（分析化学专业论文）以pcmsdvb树脂为基质的高效液相色谱填料的合成与应用研究.pdf

摘要 本研究采用一步种子溶胀技术制备了颗粒单分散大孔结构的交联聚氯甲基苯乙烯微球，以此 微球为基质采用新的化学改性方法制备了一系列新型的聚合物固定相，将其应用于生物大分子的 分离纯化中 文章中首先对聚台物基质固定相的研究进展进行了综述，对分离生物大分子的商效液相色谱 固定相的发展趋势进行了展望 采用分散聚合法，制备了单分散聚苯乙烯( p s ) 微球，系统研究了各参数对聚合产物性质的 影响优化反应条件后，制备出低分子量粒径可控的单分散p s 微球 以单分散线性p s 为种子，采用一步种子溶胀聚合法制备了单分散大孔结构的交联聚氯甲基 苯乙烯二乙烯基苯镀球( p “鲫 ) 。深入地研究了各因素对微球孔径，孔径分布的影响，优化条 件制备了7 9 t i n 的p 0 4 s m v b 微球 以p c u s m v b 树脂为基质，分另4 制备了弱阳离子交换( w c x ) 、中强阳离子交换( m c x ) 和强 阳离子交换( s ( ) 三种性能优异的阳离子交换色谱填料，详细考察了各填料的色谱性能，将三 种填料用于生物工程产品的分离纯化，结果满意另外以p c m s m v b 树脂为基质，合成了三种阴离 子交换色谱填料，将其应用于标准蛋白的分离中。发现其分离效果不如文献报道的好，说职该秘 填料还需进一步改进最后采用一步种子溶胀聚合法制备了p s d v b 树脂，用于对几种芳香族化 合物进行反相液相色谱分离，取得了较好的效果 关键词：单分敌大孔交联氯甲基苯乙烯微球，高效液耜色谱，生物大分子分离 i i m o n o d i s p e r s ep o l y ( c h l o r o m e t h y l s t y r e n e - - d i v i n y l b e n z e n e ) ( p c m 鲫v b ) p a r t i c l e sw i t hm a c r o p o r o n s w e r es y n t h e s i z e db y o n e - u e ps w e l l i n ga n dp o l y m e r i z a t i o nm e t h o d b a s e do nt h i sm e d i a , as e r i e so fn e w s t a t i o n a r yp h a s e sf o rh p l cw e r es y n t h e s i z e db yn e wc h e m i c a l l ym o d i f i e dm e t h o d s w h i c hc a nb e a p p l i e df o rs e p a r a t i o no f b i o p o l y m e r s 一 t h et h e s i ss u m m a r i z e dt h ed e v e l o p m e n to ft h ep o l y m e r i cm a t r i xs t a t i o n a r yp h a s e sj nh p l c m e a n w h i l ei tp r o v i d e dap r o s p e c to ft h ed e v e l o p m e n tt e n d e n c yf o rs e p a r a t i n gb i o p o l y m e mb y p o l y m e r i cm a t r i x ， a d o p t i n gd i s p e r s i o np 蜘i i z a l i o nm e t h o d ，m o n o d i s p e r s ep , 1 t y s t r y r e n es e e dh e a d sw e r ep r e p a r e d t h ee f f e c t so fa l lf a c t o r so np a r t i c l ed i s t n b u t i o na n dd i a m e t e rw e ms y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e d m o n o d i s p a r s ep o l y s t r y r e n es e e db e a d sw e r ep r e p a r e du n d e ro p t i m i z e dr e a c t i o nc o n d i t i o n s t a k i n gp o l y s t r y r e n eh e a d sa ss e e d , m o n d i s p e r s ep c u s v sb e a d sw i t hn m c r o p o r o u sw e r ep r e p a r e d b yas i n g l e - s t e ps w e l l i n ga n dp o l y m e r i z a t i o nm e t h o d t h ee f f e c t so np o r es i z ed i s t r i b u t i o ni nu n i f o r m l y s i z e dp o r o u sp c s o v b b e a d s7 9 ni nd i a m e t e rw e r ei n v e s t i g a t e d b a s e do nt h ep c t e v eb e a d s , t h r e ek r i d so fr e s n ss u c ha sw e a kc a t i o ne x c h a n g eo v c x ) , s t r o n g c a t i o ne x c h a n g e ( s 0 0 ，m e d i u mc a t i o ne x c h a n g et m c x ) c h r o m a t o g r a p h i cs t a t i o n a r yp h a s ew e r e s y n t h e s i z e db yn e wc h e m i c a l l ym o d i f i e dm e t h o d s b l c hk i n do fs t a t i o n a r yp h a s ew a se v a l u a t e di nd e t a i l w ea l cs a t i s f i e dw h e nw eu s e dt h e mt os e p a r a t ea n dp i 】f i f yt h eb i o p o l y m e r s i na d d i t i o n ，b a s e mo nt h e p c u s m v bb e a d s , t h r e ek i n d so fa n i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h i cp a c k i n g sw e r es y n t h e s i z e d i tw a s f o u n dt h a tt h e s ep a c k i n g sw e r en o ta sg o o da st h ea n i o ne x c h a n g ep a c k i n g sr e p o r t e di nl i t e r a t e s t h e y s h o wu st h ep a c k i n g sn e e dt ok c 印o nd e v e l o p i n g a tl a s t , t h ep s - d v br e s i nw a sp r e p a r e db ya d o p t i n ga s i n g l e - s t e ps w e l l i n ga n dp o l y m e r i z a t i o nm e t h o d i tw a ss a t i s f i e dt ou s ei t a st h er p l cp a c k i n g st o s e p a m t et h ea r o n m t i c i t yc o m p o u n d s k e yw o r d s ：m o n o d i s p a r s ep o z y ( c h l o r o m e t h y s t y r o n e - d i v i a y i b o n z e n e ) , i g hp e r f o r m a n c et i q u i d c h r o m t o s r a p h y , s e p a r a t i o n o f b i o p o l y m e r s j i j 宁夏大学硕，上学位论文 第一章绪论 皇皇i ! ai m - - 鼍蔓曼曼曼暮鼍皇曼曼曼暑曼曼! ! 1 1 引言 第一章绪论 随着生命科学的发展，与液相色谱相关的生物大分子的分离已成为极其重要的课题可以 认为液相色谱的新发展有赖于现代生物工程和生命科学的进展在生物大分子分离技术的发展 过程中，高效毛细管电泳是一种能与高效液相色谱相竞争的高效分离方法然而，高效毛细管 电泳的局限性是处理量小如果以获得足够纯物质为目的( 结构鉴定，生物活性试验，生物药 物制剂) 的分离而论，仍然应当首选液相色谱 液相色谱为生物大分子提供了十分温和的分离环境：( 1 ) 一般在室温下进行；( 2 ) 流动相 为有机溶剂、水和与生理液相仿的各种缓冲液；( 3 ) 固定相表面经过各种化学修饰，为不同模 式下分离生物大分子提供。软接触”的相互作用面这些对保持某些生物大分子的“活性”是 十分重要的。多孔填料的孔体积经过设计和控制，可以适应于分子量从几千到上百万的大小不 同的分子的分离这样就扩大了液相色谱处理的样品范围。高效液相色谱不仅作为一个高效、 灵敏、快速的分析方法活跃在分析化学领域，而且也作为一种高效，理想的制各分离方法出现 在化学和生物化学家的实验室或工厂里i i l 。 随着生命科学的发展，对于各种生物活性物质。特别是蛋白质( 包括酶) 、核酸和多糖等与 生命科学密切相关的生物大分子的分析、分离和纯化已成为当前分离科学、基因工程等领域的 研究热点而液相色谱作为最为有效的分离方法，在蛋白质的多级纯化过程中，发挥着至关重 要的作用尤其是在各种生物产品( 疫苗、生长因子、多肽及蛋白药物等) 的大规模制备中更 是一个不可缺少的方法口j 高效液相色谱( r i i g hp e r f o r n m c el i q u i dc h r o n m t o g r a p h y , h p l c ) 按其应用目的的不同分为 分析色谱和制备色谱州分析色谱的目的是要了解样品的组成与含量，所以不必将各个组分分 离与提取而制各色谱的目的是将目标化合物从样品中分离、收集、提取，从而最终得到纯物 质因此二者在分离条件的选择及对仪器设备的要求上也不相同前者需要将样品中各个组分 分离完全，咀便定性及定量，所以要求高效的色谱柱、最小的系统死体积、高灵敏度的检测器 及最低的检测限；后者仅需将目标化合物与其它组分分开，不必考虑各组分之间的分离，所以 可采用大颗粒填料和低灵敏度的检测器，以适应流动相流量的需要但不论是分析色谱还是制 备色谱，它们进行分离纯化的核心仍然是固定相的选择，它的发展是液相色谱发展的关键，因 此研制和开发新型的色谱填料一直是色谱学家努力的方向 目前色谱填料包括无机基质卜l q ( 硅胶、可控孔玻璃球、羟基磷灰石、氧化锆等) 和有机 基质其中硅胶填料机械强度大、柱效高、孔径和颗粒大小易于控制，是目前应用最为广泛的 一类无机填料但其存在着p h 应用范围窄( 2 o 一8 0 ) 、表面残余的硅羟基对蛋白质产生不可逆 吸附等缺陷，限制了其进一步的应用2 0 世纪末，随着合成技术的进步，许多性能优异的新一 代高教填料竟相出现，促使整个液相色谱技术获得了长足发展f l “。聚合物基质填料具有良好 的生物兼容性、化学稳定性及易于被衍生化的优点1 1 ”】，使其在生物大分子分离中的地位愈来 愈重要它的亲水性减小了基质与蛋白质之问发生非特异性相互作用的机会和可在广泛d h ( 1 2 ) 宁夏大学硕士学位论文第一章绪论 值范围内使用，并且对于样品的负载能力强，有较高的色谱容量，这些特点显著优于硅胶诸多 优点，决定了高分子类型填料广阔的发展前景，尤其对于分离纯化活性生化物质所表现的良好性 能，已越来越受到研究者和应用者的重视 1 2 高分子聚合物填料基质的制备 1 2 1 用于蛋白质分离基质的发展 渍相色谱对蛋白质的纯化已经应用了几十年，用于蛋白质分离的载体基质的发展分为四个阶 段p 7 , w i ： ( 一) 软凝胶：二十世纪五十年代末，人们已经发现。纤维素、琼脂糖和交联的葡聚糖这 样的多糖是制备色谱填料的优良载体1 1 ”，因为其便宜，易于被衍生化，具有高孔率和高表面积 而被广泛用于实验室规模的制备分离但是，这些软凝胶载体的最突出的问题是机械性能差因 此不能利用小粒子和高流速来提高分离度和缩短分离时间 ( 二) 硅胶载体：继软凝胶色谱填料的发展而来的另一时代是无机载体七十年代初，大 孔的小粒度二氧化硅基质的引入使得用于分离蛋白质的色谱柱的分离度和速度的同时增加成为 可能潞。洲。通过应用一系列的表面涂层技术，使得填料达到或超过软凝胶物质的分离度和柱容 量，并能在1 0 - 6 0 分钟内完成蛋白质的分离这种填料对蛋白质化学和生物技术产生了巨大的冲 击，并继续被广泛地使用二氧化硅基质的问题是其残留的硅羟基经常表现为阳离子交换作用， 其稳定极限不超过p h 9 0 当必须在较高的p h 值下清洗和消毒柱子时，这一p h 值极限成为它的 应用局限性 ( 三)两u 性有机介质：七十年代末，载体进展的第三个阶段，即有机树脂，被用于蛋白质 和肽的分离随着悬浮聚合技术的发展制备大孔的聚异丁烯和聚苯乙烯- - - g _ , 烯苯( p s ，d v b ) 树脂成为可能这种树脂具有比软凝胶大的机械强度瞄驯此外，这种材料在p h 2 1 2 范围内都 稳定这种介质可被制成小到几微米，并且有直径高达1 0 0 0 或更大的孔这种刚性大孔树脂在 离子交换色谱( 正c ) ，固载化金属络合物色谱( i m c a ) 和生物特异性亲和色谱( b a c ) 等方面 的应用已超过了二氧化硅介质 ( 四)现代载体的第四个阶段集中在克服多孔色谱填料中的停滞流动相传质问题上八十 年代中期，u n g e r 等人的研究表明：小的( 1 - 3 m m ) 无孔粒子能快速分离大分子 2 7 , 2 s 1 。例如。用一 种无孔反相填料在l o 秒钟内能完成5 种蛋白质的分离例因为这些填料没有孔，在吸附剂粒子 内的慢扩散被消除，柱子可以在至少高一个数量级的速度下进行分离。然而，无孔粒子柱也有局 限性，粒径太小，难以装柱，能产生很高的反压，而且，用无孔小粒子填装的柱子，柱容量低， 一般来说只宜于分析 ( 五) 灌注色谱填料：早期有很多研究人员提出了在不增加压降的条件下加快传质过程的 设想a f e y a n 等人于1 9 8 9 年申请了这种聚合物色谱介质的美国专利 3 0 l ，并将其称为灌注色谱 ( p e r f u s i o nc h r o m a t o g r a p h y ) ，1 9 9 0 年以来发表了对这一工作的一系列研究报告1 3 1 。”。由于灌注 色谱法具有独特的孔结构并以对流为主的传质手段，其具有以下重要的特征： 1 由于利用流动相与溶质的对流作用降低了溶质在介质内滞留的限制，明显的缩短了蛋白 2 宁夏大学硕士学位论文 第一章绪论 i i 质的分离时间，无论是分析色谱还是制各色谱，得到的蛋白质的质量、产量和产率都有所提高 2 由于其特殊的孔结构，蛋白质在高流速下不会因传质来不及而使谱带展宽，分离度降低 删 3 在灌注色谱介质上，对流传质起主导作用的事实也能从蛋白质的前沿突破曲线的陡度来 说明在传统的大孔介质上，随着流动相速度的加快，曲线的台阶逐步提前和变缓；在灌注色谱 介质上，台阶的陡度基本不随流速变化l ”l 。这表明：蛋白质在柱内的吸附过程中没有明显的传 质阻力 4 在柱容量方面，灌注色谱介质因扩散孔的存在，其结合和分离蛋白质的量与一般h p l c 大孔介质相当i 删灌注色谱的柱容量很少受流速的影响，因而用该法分离和纯化蛋白质能得到 更高的产率1 4 5 , 4 6 1 1 2 2 高分子聚合物填料基质的制备 分离基质是高效液相色谱填料的支撑骨架，它将直接决定填料的颗粒大小，刚性程度和孔结 构形态，也将直接影响到能否有效的引入具有选择性分离的官能团。因此，欲获得高柱效，高选 择性，高分辨率的柱填料，其合成是至关重要的。目前，合成高聚物填料的方法主要有以下几种 1 2 2 1 悬浮聚合法 自从m o o r e 于1 9 6 4 年应用有机基质作为色谱填料以后，在长时期内，高分子微球的合成一 直采用此种方法即”i 在工业生产中，水处理及制药等部门使用的离子交换树稻就是用这种方法 合成的 4 9 , 5 0 i 这种聚合方法合成工艺简单，应用最为广泛合成出的微球粒度分布范围很宽，必 须经过分级处理才能应用于h p l c 但是分级处理过程却非常麻烦，而且处理后的颗粒仍不够均 匀，使得色谱枉效降低。 1 2 2 2 分敢聚合法 分散聚合是二十世纪7 0 年代初由英国i c i 公司的研究者提出的一种薪的制备单分散微球的聚 合方法州该方法实际上是一种在分散介质中加稳定剂的沉淀聚合反应开始前，单体、稳定剂 和引发剂都溶解在有机介质中形成均相体系；反应开始后，引发剂分散引发单体聚合，当聚合物 分子量达到临界链长后，就会在介质中沉淀析出形成小颗粒；小颗粒借助于分散稳定荆悬浮于介 质中，形成稳定的分散体系从理论上讲，油溶性和水溶性单体都可以进行分散聚合，但目前研 究最多的还是苯乙烯1 5 2 - 6 a i 、甲基丙烯酸甲酯f 6 4 , ”j 和甲基丙烯酸环氧丙酣嘲在分散聚合中，单体 浓度除了影响聚合速率外，主要是影响聚合介质的溶解性，从而影响聚合物颗粒的粒径及其分布 t s e n g 和i j l 等人研究7 分散聚合动力学，l h o c h a z k a 等人1 6 7 1 提出了分散聚合的热力学模型研究 了分散聚合体系中聚合物颗粒内的溶胀现象及单体、引发剂和溶剂在颗粒内外的分布，德到了可 以接受的预计结果。p a i 一”j 研究了分散聚合体系稳定机理、溶剂的作用及聚合反应场所，提出了 一个简单的分散聚合机理模型，根据这个模型可以较成功的预计聚合物颗粒直径 目前对分散聚合的机理研究有多种方法并都有一定的实验证明，但是还不能定论。人们主要 倾向于两种机理，一是齐聚物沉淀机理1 5 3 1 ，二是接枝共聚物聚结机理【“。图1 - 1 为齐聚物沉淀机 理示意图，图中( a ) 说明在反应开始前，单体、稳定剂，助稳定剂和引发剂溶解在介质中，形成均 相体系；( b ) 上升到反应温度后引发剂分解成自由基，并引发聚合，生成溶于介质的齐聚物： 3 宁夏大学硕士学位论文 第一章绪论 曼曼曼皇曼量量舞i m , , i 皇曼量置皇鲁量曼曼曼曼舅曼皇量曼曼曼鲁量置曼曼曼皇曼寡量 ( c ) 当达到i 临界聚合度时，齐聚物从介质中沉析出来，并吸附稳定剂和助稳定剂到其表面上， 形成稳定的核；( d ) 所生成的核从连续相中吸收单体和自由基，形成被单体溶胀的颗粒，并在其 中进行聚合反应，直到单体耗尽图1 - 2 为接枝共聚物聚结成核机理示意图，由图可以看出，反 应开始前为均相体系，升温至反应温度后，产生自由基，并在稳定剂分子链上活泼氢位置进行接 枝反应，形成接枝共聚物，这些接枝共聚物中的聚台物链聚结到_ 起形成核，而稳定剂链则伸向 介质，以使颗粒稳定的悬浮在介质中，颗粒不断从介质中吸收单体进行聚合反应，使颗粒不断长 大，直到反应结束 i ， ，。 ，b 0 ”- - d ，、 二，。一一 ：j ， 一1。一w 、j 。? 。、j “。? 丘、 1 。( a ) 、，一- l , 8 - ( b ) f 专努蕾 、攀 _ ，j 3 _ 楞。，穆、 豳i - i 齐聚物沉淀成核机理 1 2 2 3 种子溶胀聚合法 魏蠡擒 f ，1 分于诡。? 7 靠报缟疵：垃 引发崭靛剂 单0 矗 拦箩蓑 粒子增长 腆仫 ；、 ：， ， 田1 - 2 接枝共聚物聚结成棱机理 种子溶胀聚合法是制各各种不同物理、化学结构的单分散、大颗粒聚合物微球的一种有效方 法，所谓种子溶胀法就是先用无皂乳液聚合、分散聚合或雾化法等方法制成小粒径单分散聚合物 颗粒，然后以此为种子用单体进行溶胀，使颗粒长大，再引发聚合，这样就可以制得大粒径单分 散聚合物微球d c 曲。疗等人r 叫”l 曾在宇宙飞船上的失重条件下用种子乳液聚合法制成了颗粒 为伽m 的单分散聚苯乙烯( p s ) 微球。但毕竟因其成本太高，而且这样的条件在地面上不易 获得，故该技术难以酱及推广如何在地面上的通常条件下制备出单分散、大粒径的聚合物微球 是为研究者提出的重要课题根据合成工艺又可以将种子溶胀聚合法分成常规溶胀聚合法、逐步 溶胀聚合法、两步溶胀聚合法、动力学溶胀聚合法及一步溶胀聚合法五种，以下分别予以介绍 1 2 2 3 1 常规溶胀聚合法 o k u b o 等人心”憎常觌种子溶胀法制成了大控径单分散聚合物微球他们首先通过分散聚合 制成直径约为年m 的单分散p s 颗粒，然后在0 c 下朋苯乙烯或二乙烯基苯混合物溶胀2 4 小时， 最后进行聚合反应，制成颗粒直径约瓤m 的单分散微球。 1 2 2 3 2 逐步溶胀聚合法 逐步溶胀聚合法【7 ”6 】指把种子颗粒进行多次溶胀、多次聚合最终制得聚合物微球的方法。根 据m o r t o n 分散颗粒熟力学方程( 7 1 计算出种子颗粒被单体溶胀后体积可增大两倍，粒径增大1 4 倍反复溶胀，反复聚合即可得到大粒径颗粒从理论上讲，小粒子增长速率大于大粒子，经过 4 宁夏大学硕士学位论文第一章绪论 一连串溶胀聚合步骤以后，粒度分布应当趋于变窄，但若控制不好，每一步都有可能产生新的小 颗粒，故逐步溶胀法很难得到单分散的微球另外，这种方法需要很长时间，这样会造成颗粒间 相互碰撞而导致聚结，使体系稳定性变差，且粒度分布变宽” 1 2 2 3 3 两步溶胀聚合法 二十世纪七十年代末，u g e l s t a d 等人 n - s 2 发明了一种制备大粒径、单分散聚合物微球行之有 效的新方法两步溶胀聚合法用这种方法可以制得粒径为1 - 1 0 0 # m ，标准偏差2 的聚合物 微球该方法是种子首先吸收一种在水相中溶解度比单体低的小分子化合物( 即活化) ，根据计 算，可使种子的溶胀能力提高1 0 0 0 倍以上，活化后的种子再用单体、引发剂、致孔剂等溶胀， 最后升温聚合即可得到大颗粒聚合物微球合成出的固定相得到了广泛的应用并取得了较好的结 果。由于具有许多优点，该方法已成为制备颗粒单分散功能高分子微球的最有效手段之一 1 2 2 3 4 动力学溶胀聚合法 动力学溶胀法是九十年代初由日本神户大学o k u b o 教授提出的一种制备大颗粒单分散聚合 物微球的新方法【“蚓其过程如下：先以在有机溶剂中用分散聚合法制各p s 粒度均匀微球分散 体系，再向该分散体系中加入混合溶剂和可溶于分散介质但不溶于水的单体、引发剂、稳定剂 然后向体系中加入水，使单体在分散介质中的溶解度下降，以改变其在聚合物颗粒和分散介质之 间的分配系数，使更多的单体进入聚合物颗粒，溶胀成约8 t m 的单分散颗粒最后升温聚合即得 到砸n 的单分散微球动力学溶胀法适用于各种疏水性单体的聚合，可用甲醇、乙醇、异丙酵、 乙二醇及丙二醇等水溶性溶剂作介质，可采用p v a 、甲基纤维素、p a a 、p a l m 及聚7 , - - 醇等作 稳定剂，可采用b p o 及a i b n 等油溶性引发捌动力学溶胀法中加入水的目的是为了降低单体 在介质中的溶解度，其技术关键是如何使水缓慢而均匀的进入体系，而不至于出现水的局部过浓 为达到此目的，可以采用半透膜加水，或把水结合在某种物质( 如交联聚合物或微胶囊) 中，让 水在溶胀过程中逐渐释放出来，或采用水蒸气加水等方式，要降低单体在介质中的溶解度，还可 以采取降低温度、蒸发溶剂或用某种物质来吸收溶剂等方法 1 2 2 3 5 一步溶胀聚合法 o g i n o 等人暇l 于1 9 9 5 年介绍了一种新的溶胀聚合技术，即将单体、引发削，致孔剂等含有 稳定剂和表面活性荆的水溶液，一次性混合乳化，再与种子混合溶胀，最后升温聚合丽得到大粒 径粒度均匀的聚合物微球，称为“一步溶胀聚合法，其主要特点是采用分散聚合法制备的较大 颗粒的p s 微球为种子，由于这种p s 种子的分子量比无乳液聚合制备的p s 种子的分子量要小， 且表面存在聚合物与分散稳定剂的接枝共聚物，所以溶胀能力很高，可达1 0 - 2 0 0 倍，然而当其制 备了单分散交联聚苯乙烯树脂时，在溶胀比为5 时徼球破裂我国学者柴志宽哪l 于2 0 0 0 年改进 了种子的合成方法制备了溶胀比为5 的交联单分散聚苯乙烯微球并且微球的刚性很好。而s m i g o l 等【辨】曾报道，没有活化的用无乳剂乳液聚合制备的p s 种子最多只能溶胀5 0 倍 以上几种制各聚合物微球的方法比较见表1 - 1 ，用这些方法，根据需要可以制备出粒径 1 - 1 0 0 9 x a 单分散的聚合物微球。 5 宁夏大学硕士学位论文 第一章绪论 麦i - i 高分子聚合物填料基质捌鲁方法的比较 1 3 高分子聚合物填料的化学改性研究 1 3 1 单分散交联聚苯乙烯的化学改性 在已使用的聚合物基质材料中，由于交联聚苯乙烯具有良好的刚性和化学稳定性，它是应用 最为广泛的一种树脂但该树脂的表面疏水性强，要用于色谱分析必须经过化学改性，才能应用 于不同色谱分离目的及分离模式的需要进行化学改性的一般原则是，首先将强疏水性表面转化 为与蛋白质和水相匹配的亲水性表面，然后再根据不同色谱分离模式的需要，键合上不同的化学 功能团表面亲水性改性是这类树脂的难点虽然这类树脂的氯甲基化、胺化和硝化、磺酸化、 傅克烷基化和酰基化反应用于表面键合- c o o h 和- s 0 3 b 等的离子交换填料已获得应用。然而，将 其改性为用于生物大分子分离的排阻色谱填料的报道却较少，如表面键合甘油及聚乙二醇、多塘、 胺类，虽然树脂表面的亲水性有一定程度的增大，但对蛋白质的体积捧阻色谱分离需要在流动相 中加入3 0 的乙腈这表明固定相的疏水性还较强 另外，涂层技术也是对聚苯乙烯表面改性中常用的方法涂层物质一般是亲水性聚合物或有 机单体将涂层物质以物理吸附的形式覆盖在基质表面形成聚合物层，可以是直接吸附，如将聚 乙烯亚胺吸附于聚苯乙烯表面。也可以用亲水性单体首先吸附，然后聚合形成涂层这类树脂一 般亲水性较强，但是却存在着动力学上的不稳定性，当进一步对其进行化学修饰或使用有机流动 相时，涂层聚合物有流失现象。总之，交联聚苯乙烯微球的表面的亲水性化学改性仍是一个有待 解决的课题。 6 宁夏大学硬士学位论文第一章绪论 1 3 2 单分散交联聚丙烯酸酯类和聚乙烯醇微球的化学改性 交联醋酸乙烯酯、交联聚乙烯醇、交联聚甲基丙烯酸及其酯类、交联聚乙烯亚胺与聚酰胺类、 交联聚乙烯吡啶和高交联度琼脂糖等，这类树脂的亲水性较聚苯乙烯树脂的强它们的表面进行 适当的亲水性化学改性后，再键合上所需官能团如聚醋酸乙烯酯水解后，可用于弱阳离子交换 填料甲基丙烯酸环氧丙酯的环氧基是许多反应的活性中间体，可与胺反应生成弱阴离子交换填 料、与亚胺基二乙胺反应得到金属螯合色谱填料、与蛋白质等配体反应得到亲合色谱填料对于 含氨基、羟基的树脂，有时还需进一步的活化，然后再接上官能团 1 4 分离生物大分子的有机聚合物基质的色谱固定相的发展趋势 生命科学及生物工程技术的发展，对生物大分子的分析与分离提出了更高的要求如何实现 快速分析、大规模制备是生物大分子的高效液相色谱面临的一大课题针对于此，高分子聚合物 固定相在生物大分子分离中的地位会越来越高，今后的发展方向是： ( 1 ) 结合分子设计，合成出带功能基的新型高分子聚合物基质，以扩大目前已有的聚合物 类型及满足各种分离模式的需要； ( 2 ) 继续研究填料的合成技术，特别是开发具有高的分辨率、样品回收率和活性回收率、 负载量大、应用范围广、价格低廉的色谱填料； ( 3 ) 继续研究结构与色谱性能的关系，以便合成出耐高压、溶胀性能与硅胶可相比的聚合 物色谱填料； ( 4 ) 在研究、开发新型基质的同时，进一步加强高分子配基的研究。相信随着高分子化学 的发展，聚合物介质色谱填料将会更加多样化，应用也会更加广泛 7 宁夏大学硕士学位论文 第二章单分散聚苯乙烯种子的制各 i 2 1 引言 第二章单分散聚苯乙烯种子的制备 微米级颗粒均匀的聚合物微球，作为功能高分子材料，在分析化学、生物化学、免疫医学、 标准计量以及某些高新技术领域中有着广泛的用途，因而对这类树脂的研究越来越受到重视目 前，微米级的聚苯乙烯微球是最常用的一种材料。单分散聚苯乙烯微球的合成方法通常是乳液聚 合法佛“l ，这种方法得到的微球粒径通常在0 4 - 0 5 a m 范围内，难以达到1 t i n 以上，并且聚合度 高，这是由乳液聚合的机理所决定的 9 5 1 乳液聚合时，链自由基处于孤立隔离状态，长链自由基 很难彼此相遇，以致自由基寿命较长，终止速率较小，因此聚合速率较高，而且获得高的分子量 t h o m s o n ，b 等人降j 向乳液聚合体系中加入甲醇，虽然能提高聚合反应的速率和产率，但聚合物 的分子量依然较高由英才等人1 9 3 1 也进行了这方面的研究。取得了同样的效果由高分子溶胀聚 合理论知种子微球的直径小、分子量高都不利于进一步溶胀聚合制备交联的大颗粒微球，而且溶 胀后的大颗粒微球中的种子很难用有机溶剂抽提除去，残余的聚苯乙烯种子具有较强的疏水性 分散聚合是一种特殊类型的沉淀聚合，与其它聚合物微球的制各方法相比，分散聚合法生产 工艺简单，可适用于各种单体，且能制备出各种粒径的单分散聚合物微球微球的分子量可以通 过引发剂的用量等因素来调节 本章利用分散聚合方法，成功制备出了低分子量粒径在1 丑范围内，单分散线性的聚 苯乙烯( p s ) 微球，系统地研究了单体浓度、引发剂用量、反应温度和时间等各种聚合参数对聚 合产物粒度及其分散性的影响，并获得了优化的合成条件 2 2 实验部分 2 2 1 实验设备 旋转蒸发器。( 上海亚荣生化仪器厂) ，恒温水浴锅，搅拌器，真空泵，低速离心机( 常州国 华电器有限公司) ，生物显微镜( x s p - 3 c a i ，上海光学仪器六厂) ，超声波清洗器( k q - 2 5 0 b ， 昆山市超声仪器有限公司) 2 2 2 试剂 苯乙烯( 乳化学纯) ，聚乙烯吡咯烷酮( p v p ，分析纯，分子量为4 0 0 0 0 ，a l d r i c hc h e m i c a l c o m p a n y , i n c ) ，过氧化苯甲酰( b p o ，化学纯) ，无水乙醇( 分析纯，天津化学试剂二厂) 。 2 2 3 试剂的前处理 苯乙烯：将1 0 0 m l 苯乙烯装入减压蒸馏装置中r 在真空度为0 0 9 m m l - l $ 的条件下，收集9 0 9 1 8 宁夏大学硕士学位论文 第二章单分散聚苯乙烯种子的制备 曼曼曼曼曼曼鲁曼曼曼曼曼曼量皇皇| 皇曼曼皇曼曼曼| 曼曼曼曼曼皇曼曼曼曼曼量一ii 曹量曼曼曼曼曼寡皇量詈曼曼曼量 馏分将减压蒸馏后的苯乙烯装入内有无水硫酸镁的磨口瓶中，干燥2 4 小时 过氧化苯甲酰：用乙醇重结晶为白色针状晶体，放入干燥器中干燥后使用。 2 2 4 实验方法 实验采用的是分散聚合法，其体系为单体苯乙烯，引发剂b p o ，稳定剂p v p ，反应介质无水 乙醇组成的混合物，合成实验的基准原料配比如表2 - 1 所示。将称量好的原料加入到1 0 0 m l 的圆 底烧瓶中，超声使其充分溶解并通入氮气l o 分钟以除氧，然后将烧瓶置于旋转蒸发器上，于7 0 条件下聚合反应2 4 小时反应结束后，离心除去溶剂，并用乙醇充分洗涤，即可得到颗粒单分 散的聚苯乙烯微球 襄2 - i 单分散线性聚苯乙烯种子的翻鲁条件 2 3 结果与讨论 2 3 1 分散聚合法的机理 分散聚合法是一种介于乳液聚合法和悬浮聚合法之间的聚合方法，它的成核方式与乳液聚合 和悬浮聚合不同如图1 - 2 所示，它是通过分散剂在分散介质中对生长的高分子链的隔离来起分 散稳定作用的即，”。首先，要求分散稳定剂易溶于分散介质，象聚乙二醇这类分散稳定剂主要 是依靠大分子链的立体效应来稳定的，大分子链在分散介质中溶解后舒展开，可认为展开的高分 子链在分散介质中形成许多“微小区域”，引发剂分解产生的自由基就在这些“微区”中引发聚 合当反应进行到一定程度后，高分子长链生长到一定长度，分子链就相互缠结在一起，在搅拌 作用下逐渐形成球状的核，缠结在高分子中有利于球核的稳定。随着反应的进行，不断有大分子 链在已形成的核上生长并缠结，至最后形成完整的微球从聚合相中析出 2 3 2 单体浓度的影响 初始单体浓度是分散聚合的一个重要参数为了研究它对分散聚合反应的影响，在不同的单 体浓度下，进行了分散聚合，并在显微镜下观测其粒径，结果见图2 - t 由图上可以看出，随着 单体浓度的增大，粒子平均直径增大 单体浓度对微球直径的影响关键在于分散介质对聚合物初始溶解度的改变随着初始单体浓 度的增大，分散介质对聚合物链的溶解性增大，聚合物的临界链长增大，致使在成核阶段形成初 级粒子和次级粒子的数目减少，因而导致最终聚合物微球直径增大随着单体浓度的增大，从显 微镜下观察到微球的直径分布变宽，原因是单体浓度增大时，溶液中聚合反应速率加快，齐聚物 自由基和死聚物链生成速率也加快，颗粒的相对捕捉效率下降，体系中的次级粒子不能有效地捕 9 宁夏大学硕士学位论文第二章单分散聚苯乙烯种子的制备 捉连续相中的齐聚物自由基和死聚物链，这些未能被及时捕捉的齐聚物自由基和死聚物链从连续 相中沉析出来，就有可能有足够的时间结合足够的分散剂而稳定存在，形成能够继续长大的次级 粒子，即。二次成核”。“二次成核”的存在，必然引起粒子生长的不均匀，造成最终粒径分布变 宽从某种意义上来讲，。二次成核”的出现相当于延长了分散聚合的成核期，这也将导致最终 颗粒单分散性变差，粒径分布变宽 畲 三 皇 苫 l o 1 5 2 3 3 引发剂浓度的影响 2 03 03 54 0 s t 】- t 圈2 - 1 单体浓度对聚苯乙烯徽球粒径的影响 分散聚合实际上是一种特殊的沉淀聚合在反应初期聚合物还没达到沉淀的临界链长时，体 系是均相的，这时的反应为在溶液中进行的自由基聚合反应根据聚合理论推导可知，聚合物的 分子量随引发剂浓度的增大而减小，即m n o c 【引发剂】”在组成和温度一定时，p s 链的溶解度 依赖于它的分子量，分子量下降能显著提高它在介质中的溶解度，因此，随着引发剂浓度的增大， 生成聚合物链分子量下降，其溶解度必然升高，致使生成的次级粒子数目减少，粒径增大引发 剂浓度对粒径分布有着两方面相反的影响，一方面，当引发剂浓度过低时，聚合物链沉淀速率过 低，将使成核期大大延长，会导致最终粒径分布变宽；另一方面，引发剂浓度太大时，次级粒子 粒径过大，数目过少，对连续相中齐聚物自由基和死聚合物链的捕获效率将过高，都不利于制备 单分散聚合物颗粒。对于其它条件固定的反应体系，存在一个合适的引发剂浓度范围，在这个范 围内才可以得到单分散聚合物颗粒，由实验结果可知，采用5 浓度的引发剂就能得到单分散的 聚苯乙烯微球，又可使聚合物的分子量相对比较小。另外，由于反应介质为有机溶剂乙醇，反应 是由溶于介质中的单体被引发剂游离引发而产生聚合的。因此采用油溶性引发剂要比水溶性引发 剂更有利于制备粒径较大的微球。本实验中采用油溶性的b p o 得到较好的效果 2 3 4 聚合反应温度的影晌 不同温度下，使反应体系引发聚合所得到的聚合物颗粒的粒径不同，实验结果见图2 2 。升 高反应温度，将发生如下变化：连续相对高分子链的溶解性提高，聚合物临界链长增大；引发剂 l o 4 5 3 5 2 5 l 5 o 3 2 1 0 宁夏大学硕士学位论文 第二章单分散幕苯乙烯种子的制各 分解速率加快，齐聚物分子量下降，在介质中的溶解度增大；体系粘度下降，粒子问相互撞合的 可能性增加。这些变化均会造成颗粒直径变大，数目减少，而这样又会引起聚合物颗粒的总表面 积下降，对连续相中齐聚物自由基和死聚合物链的捕捉效率下降。使出现“二次成核”的可能性 增加，故使颗粒最终直径分布变宽 4 5 4 3 5 3 0 5 o 3 0 4 05 05 56 06 57 07 5 t 围2 - 2 反应温度对聚合物粒径的影响 反应温度过低时，其它条件不变，聚合反应的转化率偏低，聚合产物粒子较软，显黄绿色； 反应温度过高时( 8 5 0 ) ，引起成核数目剧增，使反应体系稳定性变差，粒径反而下降本实验 中采用温度为7 0 0 时发生聚合反应，以确保获得增长过程中的苯乙烯低聚物自由基的瞬间高浓 度，而这些自由基立即开始沉淀和联结以形成不稳定的核，这些核通过聚结的方式继续增大，直 到微球的粒径不再增大。 2 3 5 聚合反应条件的优化 前面分别讨论了影响聚合物粒度的各神因素。在此基础上，选择乙醇为介质，b p o 为引发剂 p 、，p 为稳定剂，通过优化反应的条件，可以制备出1 0 - 4 犁m 颗粒单分散的p s 微球，优化后合 成微球的条件见表2 - 1 ，这里不再赘述优化条件后合成的3 劬m 聚苯乙烯微球的电镜照片如图 2 - 3 所示。 2 4 小结 圈2 嵋优化条件后台成的3 b “_ 聚苯乙烯微球的电镜照片 1 用分散聚合法，在乙醇介质中，以苯乙烯为单体，b p o 为引发剂，p v p 为稳定剂，成功 地制备出了微米级单分散聚苯乙烯微球 2 系统地研究了各反应参数对微球植径的影响实验结果表明，在其它条件给定的情况下： 颗粒单分散p s 微球的粒径随着引发剂浓度的增加、反应温度的升高、介质溶解性的增加而增大， 随着稳定剂浓度的增大而减小，而随着单体浓度的增大呈曲线增加趋势a 3 利用分散聚合法合成的p s 微球，通过优化反应条件，可以有效的调控微球粒度大小与分 散性，合成出的p s 徽球粒径范围在l 4 4 1 2 宁夏大学硕士学位论文 第三章一步种子涪胀聚合法制各单分散聚氯甲基苯乙烯二乙烯苯树脂 3 1 前言 第三章一步种子溶胀聚合法制备单分散 聚氯甲基苯乙烯- - - z 烯苯树脂 自从将高分子填料引入色谱技术以来。大部分商业填料都是基于苯乙烯一- - z , 烯苯交联共聚制 各p 9 l 。单分散交联聚苯乙烯树脂的出现无疑在分离介质的研究领域代表着一个巨大的进步，但其 具有较强的疏水性，用在水相体系分离生物大分子时，必须经过一定的化学修饰，使其表面具有 足够强和密度足够高的亲水基团，这是树脂改性的难点 另一方面，基于多糖如葡聚糖或琼脂糖的有机凝胶成为商品供应已有几十年的历史了，他们 表现了良好的生物兼容性和化学稳定性，但其缺点是没有永久性大孔，只在溶胀中才产生孔，而 且缺乏刚性，能承受的最大线流速较低( 2 5 c m h ) ，这就大大限制了它在色谱中的应用由此可 以看出，如果所合成的机制既具有交联聚合物的刚性又在一定程度上类似软胶基质的亲水性，或 者容易衍生成亲水性介质，那么这类基质材料将是十分有前途的 颗粒单分散多孔结构的聚合物微球作为特殊用途的功能材料一直是高分子科学以及相关应 用领域中颇受重视的研究内容以这类聚合物微球为基质的各种h p l c 填料，具有优异的分离性 能，尤其对于提高柱效和增强穿透性十分有利1 1 e 0 1 近年来，随着合成技术的提高，很多具有优 异分离性能和不同物理结构特征的卸? 【c 填料应运而生，交联聚苯乙烯 1 0 1 , 1 0 2 , 1 叫、交联聚甲基丙烯 酸酯 1 0 4 , 1 0 5 1 、交联甲基丙烯酸环氧丙酯【“岷”l 等树脂，已被相继应用到不同的色谱技术中 o 面等人【”j 在1 9 9 5 年曾经报导了通过“一步种子溶胀聚合法”制备单分散聚苯乙烯二乙 烯苯微球的方法，然而，由于其表面强的疏水性，使得其化学改性很困难i l 单分散交联氯甲基苯乙烯二乙烯苯微球( p o , d d v a ) 疏水性比交联聚苯乙烯弱，而且其表面 含有活性比较高的苄基氯，很适合于改性，改性后会衍生出大量的其它官能团，特别适合于生物 大分子的分离纯化本章采用分散聚合法制备的单分散线性聚苯乙烯微球为种子，以氯甲基苯乙 烯( o 腮) 为单体，二乙烯苯( d v b ) 为交联剂。甲苯和邻苯二甲酸二丁醣为致孔剂，过氧化苯 甲酰( b p o ) 为引发剂，采用“一步种子溶胀聚合法”制各了大粒径多孔单分散氯甲基苯乙烯- - z t , 烯苯微球，并对影响微球粒径大小、粒径分布及孔径的各种因素进行了研究。 3 2 实验部分 3 2 1 实验设备 生物显微镜( x s p 3 c a l ，上海光学仪器六厂) ，超声波清洗器( k o - 2 5 0 b ，昆山市超声仪器有 限公司) ，超声波细胞粉碎器( j y 9 2 4 1