（生理学专业论文）小鼠类乳腺干细胞的分离、培养和鉴定.pdf

中文摘要 哺乳动物的乳腺是唯一在动物出生后可以多次再生、退化的器官。不同发育时期的动物乳腺 中都存在一定比例的干细胞。正是这些干细胞维持和保证了乳腺发育的特性。利用类乳腺干细胞 蒋生乳腺是近两年来兴起的项高新技术，具有咀下四个方面的重要意义：为那些冈乳腺肿瘤或 癌症而切除乳腺的妇女修复或再生功能性乳腺：为那些需要隆聃的女性提供安全可行的填充瓶材 料i 为将健康成年雌性家音乳腺改造成为分泌约用或保健用蛋白的乳腺提供一个实验动物的技术 平台：为其他器官的发育、再生或修复提供方法、思路年理论借鉴。 我们以小鼠为模犁，运用组织化学、免疫荧光组织( 细胞) 化学、流式细胞仪分选方法( f a c s ) 以及分子生物学手段，研究了小鼠乳腺的发育规律；小鼠乳腺编织中类乳腺千细胞；小鼠乳腺细 胞的分离、培养以及类乳腺千细胞的鉴定；小鼠类乳腺干细胞分化的擀能：小鼠乳腺类腺体体外 短期培养富集类乳腺干细胞体系的优化等。研究结果表明： 1 3 周龄的b a l b c 小鼠是去除乳腺腺体的最佳时期： 2 不同发育时期乳腺组织中都存在类乳腺干细胞j 3 6 8 周龄和怀孕期小鼠是获得大量类乳腺干细胞的理想时期； 4 首次证明体外短期培养的乳腺类腺体体系中，有一些细胞可以表达一定量的胚胎干细胞 的特异性表达抗原基因o c t - 4 、r e x ，：上皮干细胞的特异性表达抗原基因i n t e g r i n 肛，： 大部分已知干细胞共表达鹩抗甄基因b c r p i a c 堙2jj 5 小鼠类乳腺干细胞移植到去除乳腺腺体的小鼠乳脂垫中，可以再生功能性乳腺，网此， 类乳腺干细胞在体幽具有分化潜能： 6 小鼠类乳腺干细胞在体外诱导泌乳体系中培养7 天，可以表达b 酪蛋白及其基冈，表明 类乳腺干细胞在体外具有分化潜能； 7 首次建立了优化的乳腺类腺体体外短期培养富集类乳腺干细胞体系，由此体系培养的类 腺体获得类乳腺干细胞( s e a l - 1 + ) 的比例远远高于文献报道使用体系获得类乳腺干细胞 比例： 8 小鼠乳腺类腺体结构体外短期培养获得的细胞中有一定量的类乳腺干细胞存在：优化体 系培养2 2 小时获得的细胞的类乳腺千细胞( s e a l 1 + ) 比例远远高于培养7 2 ，j 、时获得细 胞的比例：相反，表达造血干细胞特异性抗原c d 3 4 的细胞( c d 3 4 + ) 比例在培养7 2 小时比培养2 2 小时高：同时，培养的体系中还有一定比例的s e a l 1 + c d 3 4 + 细胞存在。 总之，随着对类乳腺干细胞研究的深入我4 f _ j 急需找到类乳腺干细胞的特异性表达抗原。 在此之前，仍然只能以造血干细胞的特异性表达抗原s c a 一i 作为一个标记，进行类乳腺干细 胞的分析和分选研究。进一步研究类乳腺干细胞的特异性表达谱，以期能够找到类乳腺干细 胞的特异性表达抗原，分离得到类乳腺干细胞作为发育生物学和再生生物学研究的模型。 另外，如果能对乳腺类腺体体外短期培养富集类乳躲干缅胞体系进 i 优化，或许可以馍索适 台类乳腺干细胞体外扩增的培养体系。 关键词：小鼠乳腺：类乳腺干细胞；s e a l 1 ；c y t o k e r a t i n ：分化；培养；漉式细胞仪 a b s t r a c t m a m m a r yg l a n di sau n i q u eo r g a n ，w h i c hc a r lp o s m a t a l l yr e g e n e r a t e ，t e r m i n a l l yd i f f e r e n t i a t e ，a n d i n v o l u t eu p o ns u c c e s s i v ec y c l eo fp r e g n a n c y , l a c t a t i o n ，a n di n v o l u t i o n ，r e s p e c t i v e l y , a n dp r o v i d e sa n o p t i m a lm o d e lf o rt h es t u d yo fo r g a n o g e n e s i s ，d i f f e r e n t i a t i o n ，a p o p t o s i s ，a n dp a t t e mf o r m a t i o ni n v o l v e d i nd e v e l o p m e n t 、t h i si m p r e s s i v er e n e w a lc a p a c i t yi sd u et ot h ef u n c t i o no fam u l t i p o t e n tm a m m a r y g l a n ds t e m c e l l p o p u l a t i o n t h er e s e a r c ho fm a m m a r ye p i t h e l i a l s t e mc e l l sh a s m a n ys i g n i f i c a n t m o a n i n gs u c ha sr e b u i l d i n gw o m a n b r e a s t sa f t e rs u r g i c a l s e c t i o n i n gb e c a u s eo ft h eb r e a s tt u m o r so r c a n c e r s ，e n l a r g i n gl a d yb r e a s t f o rm o r eb e a u t i f u l ，r e g e n e r a t i n gt r a n s g e n i cm a m m a r yg l a n d ss e c r e t i n g m e d i c a lo rt o n i c p r o t e i n s f o r t h e r a p i n gg e n e t i cd e f i c i e n td i s e a s e s o rf o rh e a l t h i e ri n h u m a n ，a n d e s t a b l i s h i n gm o d e l s f o ro r g a n o g e n e s i s i n g ，c e l ld i f f e r e n t i a t i o na n d r e g e n e r a t i o n ，a n ds o o n t h u s ，i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ed e v e l o p m e n t a lp a t h w a y sn o to n l yi n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no f g r o w t ha n dp a t t e r n i n g ，b u ta l s oi nt h ed e t e r m i n a t i o no fc e l ll i n e a g e sa n dd i f f e r e n t i a t i o n ，w eu t i l i z e dt h e f l u o r e s c e n ti m m u n o h i s t o c h e m i c a im e t h o d s ，f l o wc y t o m e t r y a n a l y s i ss o r t i n g ( f a c s ) a n dm o l e c u l a r m e t h o d st oi n v e s t i g a t et h ed e v e l o p m e n t a ll a wo fm a m m a r y g l a n d a tt h ed i f f e r e n td e v e l o p m e n t a ls t a g e s ， d i s t r i b u t i o no f t h es t e mc e l l si nm a m m a r y g l a n d ，t h em e t h o d so f i s o l a t i o n ，c u l t u r ea n de v a l u a t i o nf o rt h e s t e mc e l l s ，t h em u l t i p o t e n ta b i l i t i e si nv i v oa n di nv i t r o ，a n dt h ee f f i c i e n tc u l t u r a ls y s t e mf o rs t e mc e l l s e n r i c h e di nv i t r o t h er e s u l t ss h o w e db e l o w ： 1 2 3 4 6 7 t h e o p t i m a ls t a g eo f c l e a r i n gt h em a m m a r yg l a n df r o mf a tp a di st h e3 - w e e k o i di nb a l b cm i c e t h e r ea r es t e mc e l l si nt h em a m m a r y g l a n d sa ta n ys t a g eo fp o s t n a t a ld e v e l o p m e n t t h eb e s ts t a g e so f g a i n i n gt h es t e mc e l l sf r o mt h em a m m a r yg l a n d sa r ew h e nt h em i c ea r e6t o8 w e e k so l do ri np r e g n a n ts t a g e t h e m a m m a r ye p i t h e l i a l s t e mc e l l s ，s o r t e dw i t h a n t i s e a l 1 a n t i b o d yb y t h ef a c s h a v e m u l t i p o t e n ta b i l i t i e sb e c a u s et h e yc o u l db ei n d u c e dt om i m i ct h ef u n c t i o no f m a m m a r yg l a n dt o p r o d u c et h em i l kc o m p o n e n tf l - e a s e i ni nv i t r oa n dc o u l d r e g e n e r a t et h ef u n c t i o n a lm a m m a r yg l a n d s a si n j e c t i n gi n t ot h ec l e a r e df a tp a d s f i r s t l yi nm a m m a r ye p i t h e l i a ls t e mc e l l s ，w ei n v e s t i g a t e dt h a tt h e r ew e r es o m ec e l l st oe x p r e s st h e s p e c i f i cg e n e s ，d e f n e di ne m b r y o n i cs t e mc e l l so ro t h e rk n o w ns t e mc e i l l i n e a g e s ，s u c ha so c t 4 。 r e x - 1 ，i n t e g r i n f l l ，b c r p l a c b g2 a n dc d3 4 e s t a b i s h e da no p t i m a lc u l t u r a ls y s t e mf o re n r i c h e d m a m m a r ye p i t h e l i a ls t e mc e l l s ，f i r s t l a f 醅r b e i n gc u l t u r e di no p t i m a lc u l t u r a ls y s t e m nv i t r of o r7 2h o u r s ，w ec o u l ds o r t3 0 o f m a m m a r v s t e mc e l l s ( s e a l - 1 。) i nt h ec e l l sd e r i v e df r o mt h em a m m a r y o 氇n o i d sa n dt h ep e r c e n t a g e so fs t e r n c e l l sw a s h i g h e rt h a nt h a to f t h er e f e r e n c e ，b u tl e s st h a to f t h ec e l l sc u l t u r e d 砌p f 幻f o r2 2h o u r s w es o r t e ds e v e r a lp e r c e n t a g e so fc d 3 4 + c e i l sd e r i v e df r o mt h ec u l t u r e dm a m m a r y g l a n do r g n o i d s a n dt h ep e r c e n t a g e so fc d 3 4 + c e l l si n2 2 - h o u r c u l t u r a ls y s t e mw a sl o w e rt h a nt h a to f t h e7 2 - h o u r c u l t u r a ls y s t e m t h e s er e s u l t sn e e dt ob ei n v e s t i g a t e df u r t h e l v i ns u m m a r y , w es h o u l di n v e s t i g a t et h em o r ee f f i c i e n tc u l t u r a ls y s t e mf o rm a m m a r yo r g n o i d si n v i t r of o re n r i c h e dm o r em a m m a r ye p i t h e l i a ls t e mc e l l s ，a n dt os c r e e nt h e e x p r e s s i o np r o f i l e s i n m a m m a r ye p i t h e l i a ls t e mc e l l st od i s c o v e rt h es p e c i f i cm a r k e rf o rm a m m a r ye p i t h e l i a ls t e mc e l l si n o r d e rt ou t i l i z et h em o d e lo f m a m m a r y e p i t h e l i a ls t e mc e l l st or e g e n e r a t et r a n s g e n i cm a m m a r yg l a n d si n c o wo r s h e e p f o rh u m a n h e a l t h ，t ou n c o v e rt h em e c h a n i s mo f o r g a n o g e n e s i s ，a n dd i f f e r e n t i a t i o n k e yw o r d s ：m o u s em a m m a r yg l a n d ；s t e mc e l l s ；s c a l - 1 ；c y t o k e r a t i n ；d i f f e r e n t i a t i o n ；c u l t u r e ；f l o w c ”o m e t 叫a n a l y s i ss o r t i n g v l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 易易i 雹 b t f , j ：h 移年z 月习日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：_ 方品u q 时间：p 碑年二月弓r 导师签名 冲， ( 令冬 ， 时间：。够多月4 n i i i 第一部分文献综述 干细胞是来自胚胎、胎儿或成人的一类具有长期白我复制和多向分化潜能的特殊细胞，可分为 两人类，即胚胎干细胞和成体干细胞，其区别见表l 一1 ( h t t p ：、j v w w n i h 。g o v n e w s s t e m c e l l s c i e p o r t h t m t ) 。) 。 人类最早对干细胞的研究起始于2 0 世纪初。p a p p e n h e i m ( 1 9 1 7 ) 对骨髓中成血发生进行了观 察研究。首次提出了组织干细胞的假设：骨髓中存在未分化的干细胞。他们认为这些未分化的干 细胞通过形成中间过渡类型的前体细胞，最终生成相麻的多种血液细胞。2 0 世纪5 0 年代t 儿个 实验小组通过骨髓移植，使骨髓辐射损伤的小鼠造血功能恢复的实验，证实了p a p p e n h e i m5 0 年 前的假说( l o r e n z ，e ta l 1 9 5 1 ；f o r d ，e ta i1 9 5 6 ；n o w e l l ，e ta l1 9 5 6 ) 。从此，人们认识井接受了骨 髓中存在的造血干细胞可以再生血液的理论和事实。 自1 9 8 1 年e v a n s 和和k a u f m a n 成功分离小鼠胚胎干细胞、1 9 9 8 年t h o m s o n 等成功分离人 胚胎干细胞后，胚胎干细胞的研究就成了生物学和医学领域的研究热点。1 9 9 8 年意大利科学家f e r r a r i 等在s c i e n c e 上发表了一个具有深远意义的发现：骨髓干细胞能够迁移到非骨髓组织例如， 损伤的肌肉组纵，并且可以参与损伤组纵的修复以及更新骨骼肌( f a r r a r i ，e ta l1 9 9 8 ) 。此研究结 果激发了科学界关丁成体干细胞可塑性研究的热潮。此后有芙成体干细胞可塑性以及庇川性的 研究成为世界权威杂志如( s c i e n c e ) ) 和 n a t u r e ) ) 报道热点。 2 0 0 1 年6 月，美国国家卫生研究院健康与人类服务学系综合分析了国际上约1 2 0 0 篇有关干 细胞文献，在互联网上公布了一篇长达1 0 5 页的文章外加9 6 页的附件：“干细胞：科学进展和朱米 研究方向”( s t e mc e l l s ：s c i e n t i f i cp r o g r e s sa n df u t u r er e s e a r c hd i r e c t i o n ) f h t t 口：w w w n i hg o v n e w s s t e m c e l l l s c i e p o r t h t m l ) 。为什么干细胞研究会受到如此重视? 为什么干细胞研究会受到如此重 视? 这是因为千细胞研究对传统的发育生物学以及组织再生和修复理论是一个很大的挑战，对于 某些疾病的防治具有重要意义，在生产克隆动物、转基因动物、新型药物研制和组织t 程等方面 夜广阔的应崩前景，并蕴藏着巨大的商机。当然。在伦理上，还有一些问题尚待解决。 如果说e v a n s 和k a u f m a n2 0 0 1 年成功培养小鼠胚胎干细胞、1 9 9 8 年t h o m s o n 等成功培养人 胚胎干细胞打开了人类对干细胞研究憧憬的大门。那么2 0 0 3 年干细胞研究领域取得的成就则使 人们感觉到了干细胞应用时代的气息。2 0 0 3 年5 月法国国家科研中心和美国宾西法尼亚人学的科 研人员在科学发表文章宣布，他们已成功将老鼠胚胎干细胞( e s 细胞) 转化为卵细胞( h u b n er e ta l 2 0 0 3 ) 。这是科学家首次在试管中从e s 细胞培育出生殖细胞。无独有偶，2 0 0 3 年1 21 f j 同样是 老鼠胚胎干细胞，可以在体外诱导获得精子细胞，并且具有授精能力( t o y o o k a ，e ta l2 0 0 3 ：v o g e i ， 2 0 0 3 ) 。这不仅将为解决不育、操纵细胞性特征和开展生殖生物学机理及生理学基础研究带来新 的前景，而且将使生物学家有可能从干细胞中得到无数卵子和精子，使严格意义上实验室“生产” 胚胎成为可能( v o g e l ，2 0 0 3 ) ，以完善治疗性克隆技术。 1 胚胎干细胞 1 1 胚胎干细胞研究现状 综述一千细胞研究与应用 哺乳动物的胚胎在囊胚期前，胚胎中的每个细胞都具有全能性或多能性。因此，科学家将桑 葚期或囊胚期胚胎的内细胞团分离，在体外抑制分化的条件下进行培养，大量增殖建立胚胎干细 胞系。1 9 8 1 年，e v a n s 和k a u f m a n 最早分离和研究了胚胎干细胞，并在n a t u r e 杂志上发表了该 研究结果。从此，科学界掀起了胚胎干细胞的研究热潮。小鼠胚胎干细胞大致的过程就是将小鼠 的延迟发育的囊胚的内细胞团分离出来并打散，然后培养在s t o 饲养层细胞上培养获得了小鼠 胚j f i 干细胞系。与胚胎干细胞相近的一种多能细胞是胚胎生殖细胞，可从附植后的胚胎( 大约5 1 0 周龄) 的性腺原嵴( 在胚胎发育稍后期，性腺原嵴可发育成为睾丸或卵巢，而原始生殖细胞可 形成卵子或精子) 中将原始生殖细胞分离山来，在抑制分化的条件卜，例如在饲养层细胞s t o m e f 上培养或者是在培养体系中添加l i f 网子，进行体外培养建立细胞系。目前，获得胚胎干细胞系 和胚胎生殖细胞系的方法都是基于以上的基本方法，加以改进斤获得的。干细胞具有自我“复制” 和分化的能力，在分裂过程中或产生两个完全等同的干细胞，或一个等同自己的干细胞与一个祖 细胞。形成两个等同干细胞的过程是干细胞自我复制的过程，而形成两个不同细胞的过程则为干 细胞的分化过程。祖细胞的分化潜能比干细胞著一些，但是仍然具有自我“复制”和分化的潜能。 祖细胞分裂时同样可以形成两个等同的祖细胞或两个特定其他细胞，这两个其他细胞就是分化末 端的细胞，不能再进行复制。一般地，祖细胞的分裂速度和频率比干细胞快，以便更新正常新陈 代谢死亡的细胞，以及修复受损组织的细胞，维持组织及其功能的完整性 ( h i t p ：1 w w w n i h g o v n e w s l s t e m c e l l l s c i e p o r t h t m l 自从1 9 8 1 年e v a n s 和k a u f m a n 分离培养获得小鼠胚胎干细胞系以来胚胎干细胞的研究就 成为生物领域一个研究热点。t h o m s o n 等人在1 9 9 8 年，发表了人胚胎干细胞的成功分离培养。 使人类对胚胎干细胞的研究更加积极，同时使人类对细胞发育有了新的认识，对胚胎干细胞在医 学领域的应用前景充满了信心。在动物胚胎干细胞的研究方面，科学家已经成功地获得仓鼠 ( d o e t s c h m a n te ta l1 9 8 8 ：p i e d r a h i t a ，e ta l9 9 0 ) 、大鼠( 1 a n n a c c o n e ，e t a l1 9 9 4 ) 、兔( g i l e s ，e t a l9 9 1 ，1 9 9 3 ：g r a v e s ，e ta l 1 9 9 3 ：s c h o o n j a n s ，e ta l1 9 9 6 ：n e i m a n na n ds t r e l c h e n k o ，1 9 9 4 ：v s i l ，e v a l e ta l1 9 9 8 ，赖学良等，1 9 9 4 ) 、猪( e v a n s ，e t a l 1 9 9 0 ：a n d e r s o n ，e ta l 9 9 4 ；n o t a r i a n n i ，e ta l1 9 9 0 ， 1 9 9 1 ；p i e h r a h i t a ，e ta l 1 9 9 0 a ，1 9 9 0 b ；s t r o j e k ，e ta l1 9 9 0 ：g e r f e n ，e ta l1 9 9 1 ；o n r s h ia n d y o u n g s 1 9 9 3 a ，1 9 9 3 b ：t a l b o t ，e ta l1 9 9 3 a ，1 9 9 3 b ；g e r f e na n d w h e e l e r ，1 9 9 5 ：c h e n ，e ta l 1 9 9 9 ) 、牛( s t r e c h e n k o ， e ta l1 9 9 1 ：s a i t o ，e t a l1 9 9 2 ：s i m m sa n df i r s t ，1 9 9 5 ) 、羊( h a n d y s i d e ，e t a l1 9 8 7 ：f l e c h o n ，e ta l 1 9 9 0 ：p i e d r a h i t a ，e ta l1 9 9 0 a ：t s u c h i y a ，e ta l 1 9 9 4 ) 、和水貂( s u k o y a n ，e ta l1 9 9 2 ，1 9 9 3 ) 以及 灵长类的e s 细胞( t h o m s o n ，e ta l 1 9 9 5 ) 。从1 9 8 1 年开始到1 9 9 8 年，短时期内，胚胎干细胞的 研究得到了迅猛发展，而且取得了突破性的进展，给人类战胜一些医学上 2 的顽症如帕金森综合症、癌症咀及糖尿病等带来了曙光。因此，1 9 9 9 年被s c i e n c e ) ) 杂志列为 十大科学进展之首( f l o y d ，e la l1 9 9 9 ) 。 表l - ! 胚胎干细胞与成体干细胞的主要区别( t a b l e 1 - it h em a i nd i f f e r e n c e sb e t w e e n 在中国，丛芰情等在1 9 8 7 年最早分离并建立了1 2 9 c 3 h 小鼠e s 细胞系( 丛笑情，1 9 8 7 ) ，随 后，尚克刚等建立了c 5 7 b l 6 x 1 2 9 等1 1 个品系小鼠e s 细胞( 尚克刚，1 9 9 2 ，1 9 9 3 ，1 9 9 4 ) 。冯 秀亮( 1 9 9 9 ) 、徐军( 1 9 9 7 ) 在西北农业大学研究猪胚胎干细胞；赖学良( 1 9 9 5 ) 在东北农业大 学研究家兔胚胎干细胞；冯书堂在中国农业科学院畜牧研究所研究猪胚胎干细胞( 2 0 0 2 ) 等陆续 开展了家畜胚胎干细胞的研究。徐令等( 1 9 9 8 ) 在中山医科大学分离培养成功了人胚胎干细胞： 乔春平等( 1 9 9 9 ) 将其诱导分化形成了浆细胞；2 0 0 0 年徐令等将其诱导形成了造血干细胞。许新 等人( 1 9 9 9 ) 建立了人的胚胎原始生殖细胞系( e g ) 。中国科学院昆明动物研究所的裴轶劲等( 2 0 0 1 ) 对灵长类动物猕猴的胚胎干细胞的分离培养进行了研究。 由于胚胎干细胞具有全能性( 指发育为机体不同特定细胞的能力) 、体外不断扩增性( 在体 外适宜条件下，能在术分化状态下无限扩增) 和可操作性( 可进行遗传操作选择，如导入异源基 因、基冈打靶) 等生物学特性，冈此它在生命科学各个领域都有重要的作用和诱人的应用前景。 1 2 胚胎干细胞的应用 1 2 1 生产克隆动物的高效材料 用胚胎干细胞作为细胞核的供体进行核移植后，在短期内可获得大量基因型和表型完全相同 的个体( g o s s l e r , e t a l 1 9 8 6 ；r o b e r t s o n ，e ta l1 9 8 6 ) 。它明显优于体细胞克隆动物，后者易出现严重 的免疫功能缺陷和突变( g o s s l e r , e ta l1 9 8 6 ；r e x r o a da n dp u r s e l 1 9 8 8 ) 。 1 2 2 生产转基因动物的高效载体 目前常用的转基冈动物的生产方法是向受精卵中注射目的基闻。外源性基因的整合表达、筛 选工作只能在个体水平上进行。利用胚胎干细胞系作为载体，体外定向改造胚胎干细胞( t h o m a s a n dc a p o c c h i 。1 9 8 7 ：c a p e c c h i ，e la l1 9 8 9 ；r o b e r t s o n ，e ta l1 9 9 1 ) ，使得基因的整合数目、位点、表达 程度和插入基囡的稳定性及筛选a 作等都在细胞水平上进行( t e m p l e t o n ，1 9 9 7 ；s t a u b e r , 1 9 9 8 ； h a d i a n t o n a k i s ，e ta l1 9 9 8 ；t o m o m u r a ，e ta l2 0 0 1 ) ，从而可获得稳定、满意的转基闻胚胎干细胞系 ( g o s s l e r ，e t a t1 9 8 6 ；t h o m a s a n d c a p e c c h i ，1 9 8 7 ) 。经动物克隆途径，可获得携带目的基囡的转基 田动物或与胚胎嵌合得到嵌合体动物，胚胎干细胞在嵌合体中发育成为全能性的生殖细胞，即可 得到携带目的基因的转基因动物( b r a d l e y ，e t a l1 9 8 4 ；r o b e r t s o n ，e ta l1 9 8 7 ，1 9 9 1 ) 。 1 2 3 发育生物学研究模型 到目前为e 。有关人类早期胚胎发育的知识基本上是由胚胎解剖与比较_ | 丕胎学的研究结果。 要真止了解胚胎发生、器官分化以及细胞分化的机制，需要有完整的胚胎发育样本。才能揭示其 中的奥秘。但是，这些都受到伦理等方面的约束。胚胎干细胞多有分化多能性，尤其可以实现体 外分化为生殖细胞。而且有望实现体外生产胚胎。这样就可以提供大量的胚胎便于研究胚胎形成、 细胞分化的分子机制等( a b e ，e ta l1 9 9 6 ；r a t h j e n ，e ta l1 9 9 8 ；d o e t s c h m a n ，e ta i1 9 9 3 ；d i n s m o r e ，e ta l 1 9 9 8 ；d u n c a n ，e t a l1 9 9 8 ；k e l l e r ，e t a t1 9 9 5 ；d a n i ，e t a t1 9 9 9 ；s c h u l d i n e r , e ta l2 0 0 0 ) 。随着人类基因组学 研究和基因芯片等生物技术的应i i = j ，比较胚胎干细胞及其不同发育阶段细胞的基因转录和表达， 可确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，有助于发现新的基阕( t h o r e y , e ta t1 9 9 8 ；s a l m i n e n e ta l 1 9 9 8 ；b a k e r , e t a l1 9 9 7 ；w e i s s 、e ta l1 9 9 6 ；g o s s i e r , e ta l1 9 8 9 ) 。 1 2 4 新型药物研究手段 胚胎干细胞提供了新药的药理、药效、毒理及药物代谢等细胞水平的研究手段，可火大减少 药物实验所需的动物数量。此外，还可用于研究某些疾病的发生机制，以便找出有效的治疗方法 ( j o n e sa n dt h o m s o n ，2 0 0 0 ) 。 1 2 5 组织器官修复和移植治疗研究 通过胚胎干细胞的定向分化取代受损的组织细胞或器官，胚胎干细胞作为移植源细胞和基囡 f f 疗源细胞，其免疫排斥效应不大。如对胚胎干细胞的基网作某些修改，也可创建“万能供者细 胞”，即破坏胚胎干细胞中表达特异性组织相容性复合体的基因，由此可避免免疫排斥反应( 华 进联等，2 0 0 1 ：周林等，2 0 0 1 ) 。应用雄性大鼠骨髓问充质干细胞向真皮定向分化，可促进肉芽 形成和创面愈合e 在雌性大鼠的受损真皮中出现雄性大鼠s t y 基冈表达。另一项研究显示。大鼠 真皮问充质干细胞参与了皮肤创伤绍织的再生和修复。局部微环境可诱导真皮闻充质干细胞的增 殖、运动和分化，同时还可使干细胞通过增强生长| j j | 子和特异性蛋白( c d l 3 8 ) 的表达促进组织修 复。 胚胎干细胞应用前景中最重要也是最令人兴奋的是，胚胎干细胞在体外可以诱导分化为具有 功能的精子和卵母细胞，经过受精过程能够形成新的个体( t 0 ”o k a ，e ta l2 0 0 3 ；h u b n e r ，e ta l2 0 0 3 ： v o g e l ，e ta l2 0 0 3 ) 。这样，艮期以来干细胞治疗过程中所涉及的伦理问题就会迎刃而解。 于细胞的研究的终极目的是人们企盼能为解决人类的疾病服务。由于干细胞的全能性，用其 开发生产人体的多种器官和组织的可能性已不是一句空话。从理论上讲，就像换零件一样，今后 利用干细胞移植可以治疗所有的疾病。在应用方面，首先，要建立人胚胎干细胞，使它能诱导复 4 制出人类需要的组织与器官，诸如，软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞和神经细胞等。冈此，以 发展干细胞工程来治疗修复组织的缺损是医学未来发展的方向。如以正常体细胞核移入去核的受 体卵细胞质中，培养并分离出胚胎干细胞，继后将其定向诱导分化出各种专能的细胞来治疗各种 疾病。建立的动物模型实现了胚胎干细胞移植治疗糖尿病( s o d a ，c ta 1 2 0 0 0 ) ：治疗肝纤维化 ( k o b a y a s h i e ta l2 0 0 0 ) ：治疗骨生成障碍和肌菱缩( h o r w i t z ，e ta l 1 9 9 9 ) ，治疗骨髓损伤引起的 运动瘫痪( m c d o n a l d 。e t a l1 9 9 9 ) ：治疗谷氨酸受体引起的听力系统障碍( d u a n ，e ta l2 0 0 0 ) ：治疗 髓鞘缺陷型人鼠的髓鞘( b r u s t l e ，e ta l1 9 9 9 ) ；河南医火一附院用神经干细胞移植成功治疗瘫痪动 物；治疗帕金森氏综台症( s t u d e r , e ta l1 9 9 8 ) ，以及许多遗传性疾病( h a w l e y , e t a l2 0 0 1 ) 。这 试验启迪人们以培养神经干细胞并行移植，为治疗各种神经疾患带来希望。 总之，胚胎干细胞的研究表明，干细胞是在生长发育过程中起骨干作用的原始细胞。这种细 胞具有臼我更新、高度增殖和多向分化的潜能。特别是人体胚胎干细胞，可以分化成人体多种类 型，进而构建人的心脏、肝脏等组织器官最终发育成一个完摧的个体。因此人体胚胎干细胞是 一种全能干细胞。从已有的研究干细胞及人体胚胎干细胞的成果看出，今后对人类各种病变、衰 老组织和器官的修补和替代，甚至对癌症的治疗、神经疾患和白身免疫性疾病、遗传性疾病均有 可能带来治疗的希望。因此干细胞的研究成为新世纪研究的新热点是必然的发展趋势。就已获得 成果，人们己在某些成年动物身体中提取出了能够分化、生长为各种组织的干细胞。如果在人体 上也能得到进一步证实，那么，人类的治疗观念将会发生巨人转变，目前在器官移植及某些疾病 治疗过程中遇到的问题会迎刃而解。 2 成体干细胞研究现状 在人们的传统观念里，一直认为来自特定组织的成体干细胞只局限于分化成所在组织的细胞 类型。并且，这种成体干细胞发育限定性的观点长久受到了经典胚胎学实验的支持。然而，1 9 9 7 年体细胞克隆绵羊“d o l l y ”的诞生，使人们认识到成年体细胞在特定环境下，其核可以重新被编程 从而逆分化为全能的发育细胞( w i l m u t ，e t a l 1 9 9 7 ；t o y o o k a ，e t a l2 0 0 3 ；h u b n e r e ta l2 0 0 3 ：v o g e i ， e la l2 0 0 3 ；c h e n ，e la l 2 0 0 4 ；d i n g ，e ta l2 0 0 3 ) 。从此科学家们开始重新思索成体干细胞的分化潜 能，并进行了一系列的探索研究。结果显示，组织特异性干细胞不仅具有分化成自身组织细胞的 特性t 同时还可以迁移到其他器官，横向分化为其他器官组织细胞类型，进行损伤性修复或进行 细胞正常新陈代谢的更新( k o p e n ，e t a l 1 9 9 9 ；c l a r k e ，e ta l2 0 0 0 ；g a l l i ，e ta l2 0 0 0 ；b _ o r n s o n ，e ta i 1 9 9 9 ： f e r r a r i ，e ta l1 9 9 8 ；j a c k s o n ，e ta l 1 9 9 9 ；p e t e r s e n ，e la l 】9 9 9 ；a l i s o n ，e ta l2 0 0 0 ；l a g a s s e , e ta 】2 0 0 0 ： e g l i t i s ，e ta l1 9 9 7 ；m e z e y , e ta l2 0 0 0 ；b r a z e l t o n ，e ta l2 0 0 0 ；x u ，2 0 0 4 ) 。因此。成体干细胞具有可塑性 如表1 - 2 、表1 - 3 、表l 一4 、表i - 5 、表1 - 6 列举了不同成体干细胞移植后可以横向分化为多种组织 细胞。 国内在成体干细胞的研究上已有良好的进展，如己掌握了造血于细胞的分离、纯化、冷冻和 保存以及复苏的一套技术。重庆妇幼保健院生殖遗传所完成囊胚期胚胎培养技术，上海复h 人学 遗传所体外培养神经干细胞成功，井把有治疗作用的有关基因转入人体外培养的神经干细胞中移 植。这种被移植的神经干细胞不仅能补充大脑内神经干细胞的不足，进行功能代偿，同时使用治 疗作用的外源基因“定向催毁憾内已发生变性的神经元，抑伟病情恶化。北大医学部已经建立人 类非病毒转化角膜于细胞体外培养体系以及一些成体干细胞库。此外，据徐荣祥报告，他在烧伤 修复的原位也找到了干细胞。上述的事实表明，国内在于细胞的研究领域中也已取得良好的进展。 表l - 2 全骨髓组织的可塑性f t a b l e ! - 2t h ep l a s t i c i t yo f t h ei n t a c tm a r r o w ) 2 1 造血干细胞研究及应用 造血干细胞( h e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ，h s c ) ：在骨髓、脐血和外周血中的都存在着造血干 细胞，据此可以将其分为骨髓造血干细胞、外周血造血干细胞和脐带造血干细胞。造血干细胞在 骨髓细胞中i _ l l 万1 1 1 5 万在外周血液中ij j1 1 0 万。干细胞表达c d 3 4 抗原，脐血中c d 3 4 + 细胞含量约占1 ，单位体积的含量与骨髓相当。造血干细胞不仅可以分化为血液中的各种细胞， 同时还有分化为非血液细胞的组织细胞( 表1 2 ，3 ) 表l _ 3 造血干细胞的可塑性( t a b l e1 - 3t h ep l a s t i c i t yo fh a e m a t o p o i e t i cs t e mc e l l s ) 发表时间研究者 筛选标记靶细胞 1 9 9 9 g u s s o n i 等h o e c h e s t3 3 3 4 2骨髂肌细胞 2 0 0 0 l a g a s s e 等 c - - k i t 、t h y 1 、肝细胞 s c a l 1l i n 。”w 2 0 0 1 o r l i c 等l i n - c - - k i t 心肌细胞、血管系统 2 0 0 1 k o c h e r 等c d 3 4 + 血管系统 2 0 0 1 j a c k s o n 等h o e c h s t3 3 3 4 2 ，i 二, j l j l , 、内皮细胞 2 0 0 1 k r a u s e 等“h o m e d ” 肺泡、支气管、食管、胃、 小肠、人肠、胆管、皮肤 _ 一 造血干细胞移植是目前治愈重度白血病和某些遗传性血液病的惟一希望，另外造血干细胞移 植对肿瘤和某些免疫疾病也有治疗作用t 我国已进行了约2 0 0 0 例造血于细胞移植。移植时需供 者和受者的白细胞抗原匹配才不产生排斥反应。孪生兄弟姐妹间白细胞抗原可完全匹