（分析化学专业论文）电化学发光dna分析方法的研究.pdf

电化学发光d n a 分析方法的研究 李延 摘要d n a 杂交分析技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛 的技术之一，是定性或定量检测特异d n a 序列片段的有力工具。它己广泛应用在 生命科学，尤其是医学的各个领域。传统的d n a 分子杂交采用的是放射性标记的 捡泓方法，这种方法虽然灵敏度商，但存在放射性物质对入体及环境的危害。自 2 0 世纪8 0 年代以来，各种非同位素如酶、荧光素、生物素、地高辛标记的化学发 光法和荧光分析法以及以电活性物质标记的电化学分析方法相继问世。这些方法 虽然在一定程度上克服了同位素标记的缺陷，但由于存在灵敏度不够高或检测系 统复杂或仪器价格昂贵或标记物不稳定等缺陷，还不能完全取代传统的分析方法。 因此寻求简单、灵敏、准确、价廉的非放射性标记的d n a 分析方法具有十分重要 的现实意义。 电化学发光( e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l t t m i n e s c e n e e ，e c l ) 是在电极上施搬定 的电压使电极反应产物之间或电极反应产物与溶液中某组分之间进行化学反应而 产生的一种光辐射。根据电化学发光的强度进行分析的方法称为电化学发光分析 法。该法不仅具有化学发光分析的灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点而 且具有电化学分析控稍性强、选择性好等优点。近几年来，将电化学发光检测技 术应用于生物分析的研究受到了人们的极大关注。本论文研究工作旨在研究e c l 活性物质钌联毗啶( r u ( b p y ) 3 “) 衍生物的电化学发光性能，并以这些物质为标记物 制备了灵敏的d n a e c l 探针，结合d n a 杂交技术分子、自组装技术和纳米技术， 将高灵敏度的e c l 检测手段应用于d n a 的序列识别及含量测定。本论文探索了三 种简单、快速、灵敏的电化学发光d n a 分析方法，并将其用于特殊d n a 序列片段 的测定。本论文研究工作是在国家自然科学基金“新型功能纳米材料组装电化学 发光生物亲会传感器的研究”( n o 2 0 3 7 5 0 2 5 ) 硬鼠能资助下完成匏。 本论文由引言、研究报告两部分组成。第一部分为引言部分，引言部分介绍 了电化学发光分析的原理、特点、体系，d n a 组成和d n a 分析的原理，概括和 总结了d n a 传感器的构造和各种d n a 传感器的原理、特点及分析应用，评述了 电化学发光分析法在杂交检测以及药物筛选方面的研究进展，最后阐述了本论文 的目的和研究内容。 第二部分为研究报告部分，研究报告由三部分组成。 2 1 电化学发光分析法检测特定净歹l j d n a 的研究结合d n a 杂交狡米和 d n a 自组装固定化技术将高灵敏度的e c l 检测手段应用于生命物质d n a 的序列 识别及含量测定。以r u ( b p y ) 2 ( d c b p y ) n h s 为标记物制备- f d n a e c l 探针，研究了 d n a e c i 标记物的电化学发光性能并基此建立了电化学发光分析法检测特定序 列d n a 的分车厅方法。通过包纽装技术将5 末端带有巯基筑目标一s s l 3 n a ( h s s s d n a ) 固定到金电极上，然后与标记有钉联毗啶衍生物的己知序列s s d n a 进行杂交反应，最后通过电化学发光信号的变化对特殊序歹 j d n a j f l 以测定。电化 学发光分析信号与待j 9 1 l l d n a 浓度在3 4 1 0 - 1 0 3 4 1 0 7m o l l 区间呈线性关系方 法检测限为1 2 x l f f 田m o l l 。对3 ，4 1 0 甚m o l ，l 的待测d n a 进行1 1 次测定，相对标 准偏差为4 7 。初步实验结果表明，本文提出的以钉联吡啶为标记物结合自组装 技术建立的电化学发光d n a 分析方法是可行的。 2 ，z 基于夹心杂交技术电化学发光分析法检浏特定序列d n a 的研究由于 利用自组装法将h s s s d n a 直接固定d n a 到电极上，e c l 检测的d n a 链端需要巯 基修饰，应用上受到一定的限制。本部分我们提出了电化学发光检测的夹心式 d n a 杂交分析方法。将d n a 夹心杂交技术用于d n a 杂交分析中。使我们要检测的 d n a 无须修饰并且提高d n a 的杂交效率。该方法通过自组装技术将5 末端修饰有 巯基单链d n a ( h s s s d n a ，捕获探针) 固定到金电极上，捕获探针与目标s s d n a 进行杂交，淋洗除去未结合目标s s d n a ，再与标记的检测探针s s d n a 结合形成 捕获掾铃s s d n a - 目标s s d n a - 标记懿捡溅探针s s d n a 的夹心式三甥治结构，电化学 发光分析信号与目标s s d n a 浓度在8 8 x 1 0 “0 8 8 x 1 0 8 m o y l 范围内呈线性关系，检 出限为3 0 x 1 0 。o m o l d l 。对8 _ 8 1 0 。m o y l 的目标s s d n a 进行1 1 次测定，相对标准偏 差为4 9 。初步实验结果表明，本文提出的基于夹心式d n a 杂交测定特定序列 d n a 的电化学发光分析法是可行的。 2 3 纳米金组装电极上电化学发光分析法检测特定序列d n a 的研究作为 d n a 电化学发光分析中不可或缺的重要环节，单链d n a 在电极上的固定化研究具 有十分重要的意义，纳米材料太的比表面和良好的电子传递特性能增强了d n a 片 段在电极上的固定程度。本文利用1 6 - 己二硫醇分子为连接剂，将纳米金组装在 金电极上。纳米金组装金电极上通过自组装技术将s 末端带有巯基的目标s s d n a ( h s - s s d n a ) 固定到修饰电极上然后与标记有钌联毗啶衍生物的已知序列 s s d n a 进行杂交反应，最后通过电化学发光信号的变化对特殊序列d n a 3 口以测 定。实验中利用电化学手段表征t l q s s s d n a 在金电极上的固定过程，计算得n 2 个碱基的h s s s d n a 在修饰电极上的表面覆盖度为4 8 5 x 1 0 1 4m o l e c u l e s c m 2 。研究 了匿定曲单链对其互於o n a 韵识影链力。由于纳来金具有较大钓比表面积，经过 令纳米颗粒修饰的电极对_ h s ，s s d n a 的固定量比未经修饰的会电搬呵提高近1 2 倍 提高了该方法的检测灵敏度。对互补d n a 的检出限) 5 6 7 x 1 0 。2m o i l l 。 关键词：电化学发光；自组装：1 ) n a 杂交分析：钉联吡啶；纳米会 d n a h y b r i d i z a t i o nd e t e c t i o nb a s e d o n e i e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e y a n l i a b s t r a c tt h ea n a l y s i so fd n as e q u e n c ea n dd n am u t a n td e t e c t i o n p l a y s f u n d a m e n t a lr o l e si nt h e r a p i dd e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rd i a g n o s t i c s a n di nt h e a n t i e a n c e rd r u gs c r e e n i n g 。s e n s i t i v i t yi nd n a h y b r i d i z a t i o na n do t h e rb i o a s s a y si s i m p o r t a n t i nc l i n i c a l d i a g n o s t i c s ，f o r e n s i cc h e m i s t r y ，e n v i r o n m e n t a li n v e s t i g a t i o n s ， p h a r m a c e u t i c a ls t u d i e sa n db i o l o g i c a lw a r f a r ea g e n td e t e c t i o n as i n g l es t r a n dd n a ( s s d n a ) p r o b eb i n d st o i t s c o m p l e m e n t a r ys t r a n d ( t a r g e ts s d n a ) t of o r md o u b l e s t r a n dd n a ( d s d n w i t hh i g he f f i c i e n c y t h e s i g n a lp r o v i d e db yt h ep r o b ei s a m e a s u r eo fd e g r e eo fh y b r i d i z a t i o n av a r i e t yo ft e c h n i q u e sa r ea v a i l a b l ef o rt h e d e t e c t i o no fd n a h y b r i d i z a t i o n ，o f w h i c he l e c t r o c h e m i c a l ，f l u o r e s c e n t ，r a d i o c h e m i c a l ， p i e z o e t e c t r o n i c h a v e b e e n d e v e l o p e d & x t h 口u g h t h e s em e t h o d s d i s p l a ym a n y a d v a n t a g e s ，t h e yh a v en o tb e e nu s e dt ot a k ep l a c ec o m p l e t e l yt h et r a d i t i o n a lm e t h o d b e c a u s eo fl o ws e n s i t i v i t yo r c o m p l e xe q u i p m e n t o ro t h e rs h o r t c o m i n g s s oi ti s n e c e s s a r yt od e v e l o pr a p i da n ds e n s i t i v em e t h o d sf o rt h ed e t e c t i o no fs p e c i f i cd n a s e q u e n c e s r e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) i s a t e c h n i q u e t h a tc o m b i n e s c h e m i l u m i n e s c e n c e ( c l ) a n de l e c t r o c h e m i s t r y ( e c ) t h ec l r e a c t i o nw a si n i t i a t e db y a ne l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o na te l e c t r o d es u r f a c e s u c ha nd e c t r o - i n i t i a t i o nr e a e t i o n i n t r o d u c e sal a r g en u m b e ro fa d d i t i o n a l a d v a n t a g e s ，s u c h a s h i g hs e n s i t i v i l y a n d s e l e c t i v i t y ，r a p i d a n dc o n v e n i e n t o p e r a t i o n a n dr e l a t i v e l y s i m p l e i n s t r u m e n t a t i o n s y s t e m d u et ot h e s ei n h e r e n ta d v a n t a g e s ，e c lm e t h o dh a sa t t r a c t e dm u c ha t t e n t i o n f r o ma i la r t a l y t i e a if i e l d s 、e s p e c i a l l yf r o mb i o c h e m i c a la n a l y s i s 1 h ea i mo f t h e p r e s e n t w o r ki st od e v e l o ph i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v em e t h o d sf o rt h ed n a h y b r i d i z a t i o n d e t e c t i o nb a s e do ne l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e b a s e do h c o u p l i n gw i t hd n a h y b r i d i z a t i o n ，i m m o b i l i z a t i o nt e c t m i q u e sa n dn a r t o - t e c h n o l o g y ，w eh a v ed e v e l o p e da s e r i e so f e e lm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no f s p e c i a ld n as e q u e n c e ，c o m p a r e dw i t h o t h e rm e t h o d s ，t h ed e v e l o p e dm e t h o d sa r es i m p l e ，r a p i d ，a sw e l la ss e n s i t i v e ap a r to f r e s e a r c hw o r ki nt h i st h e s i si sf i n a n c i a l l ys u p p o s e db yt h en a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c e f o u n d a t i o no f c h i n a ( g r a n tn o 2 0 3 7 5 0 2 5 ) t h i st h e s i si n c l u d e sar e v i e wa n dar e s e a r c hs e c t i o n i nt h er e v i e w , t h eb a s i c p r i n c i p l e s ，c h a r a c t e r i s t i c s a n ds y s t e m so fe c l ，t h ep r i n c i p l eo fd n ad e t e c t i o na r e i n t r o d u c e d t h ep r i n c i p l e sa n dc h a r a c t e r i s t i c so fv a r i o u sk i n d so fd n ad e t e c t i o na r e s u m m a r i z e d t r e n d so fe c li nd n ah y b r i d i z a t i o aa n dd r u g ( f i l t r a t i o n la r er e v i e w e d a n dt h ep u r p o s ea n dc o n t e n to ft h et h e s i sf i n a l l ya r ep r e s e n t e d t h er e s e a r c hs e c t i o nc o n t a i n st h r e es u b u n i t s s u b u n i t1 ，t h es t u d yo f e c ld e t e c t i o no f s p e c 狮cd n as e q u e n c e an o v e le c lm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f d _ n a s e q u e n c ei sd e v e l o p e du s i n g r u ( b p y ) z ( d c b p y ) n h sa sl a b e la n dt a r g e ts i n g l es t r a n dd n a ( h s s s d n a ) i m m o b i l i z e d o na ue l e c t r o d eb ys e l f - a s s e m b l yt e c h n i q u e r u ( b p y ) 2 ( d c b p y ) n h sw a gs y n t h e s i z e d a n du s e d a se c ll a b e lt o p r e p a r er u ( b p y h ( d c b p y ) n h s d n ap r o b e t h e r u ( b p y ) z ( d c b p y ) n h s - d n ap r o b e w a st h e nu s e dt oh y b r i d i z ew i t ht h et a r g e ts s d n a i m m o b i l i z e do nt h ee l e c t r o d ea n dt h eh y b r i d i z a t i o ne v e n t sw e r ee v a l u a t e db yt h ee c l s i g n a l sf r o mr u ( b p y ) 2 ( d c b p y ) n h s t h er e s u l t s s h o wt h a tt h er u ( b p y ) 2 ( d c b p y ) n h s - d n a p r o b ei sa b l et or e c o g n i z ec o m p l e m e n t a r ys e q u e n c e t of o r md s d n a t h el i n e a r r e s p o n s et ot h ec o m p l e m e n t a r ys e q u e n c ei s f r o m3 4 。1 0 1 ”t o3 4 “1 0 。m o l lw i t ha d e t e c t i o nl i m i to f1 ，2 xl0 1 0m o l l s u b u n i t2 ，t h es t u d yo fe c ld e t e c t i o no fs p e c i f i cd n as e q u e n c eb a s e do n s a n d w i c hh y b r i d i z a t i o n i ns u b u n i t1 ，t h et a r g e ts i n g l es t r a n dd n a ( h s s s d n a ) w a si m m o b i l i z e do na u e l e c t r o d e b y s e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r st e c h n i q u e ，t h et a r g e t s s d n am u s tb e f u n c t i o n a l i z e da tt h e5 e n d 、i t l lat h i o lg r o u p s ot h ea p p l i c a t i o ni sl i m i t e d i no r d e r t o d e m o n s t r a t ef u r t h e r t h e a p p l i c a t i o np o s s i b i l i t i e s ，s a n d w i c h h y b r i d i z a t i o n w a s d e v e l o p e d t oa s s a yt h es p e c i f i cd n a s e q u e n c e s i ns a n d w i c hh y b r i d i z a t i o n ，t h et a r g e t s s d n aw o u l dn o tn e e dt ob em o d i f i e dw i t ht h i o lg r o u pi nt h ea n a l l y t i c a lp r o c e d u r e t h es p e c i f i cd n ac o u l dn o to n l yb ec a p t u r e db yt h ei m m o b i l i z e dp r o b e ，b u ta l s o h y b r i d i z e dw i t ht h el a b e l e dp r o b e ( r u ( b p y ) 2 ( d e b p y ) n h s - d n a 、田地r e s u l t ss h o w e d t h a tt h e r u ( b p y ) 2 ( d c b p y ) n h s - - - d n ap r o b e i sa b l e t o r e c o g n i z ec o m p l e m e n t a r y s e q u e n c et o f o r md s d n a t h el i n e a rr a n g ef o rc o m p l e m e n t a r ys e q u e n c ei sf r o m 8 g x l 0 一ot o8 g x l 0 一m o l , lw i t had e t e c t i o nl i m i to f 3 o 1 舻m o l l 。 s u b u n i t3 ，t h es t u 咖o fe c ld e t e c t i o no f s p e c i f i cd n as e q u e n c eb a s e do na u n a n o p a r t i c l es e i f - a s s e m b l y r a ue l e c t r o d e w eu s ea un a n o p a r t i c l et oe n h a n c et h ed n a i m m o b i l i z a t i o na m o u n to ng o l d e l e c t r o d ea n d u l t i m a t e l y l o w e rt h ed e t e c t i o nl i m i to fe c ld e t e c t i o n d n a s e l f - a s s e m b l i n g o fa p p r o x i m a t e l y2 5n m d i a m e t e ra un a n o p a r t i e l eo n t o a l ，6 一 h e x a n e d i t h i o l ( h s ( c h 2 ) 6 - s h ) m o d i f i e dg o l d e l e c t r o d er e s u l t e di na ne a s i e r a t t a c h m e n to fd n aw i t ha m e r c a p t o h e x y lg r o u p a tt h e5 - p h o s p h a t ee n d t h e r e f o r ea n i n c r e a s ei nc a p a c i t yf o rd n a d e t e c t i o n q u a n t i t a t i v er e s u l t ss h o w e ds u r f a c ed e n s i t i e s o f d n a0 1 1t h ea u n a n o p a r f i c l em o d i f i e dg o l de l e c t r o d ew a sa p p r o x i m a t e l y 4 8 5 1 0 1 4 m o l e c u l e s c m 2 h y b r i d i z a t i o nw a s i n d u c e db y e x p o s u r eo f t h es s d n a c o n t a i n i n gg o l d e l e c t r o d et o r u ( b p y ) 2 ( d c b p y ) n h s l a b e l e dc o m p l e m e n t a r ys s d n ai ns o l u t i o n t h e d e t e c t i o nl i m i ti s6 7 1 0 1 2m o l lf o rc o m p l e m e n t a r ys s d n a ，w h i c hi sm u c hl o w e r t h a nt h a to fs u b u n i t1a n ds u b u n i t2 t h ea un a n o p a r t i c l ef i l m so nt h ea ue l e c t r o d e p r o v i d e ah o v e lm e a n sf o rt h es s d n ai m m o b i l i z a t i o na n ds e q u e n c e s p e c i f i cd n a d e t e c t i o n k e y w o r d s ：e l e e t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e ，a un a n o p a r t i c l e ，s e l f - a s s e m b l y ， d n a h y b r i d i z a t i o n ，t r i s ( 2 ，2 - b i p y r i d i n e ) r u t b e n i u m ( i i ) 学位论文独创性声明 y7 2 8 7 1 , 1 g 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中己经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名： 日期 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文 的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名日期； 1 1 引言 第一部分绪论 脱氧核糖核酸( d n a ) 是类重要的生物大分子，被称为生命体内的基凶物质。 它作为遗传信息的承担者，具有储存和传递信息的功能。绝大多数生物体的遗传 信息都存储在d n a 分子中，d n a 的复制构成了遗传的分子基础。研究发现人类的 许多遗传疾病都与核酸分子中碱基序列的变异有关。检测与疾病有关的变异对基 因筛选、遗传疾病的早期珍断和治疗具有十分深远的意义。 电化学发光( e l e c t r o g e n e r a t e dc h e m i l u m i n e s c e n c e ，e c l ) 是在电极上施加一定 的电压使电极反应产物之间或电极反应产物与溶液中某组分之间进行化学反应而 产生的一种光辐射。根据电化学发光的强度进行分析韵方法称为电化学发光分析 法。该法不仅具有化学发光分析的灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，而 且具有电化学分析控制性强、选择性好等优点。近几年来，将电化学发光检测技 术应用于核酸( d n a ) 杂交检测的研究受到了人们的极大关注。国内外对电化学 发光核酸分析法的研究均有评述1 1 7 】。朱果逸【1 等人介绍了电化学发光核酸分析 原理，评述了电化学发光核酸分析法在生物医学中的应用。陈扬【2 】等人综述了电 化学发光钌联吡啶体系的发光原理、标记检测方法及其在核酸应用研究的进展。 陈国南f 3 1 等人对电致化学发光在生物活性物质检测方面的应用进展进行了评述。 张成孝【4 等人综述了e c l 体系及其在临床分析研究中的应用。r i c h t e r d 5 g ；宗述介 绍了电化学发光的原理、发光体系并对电化学发光分析在生物医学、食品、环境 的应用进行了总结，引文4 3 1 篇。本论文引言部分介绍了电化学发光分析的原理、 特点及体系，i ) n a 组成和d n a 分析的原理概括和总结了d n a 传感器的构造和各 种d n a 传感器的原理、特点及分析应用，评述了电化学发光分析法在杂交检测以 及药物筛选方面的研究进展，最后阐述了本论文的目的和意义，指出论文的创新 之处及主要研究内容。 1 2 电化学发光分析法的原理及特点 1 2 ，1 电化学发光分析法的原理 电化学发光分析法( e l e c t r o g e n e r a t e d c h e m i l u m i n e s c e n c e ) 是对电极施加一 定的电压进行电化学反应，反应的产物之间或与体系中的某种组分发生化学反应， 产生激发态物质，激发态物质回到基态时产生发光，用光电倍增管等普通光学手 段测量发光强度从而对物质进行痕量分析的一种方法。根据电化学发光激发态离 子产生的途径不同，电化学发光过程从可分为以下p q 种 1 2 1 1 通过单重激发态途径的电化学发光( s r o u t e ) 一般是在电极上施加定的电压，使分子a 往电压作用下氧化或还原产生a + 或a + ，然后， a + 或a 相互反应产生单重激发念，激发态蚓到基态时发光，或是 a 卞或a 分别与溶液中的r 或o 反应产生激发念而发光。用方程式表示如下： a a + + e a + e ，a 。 a + + a 一2 a a + 一a + h v 或a + + r - a + + o a 。十o ，a + + r a + 一a + h v 大多数芳香族物质的电化学发光均属于这类反应原理。 1 2 1 2 通过三重激发态途径的电化学发光( t - r o u t e ) 一般是在电极上施加一定的电压，使分子a 在电压作用下氧化或还原产生a + 或a 。，然后，a + 或a 。相互反应产生三重激发态，激发态回到基态时发光，用方程 式表示如下： a a + + e a + e a a + + a 一3 a + a a + 一a4 - hv 1 2 1 3 由于共存物质的二次反应所引起的电化学发光 溶液中存在的另一物质与电极e 产生的电解产物之间发生氧化或还原反应， 生成激发态分子或离子，激发态物质回到基念而发光。典型的例子为鲁米诺的电 化学发光。 1 2 1 4 与溶剂分子有关的电化学发光 在六甲基磷酸酰胺中含有高浓度的l i c l 0 4 ，n a c l 0 4 ，k c l 0 4 ，n a b f 。，l i c i ， k i 等无机化合物体系，当外加直流电压叫，自电化学发光产乍。一般认为浚发光 机理为当阴极附近的溶液中产生溶剂合离子时，阳极附近的卤素离子由r 氧化而 生成卤素，并与溶剂分子缔合，由缔合物离解的离子在溶液中起反应而发光。 电化学发光的过程还有其它的说法，但不论对哪种 兑法，其中都包括电生反 应产物，直接或间接产生激发忿物质，激发态物质回到基态而发光。 1 2 2 电化学发光分析法的特点【8 1 高灵敏度与其它电化学方法相比较e c l 法具有较高的灵敏度，对无机 离子测定已达p p b 级，测定金属络合物的检测限有的可达1 0 - 1 3 m o l l 。e c l 在提高 选择性方面有着有利的因素，当体系中有多种离子共存时，可利用施加不同波形， 不同电压进行分离与富集，这不仅可提高选择性，而且还可利用富集方法提高灵 敏度。 重现性好对于同一种样品可以连续重复测定多次，结果稳定。 对发光反应机理的研究已显出它的独特性因为e c l 法可充分利用电化学 的测试手段以弥补化学发光法在这方面的不足。 仪器特点所用仪器简单、操作简便，并且易于自动化。 1 2 3 电化学发光体系 1 2 3 1 鲁米诺电化学发光体系 鲁米诺电化学发光的原理s a k u r a 9 做了洋细的研究，鲁米诺在碱性环境下过 氧化氢催化氧化发光，其发光机理如图l ： 礤扰铸：寺s 百- e n 2 苌州c o o - 一e m i s s i o n 以c 0 0 州 图i 鲁米诺过氧化氢体系的电化学发光机理图 f i g t h ee c l m e c h a n i s mo f t h es y s t y mo f l u m i n o la n dh 2 0 2 1 2 3 2 钉联吡啶电化学发光体系 1 9 8 1 年r u b i n s t e i n 1 0 发现钉联吡啶在水溶液中的发光现象。1 9 9 0 年， l e i a r i d 【1 1 1 建立了钉联吡啶一三丙胺( t p a ) 体系，i 丙胶大大提高钉联吡啶电化学发 光分析法的灵敏度。r u ( b p y ) 3 2 + 和t p a 分别存阳极氧化成r u ( b p y ) 3 “和i 内腋的阳 离子自由箍( t p a “) ，自由基( t p a ) 具肯强的还原性，从向把r u ( b p y ) 3 3 。还原 为激发态的r u ( b p y ) 3 2 ”，激发态的_ r u ( b p y ) 3 2 川到基态，发出6 2 0 n 1 1 1 的光，而日 钉联吡啶又回到燎来的状态，继续参与循环。 气 e 。( g r o u n ds t a g e 图2 钌麟吡啶t p a 体系电化学发光机理幽 f i g 2 t h ee c l m e c h a n i s mo f t h es y s t y mo f r u t h e n i u ma n dt p a 1 2 3 3 吖啶酯电化学发光体系 吖啶酯在过氧化氢和次氯酸根存在的情况下。其机理见( 图3 ) 【1 2 。 1 2 3 4 光泽精电化学发光体系 光泽精( n ，n 二甲基一9 ，9 - 联吖啶二酸盐，l u c i g e n i n ) 的电化学发光于1 9 3 9 首次由t a m m a m u s h i 和a k i y a m a 报道 1 3 】，此后l e g g 等人 1 4 $ e 1 h a a p a k k a 等人 1 5 】 分蹦于1 9 6 9 、1 9 8 1 年研究了光泽精在中性非缓冲溶液和碱性条件下的e c l 行为。 但是，由于在碱性条件下，氧气与光泽精的反应是典型的化学发光反应，因此文 献 1 3 ，1 5 】中e c l 体系的易与化学发光混淆。张棘等人( 1 6 在以上的基础上，对光 泽精h ，o ：一k c i 中性非缓冲体系电生化学发光行为及机理进行了研究，提出了以下 的可能的机理( 图4 ) ： 例般迅原 c h 3q 叱 q ? 盏。g 一一 审一器一 一鬻一 i 嚣 器 c k h 取帆十l u c 斗+ l u c l + 十n m m - 尘巳+ n m a 十l u c - _ 一l u c 十h 脚 h “4 种m ) n m a 为n m e t h y i a c r i d o n e ( n 一i = 1 毓吖啶酮) 图3 吖啶酯体系电化学发光机理图 f i g 3t h e e c lm e c h a n i s mo f t h es y s t y mo f a c r i d i n i u m 固9 ；。o = k 囟 h ， e 一 幽”取： 。? 3 嘲+ h v ( 4 4 8 n m 幽4 光泽精体系电化学发光机理酗 f 培4t h ee c l m e c h a n i s mo f t h es y s t y mo fl u c i g e n i n 5 6 彳吣。 严器 。0 r g r 上叫选专 一 ， ，需廷一 o、。 以上四种电化学发光体系，光泽精的电化学发光没有化学发光强，而且其电化 学发光的条件比较苛刻，零价的光泽精和光泽精反应的中间产物不溶丁：水，电极 污染比较严重【1 7 1 。鲁米诺和钉联吡啶体系的电化学发光体系比较成熟而且灵敏度 高，其中钉联吡啶一t p a 体系中钌联吡啶的检测限为1 0 。3m o l l 18 1 ，钉联吡啶可 以在电极上循环使用，衍生物在水中溶解性好，标已之后不影响其发光效率是一 种很好的电化学发光标记物。 1 3d n a 组成与d n a 分析研究的历史 d n a 是多聚脱氧核苷酸，其组成由d - 2 - 脱氧核糖、腺嘌呤a 、鸟嘌呤g 、胞嘧 啶c 、胸腺嘧啶t 和磷酸组成。d n a 分子是由两条多脱氧核糖苷酸链依托彼此碱基 之问形成的氢键而结合在一起，碱基在链的内侧，两条链以反平行方向盘绕同一 条轴形成右旋的双螺旋结构。两条链上的碱基按照严格的碱基互补原则相互配对， 即a 与t 配对，g 与c 配对。图5 为d n a 分子的结构简图。根据碱基互补原则，当 条多聚核菅酸链的序列被确定后，即可推知另一条互补链的序列。碱基互补原 则具有极为重要的生物学意义，它是d n a 复制、转录和反转录的分子基础。 1 8 7 1 年瑞士科学家f r i e d r i c hm i e s c h e r 首次从绷带的脓液中分离出“核素” ( n u e l e i n ，核酸和蛋白质的复合物) ，迈出了核酸研究第一步。 1 9 5 3 年w a s t o n 年i l c r i c k 1 9 发现了d n a 双螺旋结构和碱基互补原理建立了分子 生物学，同时掀起了各学科研究d n a 的浪潮。 1 9 9 0 年丌始的被称为生命的“登月计划”人类基因组计划于2 0 0 0 年6 月2 6 日基 因组草图绘制成功。d n a 的研究达到一个新的高潮。 2 0 0 1 年2 月2 6 日人类基因组计划和塞柬拉基因公司公布的结果表明：人类遗传 上有9 9 9 的共性，0 1 的差异决定每个人与他人的不同。 在研究不断发展的过程中，科学家试图解释生命中的各种现象，由此产生了 各种研究、探索和假设。 a ) 图5d n a 分子的结构简幽 f i g 5 t h ed n am o l e c u l es t r u c t u r e 每圈螺旋1 0 4 n t ，碱基堆积距o 3 4 n m ，烈螺旋平均直径2 n m 人沟：宽1 2 n m ，深0 8 5 n m ， 小沟：宽o 6 n m ，深o 7 5 n m 1 4d n a 分析的原理 随着对基因结构及功能研究的不断深入，人们己经越来越多地发现，人类的 许多遗传疾病都与d n a 分子中碱基序列的突变有关。正是这些碱基序列突变的位 置和程度不同而导致各种不同的遗传疾病。d n a 序列的测定通常采用杂交法，即 用一段已知序列的单链d n a ( s s d n a ) ( 被称为d n a 探针，一般由2 0 一4 0 个碱基的核 苷酸组成，包括天然的核苷酸片段和人工合成的寡聚核苷酸片段1 与未知序列的 s s d n a ( 目标d n a ) 在一定的条件下进行分子杂交反应，只有与探针序列完全互补的 s s d n a a 一能与其杂交形成稳定的双链d n a ( d s d n a ) 结构。通过定的方法来指示 双链结构的形成，就可以推断目标d n a 的序列特征。传统的d