3 2m i n ，3 6 1r a i n ，7 2 c2m i n1 次循环：9 3 1r a i n ， 3 6 lr n i n 7 2 2m i n ，4 0 次循环；9 3 lm i n ，3 6 1m i n ，7 2 1 0 m i n1 次循 环，筛选到p 0 9 和p 4 6 两条随机引物对s t 0 l 菌株具有较好的特异性。p 0 9 可以 从2 4 1 2 ，s t 0 1 ，s k 2 6 ，z d 0 1 四株酿酒酵母基因组d n a 中稳定扩增出长度为 4 3 3 b p 的s c a r - s c 4 3 3 片断；p 4 6 可以从2 1 8 8 2 ，s t - 0 1 ，n j 0 2 三株酿酒酵母基 因组d n a 中稳定扩增出长度为6 6 5 b p 的s c a r - s c 6 6 5 片断。供试菌株中仅有s t 0 1 能稳定的具有这两个扩增片段。对这两个片断进行回收后连接到p u c m t 质粒载 杨智酿酒酵母s t - 0 1 的发酵特性和s c a r 标记研究5 体，导入大肠杆菌d h 5 a 中，筛选阳性克隆，酶切鉴定后的质粒经过测序根据序 列设计了2 对特异性引物，建立了p c r 方法检测s c a r - s e 4 3 3 和s c a r s c 6 6 5 片 段，结果表明s t 0 1 可以特异性的扩增出这两个d n a 片段，显示了s t 0 1 与其 他菌株的分子差别。 本研究将s c a r - s e 4 3 3 和s c a r - s c 6 6 5 特征核酸序列作为s t 0 1 菌株的分子 标记为该菌株的生产应用以及进一步的改良育种奠定了基础。 关键词：酿酒酵母r a p ds c a r 双乙酰酒精含量发酵度 6 扬州大学硕士学位论文 a b s t r a c t s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei st h em a t e r i a lo f t h i ss t u d y f i r s t l y , w eh a df i n i s h e dt h e b e e rf e r m e n t a t i o n , t h e ns e l e c t i n gas t m i no fs t - 0 1b yd e t e c t i n gs o m e p a r a m e t e r so f f e r m e n t a t i o n s e c o n d l y ，w es e l e c t e dt h er a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) m a r k e r sa n dt r a n s l a t e dt h e s em a r k e r st os c a r ( s e q u e n c e dc h a r a c t e r i z e da m p l i f i e d r e g i o n ) m a r k e r s t h i sm o l e c u l a rm a r k e rm e t h o do v e r c o m e st h ed i s a d v a n t a g eo f r a p dm a r k e ra n dh o l d si t sa d v a n t a g e sw h i c ha r er a n d o ma n df a s t 。i th a sp r o v i d e d t h ea c c u r a t ed a t af o rt h ee x p l o r a t i o nt h ef a s ta n da c c u r a t em o l e c u l a rm a r k e r so n b r e w i n gy e a s t ，s i m u l t a n e o u s l ya l s op r o t e c t e di t sp a t e n ts t r a i n f o r t h ep r o d u c t i o n e n t e r p r i s ea n dp r o v i d e daq u i c k l ya n da c c u r a t em e t h o d t h i sr e s e a r c hc h o s et h ey e a s t sw h i c ha r eg o o df e r m e n t a t i o np e r f o r m a n c e t h e s e8 b r e w i n gy e a s t sc a nb eu s e di nt h eb e e rf e r m e n t a t i o n w ec o l l e c ta n da n a l y s et h e f e r m e n t a t i v ep a r a m e t e r s e a c hp a r a m e t e ro f f e r m e n t a t i o ni sc o n s i s t e n td u r i n gt h es a m e e x p e r i m e n t t h er e s u l ti n d i c a t e d ：s t - 0 1h a sg o o dp e r f o r m a n c ei ny e a s tf l o c c u l a t i o n a n dc 0 2p r o d u c t i o n i ti su pt ot h ep e a kv a l u eo fd i a c e t y lw h i c hi so 5 5m g lo nt h e 8 t hd a y , i tc a l lb ed e o x i d i z e ds u b s e q u e n t l y a tt h el a s t , t h ec o n t e n to fd i a c e t y li s r e d u c e dt oo 0 5m g l i tm e a n st h eb e e ri sm a t u r er a p i d l y t h ea l c o h o lc o n t e n ti su pt o 4 5 3 6g 1 0 0 m la n dt h ef e r m e n t a t i o nd e g r e ei s6 4 7 4 i nt h el a s tp e r i o do f f e r m e n t a t i o n o t h e r7y e a s t sa r ew o r s ep e r f o r m a n c et h a ns t - 0 1w i t hd e t e c t i n gs o m ef e r m e n t a t i o n p a r a m e t e r s os t - 0 1i sag o o db r e w i n gy e a s t sf o rb e e rf e r m e n t a t i o n w eh a v ef o u n d e dt h ed n ac h a r a c t e r i s t i cs e q u e n c eo fs t - 0 1t oo t h e r2 2y e a s t sf o r t a k i n gt h em o l e c u l a rm a r k e r w ee x t r a c t e dt h ed n a o f 2 3y e a s t sw h i c ha r ep r e s e r v e d b yo u rl a b o r a t o r y t h e nw ea m p l i f i e dt h e s ed n a w i t hr a n d o mp r i m e r s t h er a p d s y s t e mi s ：y e a s td n a 1 2 0n g ，2 5 r a mm 9 2 + ，t a q1 u ，2 0 0 p md n t p s ，1 0 p m o lr a n d o m p r i m e r s ，t h ea l lv o l u m e i s2 5 p , l p c rp r o c e s si s ：9 3 c2m i n , 3 6 c1m i n , 7 2 c2m i n o n ec y c l e 9 3 c1m b a ，3 6 c1m i n ，7 2 c2r a i n ，4 0c y c l e s ；9 3 c1m i n ，3 6 。c1m i n ， 7 2 c1 0m i no n ec y c l e 5 0r a n d o mp r i m e r sw e r et e s t e dt or a p da n a l y s i s 2e f f e c t i v e 杨智酿酒酵母s t - 0 1 的发酵特性和s c a r 标记研究 7 p r i m e r sn a m e dp 0 9 ，p 4 6w e r es e l e c t e d ，4s t r a i n s ( 2 4 1 2 ，s t - 0 1 ，s k - 2 6 ，z d 一0 1 ) c o u l d a m p l i f y4 3 3 b pf r a g m e n tw i t hp 0 9 ，a n d3s t r a i n s ( 2 1 8 8 2 ，s t - 0 1 ，n j 一0 2 ) c o u l da m p l i f y 6 6 5 b pf r a g m e n tw i t h p 4 6 t h e s et w od n af r a g m e n t sw e r ec l o n e di np u c m tp l a s m i d a n da m p l i f i e di ne c o l id h 一5 a s e l e c t e dt h ec o r r e c tc l o n e s t h e ne x t r a c t e dt h ep l a s m i d d n aa n ds e q u e n c e di ta f t e rd o u b l ed i g e s t i o n d e s i g n e dt h es c a rp d m e 培w i t h s o t t w a r e t h er a p dm a r k e r so f s t - 0 1c o u l db et r a n s l a t e di n t os c a r m a r k e r s o n l y t h es t - 0 1h a st h et w od n a f r a g m e n t ss i m u l t a n e i t y s t - 0 1i sa l s od i f f e r e n tf r o mo t h e r 2 2y e a s t s0 nd n a s e q u e n c e i nt h i sp a p e r , w em a k et h es c a r - s c 4 3 3a n ds c a r - s c 6 6 5t ob et h es c a r m a r k e r sc o u l da f f o r ds o m en e wi d e af o rf i n d i n go u tt h ed i f f e r e n c eo fs a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a es t r a i n s ，m a r k e r i n ga n db r e e d i n gt h ei n d u s t r i a ls t r a i n s k e yw o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e r a p ds c a r d i a c e t y l a l c o h o lc o n t e n t s f e r m e n t a t i o nd e g r e e 杨智酿酒酵母s t - 0 1 的发酵特性和s c a r 标记研究 9 文献综述 l 酿酒酵母及其应用 在真菌分类系统中，酵母包括5 6 个属，5 0 0 多个种，分别属于子囊菌纲 口s c o m y t e t e s ) 、担子菌纲( b 船翮。彬c p 把s ) 和半知菌f f ( f u n g i i m p e r f e c 田以及从真菌 各纲派生的退化类型。酿酒酵母属于真菌门，子囊菌纲，酵母属。在自然界分布 很广，有很多菌株，其中以酿酒酵母为最重要。酿酒酵母种类较多，包括多种不 同的菌株。酿酒酵母的学名为s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，拉丁语c e r e v i s i a e 意为麦 酒【1 1 。 酿酒酵母中丰富的维生素b 群、氨基酸、多种维生素、矿物质、核酸等，就 像是天然的综合维生素，可缓减压力、补充体力，是熬夜时有效的营养补给来源。 酿酒酵母的维生素b 群中天然维生素b l 含量也很高，维生素b 1 是参与能量代谢 的营养素，可维持心脏、神经系统的功能并能维持正常的食欲。酿酒酵母还富含 有机铬。有机铬对糖尿病的帮助( 如降低血糖、改善血脂等) 已获医学界的肯定。 许多欧美的新陈代谢科医生，也都会建议病患补充含铬食物，来改善第二型糖尿 病( 成人型糖尿病) ，所以藉由补充酿酒酵母获得优质的有机铬，可有效降低血糖， 而且无副作用产生。酿酒酵母中还含有抗氧化物质以及易消化的蛋白质，可加强 体力与免疫力的提升，对于许多正在进行癌症放射治疗或化学治疗的人而言，补 充酿酒酵母可以改善并增强病患的免疫系统。 酿酒酵母除了本身具有以上优点之外，其最重要的用途就是应用于啤酒酿造。 啤酒是风靡世界的饮料之一，是世界性饮料酒。啤酒的历史悠久，大约起源于9 千年前的中东和古埃及地区。后跨越地中海传入欧洲，1 9 世纪末传入亚洲。啤酒 是以大麦芽及啤酒花为主要原料，经酵母发酵而制成的一种含二氧化碳的低浓度 酒精饮料，它具有麦芽香和酒花爽口的苦味并含有多种氨基酸( 约1 7 种) 、蛋白 质、碳水化合物和维生素；其酒液中溶解的磷酸盐和无机盐可以维持人体的盐类 平衡和渗透压等。啤酒是一种平衡性很好的饮料，糖和蛋白质的比例最符合人类 的营养平衡，易于为人体吸收利用。因此，啤酒素有“液体面包”的美誉。在1 9 7 2 1 0扬州大学硕士学位论文 年世界第九次营养食品会议上，曾推荐啤酒为营养食品【z j 。最近的调查研究表明， 饮用适量的啤酒可以预防动脉硬化和心脏病。每天约饮一瓶啤酒的人其血液中有 益胆固醇的浓度较高，较高的有益胆固醇浓度对于预防和治疗动脉硬化将产生重 要作用。日本冈山大学药学部一位教授的研究调查表明啤酒原料啤酒花中的苦味 成分蓰草酮对癌症的发生具有抑制作用【3 l 。此外，饮用啤酒可以使肌肤健美，而 啤酒外用则可对皮肤炎症产生抑制效果。2 0 0 2 年我国啤酒总产量已赶上美国成为 世界第一啤酒生产大国，然而我国每年人均啤酒消费量不足2 0 升，距发达国家每 年人均啤酒消费水平( 德国，1 4 0 升人年) 和世界平均水平( 2 3 升人年) 仍有 一段距离，因此我国啤酒工业在以后仍然有很大的发展空间【4 】。 啤酒发酵是一个复杂的生物变化过程，其本质是麦汁经酿酒酵母发酵逐渐积 累相关代谢产物，形成特定风味物质的过程。影响啤酒质量的因素很多，而优质 的啤酒主要源于良好的发酵，酿酒酵母则是发酵的灵魂和命脉l5 1 。酵母的质量直 接影响到啤酒的质量，具有良好生理性能的酵母就成了保证啤酒质量的关键。 啤酒代谢产物中的酒精是主要代谢产物，酒精含量的高低直接反应酵母生长 和繁殖的速度。酵母在麦汁中生长时将麦汁中的大部分可发酵糖类转化为乙醇， 目前，啤酒生产中比较流行的高浓发酵法生产的啤酒的酒精含量最高可达到2 5 左右。一般啤酒的酒精含量为3 5 4 。 啤酒生产过程中的也产生许多代谢副产物，如：高级醇、挥发酯、醛类、双 乙酰等，其中双乙酰是判断啤酒成熟的主要标志。上世纪5 0 年代欧洲啤酒工业大 发展时期工业界为了日益扩大增加啤酒产量，广泛采用缩短啤酒酒龄，对啤酒成 熟指标的研究中发现当啤酒中双乙酰含量小于0 1 - 0 1 5 m g l 时，啤酒就成熟了。 双乙酰是挥发性的，有强烈的刺激性的化合物，是酿酒酵母的主要代谢副产物。 它是多种香味物质的前驱物质。酿酒酵母性能的好坏主要取决于酵母对双乙酰形 成和还原速度的影响。同时双乙酰含量的高低直接影响啤酒的口味，啤酒中双乙 酰的昧阂值为0 1 0 2 m g l 。超过此阈值时就会产生一种令人不愉快的馊饭味，影 响啤酒的风味。 酿酒酵母的凝聚特性是重要的生产特性，它会影响酵母回收再利用于发酵的 杨智酿酒酵母s t - 0 1 的发酵特性和s c a r 标记研究 1 1 可能，影响发酵速率和发酵度，影响啤酒的过滤方法选择，乃至影响到啤酒的风 味。一般发酵初期的酵母是分散的，等到发酵度达到凝聚点时细胞密度会突然降 低开始形成凝块聚集下沉。凝聚现象广泛存在于下面发酵法酿造啤酒中。凝聚性 是反应酵母在啤酒发酵过程中的重要指标。静置发酵过程中会沉积到容器底部。 酵母凝聚的主要原因是存在凝聚基因f l 0 1 、f l 0 2 、f l 0 4 。金属离子如钙离子 也是导致凝聚性的主要原因。凝聚性差的酵母发酵度偏低，代谢产物也比较少。 而酵母的过早凝聚或凝聚性过强也会导致最终的发酵度偏低。所以适中的凝聚性 对于酿酒酵母的啤酒发酵有着非常重要的意义。 酿酒酵母菌种的选用决定着酒类的风格、特点及产品质量。在啤酒发酵中性 能优良的酵母菌种在整个发酵过程中发酵速度快、发酵度高、凝聚性适中、沉淀 坚实、双乙酰峰值低、还原速度快、最终代谢产物赋予啤酒以良好的风味嘲。世 界各大型酿酒企业均有自己选育的独特的菌株，形成了酿造技术和酒类风味的多 样化。因此，探索酿酒酵母精确的分类标记方法对发酵过程的控制以及最终发酵 产品的质量具有重要意义。 2 酵母菌的鉴别与分类 人们对酵母菌的应用已有几千年，然而对其进行分类标记只有两百多年的历 史。酵母菌的标记方法包括传统标记法和现代标记法。 2 1 酵母传统鉴别方法 是否具有有性生殖过程，能否形成子囊孢子，具有掷孢子或冬孢子，以及孢 子的形状，特点，数目以及能否形成真假菌丝分类到纲，目，科；根据菌落形态， 细胞形状，增殖方式是否形成真假菌丝，结合少数糖类发酵和硝酸盐利用等试验 分类归属；根据生理特征，其中糖的发酵和同化试验最为重要，利用硝酸盐分类 到种。然而，由于酵母菌生长过程受到很多因素的控制，各不同菌种之间生理生 化差异不显著，而且同种菌株在鉴别时的结果也不稳定，常常导致鉴别出现误差。 这些缺点使传统的鉴定方法的应用受到了很大的限制。 2 2 酵母现代分类方法 扬州大学硕士学位论文 啤酒酿造过程中菌种难免受到污染，尤其酿酒酵母菌种受到野生酵母或是其 他类型酵母污染，在后期的分离鉴定工作也比较困难，几乎无法进行准确检测。 采用现代标记技术能有效克服这个缺点，而且在检测生产菌种退化方面能提供有 效的数据参考。 现代的酵母标记方法包括基于染色体的标记和基于d n a 分子水平的标记。 2 2 1 基于染色体的标记 在以染色体为基础的标记中，可以根据分析染色体的方法不同，有以下两种 标记方法。 脉冲电场凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳( p u l s e df i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s ， p f g e ) 是一种新型的酵母菌种鉴别系统，该技术是在琼脂糖凝胶中用电泳分离完 整的酵母染色体d n a 分子，从而估算酵母细胞染色体条数及每条染色体中分子 的大小，这种方法被称为电泳核型分析或分子核型分析或酵母染色体指纹图谱分 析。白逢彦根据生理生化反应将4 0 株酿酒酵母分成4 组，菌株a s 2 1 4 2 1 虽然其 表型性状与酿酒酵母的标准描述完全相符，却具有与酿酒酵母模式菌株差异明显 的脉冲电泳核型，不应归为酿酒酵母 7 1 。 温度梯度凝胶电泳温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，t g g e ) 比传统的电泳增加了一个新的分离参数，即分子构象。稳 定的构象由氢键和范德华力共同维系，并受环境温度、盐离子浓度、p h 值等因素 影响。如果环境温度升高到某一限定点就可以破坏氢键和范德华力，这时分子即 处于变性状态，此过程就称为热变性。温度梯度凝胶电泳( t g g e ) 就是利用不同 构象的分子具有不同的变性温度来进行分离的。m a r i s a m a n z a n o 等利用p c r 与 t g g e 技术从葡萄酒酿酒酵母中鉴定是否有污染的s 朋r 口咖x 淞酵母存在【8 】ob a r t t h e e l e n 等也利用t g g e 技术对从人体中分离得到的致病酵母进行了鉴定【9 j 。 2 2 2 基于d n a 分子水平的标记 随着分子生物学技术的迅速发展，d n a 标记技术己成为生态学家探讨种群遗 传变异的必然选择。d n a 相对于等位酶而言，具有更为丰富的变异，甚至能提供 杨智酿酒酵母s t - 01 的发酵特性和s c a r 标记研究 区分个体的特异“指纹”。同时试验材料易于获取，从化石到活体材料都可用，所 需材料微少，利用p c r 分析时所需的d n a 仅需几个n g 。但一般要求取用新鲜材 料，并严格控制d n a 的污染。该研究方法主要有限制性片段多长度多态法( r f l p ) 、 d n a 序列分析法、随机扩增多态d n a 法( r a p d ) 、扩增片段长度多态法( a f l p ) 、 d n a 指纹图谱法，d n a 杂交技术。以p c r 为基础的r f l p 、r a p d 、a f l p 以及 d n a 序列分析最为常用。 r d n a r r n a 序列分析r r n a ( r i b o s o m a lr n a ) h 日核糖体r n a ，酵母菌细胞质 核糖体的r n a 通常由于沉降系数不同而分为大亚基r r n a ( 2 3 - 2 8 sr r n a ) 、小亚 基r r n a ( 1 6 - - i 8 srr n a ) 、5 8 sr r n a 和5 sr r n a 。r d n a r r n a 序列分析法比较 精确可靠，并且有日益完善的i n t e r a c t 数据库和序列分析软件作为支撑，但该方 法相对较复杂，当菌株数量多时比较废时。b a l e i r a sc o u t o 利用部分2 6 s r d n a 限 制性片断作为工具鉴定红酒发酵过程。结果鉴定出除酿酒酵母以外的多种微生物 【1 0 1 。f e l l 等通过大亚基r d n ad 1 d 2 区序列分析对3 0 0 多株担子菌酵母和酵母状 真菌进行了分子系统学研究。结果表明，这些酵母菌种和属在系统发育上分布在 3 个纲的1 1 个进化枝中【1 l 】。对根据常规形态和生理生化性状难以确定分类学地位 的8 株假丝酵母菌，白逢彦等进行了以大亚基r d n ad 1 d 2 区的碱基序列分析为 依据的分子分类学研究，并确定了各个菌株的归属0 2 1 。c a i 等运用小亚基 ( 1 8 s ) r r n a 基因序列分析方法对子囊菌酵母4 个属的2 8 个菌株进行了分子系统学 研究。序列分析表明，b r e t t a n o m y c e sd e k k e r a 和d e b a r y o m y c e s 属显示了一定的同 源性，而k l u y v e r o m y c e s 属则具有显著的异源性【”1 。 限制性内切酶作用片段多态性限制性内切酶作用片段多态性( r e s t r i c t i o n e n z y m ef r a g m e n tp o l y m o r p h i s m ，r e f p ) 是指每种d n a 限制性内切酶都有特定的 作用位点，来源不同的菌株的d n a 分子、结构和序列不同，用某一限制性内切 酶作用后，会形成大小不等的一些片断，凝胶电泳后，经荧光染色，在紫外灯下 形成种( 株) 的特异性图谱，分析图谱可以达到区分菌株的目的f 1 4 j 。通过与模式菌 株的图谱比较来鉴定菌株。l e e 等用r e f p 方法成功地找到了葡萄汁酵母 u r a r u m ) 种内不同株与酿酒酵母之间的区分【1 5 1 。然而， r e f p 只是根据d n a 分子片断的 扬州大学硕士学位论文 大小来区分菌株，并不能反映出这些片断的结构以及它们在原来d n a 分子中的 位置i i6 】。 限制性酶切片段多态性限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 是1 9 8 6 年由p e d e r s e n 等人发明的一项分子标记的新技术。 因为限制性内切酶能够识别双链d n a 分子中的特异核苷酸序列，并且在特异位 点切割d n a 分子，产生一系列大小各异，长短不一的d n a 限制性片断。由于不 同的种，菌株等个体中的d n a 核苷酸序列既同源又存在遗传变异性，所以经过 限制性内切酶的酶切消化。同源d n a 限制片断在不同来源个体中的长度可能有 所变异这种变异就称为限制性片段长度多态性。r f l p 是r e f p 的改进形式，用 d n a 探针和分子杂交技术，特异性更强。r f l p 特别适用于构建遗传连锁图，在 分析种群内和种群间的遗传变异度，种群闻基因流的评价及谱系和亲缘关系时也 是很有用的工具【1 7 】，但其缺点也是很明显的如要大量高纯度的d n a 、检测步骤 烦琐、周期长、探针制备费功夫、提供的信息有限、只能检测限制性内切酶识别 位点上的变异，需要使用放射性同位素，对使用者和环境构成危害等【l 引。 扩增片断长度多态性扩增片断长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 是19 9 3 年由荷兰科学家z a b e a u 和v o sp i c t e r 发明的一种 分子标记技术【曲】。该技术的基本原理是对酵母基因组d n a 进行分离经过酶切， 用特殊的接头连接d n a 片断的两端形成特异片断利用p c r 以及p a g e 技术进行 扩增和分离鉴定【2 0 1 。该技术具有多态性丰富，共显性表达，不受环境影响，无复 等位效应，带纹丰富，用样量少，灵敏度高，快速高效等优点【“j 。 简单重复序列简单重复序列( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，s s r ) 或微卫星指真核 生物基因组中均含有的一类由1 6 个碱基串联而成的基本序列【2 2 1 。简单重复序列 在群体中通常经过多年的变异具有很高的多态性，而且一般为共显性，因此是一 类很好的分子标记【2 3 1 。1 9 9 1 年，e d w a r d s 的“简单重复序列”( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 或“简单串联重复”是上述命名的连续。目前已利用微卫星标记构建了人类、小 鼠、大鼠、水稻、小麦、玉米等许多物种的染色体遗传图谱。这些微卫星标记已 被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析或品种鉴定、农作物育种、 杨智酿酒酵母s t - 0 1 的发酵特性和s c a r 标记研究1 5 进化研究等领域【2 5 锄。由于微卫星d n a 是一种简单重复序列，其核心单位由1 - 6 个核苷酸组成，两侧一般是保守序列，又由于它具有共显性，多态性高，可进行 p c r 扩增分析，既简单又经济，因此是一种很有价值的分子标记【2 3 】。 2 1 3 酵母的r a p d 鉴别技术 随机扩增多态d n a 技术( r a n d o m l ya m p l i f i e d p o l y m o r p h i e d n a ，r a p d ) 是1 9 9 0 年由w i l l i a m s 和w e l s h 首先提出的【2 9 枷1 。它是基于1 9 8 5 年m u l l i s 发明的多聚酶 链式反应( p c r ) 而发展起来的。它利用随机合成的寡聚核苷酸序列为引物( 一般为 1 0 个b p ) ，分别与d n a 的两条单链结合，在d n a 寡聚酶的作用下对基因组的特 定区域进行p c r 扩增，经过3 0 - 4 0 个循环反应，能把极少量的目标基因在几小时 内扩增上百万倍1 3 ”，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭( e b ) 染色来 检测扩增产物d n a 片段的多态性。这些扩增d n a 片段的多态性反应了基因组相 应区域的d n a 多态性。r a p d 所用的一系列引物d n a 序列各不相同，但对于某 一特定的引物，它同基因组d n a 序列有其特定的结合位点。这些特定的结合位 点在基因组某些区域内的分布如符合p c r 扩增反应的条件，即引物在模板的两条 链上有互补位置，且引物3 端相距在一定的长度范围之内，就可扩增出d n a 片 段。如果基因组在这些区域发生d n a 片段的插入、缺失或碱基突变就可能导致 这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使p c r 产物增加、缺少或发生分子量 的改变。通过对p c r 产物的检测即可测出基因组d n a 在这些区域的多态性。对 于r a p d 来说。不同的引物扩增同一基因组d n a 产生的片段数目不同，同一引 物扩增不同基因组d n a 产生的片段数目也不同。扩增的多态性d n a 即可通过 r a p d 图谱来检测。在基于d n a 分子的分类中随机扩增多态d n a 技术具有突出 的优势。 近年来的研究表明：r a p d 具有个体、种群、亚种、种等各层次水平的特异 性。且这种变异是按孟德尔方式遗传的，因而是一类优良的遗传标记【3 2 】。与其它 d n a 多态性分析技术相比，r a p d 技术具有以下一些独到的优势和特点： 在基于d n a 分子的分类中随机扩增多态d n a 技术具有突出的优势。r a p d 所用的引物是人工合成的，因此两个基因组之间的微小差异也可以反映出来， 1 6扬州大学硕士学位论文 r a p d 技术相对于其它多态性检测技术来说方法简便易行，可以直接对生物d n a 进行多态性分析，研究所需d n a 量极少，r a p d 引物没有严格的种属局限，对 模板d n a 质量要求不严 r a p d 技术也存在一定的局限性，它是一种显性标记，不能有效鉴别杂合子， 且易受反应条件的影响，稳定性较差，可重复性小，对反应的微小变化十分敏感。 t a q 聚合酶的来源、d n a 的不同提取方法、p c r 仪的不同型号都会影响的结果。 因此，在r a p d 研究中需要严格控制d n a 模板的质量和扩增反应条件【3 3 1 。 2 1 3 特征序列区域扩增 特征序列区域扩增( s e q u e n c e dc h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o ns c a r ) 是由p a r a n 等人在1 9 9 3 年提出的一种新型分子标记，属于位点特异的p c r 标记方法。用于 抗生菜霜霉病的r a p d 标记转化为s c a r 标记获得了成功【3 4 】。s c a r 的简要步骤 和优点：对基因组d n a 做r a p d ，然后把目标r a p d 片断进行克隆，测序并以 此设计出一对特异性引物。一般是r a p d 引物的3 端与5 端延长1 4 个碱基。利 用两端各2 4 个碱基引物进行p c r 特异性扩增。将原来目标r a p d 片断相对应的 单一位点鉴定出来。这样的位点称为s c a r 。现在又出现了由a f l p 转化的s c a r 标记。原理基本一致。由于使用较长的引物和较高的退火温度，既保持了分子标 记的鉴定功能又获得了常规p c r 的稳定可靠的特点。此外s c a r 还具有转化显性 r a p d 标记为共显性s c a r 标记的可能。如果为显性可以直接染色检测。s c a r 目前是分子标记技术中能直接应用的首选标记。 s c a r 技术主要应用在分子分类标记技术上。一般都是由r a p d 标记转化为 s c a r 标记。微生物的s c a r 标记应用尤其广泛。c a s t r i l l o 等人也是运用从r a p d 到s c a r 标记找出土壤中球孢白僵菌的三个菌株间特异性标记，这些标记能对1 0 0 株球孢自僵菌g h a 的基因组d n a 进行p c r 扩增检测，也能用于土壤中不同类 别的真菌的检测【”1 。c l e r c q 等人对苹果表皮的毕赤酵母的菌株k 和其他3 0 株酵 母( 其中包括2 1 株毕赤酵母) 进行s c a r 标记把r a p d 扩增的菌株k 的2 0 0 0 b p 标记转化为s c a r2 6 2 b p 的标记，且标记十分稳定口6 】。 动植物的s c a r 分子标记应用也相当广泛。b r i s s e 等利用s c a r 技术对克氏 杨智酿酒酵母s t - 0 1 的发酵特性和s c a r 标记研究 1 7 锥虫的鉴定。通过r a p d 转化s c a r ，标记出六种克氏锥虫( 3 刀。w a n g 等人对海 带进行r a p d 种质资源分析，从中筛选出多个多态性标记并从中筛选了3 个标记 转化为s c a r 标记，这对海带的分子育种有很大的意义【3 钔。r o h 等研究朱砂根的 交叉授粉时利用r a p d s c a r 技术证实了v m 品种的后代是w m 品种的父本1 3 9 j 。 a f l p 由于其稳定准确的优点相对于r a p d 有较大的优势。s c h m i d t 等人却是 基于a f l p 标记技术对赭曲霉种间特异性结构的s c a r 分子标记。它的主要方法 是通过对7 0 株从巴西咖啡上分离的赭曲霉进行a f l p 片段的荧光和指纹分析，再 通过p a g e 电泳确定特异性条带，然后切胶回收重组克隆后测序设计s c a r 引物， 最后建立起来s c a r 标记h o l 。c h ek e p e n g 等人对西瓜种质资源进行分子鉴定时 同时比较了r a p d ，s s r ，a f l p 等技术，发现a f l p 技术准确，可靠，并且将其 中一条特异性标记转化为s c a r 标记时得到清晰稳定的约2 5 0 b p 的条带【4 1 1 。 s c a r 技术在植保和植物生理领域中的应用也非常多。邹继军，杨庆凯等人 对与大豆灰斑病抗病基因连锁的共显性标记o p s 0 3 6 2 0 和o p s 0 3 5 8 0 的2 个r a p d 特征片段o p s 0 3 6 2 0 和o p s 0 3 5 8 0 转化为s c a r 标记【4 2 1 。r w c u t l e r 等在荔枝栽 培过程中依靠温度诱导花期，将与花期诱导的连锁基因的r a p d 标记转化为 s c a r 标记【4 3 1 。 s c a r 标记与s o u t h e r nb l o t 分析，降落p c r ，d g g e 等技术联合使用对于育 种分类的应用有重大意义。杨英军，王跃进等人利用葡萄无核基因的1 8 b p 探针扩 增了5 9 0 b p 的片段进行s c a r 标记【4 4 j ，该标记随后用于引物设计并利用s o u t h e r n b l o t 分析对无核品种进行检测取得了良好的应用1 4 5 1 。y a k u b o v 等人在开心果的育 种研究中利用r a p d 找出9 0 5 b p 雌性标记和9 0 9 b p 雄性标记，再利用降落p c r 技术扩增出2 9 7 b p 的片段1 4 6 1 。这个s c a r 标记可以高特异性的检测开心果雌雄特 性。z h a n g 等把d g g e c 温a 度梯度凝胶电泳) 和a f l p ，s c a r 技术比较应用于大 西洋鲑和虹鳟的分子鉴别【4 刀。结果是d g g e 稳定性不如由a f l p 转化的s c a r 标 记。但是s c a r 研究中只有个种间特异性标记。而细胞色素b 的d g g e 鉴定 可应用于鉴别大西洋鲑中是否掺杂虹鳟。 目前，已经出现的分子标记种类很多如：r a p d ，r f l p ，a f l p 。s s r 标记。 扬州大学硕士学位论文 但标记效果最好的还是s c a r 标记。因为s c a r 标记十分稳定，在应用上具有迅 速、简便、低成本的特点，非常适合于样品的大量分析。田义轲等研究了苹果柱 型基因的s c a r 标记的可靠性也证明了s c a r 标记十分稳定p 引。s c a r 标记技术 将会比其他分子标记技术有着更加广泛的应用。但是目前s c a r 技术应用的领域 不够宽广，大多用于植物育种中的性状标记，一些微生物的分子标记研究的较少。 特别是一些工业生产菌种的标记研究相对滞后。今后应当在微生物标记育种等方 面做更多的工作。此外，s c a r 技术的研究重点要向连锁基因的s c a r 标记倾斜， 这将对下游表达等育种工作提供基础材料。意义十分重大。多种技术与s c a r 技 术结合使用也是一种发展方向。这将拓宽s c a r 技术的应用方向，使其不仅仅作 为分子标记的一种还是分子辅助育种的一种重要手段。 3s c a r 分子标记技术在酿酒酵母标记中的应用 r a p d 技术因其简便、灵敏、对材料要求不高等特性，一经出现很快就广泛应 用在种属的分类鉴定、种下分类、遗传连锁图的构建等多方面的研究，尤其在不 知道基因序列的物种的鉴定及物种的亲源关系和进化方面的研究有着独到之处。 近年来国内外发表了很多关于r a p d 技术研究酵母遗传多样性的报道，证实和澄清 了许多菌种之间的亲缘关系，使许多传统分类学上的难题得以解决。 ，s c a r 标记一般都是由r a p d 标记转化为s c a r 标记。微生物的s c a r 标记应用 尤其广泛。c a s t r i l l o 等人也是运用从r a p d 到s