（生物化学与分子生物学专业论文）高等植物中mirna相关基因研究.pdf

摘要 m i r n a 是存在于高等生物中的一类长度约为2 i n t 的小分子r n a 。m i r n a 基因是由基因组 编码的，其转录产物是具有茎环二级结构的m i r n a 前体：p r i m i r n a ，p r i m i r n a 经过一系列的 加二= ：成为成熟的m i r n a 分子。在植物m i r n a 产生过程中，r n a s e l l l 类型的酶d i c e r - l i k e 起着重 要的作用。m i r n a 分予最终组装入r n a 介导的沉默复合体( r i s c ) 中，并且指导该复合体对靶 基因的m r n a 进行切割或抑制其翻泽，以调肖靶基因的表达，从而调俐直物体的生长发育。 水稻o s d c l i 蛋白负责水稻m i r n a 的加工与成熟，对水稻的正常生长发育起着重要的洞控 作用。为了研究水稻m i r n a 代谢的机理，我们首先筛选了与o s d c l l 相互作用的蛋白。我们以 o s d c l l 蛋白的p a z 结构域作为诱饵，对水稻c d n a 文库进行筛选，找到了若干个候选蛋白，并 对其中的一个蛋白o s n o t 2 进行了互补验证： 在拟南芥和水稻中，a r g o n a u t e ( a g o ) 蛋白由一个大的基因家族编码。a g o 蛋白都具有p a z 和p i w i 两个保守的结构域，a g o 是r i s c 的核心组分，在m i r n a 功能途径中发挥着重要的作用。 我们对拟南芥和水稻中的a g o 基因家族成员进行了进化分析，确定了不同成员之问的同源关系。 为了研究每个a g o 蛋白在小分子r n a 代谢和调节植物生长发育中的作用，我们希望鉴定在每个 通路中包含的蛋白。作为第一步，我们克隆了拟南芥a t a g 0 7 舸i , a t a g o i o 基因的全跃c d n a ，井 且在人肠杆菌系统中表达并纯化了a t a g 0 1 蛋白的n 端来川以制各抗体。 关键词：r n a 沉默，m i r n a ，d i c e r - l i k e ，a r g o n a u t e ，酵母双杂交 中国农业大学碾士学位论文英文摘要 a b s t r a c t m i r n a sa r eag r o u po f - 2 i n ts m a l lr n am o l e c u l e si nh i g h e ro r g a n i s m s m i r n ag e n e s ，w h i c ha r c e n c o d e db yg e n o m e ，a r et r a n s c r i b e di n t op r i - m i r n a s ，ak i n d o fm i r n ap l e c u r s o r sw h i c hh a v e s t e m l o o ps t r u c t u r e t h ep r i m i r n a sb e c o m ei n t om a t u r em i r n a sb ym u l t i - s t e pp r o c e s s i n g i nt h e m a t u r a t i o no fp l a n tm i r n a s ，d i c e r - l i k e ，ak i n do fr n a s e l l le n z y m ep e r f o r m e di m p o r t a n tr o l e s ， m i r n a sa r c f i n a l l y a s s e m b l e di n t or n a - i n d u c e ds i l e n c i n g c o m p l e x ( r i s q ，r e g u l a t i n g t h e d e v e l o p m e n to fp l a n t st h r o u g hg u i d i n gr i s ct oe i t h e rc l e a v a g eo ft h el a r g e tm r n a s o rt or e p r e s st h e t r a n s l a t i o n o s d c l li st h ek e ye n z y m et h a ti se s s e n l i a lf o rm i r n ap r o c e s s i n ga n dt h en o r m a ld e v e l o p m e n to f r i c e i no r d e rt od i s s e c tt h em i r n ab i o g e n e s i sp a t h w a y , w ep l a n e dt oi s o l a t ep r o t e i n si n t e r a c tw i t h o s d c l l w ep e r f o r m e day e a s ti w oh y b r i ds c r e e n i n gb yu s i n gt h ep a zd o m a i no fo s d c l la sb a i t w e o b t a i n e ds e v e r a lc a n d i d a t ep r o t e i n s ，a n do n eo ft h e m ，o s n o t 2w a sc o n f i r m e db yac o m p l e m e n t a r yt e s t i n a r a b i d o p s i sa n dl i c e ，a r g o n a u t e ( a g o ) p r o t e i n s a r ee n c o d e d b yal a r g eg e n ef a m i l y a l la g o p m t e i n sc o n t a i nt w oc o n s e r v e dd o m a i n s ，t h ep a za n dp i w id o m a i n s m e a n w h i l e ，a g op r o t e i n sa r ea l s o t h ec o r ec o m p o n e n t so fr i s ca n dp l a yi m p o r t a n tr o l e si nm i r n af u n c t i o n w ep e r f o r m e da p h y l o g e n e t i ca n a l y s i so fa r g o n a u r ef a m i l i e so fa r a b i d o p s i sa n dr i c ea n dt h e i rr e l a t i o n s h i pb e t w e e n d i f f e r e n tm e m b e r si sp r e s e n t e d i no r d e rt o s t u d yt h er o l e so fe a c ha g op r o t e i ni ns m a l lr n a b i o g e n e s i sa n dr e g u l a t i o np l a n td e v e l o p m e n t ，w ew a n tt oi d e n t i f yp r o t e i n si n v o l v e di ne a c hp a t h w a y s a saf i r s ts t e p ，w ec l o n e dt h ef u l l l e n g t he d n ao fa m g 0 7a n da t a g o i o i na d d i t i o n ，w ee x p r e s s e d a t a g o in t e r m i n ii ne , c o l ia n da t a g 0 1p r o t e i n sw e i ep u r i f i e df o rg e n e r a t i n ga n t i b o d i e s k e yw o r d s ：r n as i l e n c i n g ，m i r n a ，d i c e r - l i k e ，a r g o n a u t e ，y e a s tt w oh y b r i d 独创性声明 9 3 8 2 0 3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名 时间：m6 年z 月够日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：南极时问：协每年占月哆日 导师签名 锄 f f f j ：娥年g 月岑日 中国农业大学硪士学位论文 第一章文献综述 第一章文献综述 r n a 沉默( r n a s i l e n c i n g ) 是广泛存在于高等生物中的种现象，是生物体在转录后水平调 节自身基因表达的机制。r n a 沉默现象虽早在植物中被发现，在之后的研究中，陆续从各种生 物中发现了类似的现象，如动物中的r n a 干涉( r n a i n t e r f e r e n c e ) 和真菌中的q u e l l i n g 。 其后，随着对r n a 沉默现象研究的深入，人们逐渐认识剑在这一现象中，不仅仅存在着很 多蛋白组分，还有一类k 度约2 1 - 2 5 n ! 长的小分子r n a 发挥了重要的作用这也是r n a 沉默和 其它生理现象最明显的不同点。 目前，人们利用传统的遗传学，生物化学和分子生物学手段，结台生物信息学方法，对r n a 沉默现蒙的机理展开了全面的研究，取得了突飞猛进的进展，总结一下包括以下方面：( 1 ) 通过 生物信息学预测和分子生物学实验的方法，从不同物种中克隆到了大量的小分子r n a 序列；( 2 ) 通过生物化学的方法，发现了许多在r n a 沉默机制中起重要作用的蛋白组分包括在小分子r n a 产生过程和作用过程中的许多功能蛋白；( 3 ) 通过遗传学手段，鉴定了大量和r n a 沉默现象相 关的突变体，并且对这些基因的功能开展了全面的研究，结台这些基因的功能，r n a 沉默现象 的机理也逐渐被人们所认识。 1 1r n a 沉默现象的研究历史 r n a 沉默现象最早在植物中被发现( n a p o l ie ta t ，1 9 9 0 ；v a nd e rk r o le ta l ，1 9 9 0 ) 。1 9 9 0 年，两 家实验室分别开展了类似的工作，他们都试图通过转基因的办法，在矮牵牛体内过量表达某一个 和花色素合成相关的基因，以起到加深矮牵牛花色的作用。但是事与愿违，他们发现在过量表达 这些基因之后，矮牵牛的花色不但没有加深，反而出现了局部花色消失甚至是全部消失的现象。 当时人们还没有办法解释这一现缘，于是就把这一现臻n q 做共抑制( c o s u p p r e s s i o n ) 。随后，在 线虫f g u oa n dk e m p h u e s ，1 9 9 5 ) l l 真菌( c o g o n ie ta 1 ，1 9 9 6 ) 也发现了类似的现象。1 9 9 8 年，f i r e 等在线虫中发现双链r n a 分子可以导致基因的沉默f f i r ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。1 9 9 9 年，b a u l c o m b e 等发 现植物的c o s u p p r e s s i o n 现象是由一类2 5 n t 长的小分子r n a 介导产生的( i a m i l t o na n d b a u l c o m b e ， 1 9 9 9 ) ，这是第一次把r n a 沉默现象和小分子k n a 结合在一起，这也是第一次发现s m a l l i n t e r e n c e r n a ( s i r n a ) 分子的存在。 另一方面，l e e 等在线虫中发现了一个特殊的现象：妇一4 基因的产物不是一个蛋白，而是一 个小分子r n a 这个小分子r n a 可以利砌1 4 基因的3 u t r 区域g a b ( l e e e ta l ，1 9 9 3 ；w i g h t m a ne t a 1 ，1 9 9 3 ) 。之后，他们又发现n 4 基因可以通过抑制砌1 4 m r n a 的翻泽米调节该基因的表达，这 种调节在降低l i n 1 4 蛋白水平的同时并不降低妇1 4 的m r n a 水平。这就是第一个被发现的 m i c r o r n a ( m i r n a ) 分子( l a g o s - q u i n t a n ae ta 1 ，2 0 0 1 ；l a ue ta 1 ，2 0 0 1 ；l e ea n da m b r o s ，2 0 0 1 ) 。2 0 0 0 年，第二个m i r n a 分子：t e t - z 在线虫中被发现，并且被证明和n 4 有着类似的作用( r e i n h a r te ta 1 ， 2 0 0 0 ) 。之后，在人和果蝇中也找到t l e t 7 的同源基因( p a s q u i n e l l ie ta 1 ，2 0 0 0 ) ，并且在人，果蝇和 线虫中克隆到了更多的m i r n a 分子( l a g o s - q u i n t a n ae ta 1 ，2 0 0 1 ；l a ue ta 1 ，2 0 0 1 ；l e ea n d a m b r o s ， 2 0 0 1 ) 。在植物中，2 0 0 2 年，3 个实验室分别通过生物信息学预测利试验克隆的方法，报道了植物 中m i r n a 的存在( h a v ee ta 1 ，2 0 0 2 ；p a r ke ta 1 ，2 0 0 2 ；r e i n h a r te ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 中国农业大学暖二l 学位论文 第一章文献综述 与小分子r n a 的发现同步，剥于r n a 沉默机理的研究也在逐步深入。h a m m o n d 等报道了 由双链r n a 分子产生的大小为2 1 2 5 n t 的小分子是引起基因沉默的起始因素( h a m m o n de ta 1 ， 2 0 0 0 ：z a m o r ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。2 0 0 1 年，b e m s t e i n 等首先报道了d i c e r 这个具有r n a 酶1 l i 活性的蛋 白是小分子r n a 产生的关键酶，并对d i c e r 的结构做了初步的研究( b e i n s t e i ne ta 1 ，2 0 0 1 ) 。2 0 0 3 年，另外一个在动物m i r n a 产生过程中起重要作用的蛋白d r o s h a 也被发现( k ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。2 0 0 2 年，植物中d i c e r 的同源基因c a r p e lf a c t o r y ( c a f ) ，也就是d i c e r - l i k e l ( d c l l ) ，在拟 南芥中被鉴定出来；同时，另外一个在m i r n a 代谢中起作用的蛋白h e n l 也被发现。( p a r k e ta 1 ， 2 0 0 2 ；r e i n h a r te la 1 ，2 0 0 2 ) 。2 0 0 0 年，f a g a r d 等报道了在拟南芥，真菌和线虫中发现的三个蛋白： a g 0 1 ，o d e 2 和r d e - 1 对于r n a 沉默现象是必需的( f a g a r d e ta 1 ，2 0 0 0 ) ，之后的研究表明，这 三个蛋白都是a r g o n a u t e 基因家族的成员。其后，在小分子r n a 功能途径中起重要作用的蛋白复 台体：r n a 介导的沉默复台体( r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) 在果蝇和人类细胞中被 纯化出来，并且发现a r g o n a u t e 蛋白是r i s c 中的重要组分0 i a m m o n de ta 1 ，2 0 0 1 ；h u t v a g n e ra n d z a m o r e ，2 0 0 2 ；m a r t i n e ze ta 1 ，2 0 0 2 ) 。此外，研究还发现依赖于r n a 的r n a 聚合酶( r n a - d e p e n d e n t r n ap o l y m e r a s e ，r d r ) 对于r n a 沉默是必不可少的，如拟南芥的r d r 6 ，真菌中的o d e 一1 和 线虫中的e g o 一1 ，缺失这些基因的突变体不能产生r n a 沉默现象( c o g o n ia n dm a c i n o ，1 9 9 9 ； d a l m a ye ta 1 ，2 0 0 0 ；m o u r r a i ne ta 1 ，2 0 0 0 ；s m a r d o ne ta 1 ，2 0 0 0 ) ，进一步的研究发现，r n a 沉默现 象是可以放大和传递的，在线虫中，q d e 1 对r n a 沉默信号的放大和传递起重要作用( s i j e ne ta 1 ， 2 0 0 1 ) ，由此，人们认识到了r d r 在r n a 沉默中的作用。2 0 0 4 年，在动物中一个和d r o s h a 存在 相互作用的蛋白p a s h a ( p a r t n e ro f d r o s h a ) 被鉴定出来，p a s h a 是一个x x 链r n a 结合蛋白，它和 d r o s h a 一起组成一个名为m i c r o p r o c e s s o r 的蛋白复合体，由这个复台体来完成对p r i m i r n a 的加 工e n l ie la 1 ，2 0 0 4 ；g r e g o r ye la 1 ，2 0 0 4 ) 。在植物中，y u 等发现拟南芥m i r n a 分子的末端存在一 个甲基基团，而曾经被发现在m i r n a 代谢过程中起重要作用的蛋白h e n l 的功能也被详细阐明。 h e n l 是一个甲基转移酶，在体外可以甲基化m i r n a m i r n a 双链分子i 同时，甲基化作为植物 m i r n a 产生过程中重要的一步也被证明f y ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。2 0 0 5 年，三个实验室几乎同时报道了 t r a n s a c t i n gs i r n a ( t a s i r n a ，t a s ) 的产生过程，这一研究表明，在s i r n a 产生的过程中m i r n a 也起到了重要的作用( a l l e ne ta 1 ，2 0 0 5 ；v a u c h e r e t ，2 0 0 5 ；y o s h i k a w ae ta 1 ，2 0 0 5 ) ，同时也明确了拟 南芥d c l 4 是参与t a s i r n a 加工的主要酶( x i ee ta 1 ，2 0 0 5 b ) 。 1 2m i r n a 的生物合成和以及植物m i r n a 的功能 m i r n a 是存在于高等生物体内的一类大小约为2 2 n t 的小分子r n a 。m i r n a 通过介导r i s c 对靶基因m r n a 进行切割，或者抑制靶基因m r n a 的翻译，来调节靶基因的表达，进而对生物 体的发育起到调节作, 昭( b a r t e l ，2 0 0 4 ) 。和存在于高等生物体内的另外一类小分子r n a - - s i r n a 相 比，二者在化学本质，结构，生物台成及功能方面存在许多相同或相似的地方，但是，二者在来 源方面存在较明显的差别：m i r n a 是由生物体基因组自身编码的m i r n a 前体基因转录后，经过 一系列加工过程而产生的，而s i r n a 分子则是由病毒，转座子和转基因等产生的长的戏链r n a 分子经过自n _ q - - 产生( b a r l e l 。2 0 0 4 ) 。 在动物和植物中，m i r n a 的产生过程基本相似，但是也存在一些区别。在动物中，m i r n a 中国农业大学颥士学位论文 第一章文献综述 基因转录的直接产物是一个具有茎环二级结构的单链r n a 分子被称为p r i m i r n a ，即m i r n a 的第一个前体( l e ee ta 1 ，2 0 0 2 ) 。p r i m i r n a 产生之后，在核内经过第一次加工，这一过程是由 d r o s h a 来催化完成的( l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。由d r o s h a 加工后的p r i m i r n a ，切除了茎环结构靠近茎部 位的双链部分，产生出在5 端具有一个磷酸基团，在3 端具有两个突出的不配对碱基的分子 ( b a s y u ke ta 1 ，2 0 0 3 ；l e ee ta 1 ，2 0 0 3 ) ，这就是m i r n a 的第二个前体：p r e m i r n a 。p r e - m i r n a 产 生之后，由e x p o r t i n 5 运输到细胞质 ( b o h n s a c ke ta 1 ，2 0 0 4 ；l u n de ta 1 ，2 0 0 4 ；y ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 p r e m i r n a 在细胞质中由d i c e r 进行下一步的b n 工( l e e e ta 1 ，2 0 0 3 ) ，d i c e r 对茎环结构的环部分进 行切割，产生出成熟的m i r n a 双链分子，这个双链分子同样具有5 端磷酸基团和3 端2 个突出 碱基( l i l l le ta 1 ，2 0 0 3 ) 。这个双链分子中的一条就是成熟的m i r n a 分子，而另外一条被叫做 m i r n a * 。之后m i r n a m i r n a * 般链解开，成熟的m i r n a 优先被组装入r i s c 来行使功能。 m i r n a * 分子通过克隆也被检测到了，但是实验表明，生物体内m i r n a 分子的水平要远远高于 m i r n a * 分子的水平( l i r ae ta 1 ，2 0 0 3 ；r e i n h a r te ta 1 ，2 0 0 2 ) 。m i r n a * 分子推测是由于不能被组装入 r i s c 而被降解掉了( s c h w a r ze ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 在植物中，m i r n a 的产生过程和动物中的类似。植物m i r n a 也是由基因组编码的m i r n a 基因在转录后经过一系列的加工过程最终形成的。植物m i r n a 基因在基因组中大多是独立于编 码蛋白的基因的( r e i n h a f le ta 1 ，2 0 0 2 ) ，这一点和动物的有所不同，动物的m i r n a 基因有些是存 在于某些编码蛋白基因的内含子中的倍a s k e r v i l t ea n db a m e l ，2 0 0 5 ) 。因此，植物m i r n a 通常具有 自己的转录单元。目前的研究一般认为m i r n a 基因的转录是由r n a p o l y m e r a s e l l 来完成的( x i e e ta 1 ，2 0 0 5 a ) 。和动物中的类似，植物m i r n a 基因的直接转录产物也是一个具有茎环二级结构的 单链r n a 分子：p r i m i r n a 。p r i m i r n a 在核内接受加： ，与动物中的情况不同的魁，在植物中 朱发现d r o s h a 蛋白的同源物，对p r i m i r n a 进行第一次加工的是d c l 蛋白，在拟南芥中，d c l i 是负责p r i m i r n a 加工的主要酶( k u r i h a r aa n dw a t a n a b e ，2 0 0 4 ；p a r ke ta 1 ，2 0 0 2 ；r e i n h a r te ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。此外，拟南芥其余的三个d c l 基因对于m i r n a 的代谢均没有影响( g a s c i o l l ie la 1 ，2 0 0 5 ；x i e e ta 1 ，2 0 0 4 ) ，这也提示在从p r i m i r n a 到p r e m i r n a 的加工过程中，d c l l 起到了主要作用。在 植物m i r n a 成熟过程中，h e n l 蛋白起到了重要的作用。这一点和动物中有所不同。在动物中 至今未发现h e n l 的同源基因。h e n l 蛋白含有一个甲基转移酶结构域体外试验证明，h e n l 可以甲基化m i r n a m i r n a * , q ) _ 【链分子f y ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。在野生型拟南芥植株中，m i r n a 3 端是被 甲基化的，而在h e n l 突变体中这种甲基化会丢失( y ue ta 1 ，2 0 0 5 ) ，f 且m i r n a 的积累会受到影 响，佃a r ke ta 1 ，2 0 0 2 ) ，这提示h e n l 在体内是通过甲基化m i r n a 分子来对m i r n a 代谢起作用， 其后的实验也证明了这一点，而且还发现在s i r n a 的产生过程中，h e n l 也起着类似的作用f l ie t a 1 ，2 0 0 5 ) 。此外，另外一个双链r n a 结合蛋白h y l l 可能也参与了m i r n a 的代谢，在 y f 突 变体中，某些m i r n a 的积累减少，植株的正常生长发育受到影响( h a ne ta 1 ，2 0 0 4 ) ，其后的研究 表明，h y l l 和d c l i 存在相互作用，并且在m i r n a 产生过程发挥了某些作用( h a ne ta 1 ，2 0 0 4 ； h i r a g u r ie ta 1 ，2 0 0 5 ；v a z q u e ze ta ，2 0 0 4 a ) 。在植物m i r n a 产生过程中，也存在着m i r n a 胞质运 输的问题。和动物中不同根据d c l l 定位在细胞核中这一事实，推测对于p r i m i r n a 和 p r e m i r n a 的加工都是在细胞核中完成的( p a p pe ta 1 ，2 0 0 3 ；x i e e t a 1 ，2 0 0 4 ) ，加工好的 m i r n a m i r n a * 分子再从核内运输到核质中。在植物中存在着个和动物中负责p w m i r n a 核 输出的蛋白e x p o r t i n 5 同源的蛋白h a s t y ( h s t ) ，根据目前的实验结果，在 “突变体中，很 3 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 多但不是所有的m i r n a 积累减少，推测h s t 蛋白在m i r n a 的核输出中起作用( p a r k e la 1 ，2 0 0 5 ) 。 m i r n a 产生之后，需要组装入r i s c 来行使其生物学功能。对于m i r n a 分子如何组装入 r i s c ，目前的研究尚未能给出确定的答案。可以肯定的是，m i r n a m i r n a * 双链分子中，只有 m i r n a 分子能够组装入r i s c ，而m i r n a * 分子j i ! | j 可能由于不被r i s c 保护而被降解掉了，这就是 所谓的不对称姨配。这一点和s i r n a 的情况类似：成熟的s i r n a 分子在被装入r i s c 之前也是以 双链形式存在，这两条链中，5 端配对不紧密的一条被优先选择组皱入r i s c ，而57 端配对较紧 密的一条则被排除在r i s c 之9 b ( k h v o r o v ae ta 1 ，2 0 0 3 ；s c h w a r ze ta 1 ，2 0 0 3 ) 。目前对于s i r n a 组装 入r i s c 的研究，仅在果蝇中有报道。在果蝇中，s i r n a 双链分子首先被d i c e r 2 r 2 d 2 异二聚体 识别。r 2 d 2 是一个含有双链r n a 结合结构域的蛋白并且和d i c e r 2 存在相互作用。r 2 d 2 结合 双链分子末端配对紧密的一端，而d i c e r 2 结合另外一端f r o m a r ie ta l ，2 0 0 4 ) ，之后，d i c e r 2 - r 2 d 2 将s i r n a 双链分子装入a g r o n a u t e 2 蛋白中，并且对其中的一条链进行切割以去除这一条链 ( m a t r a n g ae ta 1 ，2 0 0 5 ) 。据此，有人推测在植物中，d c l l ，h y l l 和a g 0 1 分别对应于d i c e r 2 ， r 2 d 2 和a r g o n a u t 2 ，存在类似的过程，但是这一观点还没有实验证据的证明( j o n e s r h o a d e se ta 1 ， 2 0 0 6 、。 小分子r n a 通过三种方式调节基因的表达：( 1 ) 介导靶m r n a 的切割：( 2 ) 介导对靶 m r n a 翻译的抑制：( 3 ) 转录水平的基囡沉默，而m i r n a 的功能主要为前两方面。 由m i r n a 介导的对于靶m r n a 的切割和由s i r n a 介导的类似都是由r i s c 来完成的，目 前动物中的实验证据表明，r i s c 中的a r g o n a u t e 蛋白是其有切割功能的蛋自( l i ue ta 1 ，2 0 0 4 ； m e i s t e re ta 1 ，2 0 0 4 ；r a n de ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在植物中，体外实验证明a r g o n a u t e l 蛋白能够招募m i r n a 和s i r n a 分子，并且具有切割( s l i c e r ) 活性( b a u m b e r g e ra n db a u l c o m b e ，2 0 0 5 ；q ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 m i r n a 的作用在于通过碱基互补指导r i s c 和靶m r n a 结合( h u t v a g n e ra n dz a m o r e ，2 0 0 2 ；l a i ， 2 0 0 2 ) 。 最早报道的m i r n a ：n 4 对于1 i n 一1 4 基因的调节就是基于对靶m r n a 翻译的抑制( k ee ta 1 ， 1 9 9 3 ；w i 曲t m a ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。这种调节的特点就是在降低靶基因蛋白水平的同时不降低靶基因 m r n a 的水平( w i g h t m a ne ta 1 ，1 9 9 3 ) 。一般认为，当m i r n a 和靶m r n a 互补情况较好时倾向 于对靶m r n a 进行切割；而互补较差时则倾向于抑制靶m r n a 的翻译( d o e n c he ta 1 ，2 0 0 3 ； h n t v a g n e ra n dz a m o r e ，2 0 0 2 ) 。但是也存在着例外，拟南芥中，m i r l 7 2 就是通过抑制a p e t a l a 2 m r n a 的基因来对其进行凋节的，尽管m i r l 7 2 和和a p e t a l a 2 基因的m r n a 是近乎完美的配 对( a u k e r m a na n ds a k a i ，2 0 0 3 ；c h e n ，2 0 0 4 ) 。图1 - 1 显示了植物m i r n a 从产生到执行功能的过程。 植物m i r n a 在植物体的正常生长发育过程中起着重要的调节作用，涉及到植物生理过程的 许多方面，甚至在m i r n a 代谢中起重要作用的基因，如d c l l ，a g o i 等，都受到m i r n a 的反 馈调节( v a u c h e r e te ta 1 ，2 0 0 4 ；x i ee ta 1 ，2 0 0 3 ) 。m i r n a 这种对发育的调节作用是通过对靶基因的 调节米完成的。此外，植物m i r n a 所调节的基因，有很大一部分是转录因子家族的成员，尤其 是某些决定植物发育阶段，形态建成和细胞分化的转录因子( r h o a d e se la l ，。2 0 0 2 ) 。这也从另一方 面解释了为什么一些影响植物m i r n a 代谢的基因的突变体，如d c l l ，h e n l 和a 9 0 1 等，会出现各 种生长发育上的表型( b o h m e r te ta 1 ，1 9 9 8 ；j a c o b s e ne la 1 ，1 9 9 9 ；p a r ke ta 1 ，2 0 0 2 ) 。表1 - 1 简要列出 一些植物m i r n a 和它调订的靶基因。 4 中国农业大学顺十学位论文 第一章文献综述 表1 1 植物中一些m j r 及其靶基因 m i r n a 物种靶基因 参考文献 m i r l 5 9 a r a b i d o p s i s m y b 3 3a c h a r de ta 1 ，2 0 0 4 m i r l 6 0 a r a b i d o p s i s a r f j 0 ，a r f l 6w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 m i r l 6 2 a r a b i d o p s i s d c l l x i ee ta 1 ，2 0 0 3 m i r i 6 8 a r a b i d o p s i s a g 0 1 v a u c h e r e te ta 1 ，2 0 0 4 m i r l 7 2 a r a b i d o p s 如 a p 2 c h e n 2 0 0 4 m i r l 7 3 a r a b i d o p s i s 尉s 知，t a s i b ，翻肼c ，翻 a l l e ne ta 1 ，2 0 0 5 m i r 3 1 9 a r a b i d o p s i s t c p 2 t c p 3 。t c p 4 ，t c p i o 。t c p 2 4 p a l a t n i ke ta 1 ，2 0 0 3 m i r 3 9 0 a r a b i d o p s i s 刚s ， a l l e ne ta 1 ，2 0 0 5 图1 - 1 植物m i r h l a 生物合成和功能模式图( j o n e s r h o a d e sa ta 1 。2 0 0 6 ) 5 1 3 高等生物中和m i r n a 代谢相关基因的研究 目前，对参与m i r n a 代谢的基因的研究进展十分迅速，尤其以动物中的研究为主。简单概 括一下，和m i r n a 代谢相关的基因主要包括以下儿类：( 1 ) 和m i r n a 的加工成熟相关的，这 一类基因的代表是d i c e r 或d i c e r l i k e 家族，这个基因r 泛存在与动植物中。此外，动物中特有的 d r o s h a ，植物中特有的h e n i ，h y l l 也在此类。( 2 ) 和m i r n a 的核质运输相关的，包括动物 中的e c p o r t i n - 5 和植物中的h s t 。( 3 ) 和m i r n a 功能相关的，主要包括a r g o n a u t e 以及r d r 基 因家族的成员。在这些基因之中，d i c e r ( d i c e 厂1 i k e ) 和a r g o n a u t e 基因家族的成员，分别在m i r n a 的生物合成和功能方面起着主要作用，因此也是目前研究最多的两个和m i r n a 相关的基因。 d i c e r 蛋白是一个具有r n a 酶i i l 活性的核酸内切酶，它具有多个保守的结构域( l i ue ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。d i c e r 最早被发现于于果蝇中，并且确定在s i r n a 的产生过程中起作用( b e m s t e i ne ta 1 ， 2 0 0 1 ) ，之后，又发现d i c e r 同样参与了m i r n a 的加工过程( g r i s h o ke ta 1 ，2 0 0 1 ；h u t v a g n e re ta 1 ， 2 0 0 1 ；k e t t i n ge ta 1 ，2 0 0 1 ) ，同时，在其它物种中也发现了d i c e r 的同源物，并且对其功能展开了深 入的研究。在线虫中只存在一个d i c e r ，它同时参与了s i r n a 和m i r n a 的代谢过程( g r i s h o ke ta 1 ， 2 0 0 1 ) ，同样，在人，小鼠和裂殖酵母中也只有一个d i c e r 的同源物( b i l l ye ta 1 ，2 0 0 1 ；p r o v o s te ta 1 ， 2 0 0 2 ；v e r d e le ta 1 ，2 0 0 4 ；z h a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。而在果蝇中存在两个d i c e r 同源物：d i c e r - 1 和d i c e r - 2 ， d i c e r 1 负责m i k n a 的产生而d i c e r 2 则在s i r n a 的产生过程中起作用( l e ee ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 在植物中，对于d i c e r - l i k e 基因的功能研究也取得了一些进展。在拟南芥中，一共含有4 个 d c l 基因( s c h a u e re ta 1 ，2 0 0 2 ) ，其中，d c l l 负责m i r n a 的合成( p a r ke la 1 ，2 0 0 2 ；r e i n h a r te ta 1 ， 2 0 0 2 ) ，d c l i 基因发生突变之后，植物体表现出一系列表型，例如：花器官发育不正常，植株生 长发育缓慢，子叶，莲座叶和茎生叶形状变窄等( j a c o b s e ne ta 1 ，1 9 9 9 ) ，通过n o r t h e r n 杂交发现， 在d c l l 突变体中，m i r n a 的积累减少( r e i n h a ne ta 1 ，2 0 0 2 ) ；d c l 2 和d c l 3 分别在某些病毒产生 的s i r n a 和植物内源的s i r n a 产生过程中发挥作用( ) ( i ee la 1 ，2 0 0 4 ) ，b o r s a n i 等又报道了在一个 和盐胁迫有关的基因s o r 5 相关的s i r n a 产生过程中d 血2 发挥了作用( b o r s a n ie ta 1 ，2 0 0 5 ) ；而 d c l 4 则参与了t a s i r n a 的代谢过程f g a s c i o l l ie ta 1 ，2 0 0 5 ；x i ee ta 1 ，2 0 0 5 b ；y o s h i k a w ae ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。在水稻中，“u 等报道了o s d c l i 是影响水稻m i r n a 代谢的主要酶。利用r n a i 敲除 o s d c l l 基因后，突变体表现出一系列表型，如：植株矮小，发育缓慢，叶子为深绿色，卷叶， 根的生长不正常，一些表型较强的突变体逐渐死亡管，通过n o r t h e r n 杂交检测，所有被检测的 m i r n a 在突变体中的表达均火量减少( l i u e ta 1 ，2 0 0 5 ) ，如图1 - 2 所示。 a r g o n a u t e 蛋白是小分子r n a 功能途径中的主要蛋白。在不同物种中，a g o 基因一般都是 以基因家族的形式存在( c a r m e l le ta 1 ，2 0 0 2 ) ，例如：人类中含有8 个a g o 基i 羽( s a s a k ie ta 1 ，2 0 0 3 ) ， 果蝇中含有5 个( c a r m e l le ta 1 ，2 0 0 2 ) ，拟南芥中含有1 0 个( c a r m e l le ta 1 ，2 0 0 2 ) 。最早被发现的三 个a g o 蛋白分别是拟南芥中的a g 0 1 ，真菌中的q d e 2 和线虫中的r d e 1 ( f a g