（应用化学专业论文）天然类胡萝卜素（叶黄素）的分离纯化及分子修饰.pdf

摘要 摘要 本课题探索出一种简易分光光度法测定万寿菊中叶黄素及浸膏中叶 黄素的含量，与其他现有方法( h p l c ，a o a c ) 相比，具有操作快速简便( 单样 检测时间大约缩短l 3 1 2 ) 、溶剂耗量小、检测成本低、环境污染小( 节 省溶剂约1 2 ) 、精确度高的特点，适用于万寿菊及其粗、精加工产品中叶 黄索的检测。 本课题以万寿菊提取浸膏为原料，设计出一种分离纯化工艺，得到高 纯度叶黄素。最后得到的产品经过红外、紫外、核磁氢谱、核磁碳谱确定 为高纯度的叶黄素，并且通过h p l c 定性和定量检测，产品的纯度达到8 0 以上，产率能够达到7 0 9 6 以上。且该叶黄素分离纯化工艺适于在工业生产 中实现。 本课题还设计了叶黄索向玉米黄素转化的工艺，得到最佳转化反应条 件，且得到较高的转化率( 从原来的5 提高到近4 0 蜘。工艺简单，易于应 用于生产，产业化推广。 本课题还在玉米黄素分子修饰制得生物效价极高的虾青素分子方面 做了探索。从而增加了虾青素的一种新来源，而且这是一种由天然色素分 子化合物经过分子修饰制取的来源，克服了国内外文献报道的几种来源中 存在的过程复杂、成本高的缺点，适于工业化的实现，有很好的应用前景。 关键词：类胡萝卜素，叶黄素，玉米黄素，分离纯化，分子修饰 a b s t r a c t a b s t r a c t t h et h e s i sm a i n l yr e l a t e st oap r o c e s st oo b t a i nx a n t h o p h y l l sc o n c e n t r a t e s o fh i g h p u r i t y f r o mp l a n te x t r a c t s a f t e rd r y i n gu n d e rh i 曲v a c c u r n ，t h e c r y s t a l l i n ei sa n a l y z e d t ob el u t e i nw i t hp u r i t yo fm o r et h a n8 0 p e r c e n tw i t hi r u v n 偶a n d h p l c t h et h e s i sa l s or e l a t e st oap r o c e s sl e a d i n gt ot h ei s o m e r i z a t i o no fl u t e i n t oz e a x a n t h i na n d o rz e a x a n t h i n - l i k ee p i m e r s t l ”m a r i g o l de x t r a c ti sa d m i x e d w i m g l y c o l s a n de n o u g l la l k a l i a tt h ei n e r ta t m o s p h e r e t h em i x t u r ei sh e a t e dt o t h et e m p e r a t u r eo fa b o u t1 0 0 f o rap e r i o do ft i m es u f f i c i e n te n o u g ht o c o m p l e t et h ei s o m e r i z a t i o nr e a c t i o n a n dt h ef i n a ls u b s t r a t eh a saz e a x a n t h i n c o n t e n to f a b o u t4 0 c o m p a r i n gt ot h ei n i t i a lc o n t e n to f 4 5 am e t h o dt op r e p a r i n g b e t a - c a r o t e n ed e r i v a t i v e ss u c ha sc a n t h a x a n t h i n a n da s t a x a n t h i ni sd e s c r i b e d 1 1 b em e t h o d e m p l o y s a ni ns i t us y s t e mt og e n e r a t e h y p o b r o m o u s a c i da st h eo x i d i z i n ga g e n tu s i n gas a l to f s u l f i t e ，h y d r o g e ns u l f i t e o r b i s u l f i t ei nc o m b i n a t i o nw i t hab r o m a t es a l t a s t a x a n t h i na n dc a n t h a x a n t h i na r e o b t a i n e di ng o o d y i e l dw i t h as i g n i f i c a n t l yr e d u c e dr e a c t i o nt i m e t a o l i ( a p p l i e dc h e m i s t r y ) d i r e c t e db yp r o f e s s o ry u - s h e nl i u k e yw o r d s ：c a r o t e n o i d s ；l u t e i n ；z e a x a n t h i n ；p u r i f i c a t i o n ；s e p a r a t i o n ； l s o m e r i z a t i o n 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1类胡萝l 、素 1 1 1 类胡萝b 素概述 类胡萝h 素在自然界广泛存在，1 8 3 1 年，w a c h e n r o d e r 从胡萝h 根中结晶分离 出碳水化合物类的色素，并以“胡萝卜素”命名：之后，b e r z e l i u s 从秋天的叶片 中分离提取出黄色的极性色素，并命名为“叶黄素”；随着生物物理技术的发展， 人们通过色谱分析的方法分离出一系列的天然色素，并命名为“类胡萝h 素”。它 们具有共同的化学结构特征，分子中心都是多烯键的聚异戊二烯长链，以此为基础， 通过末端的环化、氧的加入或键的旋转及异构化等方式产生出很多衍生物。目前， 已知的类胡萝h 素的成员大概有6 0 0 多种。 类胡萝b 素【1 1 ( c a r o t e n o i d s ) 属于类萜化合物，是指胡萝卜素( c a r o t e n e ) 和叶 黄素( x a n t h o p h y l l s ) 两大类色素的总称。分子中不含有氧原子的碳氨族类胡萝h 素 被称为胡萝h 索族；分子中含有氧功能团( 如羟基、环氧基、甲氧基、酮基、羟酸等) 的衍生物及其酯类则被称为叶黄素族。 根据定义，类胡萝h 素是一类碳氢化台物( c a r o t e n e s ) 及其它们的氧化衍生物。 它们由8 个类异戊二烯单位组成。这些类异戊二烯单位的连接和排列在分子中心是 反向的，两个中间的甲基处于l ，6 一位关系，其余的非末端甲基处于1 ，5 一关系。所 有类胡萝h 素形式上都可在含有11 个共扼双建碳链的番茄红素( l y c o p e n e ) 基础结 构上通过氧化、氢化、脱氢、环化，以及碳架的重排、降解而衍生获得。一些类胡 萝h 素是链状的如蕃茄红素( 非环化c 4 0 h 5 6 ，结构如图1 - 1 所示) ，但更普遍的结构 是在分子的一端或两端带有一个六元环，结构如图卜2 所示。 图卜1 番茄红素基础结构( 非环化c 4 0 h 5 6 ) 第一章文献综述 r 雒心k n 叩r 设一。81 设：81 舔：8 1 设 1 51 6 7 上 1 7 j 、 墩8 图卜2胡萝h 紊末端环的结构图 胡萝h 素( c a r o t e n e ) 是以胡萝p 的色素为代表的一类色素，一般在分子的两端 具有2 个类异戊二烯组成的六元环，中间由4 个单位类异戊二烯组成的碳链连接， 分子中间反转排列，分子中存在共轭双键发色基团。现以b 一胡萝h 素的结构式( 圈 卜3 ) 表示。分子式为c 4 0 h 5 6 。 图卜3b 一胡萝h 素的结构式 叶黄素( x a n t h o p h y l l s ) 是氧化了的胡萝h 素，分子中含一个或多个氧原子，形 成羟基、羰基、甲氧基或环氧化物( - - o c 7 ) 结构等。氧键的性质决定其光谱吸收带。 现以b 一胡萝h 素的2 个酮基衍生物角黄素( c a n t h a x a n t h i n ，图卜4 ) 和2 个羟基，2 个酮基衍生物虾青素( a s t a n x a n t h i n ，图卜5 ) 表示。 图卜4角黄素 2 第一章文献综述 h o o h 图卜5虾青素 、 ! 魂于长的多烯链的n 电子对形成的共轭体系，碳碳双键、碳碳单键的存在， 使类胡萝h 素分子具有很多的立体异构性。不同的构型：类胡萝p 素的长碳链骨 架上的每个双键都存在两种构型( 顺式或反式) ，顺反式结构由碳链上双键周围的组 成基团的分布情况而定。在天然产物中，类胡萝b 素多以反式结构存在，这主要是 因为在顺式结构中，双键附近的氢原子之间或氢原子与甲基之间会产生较大的空间 位阻，而造成顺式结构的不稳定。不同构象：自然界中的任何物质都是以最低的 能量形式存在。类胡萝h 素分子也一样。对于类胡萝卜素的长多烯碳链来说，最稳 定的构象应是线性直链分子，因为双键呈现平面时，分子稳定；碳碳双键为反式构 象时，空间位阻较少。x 射线衍射表明，类胡萝i 素是直链的线性分子，只有微弱 的s 形扭曲以缓解立体的空间张力。一般来说，碳骨架的6 与7 位间的单键易发生 旋转而产生不同的末端环状结构。但长碳链与形成的环之间的角度的大小符合能量 最低理论。 1 1 2 类胡萝1 - 索的命名和分类 许多类胡萝卜素都有俗名，不同研究者按其来源或特殊性质而命名，如胡萝h 素是由于发现时来源于胡萝h ，玉米黄素来源于玉米，而隐黄素则是一种隐藏的色 素。也有依据其环的有无、多少，将它们分为无环类( 如番茄红素) 、单环类( 如y 一 胡萝h 素) 和双环类( 如母一角黄素) 等，但这种分类方法容易引起混乱，不能反应其 特性。 现在比较常见的分类方法是按照结构将其分为4 个亚族 3 1 ：胡萝b 素，如。一、 1 3 一、y 一胡萝卜素、番茄红素等i 胡萝h 醇，如黄体素、玉米黄质、虾青素等；胡 3 第一章文献综述 萝h 醇的酯类，如b 一阿朴一8 _ 胡萝h 酸酯；胡萝p 酸，如藏红素、胭脂树橙等。 也有人将上述两种方法结合起来，按照结构将其细分为1 1 种主要类型，如表 卜1 所示： 类胡萝h 素 无环类胡萝h 素 无环叶黄素 腊环族胡萝h 脂环族叶黄素 芳族类胡萝h 素 环戊基酮类胡萝h 素 环氧类胡萝h 素 丙二烯类胡萝h 素 炔属类胡萝h 素 高类胡萝h 素 ( 如西红柿红素l y c o p e n e ) ( 如螺菌黄素，s p i r i l l o x a n t h i n ) ( 如a 一玉米胡萝p 素。一z e a c a r o t e n e ) ( 如黄体素，l u t e i n ) ( 如海绵烯，r e n i e r a t e n e ) ( 如辣椒红索，c a p s a n t h i n ) ( 如紫黄素，v i o l a x a n t h i n ) ( 如岩藻黄素，f u c o x a n t h i n ) ( 如异黄素，a 1 l o x a n t h i n ) ( 如癸异戊二烯黄素。d e c a p r e n o x a n t h i n ) 降解的娄胡萝h 索( 如b 一胡萝卜素酮，8 一c a r o t e n o n e ) ， 。 、 、 表卜1 类胡萝h 素的分类 但这种分类是相对的。例如，环氧类葫萝卜素可以归入脂环族叶黄索中，但该 类型的叶黄素都具有取代基团，因而将其归为一类。又如菌红素( 图i - 6 ) 可以归入 无环叶黄素类，但它的碳架上有c 5 0 ，含有不止8 个类异戊二烯单位，将其归入高类 胡萝卜素一类更能反映其特性。 图卜6 菌红素 4 第一章文献综述 1 1 3 类胡萝h 素的生物功能 1 1 3 1 类胡萝h 素是维生素a 的前体 a n t h o n y + 指出，b 一胡萝卜素缺乏时也会造成维生素a 缺乏症，引起角膜上皮 的脱落，增厚和角质化，使原来透明的膜变成不透明，造成角膜溃疡，晶体脱落以 致失明。轻者会发生夜盲，皮肤变厚，干燥，痂变或发生皱纹。因此维生素a 可以治 疗各种皮肤角化症。维生素a 缺乏时，也会丧失生殖能力。缺乏维生素a 的婴幼儿易 引起肺炎，麻疹以及腹泻等传染病，严重时会造成死亡。大剂量的维生素a 可以抑制 某些癌症的发展，但这各剂量会产生很大的毒性。 1 1 3 2 类胡萝卜素能增强免疫功能 生物体内的免疫系统有2 种主要的功能【5 】：首先是能保护机体免受细菌、病毒等 侵染性病原物引起的疾病，其次是能抑制癌细胞，预防癌细胞的生长。现在了解除 b 一胡萝h 素外，番茄红素以及斑婺黄素等也能增强机体对感染的抵抗能力，增进免 疫机能。在人体实验中，尤以老年人，类胡萝h 素可以减缓由衰老引起的免疫能力 下降。 1 1 3 3 类胡萝卜素具有抗氧化剂的功能 类胡萝卜索能减少自由基对细胞遗传物质( d n a ，r n a ) 和细胞膜( 如蛋白质，脂质 和碳水化合物) 的损伤【6 1 。在生物系统中有羟基自由基( h o 。) ，烷氧自由基( r o ) ， 过氧自由基( r 0 0 1 ) 单线态氧( 1 0 2 ) ，氮氧自由基( n 0 - ) ，过氧氮氧自由基( o n o o ) 和半配自由基( q ) 等。这些氧自由基都带有不成对的电子，这些电子非常活浚， 它们能使自由基与环境中的其他物质形成致癌物。 自由基能损伤细胞，细胞膜及其组成导致蛋白质损伤、酶失活、膜脂过氧化、 - i 碳水化合物和核酸损伤。+ 【7 】已经测出机体在衰老过程中，患病及炎症过程中体内的 自由基增加，b 一胡萝h 索和类胡萝卜素能抑制自由基的产生，可以缓延衰老和预防 癌症。 1 1 3 4 类胡萝h 素对预防癌症的功能 b 一类胡萝卜素能预防食道癌。如对菲律宾、加拿大和中国的食道癌患者的调查 5 第一章文献综述 、， 都证明b 一胡萝卜素能产生缓解作用。也曾用b 一胡萝h 素治疗口腔癌症的高危险者。 、i s 1 3 胡萝h 素的高摄入量或血清中高水平与子宫颈癌、子宫内膜癌与乳腺癌的低发 t 生有关。用8 一胡萝h 素治疗口腔粘膜白斑病，可以德该病得以缓解。但b 一胡萝h 素的摄入量对大肠癌或盲肠癌的抑制却没有得到明确的证明。g e r s t e r f g l 用 7 5 2 0 0 例流行病研究证实，发现血浆中b 一胡萝h 素含量低的人( 即低水果和蔬菜摄 入者) 与癌症危险性的增加里一定相关。 1 2 叶黄素( l u t e i n ) 和玉米黄素( z e a x a n t h i n ) 在已知的六百多种类胡萝卜素中，被多数国家批准使用于食品、饲料、药物以 及化妆品的类胡萝卜素有l o 多种，其中最主要的有叶黄素( l u t e i n ) 、玉米黄素 ( z e a x a n t h i n ) 。其中叶黄素( 也称为黄体素) 是绿叶中主要的类胡萝h 素；玉米黄素 的分布极其广泛，它一般与叶黄素是伴生在一起的。在大多数植物中【lo 】，叶黄素的 厂、 含量均大于玉米簧瓣仅在玉米中玉米黄素的含量高于叶黄索。近年来人们对于叶 黄索类物质( x a n t h o p h y l l s ) 在人体内的功能的研究逐渐增多，而研究的主要目标就 是叶黄素和玉米黄素。 1 2 1 叶黄素和玉米黄索的结构与性质 叶黄索( l u t e i n ) 【1 l 】是一税无维生素a 活性的类胡萝i - 醇，其分子式为 j - c 4 0 h 5 6 0 2 ，易溶于氯仿、二氯化碳，可溶于正己烷，微溶于醇、醚。其稳定性受物 理、化学及生物因素的影响较大，例如光辐射、高温、酸、碱、游离卤素、水分状 况等，但氧是影响其稳定性的主要因素，特别是纯的结晶产品更易被氧化破坏；因 而在保存时要将黄体素结晶纯品或含黄体素的材料密闭真空或充入惰性气体包装， 避免光照并且低温保存。 叶黄素和玉米黄素互为结构同分异构体，同属于脂环族叶黄索类 ( x a n t h y p h o l i s ) 。它们【1 3 】分别是d 一胡萝卜素和一胡萝卜素的3 ，3 - 二羟基衍生物， 其结构式1 1 4 】分别如图i - 7 和1 - 8 所示： 6 第一章文献综述 h 0 图1 7a u t r a n s l u t e i n ( 3 r ，3 s ，6 r ) 一b ，一c a r o t e n e 一3 3 - d i o l 3 ，3 - d i h y d r o x y a c a r o t e n e h 图1 _ 8玉米黄素( z e a x a n t h i n ) ( 3 r ，3 r ) 一b ，b c a r o t e n e - 3 ，3 一d i o l 最初 t 4 1 。【1 7 】人们仅在植物( 水果和蔬菜) 中发现单一结构的叶黄素，结构式即为 图卜7 ，后来又相继在人类的血液和海洋生物中发现了多种叶黄素和玉米黄素的立 体异构体，如叶黄素b 、1 3 z 一叶黄素、1 3 z 一叶黄素、9 z _ 叶黄素、9 z - 叶黄素、1 3 z 一 玉米黄素、9 z 一玉米黄素等，如图1 - 9 和1 - 1 0 所示： h 图卜9 叶黄素的备种异构体 7 第一章文献综述 图1 - 1 0玉米黄素的备异构体 1 2 2 叶黄素和玉米黄素的功能 1 2 2 1 用作食品添加剂 叶黄素的用途主要在于它的着色性和抗氧化性。以前人们主要把含叶黄素的材 料作为饲料添加剂【埔】，用在家禽、水产动物和鸟的蛋黄、皮肤、羽毛以及肉的着色 上。在世界许多国家和地区，特别是美国和许多亚洲国家的消费者，由于习惯和心 理作用，多数人偏爱金黄色或橙红色的蛋黄，喜欢金黄色皮肤的禽类、软红的肉质， 并且往往从蛋黄的色泽判断蛋品的营养价值和新鲜程度。消费者根据经验将黄色的 皮肤视为肉质和风味较好的肉鸡的标志，直接影响产品的售价。因此在现代养禽业 中，饲料公司为了迎合市场的需要，往往在饲料中添加超常量的合成商品着色剂， 不仅使成本大大增加，且对人类健康不利。因此，生物来源的含叶黄素和玉米黄素 的材料就成为天然饲料着色剂的主要来源，其研究日益受到关注譬在以此为饲料 的家禽中，禽蛋上有7 0 的色素为叶黄素，而且当禽蛋煮熟后其着色效果并无变化。 1 2 2 2 生物学功能 近年来，有关叶黄素和玉米黄素生物学功能研究越来越引起人们的关注，主要 集中在有关叶黄素和玉米黄索与眼部疾病、心脏疾病和癌症的关系上，同时对它们 抗氧化性质也颇感兴趣。流行病学研究显示【2 们，摄入富含类胡萝卜素( 包括叶黄素和 玉米黄素) 的蔬菜与癌症的发生呈负关系，多摄入富含类胡萝卜素食物可增进健康， 降低患癌症、心血管疾病、眼部疾病和自内障等危险忙。 研究显示摄入较多玉米黄素、叶黄素、和维生素e 可防患眼部黄斑退化( m a c u l a r 窖 第一章文献综述 d e g e n e r a t i o n ) 2 2 。k r i n s k y 2 3 】讨论玉米黄素和叶黄素对视网膜的保护作用，研究它 们作为光过滤器( 1 i g h tf i i t e r s ) 的作用和抗氧化活性，及在饮食中增加玉米黄素和 叶黄素摄入后使眼部黄斑色素增加。m a r e s ，p e r l m a n l 2 4 等人综述玉米黄素和叶黄素 对健康的益处，认为增加这些类胡萝卜素的摄入将使人体器官中( 特别是眼睛) 这类 物质的浓度上升，因而能够降低患慢性疾病( 包括白内障、癌症和心脏病等) 风险。 老年性眼部黄斑退化( a g e - r e l a t e dm a c u l a rd e g e n e r a t i o n ) 1 2 5 是导致7 5 岁以上人群 失明的主要原因，叶黄素和玉米黄素能够选择性地在眼部黄斑积累，并提供黄斑色 素。据称，在一生饮食中，常吃富含这些类胡萝卜素的人群患老年性眼部黄斑退化 的发生率明显降低。关于玉米黄素和叶黄素的作用机理 2 6 】，推测叶黄素和玉米黄质 可清除由于紫外线产生单分子氧对眼睛造成损害。f 2 7 】已经证实叶黄素和玉米黄素是 视网膜黄斑区域中唯一存在的类胡萝卜素。在饮食中摄取的叶黄素和玉米黄素可影 响黄斑色素密度，使黄斑色素水平较高，降低患老年性眼部黄斑退化可能性，也降 低老年性失明危险。 1 3 万寿菊色素 万寿菊口8 1 ( m a r i g o l d ；学名t a g e t e se r e c t a ) 办称金盏菊( 花) ( c a l e n d u l a o f f i c i n a l i sl ) 。菊科、万寿菊属，一年生草本植物。夏秋季开花，花期长，花大 而美丽，常上部成黄色，下部( 或大部) 成橙色。原产墨西哥，现我国各地均作观赏 花卉种植。 万寿菊色素亦称“万寿菊油树脂”，是由万寿菊干花粉在萃取前先行造粒，然 后用正己烷萃取，萃取液经脱溶后得黄色油状液体，再经粉制、脱臭( 除去菊科植物 特有气味) 而成。万寿菊色素( 油树脂) 为橙黄色至黄褐色块状固体、糊状或粘稠液体， 略有千草似气味。不溶于水和丙二醇，溶于己酵、丙酮、油脂、己烷等。万寿菊色 素( “万寿菊油树脂”) 为本课题的初始原料。 1 3 1 主要成分 万寿菊花不仅含有醇溶碳水化合物、脂肪、氨基酸、果胶、半纤维索等常见化 9 第一章文献综述 学成分，而且含有类胡萝h 素、类黄酮、三花皂甙、香豆素、挥发油等活性成分。 万寿菊干花朵约含各种类胡萝h 素0 1 卅1 6 ，其中叶黄素酯约占总胡萝h 素9 0 。 万寿菊提取物( 油树脂) 主要成分见表1 2 。【2 9 】 表卜2 万寿菊色素( 油树脂) 主要成分( ) 反式叶黄素酯 顺式叶黄素酯 玉米黄质 环氧化物 不皂化物 其它 7 0 2 0 7 o 5 8 l _ 0 2 1 4 万寿菊色素中主要色素成分结构式如下： 舻删叽：l o 剿瓣麟= - 33 ：2 】 全反式叶黄素( p _ e - 胡萝卜素一二醇) r o 汝k 沁m 硬 3 9 腰式盱黄素酯 r - - - 脂肪奠基 4 翟胡萝 、素。c h 。 5 p 鹾萝i - f 。c 。h o 。 h 。，西c 。弋1 r 、夏y 。：全反式玉米黄质c h 。 沁诋奄，丫妒h ，戆甄鲫妒 l o 第一章文献综述 作为商品万寿菊色素( 未皂化油树脂) ，还可能含有正己烷提取时所带入原料中 原有油脂和蜡质，也可在萃取后加入调节色价或浓度用的植物油，以及为保护其稳 定性而加入抗氧化剂b h a 、生育酚或迷迭香提取物。 在叶黄索酯中，所含脂肪酸组成为表卜3 所示： 表1 - 3万寿菊色素中脂肪酸组成【3 0 l 在各种酯中有单酯、也有二酯和混合酯，包括二棕搁酸叶黄素酯、二硬脂酸酯， 及少量棕榈酸一肉豆蔻酸酯、棕榈酸一硬脂酸酯等。 万寿菊油树脂经皂化后，在b 一环合柱( b - - c y c l o b o n dc o l u m n ) 上分离吸附后 用正己烷乙酸乙酯( 8 7 ：1 3 ) 作为流动相，流速为2 0 m l m i n ，所得洗提液) 羊j h p l c 分析其中类胡萝h 素的组成，结果见图1 _ 1 1 3 1 1 。 越 暮 图1 一1 1万寿菊提取物h p l c 色素图 其中：1 3 ：顺式叶黄索异构体4 ：全反式叶黄素5 ：全反式玉米黄质6 ： 9 或9 顺式叶黄素异构体7 ：1 3 或1 3 一顺式叶黄素异构体。 肿蜘鼬加曲柏加 王z i i i l i仉c；c；n n 第一章文献综述 1 。3 。2 提取叶黄素 万寿菊花中叶黄素均以酯形式存在，而非游离态。在提取物、皂化时因水解而 得游离态叶黄素，并进而可纯化为结晶。 在新鲜万寿菊花中，所含是反式时黄素酯和玉米黄质。在原料干燥时，反式叶 黄索可部分异构化而成为顺式叶黄素和微量环氧化物，使反式叶黄素含量会有所下 降。在提取物油树脂中，浓缩和脱溶时加热过程，也会使少量顺式叶黄素酯有所增 加。而在叶黄素酯纯化时，由于顺式叶黄素酯选择性的溶于溶剂，故因顺式体酯转 入溶剂而相对提高反式叶黄素酯含量。叶黄素酯在皂化脱酯时，主要留下反式叶黄 素。 由叶黄素酯经皂化、水解后分离、提纯、精制而得。纯叶黄素为棱格状黄色结 晶，有金属光泽，熔点1 8 3 1 9 0 ，对光和氧不稳定，需贮放于- 2 0 ( 2 和氮气下以求 稳定。不溶于水，溶于( m g l ) f 3 2 】：丙酮8 0 0 ，乙腈1 0 0 ，苯6 0 0 ，氯仿6 0 0 0 ，环己烷5 0 ， 环己酮4 0 0 0 ，二氯甲烷8 0 0 ，二甲基甲酰胺1 0 0 0 ，乙醇3 0 0 ，乙酸乙酯8 0 0 ，乙醚2 0 0 0 ， 己烷2 0 ，异丙醇4 0 0 ，甲醇2 0 0 ，叔丁酸甲酯2 0 0 0 ，四氢呋喃8 0 0 0 ，甲苯5 0 0 。据此可 选择适当的溶剂进行溶解、沉降等纯化操作。在氯仿溶液中在4 4 5 n m 处有最大吸收峰。 叶黄素有8 种异构体，以全反式为主，难以人工合成，故至今只有从植物中提取，万 寿菊是主要的原料。此外，也有从牧草( 苕蓿) 或睡莲科植物莲的叶子或微藻等经皂 化除去叶绿素后，再用溶剂萃取后脱溶而得。 1 4 虾青素 虾青素( a s t a x a n t h i n ) i ”】，又名虾黄素，化学名称为3 ，3 - 二羟基- 4 ，4 - 二酮基一 b ，e 。一胡萝h 索，分子式为c 4 0 h 5 2 0 4 ，化学结构式如图l 一5 所示。 虾青素是动物界中分布最广的一种叶黄素，特别是在水产动物的虾、蟹、鱼 和鸟类的羽毛中。呈粉红色，具有特殊的着色功能，也能够促进抗体韵产生，增强 动物的免疫力，在抗氧化性、清除自由基方面能力强于p 一胡萝l 素。具有水不溶性 和亲脂性，易溶于二硫化碳、丙酮、苯和氯仿等有机溶剂。虾青索是一种极具潜力 的类胡萝p 素添加剂，在食品、饲料、化妆品、医药等领域有着广阔的应用前景1 3 4 】。 1 2 第一章文献综述 1 4 1 虾青素的生物学功能 1 4 1 1 抗氧化性能 虾青素的重要性质在于它的抗氧化性，具有极强的淬灭单线态氧和清除自由基 能力。l e e 等人研究了叶黄素、玉米黄素、番茄红素、异玉米黄素和虾青素( 双键数 分别为1 0 ，1 1 ，1 1 ，1 1 ，1 3 ) 等五种类胡萝b 素在豆油光氧化作用中淬灭活性氧能 力。它们淬灭活性氧速率常数分别为5 7 2 x 1 0 9 ，6 7 9 x 1 0 9 ，6 9 3 x 1 0 9 ，7 3 9 x 1 0 9 ， 9 。7 9 x1 0 9 。表明它们淬灭活性氧能力随着共轭双键数的增加而增加，以虾青素的淬 灭能力为最强1 。m i k i 研究结果表明，虾青素具有的淬灭活性氧和清除自由基能力 比维生素e 强百倍以上，被称为“超级维生素e ” 3 6 10 7 1 。w o o d a l l 等人同时还发 现虾青素具有抑制脂过氧化的作用，能保护磷脂酰胆碱脂质免受氧化1 3 s 。n a k a g a w a 等人也发现虾青素具有显著降低脂质过氧化累积的作用( 3 9 】。而且虾青素的抑制脂质 过氧化的能力比b 一胡萝b 素高1 0 倍，比维生索e 高1 0 0 倍。 1 4 1 2 抗肿瘤和增强免疫作用 t a n a k a 等人通过小鼠试验观察到虾青素对膀胱癌有化学预防作用【辛叭。在小鼠饮 水中加入2 5 0r a g k gn - 丁基一n 一( 4 一羟丁基) 一亚硝胺( o h b b n ) 连续2 0 周，间隔1 周 后饮水中加入5 0m g k g 虾青素，再持续2 0 周，发现虾青素组膀胱癌发生率显著降 低。t a n a k a 等人在用硝基喹啉一卜氧化物诱发大鼠口腔癌的类似实验中，观察到虾 青素能显著降低口腔肿瘤的发生率。 n a s h i n o 研究了各种类胡萝h 素的抗癌作用，发现虾青素具有极强的抗癌作用 4 1 1 o g r a d e l e t 等人研究了虾青素等类胡萝b 素对肝癌的影响。结果发现虾青索和且 一胡萝卜素在抑制肝癌方面有显著效果，而番茄红素则无效【4 2 】。s a v o u r e 等通过裸鼠 表皮实验说明虾青素抑制肿瘤发生的效应在于对肿瘤增值的抑制f 4 3 1 。j y o n o u c m 等 人通过实验，发现虾青素能显著促进胸腺依赖抗原( t d - a g ) 刺激时的抗体产生，分泌 i g m 和i g g 的细胞数增加】。 1 4 2 虾青素的主要来源 虾青素广泛存在于生物界，特别是虾、蟹、鱼和鸟类的羽毛。例如，火烈鸟的 1 3 第一章文献综述 羽毛中就存在大量的虾青素，在大马哈鱼的肉中，虾青素占类胡萝h 素的7 0 9 9 8 。当前虾青素的主要来源是从水产加工废弃物中提取，利用藻类和酵母培养生 产。 1 4 2 1 从水产加工废弃物中提取虾青素 水产动物虾、蟹壳中含有少量的天然虾青素。因为含量较低，仅有1 5 3 m g k g 的 有效含量，单独提取虾青素是不经济的，产品的生产条件苛刻、成本高，产量低， 纯度也不高。但由于目前还没有找到更好的方法，仍有少数国家应用这种技术生产 虾青素。 1 4 2 2 从藻类中提取虾青素 很多种藻类能够产生虾青素，如雨生红球藻( h a e m a t o c o c c u sp l u v i a l i s ) 在生长 过程中，发生氮源缺乏，体内会积累虾青素；如果培养过程中再添加二价铁离子， 则会提高其台成能力，促进虾青索的沉积。另据报道，用蓝光照射时，也可以诱导 其合成类胡萝卜素和虾青素【4 5 l 。目前国外优质雨生红球藻体中虾青素占类胡萝h 素 总量的9 0 以上，其含量与光的性质和质量有关，光质量( 光质量= 光密度照射时 间) 越高，虾青素产量也越高，而且持续光照的效果比间断光照好。由于这种藻类的 生长条件十分苛刻，对水质、环境及光的要求很高，大规模生产依然存在难度【蚯】。 1 4 2 3 利用酵母菌生产虾青素 有些种类的酵母菌能够合成虾青素，目前发现的主要有红法夫酵母( p h a f f i a r h o d o z y m a ) 、粘红酵母b f - 6 等h 7 1 。红发夫酵母菌种最早由p h a f f 等人于1 9 7 0 年在 美国的阿拉斯加的高山上和日本北海道一带山区落叶树的渗出液中分离到的。后经 m i l l e r 鉴定并命名为新属范菲亚属，1 9 7 6 年h n d r e w s 等人发现它能够生产虾青索 4 8 t 。 1 4 2 4 化学合成法生产虾青素 4 9 】 虾青素是类胡萝卜素合成的终点，由一胡萝h 素转变为虾青素需加上2 个酮基 和羟基，人工化学合成比较困难，而且大多为顺式。瑞士r o c h e 公司是以前提物质 1 4 第一章文献综述 ( s ) 一3 - 乙酸基一4 氧代一b 一紫罗兰酮为原料，经过多步化学反应，转化成十五个碳 的维悌希盐，最后由两个十五个碳的维悌希盐同一个十个碳的双醛合成虾青素。 1 4 。3 虾青素的应用前景 虾青素应用于饲料、食品、保健品等行业。在饲料行业，虾青素是红色着色剂 的主要来源。水生动物进食含有虾青素的饵料后，虾青素就沉积在皮肤和肉的组织 中。尤其在高档的鱼类( 三文鱼、大马哈鱼、红鳟鱼、红绸鱼) 养殖中，必须在饲 料中加入一定量的虾青素，才能使鱼肉呈亮丽的粉红色。赋色之外，虾青素还能提 高鱼的免疫能力，提高成活率和繁殖率。在蛋鸡的饲料中加入少量的虾青素，产出 的鸡蛋蛋黄色彩亮艳，金黄喜人，蛋的营养价值大大提高。同时，提高了蛋鸡的抗 病能力和产蛋率。 虾青素的结构特点使其具有清除诱发疾病的自由基，并猝灭单线态的氧的强烈 作用，可预防和治疗癌症及其他肿瘤疾病。最近，日本大坂大学的科学家发现，虾 青素还具有帮助倒时差的作用。所以在食品、保健品、药品中将有更为广泛的应用。 第二章叶黄素的分析方法 第二章叶黄素的分析方法 叶黄素的定量一般采用的是高效液相色谱法( h p l e ) ，该方法测定结果比较准确； 但是由于实验条件的限制和效率的原因，大部分实验室不具备使用条件或者不能够 随时使用，因而我们需要一种简单、方便的简易测定方法。 美国食品添加荆协会替于1 9 9 2 年公布了一种用分光光度法快速测最苜蓿中总 类胡萝卜素和叶黄素的方法。该方法主要是将脱水苜蓿通过皂化处理后，用正己烷 萃取出类胡萝卜素或叶黄素，然后将萃取液通过硅胶层析柱，选择极性不同的洗脱 液洗涤层析柱，将洗脱液在一定的波长下进行预量，通过调整计算公式中的矫正因 子，对脱水苜蓿中的总类胡萝h 素含量和叶黄素的含量进行测定。该方法虽然能够 适用于大多数实验室，但是处理时间过长，而且在层析过程中会导致类胡萝h 素的 氧化性损失，因此对我们这种方法进行了改进，使之能够作为一种常规方法使用 2 1 h p l c 方法 2 1 1 概述 高效液相色谱法恻( h p l c ) 是在高压、快速条件下进行的液相层析，由于层析柱 固定相基质粒度很小，表面积太，可以偶连各种基团，选择性好，流动相可根据不 同要求而改变，因此分辨率高。灵敏度高。可以有效地分离和准确定量许多种类的 物质。 一般使用的h p l c 有两种：正常相高效液相色谱( n o r m a l p h a s eh p l c ) 和反相高 效液相色谱( r e v e r s e - p h a s eh p l c ) 。r p h p l c 的固定相上并入非极性结合相( 八烷 基( c 8 ) 或十八烷基( c 1 8 ) 】或者多聚物相( 聚苯乙烯、丁二烯基苯、聚甲基丙烯酸酯) ， 其流动相是极性的。层析时，类胡萝h 索在非极性固定相和极性流动相之间分配， 含氧的叶黄素首先洗出，而胡萝卜索洗出在后。而n p - h p l c 的固定相含有吸附相 ( 硅、铝) 和极性结合相( 烷基胺、烷基腈、烷基醇) ，流动相为非极性。类胡萝h 素 分子上的极性部分与溶剂修饰荆争夺固定相上的吸附部位。因此，极性低的胡萝h 素首先洗出，而极性高的叶黄素保留时闻长，从而达到分离的目的。 反相h p l c 普遍使用的柱是以硅为基质，用十八烷基硅烷( o c t y l d e c y l s i l 锄e ) 修饰 1 6 第二章叶黄素的分析方法 的柱( c 1 8 ) 这种柱函盖类胡萝h 素极性的全部范围，并且与许多溶剂的极性的相溶性 好。适合于分离类胡萝卜素。c l s 柱的生产厂家及牌号很多，它们在颗粒大小、形状、 孔径、表面覆盖度( 碳负载) 、尾端帽、周定相合成方式等方面是不相同的。 拉l 】把c 1 8 相结合到基质硅的方式有二种，最普通的是利用单氧硅烷把单层c 1 8 结合到硅表面，称单聚体合成。另一种是利用三氧硅烷把多层c ，。结合到硅表面，称 为多聚物合成。单层硅烷柱的分离重演性好，而多层硅烷柱对于结构类似物例如类 胡萝n 素的顺一反异构体的多选择性好，从下图中可以看到在硅基质表面还有未反应 的硅醇基团( s i o h ) ，这些基团的覆盖称为尾端帽( e n dc a p p i n g ) ，可以减少极性相互作 用。改善柱的重演性能。而且，硅醇残基( 如图2 - 1 所示) 对于叶黄素的分离有益处。 反相h p l c 的流动相使用的主要溶剂应该是一种低极性的弱有机溶剂，这样可 选择的修饰剂种类较多，类胡萝t - 素的溶解性好且反压低。从这些要求看，只有甲 醇和乙腈是比较适合的，一般使用乙睛，因为它的粘度低，用单体c 1 8 柱时它对 叶黄素区的选择性也有改善。在流动相中加入修饰剂，可增加类胡萝卜素的溶解度， 改进选择性并达到所要求的保留时间。常见的修饰剂是氯仿、二氯甲烷，此外也有 用四氢呋喃、乙酸乙酯和丙酮等。现在所用的流动相大都含有3 4 种溶剂。 簿磐出! i - 聚，、 剧 聪 s | _ 3 ( 卜s 。畸 o - s t - - r 图2 1 硅醇残基 高效液相色谱的发展始于2 0 世纪6 0 7 0 年代，e v a n s e ta t ( 1 9 7 5 ) f 明用常相h p l c 分 离了类胡萝h 素；r r b a n r n i 和s v a v i ( 1 9 8 5 ) 也用该种方法分析检测了油菜中的b 胡萝h 索。然后在8 0 年代，科技有了迸一步的提高，高效液相色谱柱的性能也有了很大的 提高因此出现了反相技术。与常相相比，它的分辨率高，时间短，具有一系列的 优点。反相h ? l c 普遍使用的色谱柱是以硅为介质，以十八烷基硅烷 1 7 第二章叶黄素的分析方法 ( o c t y l d e c y l s i l a n e ) 【c i s 】修饰的色谱柱，当用它分离类胡萝b 素时，含氧的叶黄素 首先洗脱出来，而胡萝h 素后洗脱出来。k h a c h i k c ta l ( 1 9 8 6 ) 用r p - - h p l c 研究了 皂化反应对于类胡萝卜素成分的影响：s a n d e re t a l ( 1 9 9 4 ) 测定了类胡萝卜素的 a l l t m s 式异构体；e m e n h i s ee ta l ( 1 9 9 5 ) 研究了目前在使用的6 0 多种色谱柱，发现 c 3 0 色谱柱对于异构体的选择性最好( 可能是因为烷基有序排列的缘故) ：而c t 8 反相 色谱柱对于顺一反异构体的分离效果则不是很好。选择碳负载低、孔径大( 3 0 0 h m ) 的改良型v y d a c2 0 1 色谱柱的分离效果也很好。 2 1 2 分析实例 2 1 2 1 试剂与仪器 金盏菊花的正己院提取物为市售商品，叶黄素标准品购i ! l s i g m a 公司，液相色谱 分析试剂为色谱纯，其余试剂为分析纯。 高效液相色谱仪由日本岛津公司生产。 2 1 2 2 色谱分析条件 色谱柱是岛津v p o d s c l 8 柱0 5 0 m i n x 4 6 m l ，由4 “ 1 ) ，检测波长4 5 4 n m ，洗脱剂 为v ( c h 2 c h ) ：v ( c h 3 0 h ) ：v ( c h 3 c n ) ：v ( h 2 0 ) = 3 2 ：3 8 ：2 9 ：1 ，流速0 5 m l m i n ，温 度为室温。 2 1 2 3 叶黄素酯的分离与纯化 将金盏菊的正已烷萃取物( 1 5 9 ) 和正丁醇( 3 0 m 1 ) 加到反应器中，在5 5 c ( 密封搅 拌) 条件下充分混合均匀，然后加入( n a 0 h ) = 2 0 的水溶液3 0 m l ，温度升至7 0 c 后， 反应7 h ，停止皂化。皂化后的叶黄素酯q b j j h , k 3 0 0 m l 的蒸馏水并搅拌均匀，过滤叶黄 素粗品，析出的叶黄素粗品分别用3 0 m l 乙醇和5 0 m l 正已烷冲洗。 2 1 2 4 标准曲线的制备 精确称取0 i g 叶黄素标准品，用二氯甲烷溶解后，定容至2 m 1 ，使其质量浓度为 0 0 5 9 m l ，然后用二氯甲烷依次稀释成系列质量浓度：0 0 4 、0 0 2 5 、0 0 2 、 0 o l 、0 0 5 9 m 1 ，最小质量浓度为1 1 0 。5 9 m l 。 2 1 2 5 实验结果 1 8 第二章时黄素的分析方法 叶黄素高效液相色谱的分析结果，叶黄素标准品的高效液相色谱图见图2 2 ，叶 黄索样品的高效液相色谱图见图2 3 。 。_ 一 图2 2o t 黄素标准品的h p l c 谱图 毛畏i 翁r 孓 2 。2 a o a o 方法删 美国公职分析化学家协会( a o a c ) 公定分析方法原文，1 9 9 0 年第十五版，中华人 民共和国国家进出口商品检验局a o a c 编译委员会编译，中国科学技术出版社。 2 2 1 仪器 a 色谱管：1 2 5 m m 内径3 0 e m ，硬质玻璃管，底部配有2 m m 内径约1 0 c m 的 毛细管，插入2 5 m l 容量瓶的颈部。 b 真空过滤装置用于将洗脱液收集至容量瓶中，将装嚣经橡皮塞与色谱柱相 连。 2 2 2 试剂 a 丙酮：干燥，无乙醇，在约1 0 的e n 粒上蒸馏。 b 正己烷：市售品，高纯度或等效品。 c 抽提溶液：正己烷：丙酮：无水乙醇：甲苯( 1 0 ：7 ：6 ：7 1 d 吸附剂i ：在机械混合器中将1 + 1 ( w w ) 硅胶g 和硅藻土混匀1 - 2 h r 。 e 吸附剂：将1 + 1 ( w w ) 活化的氧化镁和硅藻土在机械混合器中混匀1 2 h r 。 f 氢氧化钾甲醇溶液：4 0 将4 0 9 k o h 溶解在m e o h 中，冷却，并用m e o h 稀 释至1 0 0 m l 。 1 9 第二章叶黄索的分析方法 g 硫酸钠溶液；1 0 。将1 0 9 无水n a 2 s 0 4 溶解在1 0 0 m l h 2 0 中。 h 洗提液：( 1 ) 胡萝h 素一己烷一丙酮( 9 6 + 4 ) 。( 2 ) 一羟基色素( m h p ) 一己烷一丙 酮( 9 0 + 1 0 ) 。( 3 ) - - 羟基色素( d h p ) - - 己烷一丙酮( 8 0 + 2 0 ) 。( 4