（生理学专业论文）学习、运动促进成年大鼠海马齿状回神经发生及提高空间学习能力.pdf

学习运动促进成年太鼠海马齿状田神蛙生生置提高空阃学习性力 学习、运动促进成年大鼠海马齿状回 神经发生及提高空间学习能力 中文摘要 目的：( 1 ) 观察y 迷宫训练、踏转轮运动对成年大鼠海马齿状回( d e n t a t e g y m s ，d g ) 神经干细胞前体细胞的增殖作用；( 2 ) 观察踏转轮运动增 殖的细胞分化性质及其对空间学习记忆能力的影响。 方法：( 1 ) 通过y 迷宫训练、踏转轮运动分别建立学习及运动的模 型，经腹腔注射5 溴2 脱氧尿嘧啶核苷( 5 - b r o m o 一2 一d e o x y u r i d i n e ，b r d u ) 标记增殖细胞，巢蛋白( n e u r o e p t h e l i a ls t e mc e l lp r o t e i n ，n e s t i n ) 标记神 经前体细胞；用免疫细胞化学a b c ( a v i d i n b i o t i nc o m p l e x ) 法进行检测， 以大鼠海马齿状回b r d u 及n e s t i n 阳性细胞为观察指标，探讨y 迷宫训 练、踏转轮运动对成年大鼠齿状回细胞增殖的作用；( 2 ) 采用y 迷宫及 m o r r i s 水迷宫法检测大鼠空间学习记忆能力。( 3 ) 利用b i i i 型微管蛋白 ( t u b u l i n ，t u j 1 ) 标记不成熟的神经元、胶质原纤维酸性蛋白( g l i a l f i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ，g f a p ) 标记星形胶质细胞，对踏转轮运动增殖的 细胞分化性质进行鉴定。 结果：( 1 ) 成年大鼠海马齿状回可见少量的b r d u 阳性细胞，分布在 齿状回颗粒细胞层( g r a n u l a rc e l ll a y e r ，g c l ) 、颗粒下层( s u b g r a n u l a r l a y e r ，s g l ) 及门区，其中颗粒下层最多；( 2 ) 成年大鼠海马齿状回n e s t i n 学习运动促进咸丰太鼠海马齿状田神旺置生废捷禹空问晕习靶力 阳性细胞排列稀疏，位于齿状回颗粒下层，并向颗粒细胞层内伸展；( 3 ) y 迷宫训练增加海马齿状回b r d u 及n e s t i n 阳性细胞数，且y 迷宫学习 训练成绩的优劣与海马齿状回b r d u 阳性细胞数的多少密切相关，训练 成绩越好，海马齿状回细胞增殖越多；( 4 ) 踏转轮运动也增加海马齿状 回b r d u 及n e s t i n 阳性细胞数，促进齿状回细胞增殖，且这种增殖作用 具有强度依赖性，低强度运动对神经干细胞前体细胞的增殖作用最明 显；( 5 ) 踏转轮运动增殖的细胞大多数分化为星形胶质样细胞，也有少 量为神经元样细胞，它们共同影响海马的生理功能。( 6 ) 踏转轮运动改 善y 迷宫及m o r r i s 水迷宫学习成绩，提高与海马相关的空间学习记忆能 力。 结论：( 1 ) 成年大鼠海马存在神经发生，其生发区位于齿状回颗粒下 层；( 2 ) y 迷宫训练和踏转轮运动均能促进成年大鼠海马齿状回细胞增 殖：( 3 ) 踏转轮运动能够提高y 迷宫及m o r r i s 水迷宫学习成绩，提示踏 转轮运动通过增强海马齿状回细胞增殖，从而改善空间学习记忆能力。 关键词：神经发生：y 迷宫；踏转轮运动；齿状回；b r d u l i 作 者：徐卫平 指导教n -郭试瑜教授 聿习，运动促进成年戈孔海马齿救田神经发生厦提南空问学习晚力 荚主摘蔓 l e a r n i n ga n dr u n n i n ge n h a n c en e u r o g e n e s i s i nt h e h i p p o c a m p a l d e n t a t eg y r u so fa d u l tr a t sa n di m p r o v e s p a t i a ll e a r n i n ga b i l i t y a b s t r a c t o b j e c t i v e ：( 1 ) t oi n v e s t i g a t e t h ee f f e c t so fym a z el e a r n i n ga n d m o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n go nn e u r a ls t e mc e l l p r e c u r s o rp r o l i f e r a t i o ni n t h e h i p p o c a m p a l d e n t a t e g y m so f a d u l t r a t s ( 2 ) t o o b s e r v et h e d i f f e r e n t i a t i o no fn e w l yg e n e r a t e dc e i l sb ym o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n g a n dt h e i re f f e c t so nt h ep e r f o r m a n c eo fs p a t i a ll e a r n i n g m e t h o d s ：( 1 ) ym 啦l e a r n i n ga n dm o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n gw e r e u s e dt om a k et h em o d e l so fs p a t i a ll e a r n i n ga n dp h y s i c a le x e r c i s e ， r e s p e c t i v e l y i n t r a p e r i t o n e a li n j e c t i o n ( i p ) o f5 - b r o m o 一2 d e o x y u r i d i n e ( b r d u ) ，t h et h y m i d i n ea n a l o g ，t h a tc a ni n c o r p o r a t e di n t ot h ed n ad u r i n g t h esp h a s eo fc e l l c y c l e ，w a sa p p l i e d t om a r kc e l l p r o l i f e r a t i o n n e u r o e p t h e l i a ls t e mc e l lp r o t e i n ( n e s t i n ) e x p r e s s i o nw a su s e dt oi d e n t i f y n e u r o p r e c u r s o rc e l l s t h eb r d u - p o s i t i v ec e l l sa n dn e s t i n - p o s i t i v ec e l l s w e r eo b s e r v e da sc e l lp r o l i f e r a t i o n ，w h i c hw a se x a m i n e db yu s i n gb r d u , n e s t i na n da v i d i n b i o t i nc o m p l e x ( a b e ) i m m u n o c y t o c h e m i c a lt e c h n i q u e ( 2 ) t h ea b i l i t yo fs p a t i a ll e a r n i n ga n dm e m o 叫w a se v a l u a t e db yym a z e a n dm o r r i sw a t e rm a z el e a r n i n g ( 3 ) t u b u l i n ( t u j 1 ) w a su s e dt ol a b e lt h e i l l 学习，遗动促进成年走鼠海马齿状四神经发生厦提高空闻学习能力 美主摘要 i m m a t u r en e u r o na n dg l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ( g f a p ) t ol a b e lt h e a s t r o c y t e b o t ho ft h e mw e r ec o n d u c t e dt od e t e r m i n et h ed i f f e r e n t i a t i o n o fn e w l yg e n e r a t e dc e l l sb ym o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n g r e s u l t s ： ( 1 ) a f e wb r d u p o s i t i v ec e l l sw e r ev i s u a l i z e di nt h e h i p p o c a m p a ld e n t a t eg y m so fa d u l t r a t s t h e s ec e l l sw e r el o c a t e di n g r a n u l a rc e l ll a y e r ( g c l ) 、s u b g r a n u l a rl a y e r ( s g l ) a n dh i l u s ，s p e c i a l l y , m o s to fw h i c hi ns g l ( 2 ) n e s t i n p o s i t i v ec e l l s i n t h eh i p p o c a m p a l d e n t a t eg y r u so fa d u l tr a t sw e r el o o s e l ya r r a y e d ，l o c a t e di nt h es g la n d e x t e n d e di n t ot h eg c l ( 3 ) ym a z el e a r n i n ge n h a n c e dt h en u m b e ro f b r d u - p o s i t i v ec e l l sa n dn e s t i n - p o s i t i v ec e l l si nt h eh i p p o c a m p a ld e n t a t e g y r u s a n dt h e r ew a sat i g h tc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ep e r f o r m a n c eo fy m a z el e a r n i n ga n dt h en u m b e ro fb r d u - l a b e l l e dc e l l si nt h ed e n t a t eg y m s t h eb e t t e rt h ep e r f o r m a n c et h e ya c h i e v e d ，t h em o r ec e l lp r o l i f e r a t i o nw a s ( 4 ) m o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n ga l s oi n c r e a s e db r d u - p o s i t i v ec e l l sa n d n e s t i n - p o s i t i v ec e l l so fd e n t a t eg y r u s ，e n h a n c i n gc e l lp r o l i f e r a t i o ni nt h e d e n t a t eg y r u s i na d d i t i o n ，t h ee f f e c to fr u n n i n go nc e l lp r o l i f e r a t i o nw e r e i n t e n s i t y - d e p e n d e n t ，a n dt h ei n c r e a s i n ge f f e c tw a sm o r ep o t e n ti nl i g h t i n t e n s i t yg r o u p ( 5 ) t h en e w l yg e n e r a t e dc e l l sb ym o t o r - d r i v e nw h e e l r u n n i n gw a sd i f f e r e n t i a t e di n t on e u r o n l i k ea sw e l la sa s t r o c y t e - l i k ec e l l s ， m o s to fw h i c hw e r ea s t r o c y t e l i k ec e l l s ( 6 ) m o t o r - d r i v e nw h e e lr r u n n i n g f a c i l i t a t e dt h ea c q u i s i t i o no fym a z ea n dm o r r i sw a t e rm a z el e a r n i n g i v 学习、运动促进成年太鼠海马齿状田神妊发生厦捉南空间学习幢力 英文摘要 t a s k s ，a n de n h a n c e dt h eh i p p o c a m p u s - d e p e d e n ts p a t i a ll e a r n i n ga b i l i t y c o n c l u s i o n s ： ( 1 ) n e u r o g e n e s i s o c c u r e di na d u l tr a t h i p p o c a m p u s ， l o c a t e di ns g lo fd e n t a t eg y r u s r 2 ) b o t hym a z e l e a r n i n g a n d m o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n gi n c r e a s e dt h ec e l l p r o l i f e r a t i o n i nt h e h i p p o c a m p a ld e n t a t eg y m so fa d u l tr a t s ( 3 ) m o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n g i m p r o v e dt h ep e r f o r m a n c eo fym a z ea n dm o r r i sw a t e rm a z el e a r n i n g ， i n d i c a t i n gt h a tt h ee n h a n c e m e n to fl e a r n i n ga b i l i t ya f t e rm o t o r - d r i v e n w h e e lr u n n i n gc o u l db em e d i a t e db yt h ec e l lp r o l i f e r a t i o ni nh i p p o c a m p a l d e n t a t eg y r u s k e yw o r d s ：n e u r o g e n e s i s ；ym a z e ；m o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n g ；d e n t a t e g y m s ；b r d u v w r i t t e n b y ：x uw e i p i n g s u p e r v i s e db y ：p r o f g u os h i y u y 7 8 1 7 6 8 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学 或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律 责任。 研究生签名：互金量墨e t 期：塑羔： 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文 合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的 复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本 人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文 外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分 内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名： 导师签名： 期：型 期：世 鞋 学习，遗动健进点年太鼠毒马啬状田神蛙生生噩提高空闻学习螗力 引言 引言 长期以来，人们一直认为成年哺乳动物脑内神经元的丧失是永久性 的，不存在神经再生。1 9 6 5 年，a l t m a n 和d a s 利用3 h 胸腺嘧啶核苷放 射自显影技术，发现成年大鼠脑内有新生神经元的产生【1 1 。随着研究的 深入和技术的进步，这一现象在小鼠、沙鼠、豚鼠、鸟、猴、树嗣甚至 人类中均存在2 。】。可见，成年哺乳动物脑内存在多潜能的神经干细胞 ( n e u r a ls t e mc e l l ，n s c ) ，即指存在于神经系统中能够增殖分化成神经 元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特定神经前体细胞，其基本生物学 特性主要包括多向细胞分化和自我更新的能力。 神经干细胞常常是与其产生的不同级别的神经前体细胞同时存在， 且难以仔细区分，因此统称为神经干细胞前体细胞。神经干细胞前体细 胞在一定条件下进行增殖、存活和分化的过程称为神经发生 ( n e u r o g e n e s i s ) 。现在一般认为，成年哺乳动物脑内终生存在神经发生， 其生发区位于侧脑室的脑室下区( s u b v e n t r i c u l a rz o n e ，s v z ) 和海马齿状 回( d e n t a t e 酣r u s ，d g ) 的颗粒下层( s u b g r a n u l a rl a y e r ，s g l ) 【1 ，2 一。 成年哺乳动物神经发生的发现，给神经变性和脑外伤导致的脑功能 退化提供了可能的治疗策略，包括移植外源性神经于细胞和体内自身神 经干细胞的再动员。对于前者，已有大量的研究和成功的实验报道：后 者近年来成为神经科学界研究的热门。目前，国内外对在体神经干细胞 的研究主要集中在探讨自体神经干细胞激活的影响因素及其生物学功 能。 学习、适动证进点年走冀霹马鸯状田神拄炭生晨挺高空坶荦习托力 海马( h i p p o c a m p u s ) 是学习记忆的重要脑区，近年来有关成年哺乳 动物海马神经发生的研究受到广泛关注。成年哺乳动物海马神经发生在 正常生理条件下处于较低水平，但在特殊环境或某些病理条件下可以增 强或降低。研究表明，成年海马齿状回的神经发生受多种因素的调控， 包括生理因素和病理因素。促进神经发生的因素有丰富多彩的环境、生 理活动( 如学习、运动) 、癫痫、缺血、生长因子如碱性成纤维细胞生 长因子( b f g f ) 、脑源性神经营养因子( b d n f ) 、胰岛素样生长因子1 ( i g f 1 ) 、血管内皮生长因子( v e g f ) 等】；抑制神经发生的有衰老、 应激和5 羟色胺( 5 - h t ) 缺失等 7 q 7 】。 以往的研究证实，学习训练作为一种重要的生理活动可以调控成年 海马的神经发生。g o u l d 等【1 8 1 研究了m o r r i s 水迷宫学习与成年大鼠海马 齿状回新生细胞变化的关系。结果显示，依赖海马的学习 ( h i p p o c a m p u s - d e p e n d e n tl e a r n i n g ) 促进齿状回新生细胞的存活：不依赖 海马的学习( h i p p o c a m p u s i n d e p e n d e n tl e a r n i n g ) 对海马神经发生没有影 响。l e m a i r e 等【1 9 1 在研究出生前应激对海马神经发生的作用时发现， m o r r i s 水迷宫学习促进海马齿状回神经干细胞前体细胞增殖。经典的眨 眼条件反射和m o r r i s 水迷宫学习还能促进海马齿状回新生神经元的存活 【1 8 _ 2 0 1 。有人利用甲基偶氮甲醇( m e t h y l a z o x y m e t h a n o la c e t a t e ，m a m ) 对 增殖细胞的毒性作用，来耗竭海马新生神经元，结果发现，依赖海马的 恐惧条件反射( f e a rc o n d i t i o n i n g ) 学习任务不能顺利完成；停止给药， 细胞增殖恢复，依赖海马的学习记忆明显改善【2 1 1 。用y 射线照射大鼠头 学习，适动促进 年太鼠海马齿状田神蛀发生覆j t 高空问学习能力 引t 部阻断海马神经发生，发现动物的长时记忆出现障碍【2 2 1 。这些结果表明， 成年海马神经发生确实受依赖海马的学习记忆任务的影响，并可能参与 此学习记忆的形成。 i 临床阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 最主要的表现为认 知和记忆功能障碍，动物空间记忆测试是研究认知功能机制的最常用方 法之一。以往有关学习记忆对海马神经发生的研究大多使用m o r r i s 水迷 宫训练方法【1 8 2 2 1 ，而m o m s 水迷宫训练方法的结果易受动物运动机能状 态、水温及实验室环境因素的干扰。因此，本实验目的之一是通过y 迷 宫训练方法，5 溴2 脱氧尿嘧啶核苷( 5 b r o m o 2 d e o x y u r i d i n e ，b r d u ) 标记增殖细胞，巢蛋白( n e u r o e p t h e l i a ls t e mc e l lp r o t e i n ，n e s t i n ) 标记神 经前体细胞，a b c ( a v i d i n b i o t i nc o m p l e x ) 免疫细胞化学方法观察学习 对海马神经发生的作用，以寻找一种简单易行、价格便宜、不受气候变 化影响的空间学习记忆模型，为探讨学习记忆的分子机制及临床认知功 能障碍性疾病的治疗提供理论依据。 大量研究表明，丰富多彩的环境( e n r i c h e de n v i r o n m e n t ) 可以促进 成年海马神经发生 7 - 9 1 。“丰富多彩的环境”即其中摆满了各种各样大鼠 喜欢的玩物，如梯子、转轮、秋千等，以给他们提供良好的活动条件及 增加相互接触和学习的机会。在丰富多彩的环境所有刺激因素中，自由 转轮运动( f r e ew h e e lr u n n i n g ) 对海马神经发生的促进作用最强。v a np r a a g 掣2 3 1 研究了自由转轮运动对海马神经发生的作用。结果发现，运动可以 促进成年小鼠海马齿状回细胞增殖、存活，而且能使更多的b r d u 阳性 学习遗劫促进点卑大鼠海马齿状田神经发生置提高空间学习能力 引言 细胞分化为神经元。该研究小组还发现，运动能增加海马齿状回b r d u 标记细胞的数量，提高长时程增强( 1 0 n g t e r mp o t e n t i a t i o n ，l t p ) ，同时 提高m o r r i s 水迷宫学习成绩。可见，运动能够促进海马神经发生，调 控突触可塑性及提高学习能力。 成年海马齿状回的颗粒下层每天产生约9 0 0 0 个新生细胞1 2 5 。最近 研究发现，成年哺乳动物海马这些新生的细胞成熟后可成为具有功能的 神经元 2 6 , 2 7 1 。成年哺乳动物脑内神经发生的发现为脑缺血、脑外伤及神 经系统退行性疾病的治疗提供了希望。对其调控因素的不断认识，以及 如何促进内源性神经元再生，引导新生神经元正确迁移、分化和发挥功 能，将会开拓神经系统疾病治疗的新领域。本实验另一个目的是用踏转 轮运动( m o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n g ) 的模型，探讨运动对海马神经发生 的作用及其对空间学习记忆能力的影响，为临床脑缺血和脑外伤等神经 系统疾病的恢复治疗提供实验依据和理论基础。 擘习，退劝促进点年戈氕海马齿收田神经发生曩捷高空阃擘习能力 一、实验材料 实验材料及方法 ( 一)实验对象 成年雄性s d 大鼠，体重1 8 0 2 4 0 克，清洁级，由苏州大学医学 院实验动物中心提供。许可证号：s y x k ( 苏) 2 0 0 2 0 0 3 7 。 ( 二)试剂 1 5 - 溴2 脱氧尿嘧啶核苷( b r d u ) r o c h ed i a g n o s t i cc o 2 b r d u 抗体b i o s o u r c ec o 3 巢蛋白( n e s t i n ) 抗体c h e m i c o ni n t e r n a t i o n a li n c 4 3 i i i 型微管蛋白( t u j 一1 ) 抗体s i g m ai n c 5 胶质原纤维酸性蛋白( ) 抗体n e o m a r k e ri n c 6 生物素化二抗v e c t o rl a b o r a t o r i e si n c 7 a b c 试剂盒( p k - - 6 1 0 2 ) v e c t o r l a b o r a t o r i e si n c 8 d a b ( d i a m i n o b e n z i d i n e ) 、叠氮钠s i g m a i n c 9 生理盐水中国大冢制药有限公司 1 0 奶粉内蒙古伊利实业集团股份有限公司 11 染发剂广州温雅化妆品有限公司 1 2 水合氯醛、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、多聚甲醛、蔗糖、氯化钠、 盐酸、胰酶、双氧水、明胶、二甲苯、中性树脂、无水乙醇、硫 堇中国医药集团上海化学试剂公司 学习连动促进成年走鼠海马齿城田神恒发生度提高空旧学习能力 ( 三)设备仪器 y 迷宫 m o r r i s 水迷宫 图像监测仪 计算机 激光打印机 变频调速器 同步低频电机 分析天平 冰冻切片机 数码相机 光学显微镜 三维摇荡仪 恒温箱 加热器 纯水蒸馏器 m g 2 型 p m s 。2 型 p i h 一0 9 e p 1 5 0 兼容机 h pl a s e r j e t6 lp r o t d y 型 9 0 t d y 2 1 4 型 t g 3 2 8 a 型 k d 2 0 2 型 c 4 1 0 0 型 c x 4 0 型 s d 1 型 w m z k 0 1 型 金星牌 s z 9 3 型 江苏三兴声电公司 中国医学科学院药物研 究所 广州利凌电子有限公司 苏州大学 惠普科技( 上海) 有限 公司 苏州市斯奥克微电机厂 苏州市斯奥克微电机厂 上海分析仪器厂 浙江金华市科迪仪器设 备有限公司 o l y m p u s o l y m p u s 苏州大学科教仪器厂 上海医用仪器厂 福州福安金星热水器厂 上海亚荣生化仪器厂 ， ， ， ， ， ， ， ， ， d 幻 ” ” d l 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 l 1 1 1 ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( ( 学习退莉促进成年大置海马齿状田神植生生置提高空间学习幢力 二、实验方法 ( 一)实验动物分组和b r d u 标记 实验分兰部分进行： 第一部分：y 迷宫训练对成年大鼠海马齿状回细胞增殖的影响 实验分二组：( 1 ) y 迷宫训练组：动物每日进行3 轮y 迷宫训练， 时间点为0 9 ：0 0 、1 2 ：0 0 、1 5 ：0 0 ；每重复训练2 0 次为一轮，约半小时； 连续3 天，n = 1 2 。( 2 ) 对照组：动物置于y 迷宫内自由活动，不施以 电击和灯光指示，放置的时间和轮次同训练组，n = 6 。 b r d u 标记：b r d u 腹腔注射( 5 0 m g k g ，溶于生理盐水) ，2 次厌( 第 一轮和第三轮y 迷宫训练前l 小时给药) ，连续3 天。最后一次给药后 2 4 小时处死动物，从前囟后3 3 5 1 m m 作连续冰冻切片，取相邻的切 片分别进行b r d u 及n e s t i n 染色。 第二部分：踏转轮运动对成年大鼠海马齿状回细胞增殖的影响 实验分四组：( 1 ) 低强度踏转轮运动组：动物置于转轮中，转轮速 度为7 米分钟，每天训练2 次( 0 9 ：0 0 ，1 5 ：0 0 ) ，每次训练3 0 分钟，连 续6 天，n = 6 。( 2 ) 中强度踏转轮运动组：除转轮速度为1 0 米分钟外， 其余同低强度踏转轮运动组，n = 6 。( 3 ) 高强度踏转轮运动组：除转轮 速度为1 3 米，分钟外，其余同低强度踏转轮运动组，n = 6 。( 4 ) 对照组： 动物置于转轮中，速度为0 ，即转轮不转动。放置的时间与次数同运动 组，n = 6 。 b r d u 标记：动物踏转轮运动的第四天开始给药，于每次踏转轮运 学习避动促进成年太鼠海鸟齿状田神拄发生夏提高空闻学习能力 动前l 小时b r d u 腹腔注射( 剂量同前) ，2 次天，连续3 天。最后一次 给药后2 4 小时处死动物，从前囟后3 3 5 1 m m 作连续冰冻切片，取 相邻的切片分别进行b r d u 及n e s t i n 染色。 第三部分：踏转轮运动对空间学习记忆能力的影响 实验采用y 迷宫及m o r r i s 水迷宫法检测大鼠空间学习记忆能力。 1 踏转轮运动对y 迷宫学习成绩的影响 实验分两组：( 1 ) 踏转轮运动+ y 迷宫学习组( 即实验组) ：动物 同实验第二部分进行低强度踏转轮运动训练结束后，休息1 周，第8 天开始y 迷宫学习训练，每日训练一轮，每轮重复训练2 0 次，连续5 天，n = 1 0 。( 2 ) 不进行运动训练的y 迷宫学习组( 即对照组) ：动物 置于转轮中，但不转动转轮。y 迷宫学习训练的开始及结束时间同踏转 轮运动+ y 迷宫学习组，r i m - 1 0 。 b r d u 标记：标记方法同实验第二部分。于最后一次给药后2 周处 死动物，行b r d u 免疫细胞化学染色。 2 踏转轮运动对m o r r ls 水迷宫学习成绩的影响 实验分两组：( 1 ) 踏转轮运动+ m o r r i s 水迷宫学习组( 即实验组) ： 动物同实验第二部分进行低强度踏转轮运动训练结束后，休息1 周，第 8 天开始m o r r i s 水迷宫学习训练，每日训练2 次，间隔3 0 分钟，连续 6 天，n = 1 0 。( 2 ) 不进行运动训练的m o r r i s 水迷宫学习组( 即对照组) ： 动物置于转轮中，但不转动转轮。m o r r i s 水迷宫学习的开始及结束时间 同踏转轮运动+ m o r r i s 水迷宫学习组，n = 7 。 b r d u 标记：同踏转轮运动对y 迷宫学习成绩的影响。 r 擘习，远动促进成丰太鼠海马啬状田神经发生厦提高空旧学习能力 ( 二)y 迷宫训练 y 迷宫( 图1 ) 由三个相同的臂组成，分别称为i 臂、i i 臂、i i i 臂。 通常当把i 臂定为起步区，左侧( 1 i 臂) 为安全区，右侧( i i i 臂) 为电 击区。三臂相交处为隔离区( o 区) 。迷宫底铺以铜棒，可以通电刺激。 三臂顶端各装有1 5 w 信号灯，灯光作为电击的信号，以训练大鼠辨别灯 光刺激及安全方位的能力。实验前先将大鼠放入迷宫，让其适应5 r a i n ， 训练组大鼠在起步区予以电击致其逃至安全区，灯光持续1 5 s ，然后熄灯 休亩, 4 5 s ，开始下一次操作。每次实验在每只大鼠上重复2 0 次为一轮。实 验在黑暗、安静环境中进行。凡大鼠受电击后l o s 内一次性从起步区逃至 安全区的反应称为“正确反应”，否则为“错误反应”。以大鼠达到连 续l o 次电击中9 次或以上正确反应定为学会标准( 即9 1 0 标准) 。达到学 会标准所需的电击次数表示学习记忆成绩，电击次数少说明学习能力强。 f i g lp h o t o p i c t u r eo f ym a z ea p p a r a t u s 学习运动促进 年大鼠海马啬状田神蛭炭生置提高空问学习能力 ( 三)踏转轮运动训练 踏转轮运动训练的仪器由本教研室自己组装而成，它主要包括同步 低频电机、变频调速器和钢质转轮三部分( 图2 ) 。转轮直径2 6 c m 、宽 2 1 c m 、周长6 3 c m ，可在同步低频电机的驱动下进行转动，转动的快慢 可由变频调速器来控制。用秒表记录转轮转动一周的时间，根据周长计 算出转轮的速度。实验开始前按实验的要求先调好转轮的速度，然后将 大鼠放入转轮中适应5 m i n ，打开电源，训练组大鼠就会随着转轮的转动 而运动，每次训练3 0 m i n ，每天训练2 次，连续6 天。对照组动物除转 轮速度为0 外，其余同运动组。 f i 9 2p h o t o p i e t u r eo fm o t o r - d r i v e nw h e e lr u n n i n g 学习，运动促进成年太鼠海马啬收田神妊生生置捉高空闱学习能力 ( 四) m o r r is 水迷宫训练 m o r r i s 水迷宫( 图3 ) 主要由圆形水池和图像采集处理系统两部分组 成。水池直径1 2 m ，高0 5 m ，内置一高0 3 m 的站台，水池内加入牛 奶，使动物在行为训练时无法看见站台。在水池边缘上等距离设4 个标 记点，将水池等分为4 个象限，站台置于任何一象限的中央，并藏于水 面下l 2 c m ，水温2 3 _ _ 2 。c 。每只大鼠每天训练2 次，分别从2 个入水 点头面向池壁投入水中。图像采集处理系统自动记录其寻找到隐藏在水 面下站台的时间( 即逃避潜伏期) 。系统设定6 0 s 为最长逃避潜伏期，大 鼠爬上站台后，让其在站台上休息l o s ；若动物入水后6 0 s 内未能找到站 台，主试者可将动物放置于站台上休息l o s ，3 0 r a i n 后进行下一次训练。 f i 9 3 t h e a r r a n g e m e n to fm o r r i sw a t e rm a z e 擘习遘动促进成年走鼠海马齿状回神经发生及捉高空旧学习能力 ( 五)灌流与取脑 大鼠经4 水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸，左心室插管至主动脉， 先快速灌注0 0 1 m 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ) 1 0 0 m l ， 再用4 多聚甲醛( p a r a f o r m a l d e h y d e ，p f a ) 缓慢灌流3 0 m i n ，将脑迅速 取出，置于4 p f a 中后固定8 h ，再转入2 0 蔗糖中过夜。从前囟后3 3 5 1 m m 作连续冰冻切片，片厚3 0um ，隔3 张取1 张。 ( 六)尼氏染色( 硫堇染色) 将切片置于l 硫堇水溶液中，室温下，1 2 h 过夜。贴片风干后，用 7 0 、8 0 、9 0 、1 0 0 乙醇中梯度脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。 在光镜下观察海马结构轮廓、分区及细胞形态。 ( 七)免疫细胞化学 b r d u 免疫细胞化学：切片经4 n h c l 室温孵育3 0r a i n ，用0 0 1m p b s 充分漂洗后转入0 i 胰酶中3 7 。c 孵育1 0m i n ，0 0 1mp b s 漂洗 ( 5 m i n 3 次) ，加入小鼠抗b r d u 单克隆抗体( 1 ：2 0 0 ，b i o s o u m e ) 室 温孵育1 6h ，0 0 1m p b s 漂洗( 5m i n 3 次) ，转入二抗( 1 ：2 0 0 ，v e c t o r ) 室温孵育2h ，再用0 0 1m p b s 漂洗( 5m i n 3 次) ，移入亲和素生物 素试剂( a v i d i n b i o t i nc o m p l e x ，a b c ，1 ：2 0 0 ) 室温孵育2h ，最后用含 0 0 3 h 2 0 2 的0 0 5 d a b 显色3 5r a i n ，0 0 1m p b s 终止显色。 常规脱水、透明、封片。光镜下观察b r d u 免疫反应阳性细胞，并计数和 学习- 运动促进成年走鼠海马齿状田神烃发生夏提高空阃擘习能力 作显微摄影。 n e s t i n g f a p t u j 1 免疫细胞化学：为了鉴定新生细胞的分化类型， 作相应的特异性标记物的观察。已知g f a p 是星形胶质细胞的特异性标 记物，而t u j 1 是新生神经元的特异性标记物。选取b r d u 染色相邻的切 片，分别进行n e s t i n 、g f a p 或t u j - 1 染色。一抗为小鼠抗n e s t i n 单克隆 抗体( 1 ：1 0 0 0 ，c h e m i c o n ) 、小鼠抗胶质原纤维酸性蛋白( g f a p ) 单克 隆抗体( 1 ：1 0 0 0 ，n e o m a r k e r ) 、小鼠抗i b i i i 型微管蛋白( t u j - 1 ) 单克隆 抗体( 1 ：4 0 0 ，s i g m a ) 。简要步骤如下：切片经一抗室温过夜，加二抗 室温孵育2 h ，a b c 试剂室温孵育2 h 后，d a b 显色3 5 m i n ，各步骤间 用0 0 1mp b s 漂洗5 m i n x 3 次，常规封片，最后亦在光镜下计数和作 显微摄影。 ( 八) 数据处理及统计 每只大鼠随机选取位置相同的5 张不连续的切片，每张切片取海马 齿状回近门区的2 个视野，光学显微镜下( 4 0 0 ) 计数双侧海马齿状回 颗粒细胞层( g r a n u l a rc e l ll a y e r ，g c l ) 、s g l 以及门区( h i l u s ) 的免疫 反应阳性细胞数。取每只大鼠5 张切片免疫反应阳性细胞的均数作为统 计数据，以均数标准差( _ 士s ) 表示。并用s p s s l 0 o 软件作方差分析 ( o n e - w a ya n o v a ) ，e x c e l 作数据处理并制成统计图。 结果 一、尼氏染色( 硫堇染色) 海马结构( h i p p o c a m p a lf o r m a t i o n ) 由几个相关的皮质区所构成，左 右对称，它包括海马、齿状回和下托( s u b i c u l u m ) 。海马在冠状面上呈c 字形，与齿状回相连，共同形成s 形的结构。海马的皮质可分为c a l 、 c a 2 、c a 3 、c a 4 等四个部分，c a 4 区紧邻齿状回，c a l 区与下托相连 接( 图4 ) 。因此，海马与海马结构不能等同，本文中海马齿状回指海马 结构齿状回。齿状回在冠状面上呈u 字形或v 字形。光镜下，海马齿状 回g c l 可见大量排列紧密的颗粒细胞，胞体较小、呈椭圆形或圆形，核 大、浆少：s g l 可见少量大而深染的门区细胞( 图5 ) 。 f i 9 4m i c r o p h o t o g r a p hs h o w i n gh i p p o c a m p a if o r m a t i o n i na d u l tr a t ( n i s s ls t a i n i n g 4 0 1 学习遭劫促进成丰太置沣马啬收回神烃置生度提南空闻学习盹力 f i 9 5 d e n t a t eg y r u so f a d u l tr a t ( n i s s ls t a i n i n g x 2 0 0 ) 二、y 迷宫训练对成年大鼠齿状回细胞增殖的作用 ( 一)未经y 迷宫训练大鼠齿状回b r d u 及n e s tin 阳性细胞的分布 成年大鼠海马齿状回可见少量的b r d u 阳性细胞，分布在齿状回 g c l 、s g l 及门区( 图6 a ) 。典型的b r d u 阳性细胞为深棕黄色颗粒，这 些阳性细胞大部分位于齿状回s g l ，往往紧密排列、成簇出现，细胞核 较小，形态不一，呈圆形、椭圆形或无规则型；也有少量细胞散在分布 于g c l 及门区( 图6 a ) 。 成年大鼠海马齿状回n e s t i n 阳性细胞排列稀疏，位于齿状回颗粒下 层内。n e s t i n 免疫阳性反应产物主要存在于细胞体及其突起，多数的 n e s t i n 阳性神经元胞体呈锥体形，胞浆和突起也呈阳性，并向颗粒细胞 层内伸展( 图7 a ) 。 l5 学习、遣动促进戍车走乳海马齿状田神经发生及提高空问擘习能力蛄采 f i 9 6b r d u - p o s i t i v ec e l l so fd e n t a t eg y r u sa f t e rym a z el e a