（化学工程专业论文）酶法改性魔芋葡甘聚糖强化海藻酸壳聚糖微囊缓释性能研究.pdf

摘要 本文探讨了b 一甘露聚糖酶水解魔芋葡甘聚糖( k g m ) 的过程；研究了将不 同时间水解产物用作海藻酸( a l g ) 壳聚糖( c h i ) 体系添加剂，缓释牛血清白蛋白 ( b s a ) 与尼莫地平固体分散体的过程，探讨了不同水解时间魔芋葡甘聚糖与海 藻酸、壳聚糖的相互作用。试验结果如下： 在酶活2 0 0 u i ，底物浓度小于1 0 m g m l 下，测得米氏常数k m = 8 2 7m g m l ， 最大反应速率v m a x = 0 0 2 2 1m g m 1 m i n ：在酶活2 2 5 u 1 ，底物为1 0 m g m l ，水解 温度4 0 。c 下，反应初期粘度迅速下降，而还原糖变化较小，约】小时后反应停 止。色谱分析表明，魔芋葡甘聚糖的部分水解产物的分子量分布呈近似正态分布， 水解2 m i n 与水解5 m i n 的魔芋葡甘聚糖的平均分子量分别为1 5 0 0 0 - o o 与7 0 0 0 0 0 左右。 粘度测试表明，海藻酸与魔芋葡甘聚糖间有明显的增稠作用；红外测试表明， 水解魔芋葡甘聚糖与海藻酸、壳聚糖的相互作用相对较强，魔芋葡甘聚糖的水解 程度可用红外谱图表征：扫描电镜( s e m ) 观察表明，水解5 m i n 魔芋葡甘聚糖 微囊内无相分离，微囊表面覆壳聚糖量较大：溶胀度测试表明，微囊在模拟肠液 中有明显的溶胀度延迟现象，覆壳聚糖膜同时添加魔芋葡甘聚糖的体系，在模拟 肠液中的溶胀度明显减少，有利于药物的缓释； 海藻酸一酶解魔芋葡甘聚糖一壳聚糖微囊在模拟胃肠液中释放蛋白质的实验 表明。适当降低魔芋葡甘聚糖分子量，增大魔芋葡甘聚糖浓度，并选择较高的壳 聚糖分子量和壳聚糖浓度，同时适当降低凝胶离子浓度将会获得较好的缓释效 果。在模拟肠液中，缓释效果最佳的体系为：a l g 浓度2 w v ；k g m 浓度为 0 5 w v ，水解5 m i n ；c h i 浓度为o ，5 w w ，分子量为1 4 1 1 0 1 0 6 ；凝胶离子 浓度 c a 2 + 1 = o 2 m 。海藻酸一酶解魔芋葡甘聚糖壳聚糖微囊在模拟胃肠液中释放尼 莫地平固体分散体的实验也表明，适当降低魔芋葡甘聚糖的分子量与粘度，尼莫 地平在模拟胃、肠液中的释药速率相对较低。 关键词：酶解魔芋葡甘聚糖海藻酸壳聚糖微囊，b s a 尼莫地平，缓释 a b s t r a c t t h ep r o c e s so fk o n j a c g l u c o m a n n a n ( k g m ) h y d r o l y s i sb y1 3 - m a n n a n a s ew a s s t u d i e di nt h i st 1 1 e s i s e n h a n c e m e n to f c o n t r o l l e d r e l e a s ef o r a l g i n a t e ( a l g ) 一c h i t o s a n ( c h i )m i c r o c a p s u l e sb ye n z y m a t i c a l l y h y d r o l y z e d g l u c o m a n n a n ( e h g ) w a si n v e s t i g e t e d b u l ls e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n dn i m o d i p i n e s o l i dd i s p e r s i o nw e r eu s e da sam o d e l p r o t e i nf o ri nv i t r oa s s e s s m e n t t h ei n t e r a c t i o n a m o n ge n z y m a t i c a l l yh y d r o l y z e dg l u c o m a n n a na n da l g i n a t ea n dc h i t o s a nw a sa l s o d j s c u s s e d t h e e x p e r i m e n to fk o n j a cg l u c o m a r m a nh y d r o l y z e db yb m a r l d a r l a s ei n d i c a t e dt h a t t h em i c h a e l i sc o n s t a n t ( k m ) a n dt h em a x i m u mr e a c t i o nr a t ew e r e8 2 7m 2 m la n d o 0 2 2 1m g m 1 m i nr e s p e c t i v e l yu n d e re n z y m a t i ca c t i v i t y2 0 0 u i d y n a m i cv i s c o s i t y d e c r e a s e dr a p i d l yb u tr e d u c i n gs u g a rc h a n g e dal i t t l e d u r i n g i n i t i a lr e a c t i o nt h e r e a c t i o ns t o p p e da f t e r1h o u rw h e n e n z y m a t i ca c f i v i t y2 2 5 m a n ds u b s t r a t elo m g m l h y d r o l y s i st e m p e r a t u r e4 0 c h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i s d e m o n s t r a t e dt h a tt h e m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fe h gw a s a p p r o x i m a t e l yn o r m a ld i s t r i b u t i o n ，a n dt h e a v e r a g em o l e c u l a ro fk g mh y d r o l y z e df o r2 m i na n d5 m i nw e r ea b o u tl5 0 0 0 0 0a n d 7 0 0 0 0 0r e s p e c t i v e l y ， t h em i x t u r eo fa l ga n dk e mh a dh i g h e rv i s c o s i t y t h e r ew a sr e l a t i v e l ys t r o n g i n t e r a c t i o nb e t w e e na l ga n de h ga n dc h ib vt h eg r a p ho fi n f r a r e df i r l t h e p r o c e s so f k g m h y d r o l y s i sb yb m a n n a n a s ec o u l db ee x p r e s s e db yi r t h es c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) m i c r o g r a p hi n d i c a t e dt h a tn o np h a s e s e p a r a t i o n e x i s t s b e t w e e na l ga n de h g ( 5 m i mw i t h i nm i c r o c a p s u l e sa n dt h eq u a n t i t yo fc h lw a s h i g h e ro nt h es u r f a c eo fm i c r o c a p s u l e s s t u d i e so fw a t e ro fh y d r a t i o nh a ds h o w n t h a t t h es w e l l i n go fa l g - e h g - c h i m i c r o c a p s u l e sw a sl o w e r 1 1 1 e du s i n go f e h gh e l dt o e n h a n c et h ec o n t r o l l e dr e l e a s e i ni m i t a t e d g a s t r i c a n di n t e s t i n a li u i c e ，t h e e x p e r i m e n to fb s ar e l e a s e f r o m a l g e h g c h im i c r o c a p s u l e si n d i c a t e dt h a tt h er e l e a s er a t eb e c o m es l o w l yw i t h s u i t a b l yd e c r e a s i n gt h em o l e c u l a rw e i g h to fk g m a n dt h ec o n c e n t r a t i o no f g e li o n s r a i s i n gt h ec o n c e n t r a t i o no fc h i a n dt h a to fk g ma n dt h em o l e c u l a rw e i g h to fc h i a l s oe n h a n c et h ec o n t r o l l e d - r e l e a s e t h eb e r e rs y s t e mw a s2 a l ga n d0 5 e h g o f5 m i na n d0 5 c 删o f1 4 1 1o 10 。m o l e c u l a rw e i g h t t h ee x p e r i m e n to f n i m o d i p i n er e l e a s ef r o ma l g e h g c h im i c r o c a p s u l e sa l s od e m o n s t r a t e dt h a tp r o p e r d e c r e a s ei nt h em o l e c u l a rw e i g h to f k g mw o u l d h e l pt oi n d u c e t h er e l e a s er a t e k e y w o r d s ：e n z y m a t i c a l l yh y d r o l y z e dg l u e o m a n n a n a l g i n a t e c h i t o s a n m i c r o c a p s u l e b s a n i m o d i p i n e c o n t r o l l e d r e l e a s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得基生盘茔或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：签字日期：年 月同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解盘壅盘堂 有关保留、使用学位论文的规定。 特授权叁鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名 导师签名 圜 签字日期：年 月 日签字日期：年 月闩 天津大学硕士论文 前言 日舌 魔芋( k o n j a c ) ，又名药翦，属天南星科，多年生草本植物，魔芋葡甘聚糖 为其主要成分，是一种低热、低脂的可溶性食物纤维，不能被人体消化酶分解。 现代医学研究表明，魔芋葡甘聚糖对人体具有预防和治疗糖尿病、肥胖症、结肠 癌、高血脂、高血压和心血管疾病等作用。其具有非常优越的吸水、澎润、保健 等生理效应和胶凝、高粘度、易固化等流变学特性，在食品、化工、医药、环保 等领域有着十分重要的开发价值。 目前，人们对魔芋葡甘聚糖的研究重点还仅仅局限在食品领域，尚未在其它 领域深入研究，而关于不同分子量的魔芋葡甘聚糖的应用的研究更少。本文旨在 探索魔芋葡甘聚糖用于药物控制释放材料的研究，尤其是酶法部分水解获得的不 同分子量的魔芋葡甘聚糖对药物控释效果差别的探讨。 0 一l ，4 _ d - 甘露聚糖酶简称为肛d 甘露聚糖酶或肛甘露聚糖酶，是一类能 够水解含有肛1 ，4 _ d 一甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖( 包括甘露聚糖、半乳 甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等) 的半纤维素水解内切酶，在食品、医药、造纸和石 油等方面有广泛的应用。 用肛甘露聚糖酶水解魔芋葡甘聚糖，通过控制水解时间等水解条件，可得 到不同分子量的魔芋葡甘聚糖。研究水解条件对多糖分子量的影响与酶促反应动 力学，不但有助于阐明其反应机理，更重要的是有助于指导工业生产及其相关反 应器的设计与操作，得到分子量分布较为均一的水解产物。 海藻酸盐在酸性条件易降解，因此海藻酸凝胶经过胃液后易出现药物爆释。 最常用增加凝胶稳定性的方法是覆壳聚糖膜。壳聚糖作为聚阳离子电解质可与海 藻酸这种聚阴离子物质形成较致密的聚电解质复合物，其可在一定程度上增加凝 胶强度与稳定性。 使用魔芋葡甘聚糖等在胃内不被人体消化酶分解的多糖材料作为添加剂，可 改变凝胶强度与控释性能，并能明显增强抵抗酸性溶液的能力。天津大学化工学 院酶工程研究室利用魔芋葡甘聚糖作为添加剂，研制了海藻酸一魔芋葡甘聚糖一 壳聚糖微囊作为口服药物的载体。以胰岛素为释放对象，添加与未添加魔芋葡甘 聚糖体系相比，释药时间可由1 小时增加至3 小时。以尼莫地平固体分散体为包 埋对象，药物在模拟肠液中持续释放可达4 小时以上。释放机理分析结果表明， 由于魔芋葡甘聚糖模拟胃肠液中的物理化学稳定性以及与海藻酸和壳聚糖的相 互作用，使得微囊在模拟肠液中能保持一定的稳定性，降解速率降低，从而达到 对药物较好的缓释效果。 目前使用的魔芋葡甘聚分子量较大，粘度较高，不利于微囊的制备。本研究 天津大学硕士论文 n u 舀 将采用p 甘露聚糖酶部分水解魔芋葡甘聚糖，降低魔芋葡甘聚糖分子量与粘度， 通过控制水解时间与水解度，获得不同分子量分布的魔芋葡甘聚糖部分水解产 物。 同时以牛血清蛋白( b s a ) 和尼莫地平作为亲水与疏水性药物的代表，研究 魔芋葡甘聚糖部分水解产物对药物在海藻酸一魔芋葡甘聚糖一壳聚糖体系中释 放的影响。尼莫地平为一种治疗心血管疾病的疏水性药物，为提高其生物利用度 以及与缓释材料( 亲水性多糖) 的相容性，本文将以聚乙二醇( p e g 6 0 0 0 ) 作为 载体制各尼莫地平固体分散体，并将其作为缓释对象。 c g # l ，本文将分析不同分子量的魔芋葡甘聚糖与海藻酸、壳聚糖的相互作用， 分析药物释放机制。 本文的主要内容： 第一章综述了魔芋葡甘聚糖的基本性质与应用；魔芋葡甘聚糖的酶解与水解 产物的研究进展：海藻酸微囊。 第二章利用0 一甘露聚糖酶水解溶胀完全的精制魔芋葡甘聚糖，研究水解体 系粘度、还原糖与分子量分布同水解时间的关系，计算动力学常数，分析酶解机 理。 第三章利用粘度测试、扫描电镜与红外测试，研究不同水解时间魔芋葡甘聚 糖与海藻酸、壳聚糖的相互作用，以及对凝胶结构的影响。 第四章以b s a 为模型药物，考察不同水解时间魔芋葡甘聚糖、凝胶离子浓 度、壳聚糖浓度、壳聚糖分子量与魔芋葡甘聚糖浓度对b s a 在模拟胃肠液中释 放情况的影响。 第五章以尼莫地平固体分散体为模型药物，考察不同水解时间魔芋葡甘聚糖 对尼莫地平在模拟胃肠液中释放情况的影响。 第六章归纳出本文结论并提出进一步研究设想。 天津人学硕士论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1 魔芋葡甘聚糖简介 魔芋( k o n j a c ) ，又名药翦，属天南星科，多年生草本植物，魔芋葡甘聚糖 为其主要成分，是一种低热、低脂的可溶性食物纤维，不能被人体消化酶分解。 现代医学研究表明，魔芋葡甘聚糖对人体具有预防和治疗糖尿病、肥胖症、结肠 癌、高血脂、高血压和心血管疾病等作用。其具有非常优越的吸水、澎润、保 健等生理效应和胶凝、高粘度、易固化等流变学特性，在食品、化工、医药、环 保等领域有着十分重要的开发价值。 1 1 1 魔芋葡甘聚糖的特性 1 1 1 1 魔芋葡甘聚糖的化学结构 魔芋葡甘聚糖( a m o p h o p h a l l o g l u e o m a n n a n 简称为k g m ) ，系魔芋的主要成 分，一种亲水性高分子化合物，是由d 一葡萄糖和d 一甘露糖以d l ，4 糖苷键 连接起来的大分子杂多糖，二者的比例约为1 ：1 6 ，椐液相色谱测定结果，糖 残基每1 9 个就有一个乙酰基以酯的形式与主链相结合，若以3 8 个糖残基作为一 个重复单元，则结构简式可表示为1 2 1 ： - o - m m v m g - m - g m m - 0 - m g m - g m - m g - m - g - m - m - g - m 一0 - m - m m - m - g 一0 - m m ) ；一 。5 1 。 a 。 m g = 葡萄糖残基，m = 甘露糖残基，a c = 乙酰基c h 。c o _ ，x = 聚合度 图卜l 魔芋葡甘聚糖结构简式 魔芋葡甘聚糖中存在的乙酰基，是它最特殊的官能团，因此具有十分独特的 性能。 i i i 2 魔芋葡甘聚糖与其它多糖的协同作用 魔芋葡甘聚糖的分子量大、水合能力强和不带电荷等特性决定了它优良的增 稠性质。与黄原胶、瓜尔胶、刺槐豆胶等增稠剂相比，它属于非离子型，故受体 系中盐的影响很小。研究表明，魔芋葡甘聚糖与黄原胶间可产生强烈的协同增稠 作用，这与魔芋葡甘聚糖和黄原胶的化学组成、分子结构紧密相关【3 。魔芋葡甘 聚糖由d 一葡萄糖、d 一甘露糖组成，黄原胶由d 一葡萄糖、d 一甘露糖、d 一葡 萄糖醛酸组成，它们的化学组成相似，更重要的是它们分子结构上的相互作用， 黄原胶以双螺旋结构存在，魔芋葡甘聚糖分子平滑，没有分支链的部分与黄原胶 天津大学硕七论文第一章文献综述 分子的双螺旋结构以次级键形式相互结合形成三维网状结构，从而产生强烈的协 同增效作用。这种增稠效果与胶凝性密不可分，单独的魔芋葡甘聚糖( 非碱性条 件) 或黄原胶均不能形成凝胶，但两者混合后由于增稠作用几乎可在任意p h 下 形成凝胶。此外，魔芋粉和k 一卡拉胶也有很强的协同作用，能显著增强卡拉胶 凝胶强度和弹性，减少卡拉胶的泌水性，其作用效果比槐豆胶还强 4 】。另外，魔 芋葡甘聚糖与玉米淀粉的相互作用研究发现，在增稠剂5 时，4 5 改性玉米淀 粉+ o 5 魔芋粉糊化后的粘度比5 的改性玉米淀粉的粘度要高出4 6 8 6 倍【5 j 。 1 1 1 3 魔芋葡甘聚糖的凝胶特性 魔芋葡甘聚糖除具有一般聚糖的水解、酯化、醚化等化学反应以外，最特殊 的反应为脱乙酰基反应，并由此而表现出独特的胶凝性。糖残基上的乙酰基在皂 化剂如：k o h 、n a o h 、k 2 c 0 3 、n a 3 p 0 4 或n a 2 c 0 3 的作用下会皂化而脱去，在这 过程中同时还会发生胶凝反应，形成的凝胶在水中不能再溶解，弹性随温度的升 高而增大，随温度的降低而降低。凝胶机理现已清楚：在碱性加热条件下，魔芋 葡甘聚糖链上由乙酰与糖残基上羟基形成的酯键发生水解，即脱去乙酰基，这样， 葡甘聚糖变为裸状，分子间则形成氢键而产生部分结构结晶作用，以这种结晶为 节点形成网状结构体i b j 。 在一定条件下，魔芋葡甘聚糖可以形成热可逆( 热不稳定) 凝胶和热不可逆 ( 热稳定) 凝胶。如与黄原胶、卡拉胶协同作用时可形成热不稳定凝胶，其原因 在于凝胶形成的三维网状结构不稳定n 传统的魔芋豆腐食品就是一种热稳定凝 胶，这是由于葡甘聚糖分子链上的乙酰基团阻止葡甘聚糖长链相互靠近，仅在弱 碱的作用下才能形成凝胶，并且对热稳定。 1 1 1 4 魔芋葡甘聚糖的流变学特性 魔芋葡甘聚糖易溶水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂，溶于水 后，会形成一种粘稠的溶胶。在天然胶质中，- 要算魔芋葡甘聚糖的水溶液具有最 高的粘度。粘度是决定大分子流变学性能的主要参数，而粘度的大小主要取决于 大分子的分子量和分子形态，所以魔芋葡甘聚糖的分子量或粘度是其品质评定的 重要指标。魔芋葡甘聚糖吸水性强，可吸水膨胀8 0 1 0 0 倍。溶于水后，形成粘 稠溶胶，具备非牛顿流体的特征，属于假塑性流体，即有剪切变稀性质。当其浓 度达2 时，切力变稀现象特别明显，一旦停止搅拌，很快形成“胶冻”或“凝 胶状胶冻”，恢复搅拌，过程逆转峭j 。 据实验，魔芋葡甘聚糖的粘度会随着温度的上升逐渐下降，冷却后又上升。 但是，粘度不能回升到加热前的水平。魔芋葡甘聚糖不能耐8 0 。c 以上的高温， 温度过高则会发生褐变。 4 天津人学硕p 论文 第一章文献综述 k o h y a m a i g l 等观察了p h 对魔芋葡甘聚糖粘度等指标的影响。结果表明，在 p 1 = 3 以下和在p h = 1 1 5 以上粘度迅速上升，在p h = 3 9 之间粘度较稳定。这种p h 值范围对应用研究来说应该是非常有利的。 1 1 2 魔芋葡甘聚糖的提取与纯化 魔芋葡甘聚糖是由葡萄糖和甘露糖通过b 一1 ，4 糖苷键连接起来的多缩己 糖，为魔芋的主要成分，可达干重含量7 0 以上，同时魔芋中还含少量有淀粉， 纤维素、蔗糖、葡萄糖、果糖及甘露糖等。从魔芋中提取葡甘聚糖，最早用酒精 沉淀和铜络合法，但会发生分子结构变化。目前魔芋葡甘聚糖的提取主要有三种 方法。 1 1 2 1 碱液提取j 1 0 i 魔芋干粉一一石油醚提取脂肪一一5 n a o h 微热提取魔芋葡甘聚糖一一滤 去残渣，加1 0 h c l 中和至p h = 7 ，加1 0 p b ( a c ) 2 提取，除重金属离子一一滤液 中通入过量h 2 s ，以除去铅离子一6 5 乙醚离心提取一一白色粉末沉淀物一一 5 n a o h 溶解一一h c l 中和至p h = 7 一一浓缩，8 0 乙醇沉淀，离心一一白色粉 末沉淀物一一丙酮干燥一魔芋葡甘聚精制品 1 1 2 1 酶法水解除淀粉i 魔芋精粉一一5 0 乙醇浸提2 次，除小分子单糖和双糖一一乙醚4 5 。c ，1 0 h 索式提取去脂肪一溶胀一一淀粉酶水解，3 5 ，6 l 广一2 2 0 目滤布抽滤一一 s e v a g ( 用氯仿：戊醇或丁醇4 ：1 混合) 脱蛋白5 次一一1 6 0 0 0 r r a i n 离心2 0 r a i n 一一o 0 2 m o l lb “o h ) 2 沉淀一一h a c 洗一一重复三次5 0 乙醇沉淀一一真空冷 冻干燥一一魔芋葡甘聚糖纯品 1 1 2 3 乙醇提取法1 2 i 魔芋粉一一8 0 乙醇浸提2 ，除小分子单糖和双糖一一魔芋精粉一一水溶液 溶胀一一高速离心，除去不溶物一一5 0 乙醇沉淀一一水溶液中再次分散冷冻干 燥一一得到白色絮状魔芋葡甘聚精制品 蔗糖、葡萄糖、果糖及甘露糖属于单糖和双糖，在多糖提取中溶于8 0 以上 的乙醇而除去。葡甘聚糖虽溶于水，但不溶于石油醚、乙醇等有机溶剂，故在去 可溶性糖的过程中不会损失。 以上几种方法相比，乙醇提取法可提高葡甘聚糖的纯度，并最大程度上保 持其理化特性。 1 1 - 3 魔芋葡甘聚糖的分析 多糖的含量与分子量的分析目前尚无成熟稳定的方法，对于魔芋葡甘聚糖主 天津大学硕士论文 第一章文献综述 要有通过测定粘度与强酸水解确定含量，以及利用凝胶渗透色谱测定分子量。 1 1 3 1 魔芋葡甘聚糖含量分析 生产中常以粘度高低来判断魔芋葡甘聚糖的含量。在浓度为o 8 2 o 的范 围内，其粘度的对数与浓度成正比，可用下式粗略计算其中间值( b 1 ： l o gr l = 1 1 0 c + 2 8 0 ( 1 一1 ) 式中：n 为粘度，单位c p ；c 为浓度，单位w 。但因为魔芋葡甘聚糖溶液属于 非牛顿流体，其粘度随温度、剪切速率、分子量的大小、含量变化等因素而变化， 因此这种方法不宜作为精确定量的标准。 魔芋葡甘聚糖可在强酸的水解下生成单糖一葡萄糖和甘露糖。实验中常用 d n s ( 3 , 5 一二硝基水杨酸) 显色的比色法原理间接测定魔芋粉中魔芋葡甘聚糖的 含量【i ”。首先，将魔芋精粉浸入8 5 的乙醇中，除去游离的还原糖；再将处理 的魔芋精粉在水中充分溶胀、离心，得到k g m 的提取液；将提取液在3 m o l i 的h 2 s o 。中完全水解，得到魔芋葡甘聚糖水解液；最后将水解液显色、测吸光值、 与标准工作曲线对照，即得到魔芋葡甘聚糖含量。该方法简单易行、准确可靠， 适于不同等级魔芋精粉中k g m 含量的测定。计算公式如下： 魔芋葡甘聚糖= 0 9 x 葶西否r 1 0 0 ( 1 2 ) 式中0 9 为单糖和多糖间计算的转化系数。 1 1 3 2 魔芋葡甘聚糖分子量检测的色谱分析 k n i s h i n a r i 等用凝胶渗透色谱( g p c ) 测定了魔芋葡甘聚糖的分子量【l ”j 。 使用两个串联的g p c 柱t s k g e lg m p w x l ( 7 8 m m l d x 3 0 e m ) 。用泵以1 0 c m 3 m i n 的速率吸入稀释的c a d o x e n ( 2 8 1 ，2 一乙二胺，o 3 5 m o l d m 3n a o h 以及1 8 3 w w 镉) 流动相。将魔芋葡甘聚糖样品分散在c a d o x e n 中，在室温下搅拌1 2 小时直 到它们完全溶解。用同体积的水稀释魔芋葡甘聚糖溶液和c a d o x e n 溶剂并用孔径 为o 5 p m 的聚四氟乙烯膜过滤。然后，取o 2 0 c m 3 的样品溶液( 浓度约为2 m g c m 3 ) 供分析。 因为k g m 在水溶液中的溶解度很低，所以将k g m 溶解在c a d o x e n 中以获 得稀溶液。已知c a d o x e n 能溶解纤维素并形成澄清、无色、稳定的溶液。s c h w a l d 和b o b l e t e r 报道了用c a d o x e n 作溶剂和流动相对纤维素做的g p c 研究。无色溶 液允许使用r i ( 折光示差) 检测器，且c a d o x e n 溶液的黏度比水溶液低很多，这 很有利于进行g p c 分析。 1 1 4 魔芋葡甘聚糖的应用 1 1 4 1 食品应用 天津大学硕士论文 第一章文献综述 魔芋食品中水分含量较高，固形物仅占2 一3 。所以魔芋食品是一种低热 量食品，对预防肥胖或减肥非常有效。另外，魔芋食品中的无机钙质较易洗脱出 来，因此它也是能利用的营养素之一。典型的魔芋食品有含油魔芋食品、冷冻魔 芋食品和蔬菜魔芋食品。 魔芋葡萄甘露聚糖除了用作食品原料之外，还广泛地用作食品添加荆，如 用于快餐食品、饮料食品、畜肉制品中，分别起到增稠剂、热量吸收抑制剂和保 水剂的作用。 1 1 4 2 成膜特性研究 魔芋葡甘聚糖有优良的成膜性，可制成高强度的可食性薄膜，它可分解，通 气防潮，耐热性好。目前，国内外关于膜材料的研究主要集中在全降解天然高分 子如淀粉、纤维素、甲壳素和海藻酸钠等天然多糖，有关k g m 成膜性的研究还 不够深入。在适当的条件下，虽然魔芋葡甘聚糖具有较好的成膜性，具有抗断能 力强、无方向性等优点，但由于分子量大，水溶性差，水溶胶不稳定，因而膜的 强度和抗水性较差，尤其是膜的抗水性很弱，在水中浸泡几分钟即溶胀分解，故 通常将魔芋葡甘聚糖进行改性，以提高强度、抗水性和透湿性，再作成膜研究“”。 1 1 4 3 魔芋葡甘聚糖用作固定化载体 目前，魔芋葡甘聚糖作为生物材料的另外一个用途就是作为固定化载体，如 魔芋葡甘聚糖经不溶处理和表氯醇一己二胺戊二醛活化固定来固定化环糊精 葡基转移酶f j 8 。c p e r o l s 等f 】9 】人利用魔芋葡甘聚糖冷熔水凝胶制备干酪产品，在 凝结过程中形成小珠，并包裹蛋白水解酶来增加蛋白质水解，然后随着小珠液化 而熟化释放出酶。结果表明，b 5 0 0 蛋白酶的包埋率达到5 0 ，同时酶的泄漏很少。 从这些研究可以看出，魔芋葡甘聚糖作为固定化载体的研究，表现出了很多 优越的性能，诸如最适温度范围较大、载体制备简单、成本低廉等。 1 1 4 4 分离材料 1 色谱与柱填料 将魔芋葡甘聚糖酯化，成型，皂化和交联后，即可得到色谱填料，能用于离 子交换色谱。这种色谱填料的优点是耐受高的流速，减少水洗再生时间。 2 魔芋葡甘聚糖用作亲和层析载体 目前，s e p h a r o s e 4 b 是使用最广泛且效果优良的亲和层析载体，但因其价格昂 贵使用受到一些限制。魔芋葡甘聚糖具有机械强度高、化学惰性、理化性质稳定 等特点。如魔芋胶活化偶联可制成c u 2 + 金属螯合亲和胶分离猪血s o d ，与传统的 s e p h a r o s e4 b 相比吸附量、纯化倍数、纯化s o d 的比活力均大大增加，多次使 用后对吸附量、去c u 量及s o d 回收率无影响，只是洗脱曲线略有变宽。另外 天津犬学硕士论文第一章文献综述 还有w a k i t am t 2 ”、t o m o d at “”用魔芋葡甘聚糖作为亲和层析载体分别分离凝血 因子和胰蛋白酶的报道。 1 1 4 5 生物医学与药物缓释材料 1 人工晶体1 2 3 1 魔芋葡甘聚糖能和四价硼离子形成络合物，产生具有一定强度且透明性好的 凝胶。这种人工晶体含水分9 5 ，9 9 5 ，有良好的透光性、弹性、强度和生物相 容性，可用于制作隐形眼镜和医疗光学制品。 2 护眼液【2 3 】 在护眼液中加入o 5 1 魔芋葡甘聚糖，利用魔芋葡甘聚糖的保水性，能够 防止眼睛和隐形镜片的干燥。 3 促进伤口愈合 将魔芋葡甘聚糖水溶胶干燥后形成凝胶，对其消毒后可作为医用材料。这种 干凝胶吸收液体后会转变为水溶胶，能够促进伤口的愈合，并有止血和缓释药物 等功能。 4 药物缓释 在生物材料方面，魔芋葡甘聚糖除了用作层析载体和固定化酶之外，还被用 作药物控制释放研究。n a k a n o m a s a h i r o 等 2 4 1 用魔芋葡甘聚糖包埋“狄布卡 因”( d i b n c a h t e ) ；x i e ，s s 等口5 1 用魔芋葡甘聚糖释放“颅通定”( r o t u n d i n e ) ，都达 到了不同程度的控释效果，显示了魔芋葡甘聚糖在这方面的优越性。 1 1 4 6 其它 利用魔芋葡甘聚糖凝胶的缓释作用，将包埋在其中的杀菌剂缓慢释放出来， 用以处理城市废水。如将包埋c a ( o c l ) 2 的魔芋葡甘聚糖凝胶切成1 c m 3 的小块， 置于多孔容器中，再将此凝胶放在流速1 0 l m i n 的城市废水管道中，能防止藻类 的生长。此外利用魔芋葡甘聚糖的剪切流变特性，可将其作为涂料的流变剂。 1 2 魔芋葡甘聚糖的水解及水解产物的研究进展 1 2 1b 甘露聚糖酶水解魔芋葡甘聚糖生产低聚糖 低聚甘露糖( m a n n o o l i g o s a c c h a r i d e s ) 又称甘露寡糖，是由2 1 0 个单糖( 甘 露糖、葡萄糖和半乳糖) 分子通过糖苷键连接而成的直链或枝链的低度聚合糖。 它具有糖类某些共同的特征，可直接代替糖类作为食品配料，但不被人体胃酸、 胃酶降解，在小肠中不被吸收，可到达大肠部位，在大肠内有效地促进以双歧杆 菌( b i f i d o b a c t e r i u m ) 为代表的肠道有益菌群特异性自然增殖，被称为双歧因子。 低聚甘露糖具有低热值、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度等特点，其性能 天津大学硕 ：论文 第一章文献综述 和效果优于乳果糖、大豆低聚糖及半乳糖基转移低聚糖，是新一代高附加值功能 性食品，被誉为2 1 世纪食品的先导。 1 2 1 11 3 - 甘露聚糖酶 b 一1 ，z l - d 一甘露聚糖酶( p 1 ，4 - d - m a n n a nm a r m a n o h y d r o l a s e ，e c 3 2 1 7 8 ) ，简 称为p _ i 卜甘露聚糖酶或p 甘露聚糖酶( p 皿_ m a n n a n a s e ，阻n a r m a n a s e ) ，是一类能 够水解含有肛1 ，4 _ d _ 甘露糖苷键的甘露寡糖、甘露多糖( 包括甘露聚糖、半乳 甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等) 的半纤维素水解内切酶，在食品、医药、造纸和石 油等方面有广泛的应用。 1 9 8 3 年，a r s k it 根据肛甘露聚糖酶水解甘露聚糖的方式不同将肛甘露聚 糖酶分为三类：能水解甘露三糖及三糖以上的称为第一类肛甘露聚糖酶； 能水解甘露四糖及以上的但不能水解甘露三糖的称为第二类b 一甘露聚糖酶： 只能水解甘露五糖及以上的称为第三类b _ 甘露聚糖酶。1 9 9 1 年，h e n r i s s a t 比较 了3 0 1 个糖基水解酶和相关酶类的氨基酸序列，根据序列的同源性将糖基水解酶 分为3 5 个家族。1 9 9 5 年，f a n u t t i 等人【2 6 】根据上述分类原则，将6 甘露聚糖酶分 为以下几类：与第2 6 糖基水解酶家族中的水解酶类有很强同源性的为第一类 b 甘露聚糖酶，如芽孢杆菌、荧光假单胞菌( p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n ss u b s p ) 的 b 一甘露聚糖酶：与第5 糖基水解酶家族中的水解酶类有很强同源性的为第二类 b 甘露聚糖酶，如葡萄白地霉( c a l d o c e l l u ms a c c h a r o l y t i c u m ) 、变铅青链霉菌 ( s t r e p t o m y c e sl i v i d a n s ) 的b 甘露聚糖酶：与其它糖基水解酶类没有明显同源 性的为第三类d 一甘露聚糖酶。从以上可看出，有关p 甘露聚糖酶的分类仍不够 完善，有待做进一步的深入研究。 1 2 1 2 酶与底物的键含模型 国内外不同学者通过对不同聚合度的低聚甘露糖与不同来源p 甘露聚糖酶 的酶促水解研究，分析水解产物的组成，提出了p 一甘露聚糖酶水解时酶与底物 分子的键合模型【2 ”。 其要点为：b 一甘露聚糖酶分子上具有两个不同功能的结构域，底物结合 结构域( s u b s t m t e s - b i n g d i n gd o m a i n s ，s b d ) 和催化结构域( c a t a l y t i cd o m a i n s ，c d ) ； 底物结合结构域( s b d ) 为酶分子表面的狭长疏水凹穴，能与1 3 一l ，p 甘露多糖链 相嵌合，凹穴内依次排列着六个底物结合的亚位点( 、1 3 、y 、丫 、6 、) ，这些 亚位点通过与相对应位置糖残基上的羟基成键，牢老地结合在糖链的固定位置， 六个亚位点与底物的结合有一定的差异，其中6 的专一性结合对酶解的影响很 大，其它位点的影响较小，若相应位置的羟基发生改变会减弱甚至阻遏酶分子与 底物键合，进而影响酶分子在x 位点的水解；酶与底物多糖的结合是一个相 9 天津大学硕士论文第一章文献综述 互诱导过程，诱导过程中多糖链会发生一定的扭曲变形，多糖链上存在的一些侧 链基团对酶与底物的键合有一定的空间位阻；来源不同的1 3 一甘露聚糖酶分子上 六个亚位点的专一性结合有一定的差异，如瓜胶d 一甘露聚糖酶分子上所有位点的 专一性要求很严，而黑曲霉p 一甘露聚糖酶的o l 、r 亚位点的专一性要求不是很严 格；酶分子上的催化结构域( c d ) 的活性中心作用于主糖链上的b l ，4 一糖苷键。 1 2 1 3 活力测定 表1 1b _ 甘露聚糖酶活测定方法比较 t a b l e1 - 1t h ec o m p a r i s o no f m e t h o d sf o rm e a s u r i n g1 3 - m a n n a n a s ea e t i v i t y 还原糖测定法 测体系粘度法【2 q 刚果红染色法 考马斯亮蓝染色法t 3 1 1方法 【2 哪【3 0 1 酶水解多糖生成 甘露多耱胶的粘 甘露聚糖与染科形成复合物，通过酶对 的还原低聚糖 度变化在一定范 多糖链的水解，使染料释放出来，其体 在一定的浓度范 围内与酶水解多 系的颜色变化在一定范围内与多糖水解 反应原理围内与显色剂反 糖主链长短的变 程度成一定的比例关系 应，其颜色强度 化成一定比例关 与低聚糖的量成 系 比例关系 通过测定一定时 通过测定一定时通过测定一定时通过测定一定时间内 间内反应生成还 测定方法间内体系粘度的 间内产生水解圈水解释放考马斯亮蓝 原糖的量计算酶 下降计算酶活的大小计算酶活的量计算酶活 活 专一陛差好好好 灵敏度一般高 高一般 可操作性好复杂 复杂复杂 反应时间 短短长短 适_ j 范围广 窟窄窄 p 甘露聚糖酶的活力测定方法如表1 - 1 所示。从表1 1 可以看出，酶活测定 方法对确定b - 甘露聚糖酶的活力水平、特异性及分类都有重要影响。由于还原 糖测定法操作简便可行，重复性好，所以实验中常采用的是d n s ( 3 , 5 一二硝基水 杨酸) 显色法。但其专一性差，因此在确定p 甘露聚糖酶酶活时一般还需结合 其它方法，如薄层层析法等进行水解产物的鉴定。同时需要注意区分另两类外切 型的甘露多糖水解酶类( p l ，4 _ d _ 甘露二糖酶和p d _ 甘露糖苷酶) 的影响，避 免它们的干扰带来误差。其它方法由于操作复杂等原因应用较少。 1 2 1 4l l - 甘露聚糖酶水解魔芋粉制取低聚甘露糖p z | 因魔芋葡甘聚糖溶胀后粘度太大，反应浓度最多不超过i ，将未溶胀魔芋 粉与酶同时加入水解罐，边溶涨，边水解，则可提高底物反应浓度。天津大学酶 工程研究室采用魔芋粉和酶同时加入方式进行了p 一甘露聚糖酶小试与中试水解 1 0 天津大学硕士论文 第一章文献综述 魇芋粉。 结果表明：6 甘露聚糖酶水解魔芋粉制取的低聚甘露糖对青春双歧杆菌、两 歧双歧杆菌、长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌四种双歧杆菌均具有明显的增殖作用， 效果较低聚异麦芽糖显著。中试样品不能促进大肠杆菌及肠球菌的生长，即中试 低聚甘露糖样品对双歧杆菌具有选择性促生长作用，是一种较好的双歧因子。对 中试样品的重金属含量、微生物指标、毒理学检测表明：水解产品低聚甘露糖符 合国家有关功能食品的卫生及安全性要求。 1 2 2 魔芋葡甘糖酶解低聚糖脂化制备类肝素药物1 3 2 1 以魔芋精粉为原料，经酶解、羟丙基化和硫酸酯化修饰，可以得到水溶性良 好的硫酸酯化衍生物。该物质有机硫含量为2 0 ，凝胶色谱测得该物质均相对分 子质量为3 5 7 7 ，数相对分子质量为2 7 7 5 ，其分子量位于低分子类肝素的相对分 子质量的范畴中。红外光谱显示，在1 2 5 0 c m “和8 0 0 c m 处出现o s 0 3 基团的特 征吸收峰，表明已形成硫酸酯。1 h n m r 显示，一o s o f 基团主要连接在c 2 、c 3 位上以及c 6 所连的羟丙基支链上。此产物可望开发成一种有前途的防治心血管 疾病的新型低分子类肝素药物。 1 2 3 不同分子量魔芋葡甘聚糖凝胶特性研究i 3 4 l 魔芋葡甘聚糖可在热碱条件下发生脱乙酰基反应，形成热不可逆凝胶。 k o h y a m a 等人用流变仪测试了不同分子量魔芋葡甘聚糖( 酶法水解得到) 的凝 胶动力学过程。 实验结果表明，随着魔芋葡甘聚糖分子量的增加、浓度的增大、碱含量的增 加与温度的提高，凝胶时间变短，凝胶速率常数增加。如在6 0 ，对分子量分 别为2 5 6 x1 0 5 与5 9 6 1 0 5 的2 魔芋葡甘聚糖，凝胶时间分别为1 1m i n 与 5 m i n 。；对分子量为2 5 6 1 0 5 的魔芋葡甘聚糖，浓度为1 与3 ，凝胶时间分 别为4 7m i n 与4 m i n ；对分子量为2 5 6 1 0 魔芋葡甘聚糖( 2 ) ，凝胶温度4 5 与8 0 。c 的凝胶时间分别为2 7 m i n 与1 m i n ；对分子量为2 5 6 1 0 5 魔芋葡甘聚糖 ( 1 ) ，在碱浓度为o 5 m 与2 0 m 时，凝胶时间分别为1 3r a i n 与2 m i n 。 此外，存储剪切模量的平台值，即形成凝胶后的存储剪切模量随魔芋葡甘聚 糖分子量的增大而增加，这个值是凝胶温度与p h 值的函数，在某一凝胶温度与 p h 值下，达到最大值。如对于低分子量魔芋葡甘聚糖在凝胶温度大于7 5 c ，其 存储剪切模量与损耗剪切模量都有所降低。而对于未水解魔芋葡甘聚糖，在凝胶 过程中，其存储剪切模量与损耗剪切模量并未降低，这可能是高分子量魔芋葡甘 聚糖溶液粘度较大。 1 2 4 不同分子量魔芋葡甘聚糖与其它多糖的相互作用5 。1 6 l 天津大学硕士论文 第一章文献综述 魔芋葡甘聚糖( k g m ) 与角叉胶( c a r ) 混合，会产生较强的协同作用，