（微生物学专业论文）bacillus+spbsd8肌酐降解酶系的研究.pdf

博士学位论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘鲎或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：吾晚孕 签字日期： 矾 年月虏日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解迸姿盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：专曲乳孕导师签名：马蝴 签字日期：加爿年 f 月心日签字日期：矿扩年莎月钐日 博士学位论文 致谢 首先，将我最诚挚的敬意和最衷心的感谢献给我的导师赵宇华教授和马晓航 副研究员。 本论文是在赵老师、马老师的悉心指导下完成的。从论文选题、方案设计、 实验实施到论文的最终完成，无一不凝聚着导师的心血和汗水。他们渊博的学识、 敏锐的洞察力、孜孜不倦的敬业精神使我受益匪浅，平易朴实和宽厚待人的处世 之道，给了我如何为人的宝贵财富。在此，谨向我的导师致以崇高的敬意和衷心 的感谢! 感谢五年来对我的培养和教诲! 在论文的完成过程中，得到了浙江大学贾小明副教授给予的热情帮助和指 点，在此对她表示忠心的感谢。 此外，感谢我的师姐孙桂芹，师兄周学来，同学李霞、林晓燕，师弟赵伟峰、 丁海涛、开雷、王磊、刘辉，师妹卢洪波、徐晓红以及实验室的郭桂枝、孔素英 两位阿姨和徐同成、郦萍博士等同学给我的热心帮助，和他们融洽的相处，为平 日紧张的生活增添了许多乐趣，使我度过了非常愉快的五年博士学习时光。另外 还要感谢我的同学曹翠平及其导师吴小锋，在我的实验过程中提出了许多宝贵意 见，并给予了无私的帮助和支持。 值此论文完成之际，特别感激深爱我的母亲，感谢她五年来对我的学业给予 了无怨无悔的理解和支持，她的爱是我前进的动力。 最后向在我成长过程中所有关心和支持过我的老师、同学和朋友表示真挚的 感谢! 同时，向参加本论文评阅、评议和答辩委员会的全体专家，教授及为论文 答辩辛勤工作的人员致以崇高的敬意1 4 郭康平 博士论文 摘要 在临床测定中，血清中的肌酐浓度是一项判断肾功能的重要指标。酶法测定 肌酐浓度，具有反应专一性强和灵敏度高等特点。本实验室已从土壤中筛选到产 肌氨酸氧化酶( s o x ) 的芽孢杆菌b s d - 8 ( b a c i l l u ss p b s d - 8 ) ，酶纯化后对其 性质研究发现，与已报道的s o x 相比，该酶的热稳定性更好，这一点对于临床肌 酐检测有较高的实际应用价值因此本研究对该酶进行了深入的研究。此外，发 现该菌可以在以肌酐为唯一碳源的条件下生长，推测该菌株很可能还能产生肌酸 水解酶、肌酐水解酶。本研究首先对肌氨酸氧化酶基因进行了克隆、表达，采用 定向进化技术和建立的高通量筛选方法对肌氨酸氧化酶的热稳定性进行改造；之 后对肌酸水解酶基因进行了克隆、表达，酶性质研究；对肌酐水解酶基因进行了 克隆、测序。论文的主要研究结果如下： 1b a c i l l u ss p b s d - 8 肌氨酸氧化酶基因的克隆、测序与表达：利用染色 步移的方法克隆到b s d - 8 菌株s o x 的全序列，该基因的大小为11 6 4b p ，可编码 3 8 7 个氨基酸。与g e n b a n k 数据库中单亚基肌氨酸氧化酶的氨基酸序列同源性很 高。成功构建了两套表达系统：一高效表达载体p e t - 1 5 b ( 一) 和b l 2 1 ( d e 3 ) 的 表达系统，特点为加入诱导物i p t g 时蛋白高效表达，表达蛋白s o x 约占细胞总 蛋白的3 0 ；二克隆载体p b l u s c r i p tk s ( + ) i i 和最c o l id h5q 的表达系统， 特点为含蓝白斑筛选标记，阳性克隆子显白斑易于鉴定，不需要加诱导物i p t g 酶得到表达，表达量约为上述表达系统的一半，可用于之后的定向进化筛选实验。 2 肌氨酸氧化酶的纯化与酶性质的研究：大肠杆菌表达的肌氨酸氧化酶经带 n i i d a 柱一步纯化后，得到的纯酶经s d s - p a g e 电泳后表现为一条带，分子量为 5 1k d a ，酶的比活为2 8 6u m g 。重组s o x 与来源于b s d - 8 的酶性质基本相同。 该酶在p h 8 5 ，温度6 0 。c 时反应活性最高；其在6 0 c 以下，p h 7 0 - 1 0 0 范围内 可稳定存在；以肌氨酸为底物的l ( i i l 值为3 1 m m ，其转换常数k c a t 为2 4 s 。唯独 与黄素的结合方式不同，重组酶是以共价键与黄素结合，而b s d - 8 的s o x 是以非 共价键与黄素结合。 3 热稳定性肌氨酸氧化酶的定向进化：通过易错p c r 、定点突变相结合，建 博士论文 立了肌氨酸氧化酶的定向进化策略；微孔板结合表面活性剂破壁的酶活测定方法 可以有效的用于耐热肌氨酸氧化酶的筛选；对肌氨酸氧化酶进行定向进化和筛 选，获得了热稳定性显著提高的突变体，突变酶s o x m 2 有三个氨基酸被替换，热 稳定性比野生酶高5 ( 由6 0 提高到6 5 ) 。 4 肌酸水解酶基因的克隆、高效表达及酶性质的研究：利用反向p c r 的方法得到 b s d - 8 菌株肌酸水解酶的全序列，该基因的大小为1 2 3 6b p ，可编码4 1 1 个氨基 酸。成功构建了p e t 一2 8 a c r e 和b l 2 1 ( d e 3 ) 、p e t 一2 8 a c r e 和b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 两套表达系统，结果发现在宿主菌b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 表达的重组酶量较在菌株 b l 2 1 ( d e 3 ) 的高1 6 4 倍。在宿主菌b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 表达的肌酸水解酶经硫酸铵 沉淀、n i - i d a 柱纯化后，得到的纯酶经s d s - p a g e 电泳后表现为一条带，分子量 为5 4k d a ，酶比活为7 9 4 u m g 。 住 5 肌酐水解酶基因的克隆、测序：利用d n aw a l k i n g s p e e d u pp r e m i xk i ti i 试剂盒克隆到b s d - 8 菌株肌酐水解酶的全序列，该基因的大小为7 4 7b p ，可编 码2 4 8 个氨基酸。与g e n b a n k 中的肌酐水解酶基因的氨基酸序列同源性较低。 关键词：肌氨酸氧化酶、肌酸水解酶、肌酐水解酶、定向进化、热稳定性、芽孢 杆菌b s d 一8 2 博士论文 a b s t r a c t i nc l i n i c a ld i a g n o s i s ，t h ec o n c e n t r a t i o no fc r e a t i n i n ei ns e r u mi sa l li m p o r t a n t p a r a m e t e rf o rt h ee v a l u a t i o no fk i d n e yf u n c t i o n t h ee n z y m a t i cd e t e r m i n a t i o nm e t h o d h a sc h a r a c t e r i s t i co fh i g hs p e c i f i c i t ya n ds e n s i t i v i t y i np r e v i o u sw o r k ，ab a c i l l u ss p b s d - 8t h a tp r o d u c e dt h e r m o s t a b l es a r c o s i n eo x i d a s e ( s o x ) w a si s o l a t e di n0 1 1 1 l a b o r a t o r ya n dt h i se n z y m eh a db e e np u r i f i e da n ds y s t e m a t i c a l l ys t u d i e d i tw a s s h o w nt h a tt h ee n z y m eh a dar e l a t i v e l yh i g ht h e r m o s t a b i l i t ya n dm a yh a v ea d v a n t a g e i nc l i n i c a la p p l i c a t i o nf o rm e a s u r e m e n to fc r e a t i n i n e ，s oi ti sw o r t hm a d i n gt h o r o u g h s t u d y i na d d i t o n ，i tw a sf o u n dt h a tt h es t r a i nc o u l dg r o wu n d e rt h ec o n d i t i o no f c r e a t i n ea so n l yc a r b o ns o u r c e ，s ow eg u e s si tp r o b a b l yc o u l dp r o d u c ec r e a t i n i n a s e a n dc r e a t i n a s e i nt h i ss t u d y ，t h eb a c i l l u ss p b s d - 8s a r c o s i n eo x i d a s eg e n ew a s c o l o n e da n de x p r e s s i o n e d ；t h et h e r m o s t a b i l i t yo fs a r c o s i n eo x i d a s ew a se n c h a n c e d b y d i r e c t e de v o l u t i o na n ds c r e e n i n g 、析t hd e v e l o p e d h i g h - t h r o u g h p u ts c r e e n i n gm e t h o d ； t h eb a c i l l u ss p b s d - 8c r e a t i n a s eg e n ew a sc o l o n e da n de x p r e s s i o n e da n dt h ee n z y m e c h a r a c t e r i z a t i o nw e r ea l s od e s c r i b e d ；i na d d i t i o n ，t h eb a c i l l u ss p b s d 一8c r e a t i n i n a s e g e n ew a sc l o n e da n de x p r e s s i o n e d t h er e s u l t so ft h i se x p e r i m e n ta r es u m m a r i z e da s f o l l o w s 1c l o n i n g ，s e q u e n c i n ga n de x p r e s s i o no fs o x g e n ef r o mb a c i l l u ss p b s d 一8 ： t h ec o m p l e t es o xg e n ef r o mb s d - 8s t r a i nw a sc l o n e db yc h r o m o s o m ew a l k i n g m e t h o d t h eg e n ew a sc o m p o s e do f116 4b pt h a te n c o d e d38 7a m i n oa c i d s t h e a l i g n m e n tr e s u l to fa m i n oa c i d ss e q u e n c e so fs o xs h o w e dt h a tt h es o xg e n e s e q u e n c ef r o mb s d - 8s t r a i nh a dh i g hs i m i l a r i t yw i mt h o s ef r o mg e n b a n k t w o h i g h l ye f f e c t i v ee x p r e s s i o ns y s t e m sw e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d ：1h i g h l ye f f e c t i v e e x p r e s s i o nv e c t o rp e t - 15 b ( 一) a n db l 21 ( d e 3 ) e x p r e s s i o ns y s t e m t h ep r o t e i nw a s e f f e c t i v e l ye x p r e s s e d 、析mi n d u c e ri p t g ；t h ee x p r e s s e dp r o t e i ns o xc o m p r i s e d m o r et h a n3 0 o ft h et o t a lc e l lp r o t e i n ；2c l o n i n gv e c t o rp b l u s c 邱tk s ( + ) i ia n d e c o l id h 一5qe x p r e s s i o ns y s t e m t h ev e c t o rh a sb l u e w h i t eb l o t ，p o s i t i v ec l o n e s d i s p l a yw h i t es p o t sa n da r ee a s yt ob ei d e n t i f i e d s o xw a se x p r e s s e dw i t hn on e e dt o 博士论文 a d di n d u c e ri p t ga n dt h ee x p r e s s i o nl e v e lw a sa b o u th a l fo ft h a to fa b o v e ，w h i c h c o u l db eu s e df o rd i r e c t e de v o l u t i o ns c r e e n i n g 2p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i s t i c so fs o x ：t h ee x p r e s s e ds o xi nec o l iw a s p u r i f i e db yn i - i d ac o l u m n ，t h ep u r i t yo ft h ee n z y m ew a se x a m i n e db ys d s p a g e a n dac l e a rs i n g l eb a n dc o r r e s p o n d i n gt ot h e51k d ap r o t e i nw a so b s e r v e d t h e s p e c i f i ca c t i v i t yo fe n z y m ew a s2 8 6u m g t h ep u r i f i e dr e c o m b i n a n ts o xs h a r e d a l m o s ts i m i l a rp r o p e r t i e sw i t l lt h a tw i l dt y p es o x p r o t e i n ，t h eo p t i m u mp hf o rs o x w a s8 0a n dt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ew a s6 0 b e t w e e np h7 0 10 0t h es o xw a s s t a b l eb e l o w6 0 t h ek ma n dt h ek c a tv a l u eo fs o xf o rs a r c o s i n ew e r e3 1m ma n d 2 4 s ，r e s p e c t i v e l y h o w e v e r , t h e yw e r ed i f f e r e n ti nf i a v i nb i n d i n gm o d e ：r e c o m b i n a n t s o xp r e s u m a b l yc o n t a i n e dc o v a l e n t l yb o u n df l a v i na n ds o xf r o mb s d 一8c o n t a i n e d n o n c o v a l e n t l yb o u n df l a v i n 3d i r e c t e de v o l u t i o no ft h e r m o s t a b l es a r c o s i n eo x i d a s e ：i no r d e rt oi m p r o v e t h et h e r m o s t a b i l i t yo fs a r c o s i n eo x i d a s e ，d i r e c t e de v o l u t i o nm e t h o dw a su s e d n l c e v o l u t i o ns t r a t e g yi n v o l v e se r r o r - p r o n ep c ra n ds i t e - d i r e c t e dm u t a t i o n t h ee n z y m e a c t i v i t yw a sd e t e r m i n e db ym i c r o p l a t ew i t hw a l l - b r e a k i n go fs u r f a c t a n t ，w h i c hc o u l d e f f e c t i v e l yb eu s e df o rs c r e e nt h e r m o s t a b l es a r c o s i n eo x i d a s e t h r o u g hm u t a t i o na n d s c r e e n i n g ，t h em u t a n ts o x m 2h a dt h r e ea m i n oa c i ds u b s t i t u t i o n s ，t h e s es u b s t i t u t i o n s r e s u l t e di na ni n c r e a s eo ft h e r m o s t a b i l i t yb y5 。c ( f r o m6 0 ci n c r e a s et o6 5 c ) 4e x p r e s s i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fc r e a t i n a s ef r o mb a c i l l u ss p b s d 一8i n e s c h e r i c h i ac o l i t h ec o m p l e t ec r e a t i n a s eg e n ef r o mb s d - 8s t r a i nw a sc l o n e db y c h r o m o s o m ew a l k i n gm e t h o d t h eg e n ew a sc o m p o s e do f1 2 3 6b pt h a te n c o d e d4 11 a m i n oa c i d s t w oh i g h l ye f f e c t i v ee x p r e s s i o ns y s t e m sw e r es u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d ： p e t - 2 8 a - c r ea n db l 21 ( d e 3 ) ，p e t - 2 8 a - c r ea n db l 21 ( d e 3 ) p l y s s r e s u l ts h o w e d t h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e li nb l 2 1 ( d e 3 ) p l y s sw a s1 4 6 t i m e sm o r et h a ni n b l 21 ( d e 3 ) t h ee x p r e s s e dc r e a t i n a s ei nb l 2 1 ( d e 3 ) p l y s sw a sp u r i f i e db y a m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o na n dn i - i d ac o l u m n t h ep u r i t yo ft h ee n z y m ew a s e x a m i n e db ys d s - p a g ea n dac l e a rs i n g l eb a n dc o r r e s p o n d i n gt ot h e5 4k d a p r o t e i n w a so b s e r v e d 1 1 1 es p e c i f i ca c t i v i t y o fe n z y m ew a s7 9 4u m g 4 博士论文 5c l o n i n ga n ds e q u e n c i n go fc r e a t i n i n a s eg e n ef r o mb a c i l l u ss p b s d 一8 ：t h e c o m p l e t ec r e a t i n i n a s eg e n ef r o mb s d 一8s t r a i n w a sc l o n e d b yd n aw a l k i n g t m s p e e d u p p r e m i xk i ti i t h eg e n ew a sc o m p o s e do f7 4 7b pt h a te n c o d e d2 4 8a m i n o a c i d s 功ea l i g n m e n tr e s u l to fa m i n oa c i d ss e q u e n c e so fc r e a t i n i n a s es h o w e dt h a tt h e c r e a t i n i n a s eg e n es e q u e n c ef r o mb s d 一8s t r a i nh a dr e l a t i v e l yl o ws i m i l a r i t y 、析mt h o s e f r o mg e n e b a n k k e y w o r d s ：s a r c o s i n e o x i d a s e ，c r e a t i n a s e ，c r e a t i n i n a s e ，d i r e c t e de v o l u t i o n ， t h e r m o s t a b i l i t y , b a c i l l u ss p b s d 一8 5 博士论文 前言 人类的肌肉和大脑消耗的能量主要来自于磷酸肌酸的水解。磷酸肌酸与a d p 在酶的作用下可形成a t p ，同时生成肌酸，所形成的肌酸在体内最终将被转化成 肌酐。此外，磷酸肌酸也会在体内直接脱去磷酸生成肌酐。因此，肌酐是人体代 谢的一种重要产物，为了维持肌酐在血液中有较低的水平，肌酐主要是由机体通 过肾脏的过滤从血液进入尿液而排出体外，健康肾脏的这一功能可保证将代谢过 程中形成的肌酐不断地排出体外。而使血液中的肌酐始终保持在一个较低的水 平。如果肾脏发生病变，将不能有效地清除所形成的肌酐，而造成肌酐在血液中 积累。血清中肌酐含量的正常范围在3 5 - 1 5 0um ( t i e t z1 9 8 6 ) ，肌酐浓度 5 3 0um 表明肾脏严重损伤。在肾脏功能或肌肉功能出现问题时，肌酐的含量会上升到 i 0 0 0i im ( k h aa n dw o l f g a n gw e r n e t1 9 9 7 ) ，( e u nj uk i m ，t e s r y ah a r u y a m ae t a 1 1 9 9 9 ) ，( d a r r e ng ，b u r k ee ta 1 1 9 9 9 ) 。因此血液和尿液的肌酐含量可反 映肾脏的排泄功能，在临床测定中，血清中的肌酐浓度是一项判断肾功能的重要 指标。 1 肌酐检测方法 目前肌酐的测定方法主要有化学方法、酶促方法以及建立在酶促反应基础 上的电气化学方法。 1 i 化学方法 肌酐浓度的化学检测方法主要是建立在j a f f 6 反应的基础上( j a f f 6 m1 8 8 6 ： f o l i n 01 9 0 4 ) ，反应中肌酐的亚甲基与苦味酸在碱性条件下反应产生红色的复 合物。这种测定方法专一性不强、敏感性差，直接测定受样品中蛋白质沉淀的 影响，需要对样品进行预处理，且很难排除其中许多物质的干扰( c o o k1 9 7 5 ； s w a i na n db r i g g s1 9 7 7 ：d a u g h e r t y ，h a m m o n de ta 1 1 9 7 8 ：s o l d i n ，h e n d e r s o n e ta 1 1 9 7 8 ：n a r a y a n a na n da p p l e t o n1 9 8 0 ) 。其中的干扰物有人体的代谢产 物和治疗用的药物( 如肌酐的同系物和衍生物，以及丙酮、葡萄糖、丙酮酸、 抗坏血酸、脂类、胆红素等) 。因为这些干扰物亦能与碱性苦味酸盐生成红色物 6 博士论文 质，又称它们为假肌酐。它们的存在会对测定产生或正或负的影响。在, s j l 的 恶性肿瘤疾病中，肌酐的含量很低，受干扰的程度相对更大。 之后一些研究者对j a f f 6 反应进行了改进，如用l l o y d s 试剂( e d w a r da n d w h y t e1 9 5 8 ：h a e c k e l1 9 8 1 ) 对样品进行预处理。l l o y d s 试剂虽然可以特异地 吸附样品中的肌酐对样品进行部分纯化，然而样品中的酮类化合物、吲哚、胍 基乙酸内酰胺、类固醇及色素也被吸附，从而造成干扰。t a u s s k y ( t a u s s k yh h 1 9 6 5 ) 提出了用碘氧化一乙醚抽提处理样品的方法，该方法可以降低丙酮、乙 酰乙酸、果糖、葡萄糖这些物质对测定的干扰，但s l o t ( s l o t1 9 6 5 ) 对这种方法 的特异性及优点提出质疑。还有一些研究者( p o l a rea n dm e t c o f f1 9 6 5 ： r o c k e r b i ea n dr a s m u s s e n1 9 6 7 ：m i t c h e l l1 9 7 3 ) 用阳离子交换树脂来分离肌 酐及其它干扰物，这种方法在肌酐的正常范围值内测定灵敏度还比较满意，但 在测定较高浓度的肌酐时，灵敏度变差( g r a f f n e t t e r ，j a n o s o v ae ta 1 1 9 6 7 ) ， 该方法的缺点是回收率比较低。研究者( l i me ta 1 ，1 9 7 8 ：j o h n se ta 1 2 0 0 1 ) ( l i m ，r i c h m o n de ta 1 1 9 7 8 ：j o h n s ，b r o t e ne ta 1 2 0 0 1 ) 还尝试用高效液 相色谱法和毛细管电泳( b u r k e ，m a c l e a ne ta 1 1 9 9 9 ) 来分离样品中的肌酐。 总之，对j a f f 6 测定法的改良虽然在某种程度上可以克服样品中假肌酐的 干扰，但综上所述所作的修改都比较繁琐、费时且特异性与灵敏度也比较差， 在实际临床测定中有一定难度。 1 2 酶促方法 微生物可通过产生不同的酶系将肌酐降解成各种代谢产物，目前已经报道 的微生物降解肌酐的途径主要有三种：经由肌酸、肌氨酸、甘氨酸的降解途径、 经由甲基胍、乙酸的降解途径以及经由甲基乙内酰脲、n h 。+ 的降解途径。对于不 同的微生物来说，可能通过某一种或几种代谢途径来降解肌酐。s h i m i z u 等 ( s h i m i z u ，k i me ta 1 1 9 8 6 ) 报道了分离到的几株假单胞菌以不同的途径降解肌 酐，p s e u d o m o n a sp u t y d a 形只通过甲基乙内酰脲途径快速降解肌酐，而 p s e u d o m o n a ss p h 2 1 可通过肌酸和甲基乙内酰脲两种途径降解肌酐， p s e u d o m o n a ss p 0 1 1 4 则主要通过肌酸降解途径，但也可以通过甲基乙内酰脲 途径降解肌酐。酶促方法的根本原理就是用微生物所产生的不同的酶系将肌酐降 解，通过测定其降解产物而确定肌酐的浓度。 7 博士论文 1 2 1 肌酐转化为甲基乙内酰脲和n h 4 + 的酶促方法 此法是用肌酐亚氨基脱水酶( c r e a t i n i n ei m i n o h y d r o l a s eo rc r e a t i n i n e d e i m i n a s ee c3 5 4 2 1 ) 将肌酐转化为甲基乙内酰脲和n h 4 + ，n h 4 + 和酮戊二酸在 谷氨酸脱氢酶( g l u t a m a t ed e h y d r o l a s ee c1 4 1 3 ) 的作用下生成l 一谷氨酸， 伴随着催化n a d p h 成n a d p + 。测定过程中通过测定n a d p + 的含量可确定样品中肌酐 的含量( t a n g a n e l l ie ，p r e n c i p ele ta 1 1 9 8 2 ：t o f f a l e t t ij ，b l o s s e rne t a 1 1 9 8 3 ：t h o m p s o nha n dr e c h n i t zg a1 9 7 4 ) 。这种酶促反应体系由肌酐亚氨 基脱水酶和谷氨酸脱氢酶组成，其原理是： 肌酐+ h 。o 竺竺垩苎苎竺查竺甲基乙内酰脲+ n h 4 + n h 。+ + 酮戊二酸竺苎竺苎竺l 一谷氨酸+ h 。o n a d p h 八二a d p + 此测定方法受样品中内源性n h 4 + 的干扰，样品要经过预处理来降低n h 4 + 的 含量，因而这种方法的推广受到限制( g o r e n ，o s b o r n ee ta 1 1 9 8 6 ) 。 1 2 2 肌酐转化为肌酸一以n a d h 为指示剂的酶促方法 此法是当存在磷酸烯醇式丙酮酸盐、a t p 及n a d h 时将肌酐降解为肌酸的过 程中可相继产生丙酮酸、乳酸和n a d + ，通过测定n a d + 的量来确定样品中肌酐的含 量。由以下几个酶组成：肌酐水解酶( c r e a t i n i n ea m i d o h y d r o l a s eo r c r e a t i n i n a s ee c3 5 2 1 0 ) 、肌酸激酶( c r e a t i n a s ee c2 7 3 2 ) 、丙酮酸激 酶( p y r u v a t ek i n a s ee c2 7 1 4 0 ) 、乳酸激酶( 1 a c t a t ek i n a s ee c1 1 1 2 7 ) ( m o s s ，b o n d e re ta 1 1 9 7 5 ：y a n g ，e w e ne ta 1 1 9 7 9 ：3 a y n e s ，f e i de ta 1 1 9 8 2 ；p e r a k i sa n dw o l f f1 9 8 4 ) 。其原理如下： 肌酐+ h 。o 竺! 查竺今 肌酸 肌酸+ a t p ! ! 竺竺笃磷酸肌酸+ a d p a d p + 磷酸烯醇式丙酮酸盐要竺竺竺竺丙酮酸+ a t p 丙酮酸+ n a d h + h +兰竺兰竺羹l 酸+ n a d + 此法提高了测定的特异性，克服了许多化学物质的干扰，不足之处是灵敏 度不高，且试剂不稳定( g o r e n ，o s b o r n ee ta 1 1 9 8 6 ) 。 8 博士论文 1 2 3 降解肌酐为肌酸、肌氨酸、甘氨酸的酶促方法 此法是通过肌酐水解酶( c r e a t i n i n ea m i d o h y d r o l a s eo rc r e a t i n i n a s ee c 3 5 2 1 0 ，简称c r n ) 、肌酸水解酶( c r e a t i n ea m i d i n o h y d r o l a s eo rc r e a t i n a s e e c3 5 3 3 ，简称c r e ) 、肌氨酸氧化酶( s a r c o s i n eo x i d a s ee c1 5 3 1 ，简 称s o x ) 或肌氨酸脱氢酶( s a r c o s i n ed e h y d r o g e n a s ee c1 5 9 9 ) 降解肌酐， 测定其代谢产物h ：o 。或甲醛的酶法测定系统。其原理是： 肌酐+ h z 0 竺竺查竺竺肌酸 肌酸+ h 。o ! ! 竺查竺竺尿素+ 肌氨酸 肌氨酸+ h 。0 + 0 2 吧竺竺兰兰竺竺苎竺蚶氨酸+ 甲醛+ h 2 0 2 此法具有酶反应的专一性强和灵敏度高等特点( s i e d e le ta 1 1 9 8 4 ) ，已 将酶促反应中的各种酶制成试剂盒并商品化。 1 3 电气化学方法 这种测定方法是建立在肌酐酶促催化反应基础上的，通过检测电位和电流的 变化来确定样品中肌酐的含量。其中比较有价值的是电流计生物传感器法，该法 是将肌酐水解酶、肌酸水解酶、肌氨酸氧化酶吸附在电极的醋酸纤维素薄膜上， 用电流计检测产生的h 。0 ：或消耗的0 。的量( t s u c h i d ae ta 1 1 9 8 3 ) 。以此为基 础，许多研究者改进了这种测定方法，把肌酐降解酶系的三种酶通过不同的方法 固定在电极上。m a d a r a s 等( m a r a d a s ，p o p e s c ue ta 1 1 9 9 6 ) 用戊二醛把肌酐降 解酶系交叉结合；k h a n 等( k h aa n dw o l f g a n gw e r n e t1 9 9 7 ) 将肌酐降解酶系吸 附在铂黑电极上；k i m 等( k i m ，h a r u y a m ae ta 1 1 9 9 9 ) 介绍了通过聚乙二醇将 酶吸附在碳电极上制成可携带的肌酐传感器；还可以用电聚合的方法把酶固定在 聚吡咯膜上( y a m a m o t o ，o k ae ta 1 1 9 9 5 ) 或亲水的聚氨基甲酸酯上( s c h n e i d e r ， g m n d i ge ta 1 1 9 9 6 ) 。这些系统操作稳定性好，且保存期较长。德国成功建立 了第一个商业化电流计肌酐测定装置一n o v ab i o m e d i c a l ，r o d e r m a r k ( k i l l a r d a n ds m y t h2 0 0 0 ) 。 肌酐的测定方法从一开始建立的j a f f 6 反应体系，到目前为止已提出了多种 测定方法。化学测定法由于其固有的缺陷，正在被发展起来的酶促方法所代替。 而在各种酶促肌酐测定方法中，以肌酐水解酶、肌酸水解酶、肌氨酸氧化酶酶促 9 博士论文 催化反应为基础的测定方法日渐成熟并得到广泛使用。 2 肌酐水解酶的研究概况 2 1 产肌酐水解酶的微生物 已经报道了有多种微生物可以降解肌酐并产生肌酐水解酶。最早发现产肌酐 水解酶的微生物是产脲节杆菌( a t t h r o b a o t e ru r e a f a c i e n s ) ( k a p l a na n ds z a b o 1 9 7 4 ) ，后来恶臭假单胞菌奈良氏变种c - 8 3 ( p s e u d o m o n a sp u t i d av a r n a r a e n s i sc - 8 3 ) ( t s u r u ，0 k ae ta 1 1 9 7 6 ) 、黄杆菌u - 1 8 8 ( f l a v o b a c t e r i u m u 一1 8 8 ) ( s u z u k ia n ds a i t o1 9 7 8 ) 、产碱菌( a l c a l i g e n e ss p n o v ) ( i n o u y e ， m a t s u d ae ta 1 1 9 8 6 ) 相继被发现产生肌酐水解酶。它们都可以降解肌酐并产 生肌酐水解酶系。肌酐在微生物中的降解途径及降解途径中的酶如图1 - 1 所示 ( m o n i k ah e r m a n m ，h a n s j u r g e n k n e r re ta 1 1 9 9 2 ) 。 l o n - 图1 - 1 微生物肌酐降解途径 肌酐水解酶肌酸水解酶 肌氨酸氧化酶或肌氨酸脱氢酶肌酐亚氨基水解酶 n _ 甲基乙内酰脲水解酶氨甲酰基肌氨酸水解酶 ( 没有详细资料)甲基 胍水解酶甘氨酸还原酶肌氨酸还原酶 f i g1 - 1d e g r a d a t i o np a t h w a yo fc r e a t i n ei nm i c r o b i o l o g y 2 2 肌酐水解酶的酶学性质 k a p l a n 等( k a p l a na n ds z a b o1 9 7 4 ) 发现产脲节杆菌能以肌酐或肌酸为唯 一碳源，并能诱导产生肌酐水解酶和肌酸水解酶。经纯化肌酐水解酶提纯了1 1 0 多倍。用s e p h a d e xg - 2 0 0 凝胶过滤测得提纯的肌酐水解酶分子量大约为2 4 0 k d a 。酶作用的最适p h 为8 3 ，对肌酐的l ( i i l 值为1 2 5 m m 。l m mc u s 0 4 和0 1m mh g c l 。 博士论文 能完全抑制肌酐水解酶的活性，e d t a 和巯基化合物则部分抑制酶的活性。 t s u r u 等( t s u r u ，o k ae ta 1 1 9 7 6 ) 研究了恶臭假单胞菌奈良氏变种c - 8 3 ， 发现该菌株可以产生肌酐降解酶系。肌酐、肌酸、肌氨酸、二甲基甘氨酸、甜菜 碱可以促进肌酐水解酶的产生，而葡萄糖则抑制酶的产生。经纯化肌酐水解酶提 纯了4 4 4 倍，酶蛋白在圆盘凝胶电泳显示为一条带。酶的等电点为4 7 ，酶反应 的最适p h 为7 9 ，酶在p h6 1 2 、7 0 。c 以下稳定。l m m 的n 一溴代丁二酰亚胺、h 9 2 + 、 f e 3 + 、c u 2 + 和l o m m 的乙氧基甲酸酐对酶活性有强烈抑制作用，邻菲哕啉可以部分 抑制酶活性。没有活性的脱金属酶可以在添加m n 2 + 、c 0 2 + 、m 9 2 + 、f e 2 + 、n i 2 + 、z n 2 + 的情况下被激活，表明肌酐水解酶需要金属离子维持酶的活性。酶对肌酐和肌酸 的i ( i i l 值分别为2 6 m m 和1 3 0 m m 。通过超速离心分析，酶的分子量为1 7 5k d a ；s d s - 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s - p a g e ) 测得酶亚基的分子量为2 3kd a ，表明酶由8 个相同的亚基组成。 s u z u k i 等( s u z u k ia n ds a i t o1 9 7 8 ) 分离到一株产肌酐水解酶的黄杆菌 u 一1 8 8 ( f l a v o b a c t e r i u m u - 1 8 8 ) ，提纯后对其酶性质进行了研究。s e p h a d e xg 一2 0 0 凝胶过滤测得酶的分子量为1 5 0k d a 。酶的最适反应p h 为6 5 ，最适反应温度为 4 5 。c ，在p h 7 0 - 9 5 之间稳定，酶在6 7 处理l o m i n 丧失活性。对氯高汞苯甲 酸( p c m b ) 和重金属离子对酶活性有强烈抑制作用。酶对肌酐和肌酸的i ( 1 1 1 分别 为3 4 5 和4 3 5 m m 。 i n