（光学工程专业论文）基于spr传感技术的生物检测方法与实验研究.pdf

浙江大学硕士论文 摘要 表面等离子共振检测技术，是一种无需标记、无需分离纯化并能在线实时监测生 物分子相互作用、可确定反应物种类和浓度的检测技术，由于具有灵敏度高、所需试 样少、样品无需标记及检测速度快等特点，被广泛应用于食品、医疗、环境等监测领 域。但是目前的商业化s p r 监测分析系统都是大型专业化仪器，只适合实验室使用。 因此研制小型、低价、可实现现场环境痕量污染物快速检测的专用s p r 检测系统，已 成为众多研究者的目标。本项目在理论分析和实验研究基础上，研究以棱镜型s p r 传 感器为核心部件，结合微型流通池、微流恒速进样系统等外围设备，构建了小型s p r 检测仪器，并进行了s p r 生物检测方法研究与研究。主要研究内容包括： 第一章：论述了痕量有机污染物的现状和危害以及主要的检测方法与仪器，介绍 了表面等离子共振检测技术的国内外研究状况。 第二章：研究讨论了表面等离子共振的基本原理和表面等离子共振传感器的常用 调制方法，重点对双光束检测技术进行原理分析和数值模拟，探讨了基于该技术的传 感器体系结构。 第三章：研究讨论了表面等离子生物传感器的基本原理和检测方法，以及在多个 领域的应用。 第四章：讨论了国内外s p r 仪器的研究现状，介绍了自行设计的小型s p r 检测 仪器，对各主要部件的功能和结构进行了详细阐述。 第五章：介绍了s p r 检测仪器分析和应用软件的功能模块和实现方法。 第六章：运用设计的s p r 检测仪器，对不同浓度的牛血清蛋白和污染物雌激素的 标准样品进行了检测试验，建立了标准曲线。 第七章：对论文的研究工作进行了总结，并对课题的进一步研究进行了展望。 关键词：痕量有机污染物；表面等离子共振传感器：生物分子相互作用分析；敏感膜： l a b v i e w ：抗原：抗体 浙江大学硕士论文 a b s t r a c t t h en o v e ld e t e c t i o nt e c h n o l o g yo f s u r f a c op l a s m o nr e s o n a n c e ( s p r ) a s s a yi sk n o w nt o m o n i t o ri n t 既a c t i o nb e t w e e nb i o m o l e c u l a r sr e a lt i m ea n da s c e r t a mt h ek i n d so f r e a c t a n t sa s w e l la st h e i rc o n c e n t r a t ew i t h o u ti s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n s p r n s 0 1 - sa l ev a l u a b l e a n a l y t i c a lt o o l sw i ：i hab r o a dr a n g eo f a p p l i c a t i o n sf r o ml a b o m t o t 7a s s a y st os t u d yf o rf o o d s a f e t y , d r u gd i s c o v e r ya n de n v i r o n m e n t a lp o l l u t a n tm o n i t o r i n g ，w h i c hh a v et h e f e a t u r eo f h i g hs e n s i t i v i t y , l a b e lf r e e s m a l la m o u n to f s a m p l ea n dr a p i ds p e e do f d e t e c t i o n h o w e v e r , t h ec o m m e r c i a l l ya v a i l a b l es p ri n s t r u m e n ts y s t e m sa l eh i g l lc o s ta n dn o tp o r t a b l e s t u d y a n d d e v e l o p m e n tf o rac o m p a c t , i n e x p e n s i v e b i o s e n s o ri n s t r u m e n tc a p a b l eo f r a p i df i e l d d e t e c t i o ns p e c i a l i z e df o rm o n i t o r i n gt r a c ep o l l u t a n t si ne n v i r o n m e n ti st h eo b j e c t i o no f m a n y r e s e a r c h e r s as m a l ls p r 1 1 s o rs y s t e mi sd e v e l o p e dw h i c hh a ss p r e e t a - ac o m p a c t 、 i n t e g r a t e ds p rs e n s o ra si t sc o l ec o m p o n e n ta n ds o m e p e r i p h e r a le q u i p m e n t si n c l u d i n g s a m p l ec e l l , m i c r of l o ws y s t e m , s y r i n g ep u m pb a s e do nt h e o r ya n a l y s i sa n de x p e r i m e n t r e s e a r c h n em a i nc o n t e n t sa 船l i s t e da sf o l l o w s i nc h a p t e rl ，s t a t u sa n dh a z a r do fa n dt h em a i nd e t e c t i o nm e t h o d sa n dd e v i c e sf o ro r g a n i c i x a c 冶p o l l u t a n t sa l ed i s c u s s e di nt h ep a p e r r e s e a r c h s t a t u so fs p r t e c h n o l o g ya th o m ea n d a b r o a di si n t r o d u c e d i nc h a p t e r2 ，t h eb a s i cp r i n c i p l eo fs p ra n dm a i nd e c 吐0 nm e t h o df o rs p r n s o 娼a r c l n e s e n t e d t h e o r e t i c a la n a l y s i sa n dn u m e r i c a ls i m u l a t i o nf o rb i - b e a mt e s t i n gt e c h n o l o g y 黜 h i g h l i g h t e d n ek e ys y s t e ms t r u c t u r e so f s p r $ f f l l s o r 黜p r e s e n t e d i nc h a p t e r3 t h eg e n e r a lp r i n c i p l ea n dd e t e c t i o nm e t h o do fs p rb i o s e n s o r s 瓣d i s c u s s e d a p p l i c a t i o nf i e l d so f s p r b i o s e n s o r sa a l s oi n t r o d u c e d i nc h a p t e r4 r e s e a r c hs t a t u sf o rs p rs e n s o r i n g & v i c e si sd i s c u s s e d as m a l ls p rs e b s o r s y s t e ms e l f - d e v e l o p e di si n t r o d u c e d 田地f u n c t i o na n ds l n l c t u r eo fe a c hp a r to ft h e 湖s o r s y s t e mi si l l u s t r a t e di nd e t a i l i nc h a p t e r5 ，f u n c t i o nm o d u l e sa n dt h e i rr e a l i z a t i o nm e t h o do fa n a l y s i sa n da p p l i c a t i o no f t h es o f t w a r ef o rs p rd e t e c t i o nd e 、r i c ca r ei n t r o d u c e d 浙江大学硕士论文 i nc h a p t e r6 s t a n d a r ds a m p l e so fb o v i n e 翻h 唧a l b u m i n ( b s a ) a n de s t r a d i o lo fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o na r et e s t e da n dc a l i b r a t ec u r v 鹤a r ce s t a b l i s h e du s i n gt h es e n s o rs y s t e m s e l f - d e v e l o p e d c h a p t e r7s u m m a r i z et h ep a p e ra n d l o o kf o r w a r dt ot h er e s e a r c hw o r ki nt h ef u m m k e y w o r d s ：u a c eo r g a n i cp o l l u t a n t s ，s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c es g n s o r ，b i o m o l e c u l a r i n m m c t i o na n a l y s i s ，s e n s 堍f i l m , l a b v i c w , a n t i g e n , a n t i b o d y h i 浙江大学硕士论文 第1 章绪论 表面等离子共振( s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p r ) 传感技术是近二十年来国际 上迅速发展起来的一种新型光电检测技术，具有高灵敏度、高分辨率、抗电磁干扰性能 好等特点，适用于微量、痕量物质的检测，在化学、生物、环境、食品分析、医疗及制 药等领域得到了越来越广泛的应用。但是目前的商业化s p r 仪器都是面向实验室分析的 大型精密仪器，没有用于测量环境有机污染物含量的专用型仪器。我国河流湖泊众多， 且污染严重。如果能够研制出环境污染物快速检测的小型s p r 专用仪器，将大大提高环 境污染物的检测能力，促进环境监测事业的发展。 1 1 环境痕量有机污染物的现状和危害 近年来，环境痕量有机化合物( 如石油烃、有机氯农药、多氯联苯等) 的污染问 题日渐突出，人工合成的有毒有机物质在全球范围各种环境介质( 如大气、江河、海 洋、底泥、土壤等) 以及动植物组织器官和人体内普遍存在。有机污染物的物理化学 性质及其对人体健康和生态系统的危害逐渐被人们所认识。有机污染物，尤其是持久 性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，p o p s ) 具有“三致”( 致癌、致畸、 致突变) 效应和遗传毒性，可在自然环境中长时间滞留，降解困难，毒性极强，能导 致全球性的传播。这类污染物通过直接或间接的途径进入人体后，会导致生殖系统、 呼吸系统、神经系统等人体器官中毒、癌变或畸形，最后造成死亡，被称为人类的隐 性杀手。一一 由于环境有机污染物的持久性、全球性、高毒性和生物累计性，该问题已成为世界 各国关注的焦点，引起世界各地决策者和科学家的关注，早在2 0 0 1 年5 月一项重大的国 际环境公约关于持久性有机污染物( p o p s ) 的斯德哥尔摩公约) 已经出台，并于2 0 0 4 年5 月在我国正式生效，旨在争取全球共同行动来控制、削减p o p s 等痕量污染物，以保 护人体健康和生态环境的安全口j 国际上许多发达国家如美国、英国、法国、德国、日 本等相继投入大量的人力、物力，对环境有机污染物的现状、迁移及转化行为、生态毒 性、污染源控制以及污染区治理等多个方面开展广泛的理论基础及应用研究。一些发展 中国家如印度、智利也正在努力地跟上这一研究趋势i ，】。环境有机污染物研究已成为一 个十分活跃、备受关注、并极具发展潜力的新型领域，更进一步成为环境化学、生态毒 浙江大学硕士论文 理学、预防医学、环境工程学、环境经济学、环境法学等多学科交叉研究的前沿领域。 近年来，我国的工业水平发展很快，g d p 每年都在以较高的比例增长，可是人们 在大力发展经济的同时，却忽略了对环境的治理。由于缺乏环保意识，许多人把大量 的生活、工业垃圾倒入人们赖以生存的河流、湖泊、海洋中，致使我国各种水体有机 污染严重，种类多、数量大，危及人体健康的有机物达数百种，在饮用水源、河流及 底泥中发现了有机污染物，特别是在长江、辽河等流域分别检测到难降解的多环芳烃 和有机氯化合物污染 4 1 。经济的发展不能以牺牲环境质量为代价，有了发达国家的前 车之鉴，我们更不应该再走先发展后治理的老路，环境治理保护已经刻不容缓。但检 测能力不足已成为我国环境保护事业发展的瓶颈。不管是研究污染治理，水质检测、 建立评估体系，还是研究污染物的环境行为，都需要对污染物进行检测，需要简便快 速的检测技术。但目前我国有机污染物标准分析方法还不完善，有机污染物还没有纳 入常规监测体系，也缺少方便、快捷、精确的检测仪器。在国家环境保护。十一五” 科技发展规划中，已经将饮用水源中重要有机、有毒污染物的痕量与超痕量检测技 术列为重点发展领域与优先主题，充分表明我国对环境治理的决心以及开发痕量有毒 有机污染物快速检测技术的重要性和迫切性。适时、全面、系统开展水体有毒有机污 染物监测，研制能快速、精确测量环境有机物含量的仪器是广大科技人员的研究目标， 也是环境检测和治理的必需手段 1 2 痕量有机污染物的主要检测方法与仪器综述 通常存在于自然界中的痕量有机污染物的浓度非常低，这种微少含量的物质很难 用常规传感检测方法进行测量。因此研究开发高灵敏度、高精度、高选择性的痕量污 染物检测技术和传感器，已成为生态环境污染物监测迫切需要解决的关键问题 环境有机污染物大多含有毒性，常用的检测手段有： 1 2 i 化学分析法 化学分析法的基本原理是利用环境有机污染物的物化性质结合灵敏的光电技术对 其进行定性定量分析，主要包括气相色谱( o c ) 、高效液相色谱( h i l c ) 、液相色谱，质 谱分析( l c ms ) 、毛细管电泳( c e ) 以及薄层色谱0 x c ) i s - l q 等手段。每种方法都有各 自的优缺点其中，h p l c 是目前应用、研究较多的方法一般采用正相或反相色谱 2 浙江大学硕士论文 柱先对样品进行分离，然后进行紫外( u v ) 、荧光口l ) 或化学发光( c l ) 检测，具有 良好的灵敏度和选择性，但需要标准样品，限制了h p l c 的进一步应用。l c m c 解决 了该问题，只要知道分子量，就可对有机污染物进行定性定量分析g c 的一次进样 可同时分析多种物质混合样品的各个组分，操作简单、分离效率高、选择性强，分析 速度快，缺点在于需要标准样品对照，否则无法定性分离组分。g c - m s 技术比较成熟， 结合了气相色谱分离特性和质谱仪良好的定性能力，使分离、定量和定性同时进行， 局限性表现在只适合于分析可气化的样品。最近又发展了c e 法，分析速度快、具有柱 上富集功能并应用激光诱导荧光检测器提高灵敏度，同生化检测法相比，易于实现自 动化，避免了放射性物质。t l c 也是有效的毒素检测手段，操作简单，无需特设设备， 检测限可达n g 级，但灵敏度略逊于h p l c 。 1 2 2 生物分析法即 传统的生物分析法通常用小鼠腹腔注射或口腔灌喂，根据其生理病变及半致死量 评价分析有机污染物的毒性和浓度。还有用无脊椎动物如虾、贝及其卵进行评价的研 究这类方法灵敏度低、可比性差，且无法确定有机物类型及结构，但操作简单 1 2 3 免疫检测技术f “1 主要有酶联免疫吸附测定( e n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 免疫监 测技术的原理是利用有毒有机污染物诱发免疫反应产生抗体，利用抗体对抗原的特异性 识别来对各种有机污染物进行监测。通过制备亲和力高，特异性好的抗体，提高检测灵 敏度和最低检测限。但目前的试验表明抗体往往只是针对一种有机污染物建立起来，对 某些有机污染物的交叉反应低，不能监测所有有机污染物e l i s a 具有灵敏、快速、简 单、便携、易用、适用现场分析等特点，显示出良好的发展前景 综上分析，常规的检测仪器，特别是液相色谱一质谱联用( h p l c - m s ) 和气相色谱一 质谱联用( c - c - m s ) 仪器，体积庞大、价格昂贵、环境要求严格、而且还需要专门的技 术人员操作，因此检测费用居高不下( $ 4 0 - 2 0 0 样品) ；生物分析方法操作简易，但灵 敏度低，不能区分有机污染物的类型与结构，工作量大：免疫分析是基于抗原一抗体特 异性反应的分析方法，检测灵敏度高、特异性强，分析容量大、反应速度快、检测费用 低( $ 铲1 0 样品) 当前环境监测的项目，样品数量不断增多，检测限不断提高，因此， 免疫分析技术受到了各国的重视。美国，德国在8 0 年代末开始研究免疫检测方法，世界 3 浙江大学硕士论文 粮农组织( f a o ) 已经向许多国家推荐这项技术因而开发和利用免疫检测技术是有着 广阔的市场前景，美国国家环保局( e p a ) 目前推行的几种用于检测环境e p m i c r o c y s t i n s 的方法按先后顺序依次为：i m u n o a s s a y ( 免疫测定) ，b i o a s s a y ( 生物测定) ，h p l c ( 高 效液相色谱) 。l c 硼s ( 液相色谱质谱分析) 由于近海海域有机污染物成千上万，种类繁多，那么它们的全样分析( 即对各单一 有机化合物的定性、定量分析) 及混合体系总毒性评价就存在难度大、费时费力、价格 昂贵等问题。因此，研究人员都在致力于开发一种价格低、体积小、适合现场分析的环 境有机污染物检测仪器，以满足环境质量监测的迫切需求，保护人类健康和生态系统的 可持续发展。 1 3s p r 检测技术的国内外研究现状 表面等离子共振技术应用非常广泛，利用该技术可以获得丰富的信息。从物理学 和光学角度讲，可以获得敏感膜厚度、溶液折射率等信息；从生物学角度讲，可获得 诸如样品浓度、亲和性、特异性、动力学( 包括结合速率、解理常数和结合常数) 等 信息。 近年来s p r 生物传感器以其特异性强、灵敏度高、啊应速度快和使用寿命长等优 点吸引无数的眼球睁“。它利用生物大分子间( 抗体与抗原，配体与受体、酶与底物等) 特异性结合而进行分子识别，并通过光激励分子识别光输出电输出的途 径，完成分子相互作用的信息传递与检测除了上述特点，s p r 生物传感器还具有抗 干扰能力强、易于小型化及远距离传输等优点，所以受到越来越多的关注 从8 0 年代至今，s p r 传感器已先后出现了棱镜、集成光波导和光纤等几种类型， 其中棱镜耦合式s ir 传感器由于结构和工艺实现上相对比较容易，在化学、生物、环 境、食品分析及医药等领域得到了广泛的应用i l k - i t l 。自b i a c o r e 公司首次推出商品化 s p r 仪器以来，越来越多的科研人员开始热衷于s p r 仪器的开发，关于s p r 传感器的 研究已形成蓬勃发展的局面。每年发表的参考文献都在逐年增多( 见图1 - 1 ) 上世纪 9 0 代，国外的一些著名仪器公司如b i a c o r ea b ，o u a n t e c h ，t e x a si n s t r u m e n t s 等相 继研制出了棱镜耦合的生化s p r 仪器系统，使该项技术从实验室走向市场，主要应用 在血液分析、d n a 分析和生化分析等方面，应用于环境痕量检测的报导尚处于实验研 究阶段。国内白1 9 9 0 年以来中科院电子所国家重点实验室等科研单位也相继开展了将 浙江大学硕士论文 表面等离子共振技术应用于生物传感及生化分析监测的研究。目前各大公司研究的主 流方向是开发通用型的高精尖实验室仪器，针对对象是科研单位和大型制药公司等， 他们都希望占领技术制高点，却忽略了5 p r 检测技术广阔的应用前景。如果有专门用 于浓度监测的小型$ p r 仪器，必将受到市场的青睐。 0 0 41 0 9 6 2 0 9 02 0 0 22 口o 柚o o 时同 。 图l - l 近年来发表的s p r 文献数目 1 4 项目的研究意义和重要性 通常存在于自然界中的痕量有机污染物的浓度非常低，从p p m 到p p b 甚至p p t 数 量级，这种微量物质很难用常规传感检测方法进行测量。目前我国对痕量污染物的检 测主要基于实验室分析仪器，如气相色谱( g c ) ，高效液相色谱( 肿l c ) ，气相色谱 与质谱联用( c c m s ) ，其灵敏度和抗干扰能力均较为理想。但这些方法使用的分析仪 器均属于。大型精密仪器”，价格昂贵，操作烦琐，体积庞大，样品预处理复杂，耗时 耗力，并且不能实现现场分析测量。我国河流、湖泊众多，如果能够研制出种价格 低、灵敏度高、可用于现场实时测量的便携式分析仪器，将大大的提高我国环境有机 污染物的检测水平，有效地促进环保事业的发展，保护人类健康，推动社会可持续性 发展。这既是环境监测与保护的迫切需求，也是科技人员不断致力研究的目标。 与其他检测技术相比，表面等离子共振( s p r ) 技术有其独特的优越性，因而在 化学、生物、环境等多个领域得到越来越广泛的应用l ”。相关研究结果表明，棱镜结 构$ p r 传感器的检测灵敏度可达至l j l l o 。折射率单位( r i u ) ，对应l p g 矗质量变化， s 啪 枷 瑚 啪 啪 枷 珊 藿鬃姑 浙江大学硕士论文 这是传统分析仪器无法比拟的。因此，将s p r 检测技术用于环境有机污染物的浓度分 析，必将对环境痕量有毒有机污染物的快速检测产生巨大的影响。所以，进行s p r 研 究无疑具有重要意义 但是目前国内外研制的s p r 监测分析系统都是大型专业化仪器，存在结构复杂、 体积庞大、成本高、不能用于现场在线监测等缺点。因此研究一种基于表面等离子共 振原理的传感器，在保证灵敏度高、成本低的前提下，可实现环境痕量污染物现场实 时检测，才能满足日益增长的环境微量、痕量污染物的检测需求。 1 5 论文的研究内容和目标 本论文项目为浙江省自然科学基金重点项目( 项目编号：z 5 0 4 0 0 9 ) 以及国家科 技部8 6 3 资助项目( 课题编号：2 0 0 6 a a 0 6 2 4 0 6 ) ，申请发明专利一项，申请号： 2 0 0 7 1 0 0 6 8 0 5 4 1 该项目以存在于环境水体中的有机污染物为检测分析对象，在理论 分析和实验研究基础上，研究以棱镜型s p r 传感器为核心部件，结合样品池、微型流 通池、微流恒速进样系统等外围设备的小型s p r 检测系统。通过数字信号处理方法分 析样品溶液的s p r 光谱，计算出被测样品的折射率。进一步在金膜的表面耦联不同的 配体分子。由于s p r 光谱随金属表面的折射率变化而变化，而折射率的变化又和结合 在金属表面的生物分子质量成正比，因而可通过对生物反应过程中s p r 光谱的动态变 化获取生物分子相互作用的特异信号，如样品溶液中相应的受体分子浓度，建立标准 样品溶液的校正曲线。随后利用校准曲线测量实际样品溶液浓度，并将此结果与其他 实验室精密仪器所测结果相比较，验证其准确性。 具体研究内容是： 1 ) 深入研究s p r 的基本理论和生物分子互作技术的相关理论尽管s p r 的发展已经 有一段时间，但是将表面等离子共振和生物分子技术相结合仍是一块新兴的领域， 理论研究基础还较薄弱，尚处于起步阶段因此，本文将对这方面的内容进行较 为系统的论述 2 ) 构建包括样品池、微型流通池、微流恒速注射泵、检测电路系统的s p r 检测仪器 3 ) 设计根据s p r 光谱以及标准曲线反演计算浓度的分析软件，提出提高检测灵敏度 和精度的数据处理方法( 如一阶导数零点法，一阶矩分析法等方法) ，并用软件 6 浙让大学硕士论文 实现。设计界面友好、操作简单方便、功能强大的应用软件。 4 ) 研究基于s p r 的生物检测方法，包括大分子的直接检测法和小分子的间接检测法。 5 ) 利用样机进行标准样品测试，得出几种常见环境有机物的校准曲线；在此基础上， 进行实际被测样品的实验研究和结果分析， 本文研究的s p r 检测仪器，力图在保证高精度的前提下，满足小型化、低价格、 操作简便等需求，为环境质量检测提供新的技术和手段，使之适合现场痕量有机污染 物监测和其他宽广的应用前景。 1 6 参考文献 【1 】董玉瑛，冯霄持久性有机污染物分析和处理技术研究进展环境污染治理技术与设备，2 0 0 3 ，6 【2 】沈平 o ) 并不立即消失，而是透射进入第二种介质一定深度，且其振幅随入 射深度呈指数衰减，称为倏逝波 3 1 倏逝波沿z 方向传播约半个波长，再返回光密介 质。着光疏介质很纯净，在没有吸收和其它损耗的情况下，反射光强度并不会衰减， 即光能无衰减。反之，光能会损失，反射率r 也将小于1 倏逝波是激发s p w 的前提， s p w 正是利用衰减全反射，将光能转变成金属表面电子的动能，使光的全内反射能量 下降s p w 沿着金属和介质的交界面x 方向传播，它的电场矢量在垂直于交界面z 方 向上里指数衰减，见图2 - 1 9 浙江大学硕士论文 z j 图2 1 金属与介质表面的表面等离子波 x 当光以某一特定角度或波长入射到金属和介质交界面时，倏逝波和表面等离子波 将发生共振，即表面等离子共振( s p r ) 。此时，倏逝波的能量耦合进入表面等离子波， 界面处的全反射条件被严重破坏，呈现衰减全反射现象，反射率出现最小值。由菲涅 尔公式可知，反射率是入射波长或入射角的函数，因此将反射光强出现最小值的点称 为共振波长或共振角。图2 2 为角度调制方式的s p r 光谱曲线。共振波长或共振角对 其邻近介质光学特性的变化非常敏感，例如微小的折射率变化都会引起它们的偏移， 这也是s p r 的应用基础。常温下，水、酒精、浓度3 0 * , 6 的糖溶液具有不同的折射率， 分别为1 3 3 3 ，l3 6 ，1 3 8 ，它们的s p r 共振角也各不相同，见图2 - 2 所示。等离子 体的强度受到了金属两侧材料的影响，如果在金属薄膜一侧加上一层待测物质，试样 与金属薄膜的耦联影响了结构的折射率，从而影响了衰减波、反射光以及等离子体共 振，这就是s p i t 传感器可以检测溶液折射率的原因。 图2 - 2 不同折射率溶液的s p r 光谱曲线 1 0 浙江大学硕士论文 2 1 2 激发表面等离子体的条件 激发表面等离子体的结构如图2 3 所示：棱镜基板上蒸镀一层金属薄膜( 一般为 a u 或a g ) ，棱镜、金属空气的折射率分别用岛、毛、占：表示，通常金膜厚度小于 1 0 0 n m h 。当无光照时，金属内的自由电子作无规则运动，而一旦光波入射到棱镜端面 发生全内反射时，渗透到金属薄膜内的光波激发金属中的自由电荷呈连续有规律运动， 产生表面等离子波。 s p r 传感器中，入射光必须使用p 偏振光定性的说：p 偏振光( 横磁波) 的电场方 向垂直于棱镜和金属薄膜的交界面，激励表面电子密度起伏，形成局限于表面附近的 等离子波；s 偏振光( 横电波) 的电场方向平行于交界面，金属电子的运动并无障碍。 因此p 偏振光是产生表面等离子体的必要条件。 图2 - 3 表面等离子共振传感原理图 根据- t a x w e l l 方程，激励表面等离子体还需要满足以下条件四： 1 绝缘体的介电常数为正实数 2 金属薄膜的介电常数实部为负 3 金属薄膜的介电常数的实部远大于虚部，因为虚部决定了等离子的衰减速度。 具体分析如下： l l 浙江大学硕士论文 金属和空气中的电场可以表示为： e = ( 玩，0 ，玩) e x p i k x + a i z - i w t 】f o rz 0( 2 2 ) 式中：q 、金属( 介质1 ) 、空气( 介质2 ) 中的衰减常数， 聍_ 啵矢量( x = w c ) 式2 1 、2 2 必须同时满足波动方程，所以 v 2 e + 毛( 国2 c 2 ) e = 0f o r z 0( 2 4 ) 由此可以得到： i k e 2 ，= 峨e 2 ：f o r z o ( 2 6 ) 根据边界条件可知： a ) 在z = o 处，电场的切向分量连续 瓦= ( 2 7 ) b ) 在z = 0 处，电感的法向分量连续( 假定界面上的自由电荷密度q 2 ( 屯，功 q ：，k ) d l ：= d 2 ；，毛五，= 岛易： ( 2 8 ) 若无自由电荷，则 v d e = 0 ( 2 9 ) 将式2 1 、2 2 代入上式可知： 毛吃置，+ 岛q j 乙= 0f o r z 0 ( 2 1 1 ) 将式2 1 0 、2 1 1 代入式2 8 可知 毛譬卜岛( 班 即e t a 2 玩+ e 2 a l 点l = 0( 2 1 2 ) 前已述及，电场的切向分量连续，所以上式可简化为 岛吃+ e 2 a l = o ( 2 1 3 ) 1 2 浙江大学硕士论文 联立2 6 、2 7 、2 1 3 可以得到色散方程： 如等( 最) 晓 同样的方法计算s 偏振波，得不到类似的色散方程。由此从理论上证明表面等离 子波是p 偏振的。 为了形成局限于表面附近的等离子波，要求q 和为正实数( 假设介质是无损耗 的) 从式2 6 、2 7 得知 心各等毛 晓 从式2 1 2 易知： 丑量 波长调制陋1 3 1 ：与角度调制类似，只是固定入射角、改变入射光波长( 或以白光入 射) 由d r u d e 的色散模型可知，对于棱镜型s p r 传感器，当入射光波长变化时， 金属膜和棱镜的折射率也随之改变。对某一特定折射率样品，扫描入射光波长， 使之满足共振条件，产生表面等离子共振对于不同折射率的样品溶液，建立共 振波长与被测样品折射率的关系。灵敏度与角度调制基本相同，适合平面波导或 光纤型s p r 传感器。通常入射光采用白光光源，检测装置采用光谱仪或c c d 检测 装置。如果采用激光光源，由于可调的宽度有限，检测系统复杂，造价也较高。 强度调制胁1 5 1 ：固定波长和入射角，测量折射率变化产生共振时的光强，建立反射 光光强与折射率之间的关系。这种方法的结构简单，装置价格低廉，但稳定性差， 抗干扰能力弱，检测灵敏度低，无法区分所检测的光强信号是由于样品折射率变 化引起还是检测装置本身引起。理想情况下此法的灵敏度仅为1 1 0 - 5 r i u 相位调制嗍：固定入射角和波长，建立相位与被测样品折射率之间的关系。相位调 制是一种极具发展潜力的检测方法，具有较好的信噪比和较高的检测灵敏度，可 是系统的检测装置比较复杂，结果分析也困难，难以实现仪器便携化，适合实验 室研究用 除了相位调制尚处于起步阶段，角度调制、波长调制和强度调制技术已经比较成 熟，在表面等离子共振s p r 传感器以及基于此原理设计的监测分析系统中得到广泛应 用角度调制由于检测精度高、原理简单等优点，成为现今最流行的一种s p r 检测技术 目前很多大公司如b i a c o r e 推出的商业化仪器，用的也是该方法。但角度调制往往需要 一套高精度的角度调制装置，难于实现仪器便携化，不方便用于现场在线监测。许多学 者一直致力于研究新型的基于表面等离子共振原理的调制检测技术，使之能够满足精度 需求、可以应用于实时监测和可移动的在线分析中，并最大程度的降低传感器的设计成 本现在，已有一些研究人员提出基于角度调制和波长调制的拓展结构，在某些特定的 场合得到了应用。本论文在对表面等离子共振传感器的检测技术进行系统分析和大量实 验研究基础上，提出一种全新的双光束检测技术。 浙江大学硕士论文 2 3 双光束调制技术 顾名思义，双光束检测方法有两束入射光这两束光作用到检测区域后分别用两个 光电探测器检测其反射光强，建立两者的光强差与溶液折射率之间的关系，即可以获得 被测样品的折射率大小双光束检测装置在探测中无需进行角度扫描，只需要在探测前 根据计算结果调整入射光的角度，以获得较高灵敏度。检测系统只用两个光电二极管， 因此既可大大简化系统的复杂性，降低系统制造成本，又能满足检测系统的高灵敏度的 要求 2 3 1 双光束检测原理和模型 双光束检测模型如图2 - 5 所示： 图2 - 5 双光束结构模型 两束p 偏振光b e s m l 、b e a m 2 ，分别以不同的角度入射到棱镜端面，反射光的功率 p ( 0 。) 和p ( 0 2 ) 分别由光电探测器p d l 和p d 2 获取，定义两路反射光的光强差为： p = q ，一1 1 2 = p o 。r 。也。r ：，其中p o i 、r 。表示光束l 的入射光光强和反射率，、r ：表 示光束2 的入射光光强和反射率假设两束入射光的光强相等( p o 。= = p o ) ，则有 h j 。- - p o ( r 。- r ：) ，即反射光强之差只与反射率之差有关当两束光的入射角分别为5 7 。和 6 2 。时，得到两条s p r 曲线( 折射率与反射光强关系曲线) ，如图2 - 6 ( a ) 所示进一步 计算得到的反射光强差p 与折射率的关系曲线，见图2 - 6 ( b ) 1 7 浙江大学硕士论文 样品溶液折射率 2 - 6c a ) 不同入射角的s p r 光谱曲线 图2 - 6 ( b ) 双光束时反射光强差与折射率曲线 光强调制时，灵敏度定义为单位折射率变化对应的光强变化。同理，双光束检测 方法中，灵敏度定义为单位折射率变化对应的光强差变化。分析图2 6c a ) 可知，入射 角为5 7 度的s p r 曲线在折射率1 3 8 2 - 1 4 2 0 这一段线性好，灵敏度最佳。而分析图2 - 6 ( b ) 可知，反射光强差与样品折射率的关系曲线在折射率1 3 8 2 - 1 4 4 0 这一段线性好，光强 差变化范围也相应扩大( + o 8 2 口- 0 6 8 ) ，接近于左图单条s p r 曲线光强变化范围 ( o 8 8 f 1o 0 2 ) 的2 倍。由此可知：双光束检测方法与传统的光强调制方法相比，具有更 高的灵敏度和更宽的检测范围。 双光束s p r 检测方法即保留了光强调制型传感器结构简单的优点，同时由于采用了差 分光强检测技术，因此对于光源波动、环境变化等干扰具有良好的抑制作用，大大提高 了系统的稳定性、抗干扰能力以及检测灵敏度。 2 3 2 双光束s p r 传感器的数值模拟 1 ) 检测范围与入射角的关系 为了提高传感器的检测灵敏度、扩大检测范围，合理选择入射角十分关键。尽管 只要满足入射角大于临界角就能引起表面等离子共振，但只有在共振角附近，p 偏振 光的光强才会发生强烈变化，所以双光束检测中两束光的入射角也必须选择在共振角 附近 通过理论分析、数值模拟和仿真表明，当两束光入射角相差5 度时，双光束检测 l s 反射光墨4 浙江大学硕士论文 方法具有较高的灵敏度和较宽的检测范围。图2 7 为不同入射角时，反射光强差与样 品折射率的关系曲线。 样晶折射率 图2 - 7 不同入射角时，反射光强差与样品折射率曲线 从图2 - 7 可以看出，当入射角变化时，检测范围也相应发生变化当入射角为5 2 时，对应折射率的检测范围为：1 3 1 1 3 8 2 ( 中间单调上升段) ；当入射角为5 7 。 时，对应折射率的检测范围为：1 3 8 2 1 4 4 5 。可以利用此特性，以1 。的步进量旋 转传感器，就可测量不同折射率范围的样品。所以双光束检测方法省去了传统光强调 制法必须使用的角度微调机构，降低了系统成本和复杂性 2 ) 检测灵敏度与金属膜材料及厚度的关系 双光束检测方法中，影响s p r 传感器灵敏度的因素较多，其中一个重要的影响因 素是激发等离子波的金属薄膜，金属膜系的光学参数( 材料和厚度) 都将直接影响传 感器的检测灵敏度。 a g 膜和a u 膜是s p r 传感器中最常使用的两种金属薄膜，目前也有综合a g 膜反射 率高、检测灵敏度高、但表面易氧化和a u 膜稳定性好、但粘附性差的特点，设计制 作的银金金属复合膜。如在s p r 传感器棱镜的底部，利用磁控溅射方法溅射4 7 n m 厚 的银膜，再在其上均匀溅射5 n m 厚的金膜，形成4 7 n m ( 银) 5 r i m ( 金) 的金属复合膜， 以优化传感器的性能 金属膜层的厚度是影响共振深度的重要因素，由于倏逝波的穿透深度大约是波长 量级，如果金属膜太厚，倏逝波就无法穿透膜层到达样品；但如果金属膜层太薄，s p r 1 9 百缸攫龙谒差凹 浙江大学硕士论文 效果就会变得不明显。所以也要合理地选择金属膜的厚度。 以金膜为例说明金属膜厚与双光束s p r 传感器灵敏度的关系。金膜厚度从2 0 n t o 到6 0 n t o 时，反射功率差和折射率的一簇关系曲线如图2 - 8 所示。由图可见，当金膜在 4 0 - - 5 0 n t o 左右时，传感器灵敏度较高，而在此范围之外，灵敏度变低，线性度也变差 2 3 3 小结 图2 - 8 金膜厚度不同时，反射光强差与样品折射率曲线 本文提出的表面等离子共振双光束检测方法既保留了s p r 传感技术的特点，同时 由于双光束s p r 传感器不需要精密扫描入射角度，简化了角度调整机构，避免了传统 方法中结构庞大、系统复杂等问题，易于保证测量精度，提高了测试灵敏度和可操作 性。光强差分方法的采用，增强了系统的稳定性、抗干扰性能力和测量数据的可靠性。 由于检测的是两光束的光强信号，可以用光电二极管代替光谱仪或昂贵的c c d 阵列， 因而可大大降低系统的复杂性和制造成本，易于设计成便携式仪器。 浙江大学硕士论文 2 4 参考文献 【1 】n a i m u s h i n , a l e x e in ，s o e l b e r g ap o r t a b l es u r f a c ep l a s m o nf t s m 姗( s p r ) s e n s o rs y s t e mw i t h t e m p e r a t u r er e g u l a t i o n s e n s o r sa n da c t u a t o r sb ：c h e m i c a l 2 0 0 3 ，9 “1 - 2 ) ：2 5 3 - 2 6 0 【2 】l o u i sa m o ro b a n d o d e s i g n ，m a n u f a c t u r ea n da p p l i c a t i o no f f i b e r - o p t i cs u r f a c ep l a s m o nn s 咖1 锄 d i p - p r o b e s a r i z o n as t a t ea n i v e r s i t y ，2 0 0 1 【3 】陈军光学电磁理论科学出版社，2 0 0 5 【4 】m a r t i nn w e i s s ，r a m a k a n ts r i v a s t a v a , h o w a r dg r o g e r , e ta 1 at h e o r e t i c a li n v e s t i n g a t i o no f e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n gu s i n gs u r f a c e