（微生物与生化药学专业论文）珍稀药食用真菌深层发酵及其产物活性的初步研究.pdf

摘要 摘要 药食用真菌是指对疾病有治疗、预防及抑制作用或具有保健功效的一类真菌，在我 国传统医药中占有重要的位置。但由于药食用真菌野生资源稀少，从而应用深层发酵培 养药食用真菌己成为天然药物开发的研究热点之一。液体发酵获得的产物，富含各种生 物活性物质，有很高的科研价值。二肽基肽酶i v ( d i p e p t i d y lp e p t i d a s ei v ，d p p i v ) 是目 前糖尿病新药研发的热点之一。胰高血糖素样肽1 ( g l p 1 ) 具有较好的抗糖尿病效应， 但在体内易被以d p p i v 为主的酶降解，半衰期仅2m i n ，因而限制了其在临床上的应 用。研究表明d p p i v 抑制剂能延长g l p 1 在体内的半衰期，从而有效地降低血糖。 目前已有多个化合物进入二期、三期临床实验，甚至上市销售。 本文利用已建立的d p p i v 抑制剂的体外筛选模型，从药食用真菌发酵产物入手， 筛选在体外体内对d p p i v 有抑制作用的药物，得到了在体外具有d p p i v 活性抑制 作用的两株药食用真菌桦褐孔菌、虎奶菇，二者的抑制作用均与样品浓度呈正相关，各 组分中又以桦褐孔菌正丁醇萃取物和虎奶菇正己烷萃取物的抑制率最高，两者在1 0 0 0 m g l 。1 时，分别达到了5 0 0 8 和4 5 9 7 。为今后获得具有抑制d p p i v 功能的新结构化 合物打下基础。 本文最后以管碟法研究了实验室药食用真菌发酵产物的抑菌作用，并得出了它们各 自的最低抑菌浓度。还以虎奶菇为例研究得出，在1 0 4 0m g m l d 的浓度范围，虎奶菇 发酵液不同组分的抑菌作用大小依次为正丁醇萃取物 乙酸乙酯萃取物 萃余发酵液，正 己烷萃取物无活性。其菌丝体乙醇提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用明显。故推测脂 溶性小分子化合物为其抑菌的主要活性成分。该研究方法和实验结果对以后待开展的药 食用真菌抑菌作用的研究提供了一个范例和参考。 关键词：药食用真菌；d p p 1 v 抑制剂；药物筛选；降血糖；抑菌 a b s t r a e t a b s t r a c t e d i b l ea n dm e d i c a lm u s h r o o m sa r eat y p eo ff u n g iw i t he f f e c t so ft h e r a p y , p r o p h y l a x i s a n dh e a l t hp r o t e c t i o n a n dp l a yar o l ei nc h i n e s et a d i t i o n a lm e d i c i n e d u et ot h er a r i t yo ft h e i r f r u i tb o d i e so rs c l e r o t i u m s ，s u b m e r g e df e r m e n t a t i o nh a sb e e nu s e dt oc u l t u r et h e s ef u n g ia n d b e c a m eah o tp o i n ti 1 1t h ef i e l do fn a t u r a lm e d i c i n ed e v e l o p m e n t f u t h e r m o r e ，s u b m e r g e d f e r m e n t a t i o nt e c h n o l o g yo ft h e i rv e g e t a t i v ef o r m si nm a n yh a sb e e na c h i e v e d ，a n dt h e p r o d u c t so ff u n g io fs u b m e r g e dc u l t u r e d ，h a v el o t so fb i o l o g ya c t i v i t i e s s oi t i sw o r t h f u lt o r e s e a r c ho nt h e s ep r o d u c t s d i p e p t i d y lp e p t i d a s e1 v ( d i p e p t i d y lp e p t i d a s ei v ，d p p i v ) i sa l l i m p o r t a n tt a r g e tf o rt h et r e a t m e n to fd i a b e t e s i th a sb e e ns h o w e d t h a tg l u c a g o n - l i k ep e p t i d e 一1 h a v es i g n i f i c a n th y p o g l y c e m i ce f f e c t s h o w e v e r , g l p - la c t i o nh a sav e r ys h o th a l fl i f eo f a b o u t2m i nd u et oi t sd e g r a d a t i o nb yd p p i v ，w h i c hl i m i t e di t sc l i n i c a la p p l i c a t i o n d p p i v i n h i b i t o r sh a v eb e e np r o v e dt op r e v e n tg l p - 1d e g r a d a t i o na n dt h u se f f e c t i v e l yd e c r e a s eb l o o d g l u c o s e t h e r ea r ean u m b e r so fc o m p o u n dh a v eb e e nt a k e np a r ti np h a s ei i ，p h a s ei i i c l i n i c a lt r i a l s s o m ee v e nh a v eb e e np u s h e dt ot h em a r k e t t h ea i mo ft h i st h e s i si st os c r e e nt h ep r o d u c t so fs u b m e r g e df u n g if o rd p p - i v i n h i b i t o r s u s e dae s t a b l i s h e dm o d e li nv i t r o a sar e s u l t ，t w of u n g i ，p 昆u r o t u st u b e r - r e g i u r a a n dl n o n q q u so b l i q u u s b o t hh a di n h i b i t i o ne f f e c to fd p p 一1 vi nv i t r o ，a n dw e r ea l lp o s i t i v e l y r e l a t e dt ot h e i rc o n c e n t r a t i o n m o r e o v e r , ，z b u t a n 0 1e x t r a c to fl n o n q q u so b l i q u u sa n dn - h e x a n e e x t r a c to fp l e u r o t u st u b e r - r e g i u ms h o w e dt h eb e s te f f e c ta m o n gt h ee x t r a c t so ft h e i rc u l t u r e b r o t h t h e i ri n h i b i t o r ya r e5 0 0 8 a n d4 5 9 7 r e s p e c t i v e l ya t1 0 0 0m g l t h e s ea r ea st o m a k et h eb a s i sf o ro b t a i nt h en e ws t r u c t u r eo ft h ec h e m i c a lm a t e r i a li nf u t u r e ac y l i n d e r - p l a t em e t h o dw a su s e dt o t e s tt h ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fe x t r a c t so fa l l c o n c e r v e ds t r a i n si ns u b m e r g e dc u l t u r e ，a n dt h e i rm i n i m a li n h i b i t i o nc o n c e n t r a t i o n sw e r e w o r k e do u t p l e u r o t u st u b e r - r e g i u mw a ss e ta sa ne x a m p l et ob es t u d i e d ，a n dt h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ept u b e r r e g i u mi ns u b m e r g e dc u l t u r eh a da no b v i o u si n h i b i t o r ya c t i v i t yo ns a u r e u s 刀b u t a n o la n de t h y la c e t a t ee x t r a c t so fc u l t u r eb r o t h ，a n dr e s i d u a lb r o t hp o s s e s s e d i n h i b i t o r ya c t i v i t i e sd u r i n g10m g m l a n d4 0m g 。m l ，w h i l et h ei n h i b i t o r ya c t i v i t y o f n h e x a n ee x t r a c tf r o mt h ec u l t u r eb r o t hw a sn o to b v i o u s e t h a n o le x t r a c to fm y c e l i aa l s o s h o w e dp o t e n ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t y , i na d d i t i o n i ti ss u g g e s t e dt h a to r g a n i cs o l v e n ts o l u b l e c o m p o u n d sw i t hl o wm o l e c u l a rw e i g h tm i g h t b er e s p o n s i b l ef o rt l l ea n t i b a c t e r i a la c t i v i t yo fp t u b e r r e g i u m a l lt h e s ew o r k sa n dr e s u l t sa b o v es u p p l i e da ne x a m p l ea n dc o n s u l t a t i o n sf o r t h es t u d yo fo t h e re d i b l ea n dm e d i c a lf u n g i k e y w o r d s ：f u n g i ；d p pi vi n h i b i t o r s ；d r u gs c r e e n i n g ；a n t i h y p e r g l y c e m i c ；a n t i b a c t e r i a l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：汤莹、召 e l 期：妒， 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 芝耋墨 导师签名： e l期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 药食用真菌的传统应用和现代化 1 1 1 药食用真茵及其传统应用 药食用真菌是指对疾病有治疗、预防及抑制作用或具有保健功效的一类真菌，它可 分为两类：一类是药食兼用型，如香菇、姬松茸、金针菇、竹荪等；另一类为医药专用 型，如灵芝、云芝、冬虫夏草等。 药用真菌在分类上多属于担子菌亚门和子囊菌亚门，虽其种类繁多，大小不同，形 态各异，但一般都是由菌丝体和子实体两大部分组成。菌丝体是药用真菌的营养器官， 由许多菌丝集合而成，多呈丝状或须状，广泛存在于土壤、树木等各种基质中，相当于 高等植物的根、茎、叶。菌丝具有不断向外生长和扩展的能力，其主要作用是分解基质、 吸收营养、输送和贮存营养并进行无性繁殖。当菌丝生长到一定时期，能相互纠结形成 菌索、菌核和子座等各种营养体的变态。子实体是药用真菌的繁殖器官，它和营养菌丝 相比，功能发生了特化。真菌的生殖方式可分为有性生殖和无性生殖两大类。药用真菌 的有性生殖一般表现为两个可亲和的有性孢子萌发生成的两种形态无差别，但性别不同 的初生菌丝之间的结合，其整个过程可分为质配、核配和减数分裂3 个阶段。无性生殖 也有多种方式，有无性孢子的产生、菌丝体断裂以及芽殖等。在药用真菌的栽培中，菌 索、菌核、子实体的组织分离，菌种转接，均是利用无性生殖繁殖后代的重要形式【l 】。 早在公元l 世纪东汉末年编著的神农本草经共记载中药3 6 5 种，其中就有茯苓、 猪苓、雷丸等1 0 余种真菌药物。明代著名的医药学家李时珍编著的本草纲目，载药 1 8 9 2 种，据不完全统计，其中有药用真菌4 0 余种，如香菇、马勃、茯苓、猪苓、雷丸、 木耳、灵芝等1 2 。 药用真菌在提高人体免疫功能、滋补、抗衰老方面的作用早已受到我国历代医药学 家的关注，冬虫夏草、灵芝、香菇等在医疗临床或滋补保健中都显示了它的效果。获苓、 猪苓利水渗湿、雷丸杀三虫、马勃医治恶疮，一直用于中医临床。 我国真菌资源丰富，己报道的8 0 0 0 种左右。其中传统药用及试验有药效的大型真菌 和部分小型真菌有4 0 0 余种，计5 1 科、1 3 8 属。目前我国正式入药应用的药用真菌总数5 0 种左右，常用的约3 0 种l ”j 。 1 1 2 药食用真菌的药理作用和活性物质 1 1 2 1 药食用真菌的药理作用 抗癌作用药用真菌以抗癌为特色，从2 0 世纪7 0 年代初开始，国内外对真菌多糖 的抗癌活性进行了大量的研究工作。1 9 7 1 年，s a s a k i 从树舌子实体中分离出的多糖成分 对小鼠肉瘤s 1 8 0 有抑制作用，抑制率为5 4 7 。2 0 0 0 年，张劲松【5 】等发现云芝粗提液 对人体慢性骨髓性白血病细胞株k 5 6 2 和人体大肠腺癌细胞株s w 6 2 0 的试验结果表明， 在浓度为5 0 0 斗g m l 以时，其抑制率可达9 0 1 6 1 。 江南大学硕士学位论文 免疫调节作用试验表明，药用真菌能提高机体的多种免疫功能。具体表现为： 首先，能增强单核巨噬细胞系与n k 细胞的功能。这两类细胞均是人体的第一道天然防线， 单核巨噬细胞系具有非特异性防御和调节免疫应答等重要功能，n k 细胞能分泌干扰素， 具有抗感染、抗肿瘤的作用；其次，可以增强体液的免疫功能，促进免疫球蛋白中i g m ， i g g 的产生，提高其对相应抗原的免疫反应；再次，它通过促进t 淋巴细胞的分化进而增 强细胞的免疫功能。同时还可以提高这些细胞因子的活性调节机体抗病能力，并能改 善由衰老所致的免疫功能衰退【7 】。 对心血管系统的作用药食用真菌的醇提取物( 如生物碱类) 、水提取物对心血管 系统具有药理作用。临床上用灵芝总碱、紫芝酒等增加冠状动脉中的血液流量，提高机 体对心肌的供氧能力；用银耳多糖等降低血液中的胆固醇含量，促进血液中胆固醇的代 谢碍j 。又如，灵芝多糖a ，b 是灵芝多糖中具有降血糖作用的主要成分。其中人们对灵芝 多糖b 的研究更为彻底。实验发现在服用灵芝多糖b 后3h 一7h 内，血糖浓度明显下降。 抗菌消炎作用体外实验证明，一些药食用真菌的提取液还可以抑菌、抑制病毒 的增生。如，由长根菇的培养液提取的长根菇酮有抑制霉菌的能力。由我国研制的蜜环 菌甲素和乙素，取自假蜜环菌( 亮菌) ( a r m i l l a r i at a b e s c e n s ) 的菌丝体，用它制成的“亮 菌片 对胆囊炎和传染性肝炎有一定疗效 9 1 。 其他药理作用除以上所述外，药食用真菌还具有其它方面的作用。动物试验证 明，灵芝子实体的热水提取物、银耳多糖、猴头多糖等，可以提高实验动物血液中胰岛 素含量，增加糖代谢系统酶的活性，降低血糖的含量【l0 1 。亮菌的发酵液提取的有效成分 还能促进骨髓细胞中蛋白质及核酸的合成，可以促进骨髓细胞的增殖与分化。并可防止 骨髓细胞中染色体的畸变，具有抗放射线能力【j 7 1 。民间则用灵芝、蜜环菌治疗冠心病， 用马勃、木耳止血，用银耳滋阴补气，强心补脑等等【l o l 。 1 1 2 2 药食用真菌的活性物质 现代药理学研究表明，冬虫夏草、灵芝、获苓、灰树花、香菇等药用菌具有免疫调 节、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、保护肝脏、抗炎症等多种药理作用。在日本， 裂褶菌素( s c h i z o p h y l1 a n ) 和香菇多糖( 1 e n t i n a n ) 在1 9 8 6 年就作为免疫调节剂临床用于治 疗癌症【1 1 1 。 目前发现的真菌药物的成分主要为以下几类： 真菌多糖类。真菌多糖类物质包括那些由7 个以上醛糖、酮糖缩合而成的多聚 糖由于它还结合有部分蛋白质或多肽类成分，所以又称其为糖蛋白或糖肽。其广泛存 在于真菌的子实体、菌核或菌丝体中，也可从它们发酵的菌液中得到。其化学结构特征 是含有p ( 1 3 ) ，p ( 1 一) 糖苷键，或者是含有p ( 1 _ 3 ) ，p ( 1 一) 糖苷键。经药理实验证明， 真菌多糖是一种免疫调节剂。它通过调节人体免疫系统的功能，提高机体的抗病能力经 动物试验和临床证明，真菌多糖具有抗肿瘤作用：在动物实验中，真菌多糖对宿主的毒 性小，而对肿瘤的作用很强。据统计，已从大型真菌中筛选出了2 6 0 余种具有抗癌活性 的多糖阴。 萜类化合物。目前从药用真菌中发现的萜类多为倍半萜，二萜和三萜类。其中倍 2 第一苹绪论 半萜类化合物多具有杀菌作用和抗癌作用；二萜类化合物在菌物中的含量和种类皆较 少，但皆有抗茵活性；对于二萜类化合物的药理活性，尚缺少了解。 色素类化合物，为双聚色酮类、双聚蒽醌类、双聚萘骈吡喃酮类、1 2 一吡喃酮类 及芘醌类化合物。如麦角菌中含有的一种双聚色酮及两种异构体，它们与麦角及其提取 物的颜色有关。其药理活性尚待研究。从竹黄菌中分离出来的竹红菌素a ，是一种芘醌 类化合物，它具有消炎、镇痛及抗癌作用 7 1 。目前，对色素类化合物的药理活性尚缺乏 研究，所知甚少。 生物碱类成分。从真菌中分离出来的生物碱可分为吲哚、嘌呤和吡咯3 类。吲哚 类主要有麦角碱、麦角胺新碱、麦角胺、麦角异胺、麦角生碱、麦角异生碱等六对旋光 异构体。有药理活性的是其中的左旋体。含这类成分的代表真菌为子囊菌的麦角菌， 担子菌类的杯菌属中一些种类亦含有这类活性物质。吲哚类成分中麦角碱及其衍生物对 治疗偏头痛、心血管疾病均有明显效果；对眼角膜炎患者、内耳平衡功能及甲状腺分泌 功能失调等症也有一定疗效。麦角新碱则为促子宫肌肉收缩、减少产后流血、催产等妇 科用药。嘌呤类是真菌新陈代谢过程中的产物。例如具有降低血脂作用的蜜环菌腺苷及 嘌呤，降低胆固醇的香菇嘌呤，有杀菌作用的虫草素等等。从灵芝中分离出来的灵芝碱 甲、灵芝碱乙等均属吡咯类，它们具有抗炎作用1 9 】。 氨基酸、多肽、蛋白质类成分，含量丰富，大多可食用、有些具有特殊的结构和 生物活性，如口蘑氨酸、鹅膏氨酸杀蝇，血色氨酸镇静，鹅膏毒肽、灵芝蛋白l z - 8 抗癌 生车【2 】 寸o 其他，如以麦角甾醇为代表的甾醇类，还有有机酸、多元醇、酚、酯类以及微量 元素和有机微量元素1 6 j 。 1 , 1 3 药食用真菌的开发现状和展望 1 1 3 1 药食用真菌的开发现状 随着药用真菌在人类生活和食物构成中的重要作用逐渐为人们所认识，药用真菌的 生产也得到了巨大发展。当今在药用真菌的开发和研究成果主要有： 生产工艺研究深入。除加强传统的栽培方式研究外，各科研部门都把主要精力 放大工业发酵工艺和下游后处理工艺设备的研究。利用真菌在培养液中的生长特点，将 过去利用子实体成药的特点，改为从发酵液中提取药物成分，这正是当今药食用真菌研 究和开发的热点和走向。 资源种类显著加强。愈来愈多的真菌被证明具有药用价值，这为研制真菌新药提 供了更多的品种和可能。如发现含有抗生素的真菌就多达六十种左右。 药理药化研究的强化。现代化的仪器设备和检测手段为深入的药理药化研究提供 了条件。已从药用真菌药物的有效成分中测出多糖体、多肽类、糖苷肽、生物碱、多烃 类、醌类、类固醇类、类萜类、维生素、嘌呤类、有机酸等多种物质，说明药物成分的 多样化。对药性成分的了解，又促进了加工提取工艺的改进。借助分子生物学技术的运 用，为基础研究和开发应提供了更先进的手段。 江南大学硕士学位论文 产品开发的种类和剂型不断开拓。在传统的丸、汤的基础上，已开发了针剂、冲 剂、片剂、胶囊及至保健口服液、酒等各种产品。目前已上市的药用真菌口服液或保健 饮料已达3 0 种以上，今后的发展势头仍将是临床药品和大众保健品齐头并进。 药用真菌的医疗价值和保健作用，已引起世界各国的广泛重视。但从目前我国的生 产情况看，生产技术、设备、管理水平及产量等，与一些发达国家相比仍有较大差距。 所以，继续加强对药用真菌的科学研究工作，不断培育出产量高、质量好的优良菌株， 改进栽培管理技术，努力提高药用真菌的生产能力，以适应市场发展的需要。药食用真 菌的化学和药理学方面的研究也应着重加强。 1 1 3 2 药食用真菌的研究展望 药食用真菌的功效是多方面的，其化学成分也比较复杂。因此，不仅应重视药食用 真菌多糖及多糖衍生物等大分子化合物的研究；而且应加强小分子化合物，如生物碱、 萜类、醌类、类固醇、维生素、嘌呤类、有机酸等化合物的提取、分离、药理等研究， 从中发现新的药理活性的天然产物，扩大药源。 寻找新的药用真菌有效成分，提高生物利用率，通过结构改造，以及药食用真菌分 离、驯化和人工培养、发酵培养；完善生产工艺，提高药品质量和药效；充分利用基因 工程等先进技术，预期将会有更多的药食用真菌相关的药制品问世，为人类健康做出更 大的贡献。 1 1 4 药食用真菌的现代发酵技术 药食用真菌发酵始于1 9 4 9 年，h u m f e l d 和s u g i h a r a 1 2 ，1 3 】首次成功地在发酵罐中培养 出了双胞蘑菇菌丝体。此后，许多药食用真菌深层发酵获得了成功。药食用真菌发酵应 用于有用代谢产物的生产具有很多优点，它可以克服化学合成中存在的不经济性，避 免了人工栽培过程受气候、土壤、虫害、人为条件等的影响。同时发酵培养具有可以通 过筛选获得高产菌种、容易控制培养条件、保证产物品质、易于大规模生产等优点。 国内在2 0 世纪6 0 年代兴起深层培养( 或发酵) ，在2 0 世纪8 0 年代，中国医学科学院药 物研究所进行的冬虫夏草的大规模发酵培养研究，但仅是对菌类自身发酵的研究，如灵 芝、冬虫夏草、香菇发酵等，大都是单一发酵。目前对灵芝、冬虫夏草、灰树花等很多 菌种的发酵技术已日趋成熟【1 4 6 1 。利用液体发酵大量获得真菌茵丝体来提取其中有效成 分是目前最经济、最符合环保的方法，其效果接近子实体【1 7 】，而且可直接从发酵液中分 离提取活性成分。因此，发酵生产将是未来获得大量药食用真菌有用代谢物的一种重要 方法。 我国拥有丰富的药用和食用真菌资源，但对其深层发酵的系统研究还较少。深入开 展此方面的研究，将为进一步开发利用奠定扎实的理论和实践基础，显得十分重要。 1 1 5 从药食用真茵及其发酵产物中寻找抗生素 由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一 类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生 4 第一章绪论 素有微生物培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。 抗生素的使用，使许多疾病的发生和致病微生物的传播得到有效控制。但是，抗生 素的使用也导致了多药耐药微生物的出现和扩散，且该问题越来越严重【1 8 1 。因此急需发 现新型抗生素，从而可以减少对传统抗生素的使用，避免微生物对这些化合物的耐受作 用继续增加。由于天然产物尤其是真菌中含有大量活性化合物，许多研究学者的致力于 从中发现新的抗生素。 如前文所述，许多药食用真菌的提取液具有抗菌消炎的作用。对常见药食用真菌关 于抗生素的研究汇总如表1 1 所示。 表1 - 1 部分药食用真茵的抑菌活性 t a b 1 1e f f e c to fa n t i b a c t e r i a lo f f u n g i 菌株相关报道 黄伞子实体乙醇提取物抑制酒精酵母、啤酒酵母和黑根霉等等。 虎奶菇茵核乙醇提取物对葡萄球菌，沙门氏菌有抑制作用；菌丝体和发酵液对 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有明显抑制作用。 樟芝樟芝同态发酵的水提物和乙醇提取物对大肠杆菌、蜡质芽孢杆菌、枯草 芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳球菌、粪链球菌、变形杆菌、铜绿假单 胞菌、荧光假单胞菌等都有一定的抑制作用。 猴头菌子实体水提物、发酵液、菌球水提物和子实体多糖对细菌、酵母菌和霉 菌均有不同程度的抑制作用。子实体多糖对对金黄色葡萄球菌和青霉的 抑制作用达到最强。 桑黄桑黄的正丁醇提取物对耐甲氧基西林金黄色葡萄球菌具有抑制作用，其 m i c 毛e 6 3 - - 12 5 l g m l 1 。 蝉拟青霉蝉拟青霉菌丝体和发酵液甲醇提取物具有抗霉菌和抗白色假丝酵母菌 的活性。 香菇子实体多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母均 有一定的抑制作用。 鹿角灵芝 羊肚菌 尚未见。但灵芝属其他种有较广的抗菌菌谱。 羊肚菌多糖对大肠杆菌、枯草 芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌以及放线菌的抗菌活性都比较强。 本课题将以若干种指示菌，对实验室保藏的药食用真菌的深层发酵产物及其不同的 萃取相进行抑菌活性的筛选。也可以为活性物质的进一步分离纯化打下基础。 1 2 药物筛选模型和筛选样品库 1 2 1 药物筛选模型 随着科学的不断发展，药物筛选技术也产生了巨大的进步：从动物模型上升到细胞、 分子水平；从传统的筛选方法发展为以快速、微量、大规模为特征的高通量筛选。 药物筛选模型是药物筛选的关键。目前用于药物筛选的模型主要有分子和细胞两种 筛选模型 19 2 0 1 。 分子水平筛选模型：分子水平的筛选模型多是测定某两个确切的生物分子间的相互 反应。该方法最适用于检测以酶为代表的具有确定生理功能的药靶分子，是研究药物作 5 江南大学硕士学位论文 用机制的有效手段。以酶为药靶的高通量筛选绝大多数是直接检测酶活性，发现能干扰 特定酶促生物反应的生物活性化合物。具体方法根据酶的不同而不同，主要有基于放射 性和基于比色、荧光两大类方法。 细胞水平筛选模型：是以细胞功能为基础的筛选模型。除了能用于鉴定分子水平模 型发现的化合物外，还着眼于细胞整体的某些功能和信号转移途径中的其他位点。在对 某个分子信号通路并不完全了解的情况下，细胞水平筛选是唯一可用的方法。 本课题利用并优化了苗雷建立的d p p i v 抑制剂体外筛选模型1 2 ，采用的是基于分 子水平的药物筛选。它以分子为基础，采用计算机控制的自动化操作系统和灵敏快速的 检测仪器，对样品进行分析，采用体外实验方法，分子机制明确。 1 2 2 药物筛选样品库 高容量的样品库是药物筛选进行的先决条件，化合物数量越多，结构越多样，筛选 的前景则越好。目前，化合物样品主要有人工合成和天然产物中分离两个来源1 2 7 | 。 合成化合物库：合成化合物库又可分为常规化学合成库和组合化学合成库两种。常 规化合物库是指通过常规化学合成的各种结构明确的纯化合物。它们是国外制药企业建 立化合物样品库的主要来源。组合化学的出现为大量增加化合物的数量提供了另外一种 来源。组合化学库是利用组合化学和组合合成技术，同步合成大量筛选所需的化合物， 为快速地合成大量结构多样的化合物提供了巨大的潜力。 天然产物库：从天然产物中分离出来的化合物，母核结构和活性基团是长期的自然 选择形成的，具有丰富的多样性( 尤其是结构多样性) 。它们在大量筛选中所表现出的生 物活性在药物发现中具有人工合成所不能比拟的优势。 由于药食用真菌在深层发酵过程中会产生和释放大量的化合物，尤其在发酵液中更 是存在大量的生物活性物质，所以本课题对药食用真菌的深层发酵产物进行了初步的处 理，并以此为对象筛选有效组分( d p p i v 抑制活性、抑菌活性) 。 天然产物库无论在化合物结构还是功能方面都具有更丰富的多样性。虽然天然产物 成分复杂，提取活性物质并阐明其结构需要消耗大量人力和物力，从活性提取物到确定 活性化合物往往需要很长的时间，但是天然产物仍然以其化学多样性的优点仍然极大的 吸引着人们的重视。 1 3 糖尿病概况和抗糖尿病药物( d p p i v 抑制剂) 的研发 1 3 1 糖尿病概况 糖尿病( d i a b e t e sm e l l i t u s ，d m ) 是由于多种遗传和环境因素相互作用，引起胰岛 素相对或绝对不足以及周围靶组织不同程度对胰岛素抵抗，引起蛋白质、脂肪、水和电 解质等一系列代谢紊乱综合症，其中以高血糖为主要共同标志。临床上可以出现具有特 征性症状群，如多尿、多饮、多食、消瘦等表现即“三多一少”症状。 糖尿病的主要危害表现在它所引起的多种并发症，其并发症发生率高达6 5 1 。而 糖尿病引起的各种并发症则是致死的主要原因田】诸如：糖尿病并发冠心病、糖尿病并 发大血管疾病、糖尿病并发肾病、糖尿病并发神经病、糖尿病性视网膜病变等。其中， 6 第一章绪论 糖尿病又是冠心病的独立致病因素，大血管疾病并发症是糖尿病患者的主要死因团】。近 来，2 型糖尿病被确认为阿尔咨海默病的一个致病因素【2 4 】。 随着人们生活水平的提高，人口老龄化，生活方式的改变以及诊断技术的进步，糖 尿病已属常见病、多发病，患病率逐年增加，成为发达国家中继心血管疾病、肿瘤之后 的第三大非传染性疾病。据国际糖尿病联盟( i n t e r n a t i o n a ld i a b e t e sf e d e r a t i o n ，i d f ) 2 0 0 6 报告，目前全球仅2 型糖尿病患者就达2 4 6 亿，且预计在未来2 0 年内2 型糖尿病患者将逾 3 8 亿1 2 5 1 。糖尿病发病率无论在发达国家还是在发展中国家都在增加。有关数据表明， 近二十年来，我国糖尿病的发病率呈迅速上升趋势，估计我国现有糖尿病患者5 0 0 0 万人 左右，另有不少于此数量尚不构成糖尿病诊断的糖代谢异常患者，患病率居世界第二位 【2 6 】 o 1 3 2 糖尿病药物治疗的最新进展 近年来，随着对2 型糖尿病发病机制的深入研究，发现了多个药物治疗的新靶点。 这些新靶点能提高胰岛素的活性，刺激碳水化合物和脂肪的分解代谢，减少内原代谢产 生葡萄糖，促进胰岛o 细胞的生成等。新靶点包括乙酰辅酶a 羧化酶( a c e t y l c o a c a r b o x y l a s e ，a c c ) ，i k b 激酶，g l p 1 受体和d p p i v 等等【25 。现归纳总结如下。 1 3 2 1 乙酰辅酶a 羧化酶 乙酰辅酶a 羧化酶是近年来在肥胖及糖尿病发病机制研究中被逐渐重视的一种促进 脂肪酸合成的酶，其处于脂肪和糖代谢的一个交汇点，在碳水化合物和脂肪代谢中有重 要作用。a c c 有两种亚型，a c c l 主要分布在脂肪合成、储存的器官和组织，如肝脏、 脂肪、胰岛和下丘脑；而a c c 2 主要分布在脂肪分解的组织即骨骼肌和心肌。在进食后 和高胰岛素水平的情况下，a c c l 是激活状态，协助机体以脂肪形式储存能量或减少摄 食；而在空腹状态下，a c c 2 是被抑制的，有利于脂肪的水解和氧化。因而选择不同a c c 亚型，可达到治疗糖尿病的目的。激活a c c l 或抑制a c c 2 均能显示出改善胰岛素敏感性 及治疗糖尿病的作用，对a c c l 激动剂如甜菊苷( s t e v i o s i d e ，s v ) 深入研究，有可能发 现崭新的治疗糖尿病的药物1 2 7 j 。 1 3 2 2i k b 激酶 大量的科研证明，亚临床期的炎症在一定程度上介导胰岛素抵抗。其中，肿瘤坏死 因子( t n f ) 仅在人体内以及已知的所有动物肥胖模型中，能加强胰岛素抵抗。但很多 t n f a 介导的炎症反应由i k b 激酶( i k k ) 调控【2 引。有相关报道称，在高脂饮食和肥胖 引起的胰岛素抵抗中，i k k b 可能是介导该作用的主要丝氨酸激酶。因此，i k k b 已成为 糖尿病药物研发的又一个新靶点。 1 3 2 3 胰高血糖素样肽1 ( g l u e a g o n 1 i k ep e p t i d e1 ，g l p 1 ) 类似物 在哺乳动物中，g l p 1 来源于小肠黏膜l 细胞中的胰高血糖素原肽，它作用于胰岛1 3 细胞上的g l p 1 受体引起促胰岛素分泌。正常人进餐后，g l p 1 快速释放( 1 0m i n 内) 入 血。而在t 2 d m 或葡萄糖耐量受损( i g t ) 的患者，这种餐后释放是缺陷的，导致餐后 7 江南大学硕十学似论文 g l p l 浓度下降，胰岛素分泌减少口。因此，科研人员已经开始寻找g l p l 类似物。此 类在研药物有l i r a g l u t i d e 和c j c l l 3 1 等，已上市的药物有e x e n a t i d e 。 1 3 2 4 二肽基肤酶i v ( d i p e p t i d y lp e p t i d a s ei v 。d p p i v ) 上述的g l p 一1 在二肽基肽酶i v ( d p p - i v ) 的作用下可被迅速降解( t i n 2m i n ) 。因此， 抑制d p p - i v 就能延长内源性g l p i 的t 增加内源性g l p 1 的血浆浓度。d p p i v 抑制 剂的筛选和研发已成为寻找治疗糖尿病新药的热点。此类在研药物有n n 7 2 0 1 ，s y r - 3 2 2 和p 3 2 9 8 等，已上市的药物有西他列汀( s i t a g l i p t i n ) 1 o l 和维达列汀( v i l d a g l i p t i n ) 1 3 1 i 等。 1 3 2 5 过氧化酶增殖体澈活受体a ，v ( p p a r n y 1 k w 锄g 等p 发现一种新型p p a rn y 激动药k r 2 6 2 9 8 0 ，是一种新型的胰岛素增 敏药。k r 2 6 2 9 8 0 对p p a rq y 有良好的选择性，能增加3 t 3 一l 1 脂肪细胞对葡萄糙的摄 取。在胰岛索存扯的情况下，能促进3 t 3 - l l 脂肪细胞对3 h 一脱氧葡萄糖的吸收，并呈 星效关系对罗格列酮引起的促脂肪生成有一定抑佑作用。 1 3 3 二肽基肤醇及其抑制荆的简介 1 3 3 1 二肽基肤酶的简介 二肽基肽酶i v ( d p p - 【v ) 是位于细胞表面的一种丝氪酸肽酶( s e r i n ep e p t i d a s e ) ，由 h o p s u - h a v u 和g l e r m e r 在鼠肝脏组织匀浆过程中发现的，广泛存在于肾脏、胃肠道、结 缔组织、淋巴结等组织中，其催化活性中心位于胞外分子c 末端区域，凡n 端第二位上 存在脯氨酸( p r o ) 或丙氪酸( a i a ) 的多肽是该酶发挥活性的主要底物1 3 3 】。 g l p - l 在体内主要由肠道l 细胞分泌，具有降血赫作用，延迟胃排空，促进饱胀感， 抑制肝糖合成，提高胰岛索分泌，促进口细胞分化增殖，抑制凋亡，所以围绕g l p 一1 开 发的药物已成为2 型糖尿病新药研发的一个重要靶点，由于g l p 一1 在体内很快就能被 d p p i v 为主的酶降解而失活( 其示意如图i 2 所示) ，半衰期很短，故难于临床应用。d p p 一 】v 抑制荆的结构与d p p 一的灭然底物相似，含有x a c t p r o 类似结构，可以竞争性地结合 d p p i v 活化部位，但其亲和力却远大于它的天然底物，从而改变d p p i v 的构象，降低 其催化活性。故能有效延长g l p 1 半衰期，增强葡萄糖诱导的胰岛索分泌，调节血糖浓 度，所以寻找d p p i v 抑制剂己成为糖屎病新药研究的一个热点p ”。 曲q 麟 目1 1o l p - 1 枉d p p - i v 作刷下失活 f i g i 一1 t i a e i n a c t i v a t i o np r o c e s s o f g l p - ib y d p p - i v 第一章绪论 1 3 3 2 国外二肽基肽酶抑制药物的研究动态 国外已有成药于2 0 0 6 年8 月在墨西哥上市，接着美国及其他国家，还有很多已进 入待批和i i 、期临床阶段，主要为化学合成药物3 5 1 ，见表1 2 ( 截至2 0 0 8 年1 2 月) 。 表1 - 2d p p i v 抑制剂的研究现状 t a b 1 2t h ec u r r e n tr e s e a r c hs t a t u so f d p p i vi n h i b i t o r s 9 江南大学硕士学位论文 t a - 6 6 6 6g s 骱a n a b e a l s2 - 0 4 2 6 a l a n t o sp h a r m a i 期 i 期 不详 不详 1 3 3 3 以d p p i v 为靶点的药物筛选 自从围绕g l p 一1 开发的药物成为i i 型糖尿病新药研发的一个重要靶点后，d p p 抑制剂便成为糖尿病治疗的一个新方向，d p p 抑制剂多为小分子化合物，易于n n 给药，国外越来越多的人致力于从化学合成药物中筛选d p p 抑制剂，也有从海洋生 物中筛选具有d p p 抑制作用的药物【3 6 1 。已有此类化学合成药物上市，如默克公司的 西他列汀和诺华公司的维格列汀，还有许多已进入三期四期临床阶段。国内目前没有这 方面的报道。 本课题利用并优化了苗雷建立的d p p i v 抑制剂体外筛选模型。它是以甘氨酰脯氨 酸对硝基苯胺( g l y p r o p n a ) 为底物的发色底物法。其原理如下：在碱性条件下d p p 。 催化底物g l y p r o p n a 水解，生成甘氨酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者在波长 4 0 5a m 处有特征性吸收峰，通过酶标仪在4 0 5n l n 处测得的吸光度大小即发色基团p n a 生成量多少反映酶活性高低。 优点：可检测微量d p p i v 的活性；步骤简便，适于批量样品的测定；通过与阴性 对照的比较，可定量测定d p p 的活性；不需要特殊检测仪器；反应时间长，不易受 操作的影响。 缺点：多种中药可在4 0 5n n l 处产生吸收峰，故出现假阳性或者假阴性的可能性极 大，需要反复验证以及通过其他方法相互验证。 1 4 本课题研究的主要内容 ( 1 ) 研究实验室药食用真菌的深层发酵，并建立实验室药食用真菌信息库； ( 2 ) 利用体外筛选模型和管碟法研究真菌发酵产物的活性； ( 3 ) 对筛选出的活性最优的菌株进行初步分离，并筛选得出活性最优的组分。 1 0 第二章药食用真菌深层发酵及样品制各 第二章药食用真菌深层发酵及样品制备 2 1 前言 如绪论所述，药用真菌是指对疾病有治疗、预防及抑制作用或具有保健功效的一类 真菌。现代药理学研究表明，冬虫夏草、灵芝、灰树花、香菇等药食用菌具有调节免疫、 抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、保护肝脏、抗炎症等多种药理作用【3 7 1 。药食用真菌 在提高人体免疫功能、滋补、抗衰老方面的作用早已受到我国历代医药学家的关注。 随着现代发酵技术的进步，药用真菌的生产由田间栽培、椴木栽培发展到工业化发 酵生产，不但有周期短、规模大、效率高、质量稳定的优点，而且可直接从发酵液中分 离提取活性成分。目前对灵芝、冬虫夏草、灰树花等很多菌种的发酵技术已日趋成熟 1 1 4 - 1 6 。而利用液体发酵大量获得真菌菌丝体来提取其中有效成分是目前最经济、最符合 环保的方法，