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广西北部林地腐霉资源调查与腐霉的分子鉴定研究 摘要 2 0 0 7 年3 月2 0 0 8 年1 1 月，到广西北部的兴安、永福、罗城、金城江区、乐业、 田林、三江、融水等县不同林地共采集1 3 0 份土壤标样，在实验室分离得腐霉菌株 2 6 0 株，初步探明广西北部林地腐霉的种类有1 7 种，分别为棘腐霉、刺腐霉、昆明 腐霉、孤雌腐霉、瓜果腐霉、缺性腐霉、南宁腐霉、浮游腐霉、乳突腐霉、刺器腐霉、 终极腐霉、逸见腐霉、德里腐霉、间型腐霉、钟器腐霉、镰雄腐霉、宽雄腐霉。其中 棘腐霉和刺腐霉出现的频率最高，分布最广，为优势种；其次是缺性腐霉，瓜果腐霉 和昆明腐霉，以上5 种为主要种群。 在广西北部的各个样区中，以罗城的腐霉种类最多，分离得1 3 种；其次是金城 江和乐业，均为9 种，以田林的腐霉种类最少，仅分离到3 种。从不同林分土壤分离 到的腐霉种数不同，在针叶林、阔叶林地中各分离到9 种腐霉，桉树林地分离到8 种腐霉，竹林样土中培养出的腐霉的种类最少仅为4 种。不同林分类型的腐霉的分离 率也有差别，针叶林林区的腐霉分离率较高，达到3 4 2 5 ，桉树林林区的腐霉分离 率也有3 1 2 5 ；而阔叶林林区的腐霉分离率只有2 7 5 ；竹林区的腐霉分离率较低， 仅为2 6 。林地表土层( 0 - 1 0 锄) 的分离率为较高。在1 0 1 21 0 0m 各个海拔之间 不同海拔林地的腐霉的分离率相差不大，以1 0 1 , - - 一3 0 0 m 海拔的标样分离率略高，分 离率达到3 5 。 以3 3 个腐霉的r d n ai t s 为基础，以一种海生疫霉和两种疫霉为外群，按邻接法 构建系统发育树，对腐霉属中代表各种形态性状菌株与d n a 序列之间的关系进行了 分析。分子系统树的结构表明，孢子囊为球形或者亚球形的腐霉构成第一集团，孢子 囊为丝状或裂片状者构成第三集团，中间形成第二集团，属于过渡集团，其特征是两 种特征的混合，包含两种形态类型的混合群体，包含孢子囊为球形或者亚球形的，也 有孢子囊是丝状或者裂片状的，藏卵器壁光滑与不光滑两种类型皆有。第三集团内部 还可以区分为卵孢子满器和不满器两个组群。分子系统树体现腐霉孢子囊的形态特征 由球形或亚球形逐步过渡到丝状或裂片状，是腐霉分类的第一重要特征，卵孢子满器 或不满器成为第二重要特征。藏卵器表面都是光滑与有突起的在以i t s 建立的系统树 中尚不能区分成不同的组群。 通过建立分子系统发育树，可以看出自测的4 个菌株序列与g e n b a n k 上的权威 菌株聚集在一起，具有很高的同源性，表明通过建立分子系统发育树，将有可能成为 腐霉分子鉴定的重要手段。 关键词：腐霉；资源；分类；分子鉴定 a n i n v e s t i g a t i o no np y t h i u m r e s o u r c e so ff o r e s tl a n di n n o r t h e r ng u a n g x ia n dm o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o no f h u a n g w e i h u a ( c o l l e g eo f a g r i c u l t u r e ，g u a n g x iu n i v e r s i t y , n a n n i n g5 3 0 0 0 4 ，c h i n a ) a b s t r a c t f r o mm a r c h2 0 0 7t on o v e m b e r2 0 0 8 ，as u r v e yo np y t h i u mr e s o u r c e so ff o r e s tl a n d h a sb e e nc a r r i e do u ti nn o r t h e r ng u a n g x i ，c o v e r i n g8c o u n t i e si n c l u d i n gx i n g a l l ，y o n g f u ， l u o c h e n g ，j i n c h e n g j i a n g ，l e y e ，t i a n l i n ，s a n j i a n g ，r o n g s h u ia n ds oo n at o t a l2 6 0 p y t h i u ms t a i n sw e r ei s o l a t e df r o m1 3 0s o i ls a m p l e sc o l l e c t e df r o md i f f e r e n tf o r e s tl a n d s s e v e n t e e ns p e c i e sw e r ei d e n t i f i e dp r e l i m i n a r i l y , w h i c hw e r epa c a n t h i c u m ，ps p i n o s u m ，p k u n m i n g e n s e ，pa m a s c u l i n u m ，pa p h a n i d e r m a t u m ，pe l o n g a t u m ，pn a n n i n g g e n s e ，p a q u a t i l e ，pm a m i l l a t u m ，pa c a n t h o p h o r o n ，pu l t i m u m ，只h e m m i a n u m ，pd e l i e n s e ，p i n t e r m e d i u m ，py e x a n s ，pf a l c i f o r m e ，a n d 户d i s s o t o c u m a m o n gt h e m ，pa c a n t h i c ua n dp s p i n o s u md i s t r i b u t e du n i v e r s a l l yw e r ed o m i n a n ts p e c i e s 、 ，i t ht h eh i g h e s ti s o l a t i o nr a t e t h e i s o l a t i o nr a t e so fpe l o n g a t u m ，pa p h a n i d e r m a t u ma n d 只k u n m i n g e n s ew e r em o d e r a t e l y h i g h t h ef i v es p e c i e sa b o v ew e r em a i np y t h i u ms p e c i e so ff o r e s tl a n di nn o r t h e r n g u a n g x i a m o n g8s u r v e y e dc o u n t i e s ，t h eq u a n t i t yo fp y t h i u ms p e c i e si s o l a t e df r o ml u o c h e n g c o u n t yw a st h i r t e e n ，w h i c hw a st h em o s t ；t h eq u a n t i t i e so fp y t h i u ms p e c i e sr e s p e c t i v e l y i s o l a t e df r o mj i n c h e n g j i a n gr e g i o na n dl e y ec o u n t yw e r en i n e ，w h i c hw e r er e l a t i v e l y h i 曲a n dt h eq u a n t i t yo fp y t h i u ms p e c i e si s o l a t e df r o mt i a n l i nc o u n t yw a st h r e e ，w h i c h w a st h el e a s t t h ea m o u n to fp y t h i u ms p e c i e si s o l a t e df r o md i f f e r e n tf o r e s tl a n d sw e r e d i f f e r e n c e ，a m o n gw h i c hn i n ep y t h i u ms p e c i e sw e r ei s o l a t e dr e s p e c t i v e l yf r o mc o n i f e r o u s f o r e s tl a n da n db r o a d l e a v e df o r e s tl a n d ，e i g h tp y t h i u ms p e c i e sw e r ei s o l a t e df r o m c o n i f e r o u sf o r e s tl a n da n d f o u rp y t h i u ms p e c i e sw e r ei s o l a t e df r o mb a m b o ol a n d t h e i s o l a t i o nr a t e so fp y t h i u mi nd i f f e r e n ts t a n d i n gf o r e s t sc l u s t e r sw e r ed i f f e r e n c e ，a m o n g i l i w h i c ht h ei s o l a t i o nr a t ei nc o n i f e r o u ss t a n dw a s3 4 2 5 t h a tw a sr e l a t i v e l yh i g h , t h e i s o l a t i o nr a t e si ne u c a l y p t u ss t a n da n db r o a d l e a v e ds t a n dr e s p e c t i v e l yw e r e31 2 5 a n d 2 7 5 ，a n dt h ei s o l a t i o nr a t e si nb a m b o os t a n dw a s2 6 t h a tw a sr e l a t i v e l yl o w t h e i s o l a t i o nr a t eo fp y t h i u mi no 一10 c ms o i ld e p t ho ff o r e s tl a n dw a sh i g h e rt h a ni nm o r et h a n 10 c ms o i ld e p t h t h ei s o l a t i o nr a t e so fp y t h i u ma tt h ed i f f e r e n ta l t i t u d ew e r en oo b v i o u s d i f e r e n c eb u tt h ei s o l a t i o nr a t e sa t101 3 0 0 ma l t i t u d ew a s3 5 t h a tw a sr e l a t i v eh i g h e r t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nd n as e q u e n c e sa n dm o r p h o l o l o g i c a lc h a r a c t e r sw a s a n a l y z e da f t e ran e i g h b o r - j o i n i n gp h y l o g e n e t i ct r e ew a sc o n s t r u c t e dw i t h3 3r d n a i t s s e q u e n c e so fp y t h i u ms p e c i e si n c l u d i n gr e p r e s e n t i v em o r p h o l o l o g i c a l c h a r a c t e r sa n d r o o t e d 、i mh a l o p h y t o p h t h o r ab a t e m a n e n s i sa n dt w os p e c i e so fp h y t o p h t h o r aa sa n o u t g r o u p t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es t r a i n sw i t hs p h a e r i a lo rs u b s p h a e r i a lz o o s p o r a n g i u m c o m p o s e do ft h e f k s tg r o u p ，t h es t r a i n s 、析也f i l a m e n t o u so ri n f l a t e dz o o s p o r a n g i a c o m p o s e do ft h e t h i r dg r o u pa n dap a r to fm i x i n gs t r a i n si n c l u d i n gt h e s t r a i n sw i t l l f i l a m e n t o u so ri n f l a t e d z o o s p o r a n g i a a n ds t r a i n sw i t h s p h a e r i a l o r s u b s p h a e r i a l z o o s p o r a n g i ac o m p o s e do ft h es e c o n dg r o u pt h a tw a sa ni n t e r i mg r o u p t h et h i r dg r o u p c o u l df u r t h e rb ed i v i d e di n t ot w os u b g r o u pi n c l u d i n ga p l e r o t i co o s p o r eo rp l e r o t i co o s p o r e m o l e c u l a rp h y l o g e n e f i c a lt r e es h o w e dm o r p h o l o l o g i c a lc h a r a c t e ro fz o o s p o r a n g i aw a st h e f i r s t l yi m p o r t a n tc h a r a c t e ro nt a x o n o m yo fp y t h i u ma n da p l e r o t i co o s p o r eo rp l e r o t i e o o s p o r ew a st h es e c o n d l yi m p o r t a n tc h a r a c t e r t h es t r a i n s 、加ms m o o t ho o g o n i aa n dt h e s t r a i n s 、 ，i t l lo r n a m e n t e do o g o n i au s u a l l ym i x e da n dc o u l dn o tb ed i v i d e di n t oas i n g l e s e c t i o nb a s e do nt h em o l e c u l a rp h y l o g e n e t i c a lt r e eg e n e r a t e dw i mr d n ai t ss e q u e n c e s t h es e q u e n c e so ff o u rp y t h i u ms t r a i n st h a tw e r es e q u e n c e di nt h i st e s tc l u s t e r e d t o g e t h e ra n dw e r eh i g hh o m o g e n e t i c 、析mt h e a u t h o r i t a t i v e s e q u e n c e sl o a d e df r o m g e n b a n kb a s e do nm o l e c u l a rp h y l o g e n e f i c a lt r e eg e n e r a t e dw i 也r d n ai t ss e q u e n c e s i t m e a n tt h a tc o n s t r u c t i n gam o l e c u l a rp h y l o g e n e t i c a lt r e ew i l lb ea ni m p o r t a n ta n de f f e c t i v e m e t h o do nm o l e c u l a r l yi d e n t i f y i n ga nu n k n o w np y t h i u ms t r a i n k e yw o r d s ：p y t h i u m ；r e s o u r c e ；c l a s s i f i c a t i o n ；m o l e c u l a ri d e n t i f i c a t i o n i v 承诺书 广西大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下完成的，研究工作所取 得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已 经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究 工作提供过重要帮助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。本人完全意识到 本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：j 鬈诲日期：2 。 年舌月1 ) 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不 以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论 文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索 与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢 利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 本学位论文属于： 口保密，在年解密后适用本授权书。 囤不保密。 学位论文全文电子版提交后： 囵同意在校园网上发布，供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览。 作者签名： 导师签名： 日期：竺罩：笸：兰呈 日期：兰驾：垒：三星 广西大掌硕士掌位论文广西j 匕部林地腐霉资源调查与霸霉的分子鉴定研究 1 前言 腐霉是世界性分布的一类菌物，它广泛分布于土壤和水中，多数腐霉在各种土壤 和水生环境中营腐生生活，少数腐霉是寄生菌，它们引起一些重要的植物病害( 种腐、 根腐、果腐、苗期猝倒和蔬菜贮藏期的腐烂等病害) 、动物病害( 如鱼、虾的病原菌、 哺乳动物的病原菌，能引起人类的疾病) ( p l a a t s - n i t e r i n k 1 9 8 1 ) 。除此之外，有些 腐霉还能诱导植物产生系统抗性；有些腐霉具有拮抗与生防作用，如寡雄腐霉等对其 它土壤病原真菌( 包括腐霉) 具有拮抗与生防作用，还有些腐霉是蚊子幼虫上的寄生 菌。在工业和医药方面，腐霉也有其独到的作用，有些腐霉能合成生物素、叶酸、泛 酸、核黄素和抗坏血酸等，有些可分泌果胶酶、纤维素酶等，对医药制造业具有重要 的作用( s a u n d e r s ，1 9 8 8 ) 。腐霉是研究生物由腐生到寄生、由水生到陆生的演化材 料，也是生物学基础理论研究的理想材料，因而受到生物学家，特别是生物系统学家 和菌物学家的瞩目，因此腐霉在理论和实践上都拥有十分重要的地位。 腐霉属( p y t h i u mp r i n g s h e i m ) 是假菌界哐i i l g d o mc h r o m i s t a ) 、卵菌f - ( o o m y c o t a ) 、 卵菌纲( o o m y c e t e s ) 、腐霉目( p y t h i a l e s ) 腐霉科( p y t h i a c e a e ) 的一个成员( k i n k 2 0 0 1 ) 。从 1 8 5 8 年p r i n g s h e i m 建立腐霉属至今，腐霉属已经记载有2 7 5 个种名，其中绝大部分 种是根据形态特征来鉴定的。对腐霉属的分类曾先后出现过6 个分类体系，比较有代 表性的分类体系有如h e n d r i x 和p a p a ( 1 9 7 4 ) 把腐霉区分为1 5 群6 6 个种，而 p l a a t s - n i t e r i n k ( 1 9 8 1 ) 的腐霉专著包含8 7 个种，d i c k ( 1 9 9 0 ) 将腐霉分成1 3 8 种【包 含6 个变种，5 个种群( g r o u p ) 】，其中产生有性态的腐霉区分1 2 4 种，不产生有性 态的腐霉区分9 种和5 个种群。纵观这六个腐霉分类体系，各个分类体系所采用的第 一级、第二级和第三级分类特征各不相同，分种的个数也不一样，可见，以传统的形 态学为依据对腐霉的分类存在许多分歧。 形态学分类难以充分反映出系统的演化关系。长期以来，腐霉属的传统分类主要 是依靠形态特征来界定的，缺乏系统发育关系的研究，建立的分类系统包含过多的主 观因素( 如卵孢子满器和不满器) ，对于属内部分种名的认同和界定，不同学者持有 不同的观点，而同一个菌株采用不同的分类系统鉴定，鉴定的结果也有差别，只以细 微的差别而鉴定为不同的种类，导致大量异名出现，其分类现状处于不稳定的局面。 种名的混乱和错误鉴定制约了研究成果的相互间准确交流及对这类菌物的研究和开 发。以形态特征为依据的传统菌物分类，从肉眼的观察结果很难判断菌物种类之间的 广西大学硕士学位论文 广西北部林地腐霉资源调查与腐霉的分子鉴定研究 亲缘关系，往往作为表型的菌物形态复杂多变，某些性状很容易受环境条件和营养基 质的影响而出现较大的变化，往往难以判断这些变化特征的相互联系，形态及发育的 特征已证明难以用来界定种并反映其系统发育关系。 人类无法看到过去几千万年来生物的进化和演变的过程，某些化石虽然有助于人 们对过去漫长进化过程的推断，但能提供进化过程分析的化石是很有限的，生物体内 的大量分子物质却贮存着生物进化过程的信息，它是生物长期演变的重要证据。分子 系统学就是通过对生物分子的分析探讨生物进化的历程及不同分类阶元之间的相互 关系。 分子系统学是检测、描述并解释生物在分子水平上的多样性及其演化规律的科 学。分子系统学研究是通过现代分子生物学技术获得物种特定遗传标记的大量数据， 然后对这些数据进行相关的数学分析进而推断分类单元的起源及它们的进化关系。这 些直接反映生物遗传信息的分子数据使我们能够从另一个侧面来理解腐霉属种间的 系统发育关系及进化历程。以表型和基因型相结合的菌物系统学研究方法，将从本质 上揭示该类菌物的接近自然的演化和系统发育的关系。 核酸是生物体的基本信息单位，随着测定方法的不断改进和完善，核酸序列分析 已经成为研究生物系统发育关系的重要手段。人类可以通过对生物分子的相似性进行 比较探讨菌物之间的亲缘关系，建立接近或符合生物自然演化关系的系统树，使人们 按自然演化关系对生物进行分类的目标得以实现。m u l l i s ( 1 9 8 6 ) 的聚合酶链式反应 技术( p c r ) 和w h i t e ( 1 9 9 0 ) 的真菌核糖体r n a 基因的扩增和直接测序，用于真 菌系统学的研究迅速推动了用d n a 序列数据开展菌物分子系统学研究的发展。编码 r r n a 的基因( r d n a ) 广泛存在于一切生物体中，但其不同区段的保守性是有区别 的。通过对r d n a 片段序列分析建立生物系统发育关系是系统学研究中的重要组成部 分。至今，人们通过对5 8 sr d n a 、i t s 、2 8 sr d n a 及1 8 sr d n a 的分析，成功地对 菌物的不同分类单元进行了定位，通过对r d n a 中的1 8 sr r n a 基因序列的分析表明， 在五界系统中的“真菌界 实际上是一个多系类群，从而接受了多界菌物系统 ( k i n g d o m so f f u n g i ) 。核酸序列分析使菌物许多目、科、属的亲缘关系得以确认，解决 了许多以形态为依据的分类单元划分之间的争议，如康冀川等( 2 0 0 0 ) 对虫草多形性 现象的5 8 sr d n a 和i t s 2 序列分析发现冬虫夏草( c o r d y c e p ss i n e n s i s ) 和甘肃虫草 ( cg a n s u e n s i s ) 属于同一个种，显示了分子系统学的客观性和对形态分类学的促进 2 广西大学硕士掌位论文广西j 匕舌争林地腐 资萄i 调查与腐霉的分子鉴定研究 作用。此外也用于一些很难区分的菌物属、种( 尤其是难产生孢子的真菌种) 的鉴定 及分类地位的确定。目前，i t s 区( i t s l 和i t s 2 ) 的分析已广泛应用于许多类群菌 物的种间区分，同时，线粒体小亚基r d n a ( 简称m i t s s u r d n a ) 和微管蛋白基因 ( t u b u l i ng e n e ) 序列也已用于许多菌物属内的种间区分。除了d n a 序列分析，d n a 片段多态性分析如i t s 片段的限制性酶切片段长度多态性( r f l p ) ，i t s l i t s 2 片段 的单链结构多态性( s s c p ) ，d n a 随机扩增多态性( g a p d ) 也是分子系统学研究的常用 方法。根据不同的分类单元等级( 界、门、纲、目，科、属、种及种以下) ，选用适 当的分子标记。 1 1 国外对腐霉的研究 国外菌物学家对于腐霉资源的调查研究始终在进行着，他们的工作使得腐霉家族 成员的数量在不断增加。从1 9 2 5 至0 1 9 6 0 年的3 5 个年月里d r e c h s l e r 共命名了1 8 种腐霉。 伊藤诚哉( 1 9 3 6 ) 对1 6 种腐霉进行了描述；f r e z z i ( 1 9 5 6 ) 也报道过1 7 种腐霉；w a t e r h o u s e ( 1 9 6 7 ) 首次将收集到的8 9 种腐霉资料制作成一个比较全面实用的分种检索表。 r o b e r t s o n ( 1 9 8 0 ) 发表了新西兰的腐霉2 7 种；p l a a t s - n i t e r i n k 于1 9 8 1 年出版了腐霉属 的专著，其中记述有腐霉8 7 种。在此之后，日本( 1 9 8 4 ) 、前苏联( 1 9 8 5 ) 、英国( 1 9 8 5 ) 、 泰国( 1 9 8 8 ) 和韩国( 1 9 8 8 ) 等国家也分别报道了各自国家的腐霉种类。g w m o o r m a n ( 2 0 0 2 ) 在美国宾夕法尼亚州的一个温室内共分离出1 3 种腐霉。t i m o t h y 等 ( 2 0 0 3 ) 也报道了自华盛顿分离到的一个腐霉新种。 腐霉的分子系统学研究仍然处在初期探索阶段。一直以来人们都在不断的进行着 腐霉的分子系统学研究，b r i a r d 等( 1 9 9 5 ) 对腐霉科属间的核糖体r n a 序列的差异进 行了研究。w a n g 和w h i t e ( 1 9 9 7 ) 以r d n a 内转录间区( i t s ) 的限制性片段长度多态 性分析对腐霉的分子特征进行了研究，m a t s u m o t o 等( 1 9 9 9 ) 对日本的3 0 种腐霉的i t s 和5 8 sr d n a 序列分析了腐霉的种间关系。c o o k e 等( 2 0 0 0 ) 研究了疫霉属与其它卵 菌的分子系统关系，p a u l ( 2 0 0 0 2 0 0 4 ) 先后根据腐霉的r d n a 的i t s 区分子特征对法国 的腐霉进行分类并发表了1 7 个腐霉新种，v o g l m a y r ( 2 0 0 3 ) 根据i t s 序列分析霜霉属 ( p e r o n o s p o r a ) 与近缘属之间的分子系统学的关系，g o d f r e y 等( 2 0 0 3 ) 利用种的i t s 特异p c r 鉴定p y t h i u mo l i g a n d r u m 。核糖体d n a 序列的测定与比对为我们研究物种间 亲缘关系较近分类群的系统发育与亲缘关系提供了非常有价值的数据，特别是核糖体 d n a ( r d n a ) 内转录间隔区，现在已经被广泛应用于系统发育的研究中。在腐霉属 3 广西大掌硕士学位论文广西j 匕部林地腐霉资溺【调查与庸霉的分子鉴定研究 的研究中，先后有b r i a r d ( 1 9 9 5 ) 采用8 种腐霉的2 8 sr n a 基因的部分序列，w a n g ( 1 9 9 7 ) 采用3 6 种腐霉i t s 区的r f l p ， m a t s u m o t o ( 1 9 9 9 ) 和m a r t i n ( 2 0 0 0 ) 采用3 0 种腐霉的i t s 序列和2 4 种腐霉的细胞色素i i 基因序列腐霉属的系统发育关系来探讨， 但他们的分析涉及到的腐霉种比较少而且也没有对各种类间的演化关系进行系统的 阐明。现有的研究结果为探索该类真菌的系统发育关系提供了线索，由于已报道的结 果因所用于分析的腐霉种类不多，而且只采用单基因系统发育分析，所以很难充分揭 示整个属的种间系统关系，其结论尚须进一步验证，亟需在利用更多菌株材料的基础 上，采用多基因系统发育分析，对该类真菌的分子系统学作更深入的研究。 1 2 我国对腐霉的研究 我国腐霉的资源调查工作始于上世纪3 0 年代，俞大绂是研究中国腐霉的先驱， 他首先研究了瓜果腐霉在南京所引起的黄瓜猝倒病，他首次报道了第一个腐霉种瓜 果腐霉( p y t h i u ma p h a n i d e r m a t u m ) ，之后又研究了蚕豆和地瓜上的刺腐霉和终极腐 霉；他先后报道了中国的腐霉共有1 5 种。从1 9 6 1 年开始，余永年较全面的研究了中 国的腐霉，到1 9 7 3 年，他就鉴定出腐霉4 0 多种，其中包含5 个新种。其后，他又对 中国的云南 发现有1 9 个种( 含1 个新种3 个中国新记录种) 和宁夏的腐霉 发 现了1 0 个种( 含1 个中国新记录种) 进行了比较系统的研究。1 9 9 8 年，他出版了 一本专著，其中共描述了中国的腐霉达5 6 种。沉善炯和相望年( 1 9 4 8 ) 也报道过云 南的一种水生腐霉。魏景超( 1 9 5 7 ) 和戚佩坤等( 1 9 6 6 ) 也分别描述了1 2 种腐霉( 其 中有两种产于我国) 和我国的2 种腐霉。2 0 世纪7 0 年代，先后有谢焕儒( 1 9 7 6 ) 报 道了中国台湾的腐霉7 种。戴芳澜( 1 9 7 9 ) 记载了3 5 种中国腐霉，并对其中的6 种 腐霉进行了详细的描述。进入2 0 世纪8 0 年代，我国逐渐深入和广泛的对腐霉进行了 研究。其间，张中义等( 1 9 8 7 ) 制作了含有4 5 种中国产腐霉的检索表。张炳欣等( 1 9 8 8 ) 也报道了浙江的植物致病性腐霉有1 1 种，之后他又与沈杰共同研究鉴定出浙江大、 小麦上的致病腐霉5 种，其中p p o l y p a p i l l a t u m 为中国的新记录种。第二年，他与王 政逸等较系统的对杭州市菜地及小麦、水稻根围的土栖腐霉进行了研究，分别报道了 腐霉1 6 种和1 0 种。2 0 世纪9 0 年代以来， 腐霉，而王宽仓等则分离到了1 0 种腐霉。 先后有蒋继志( 1 9 9 2 ) 在宁夏发现了5 种 王晓鸣等( 1 9 9 4 ) 也报道过寄生于玉米的 6 种腐霉。王家和( 1 9 9 7 ) 从云南的烤烟田中分离得到4 种致病腐霉。王国良等( 2 0 0 0 ) 也在浙江冷季型草坪上鉴定了6 种致病腐霉，同时指出瓜果腐霉为优势种。赖传雅 4 广西大学硕士学位论文 广西j 匕部林地腐i 资蔫调查与曩 霉的分子鉴定研究 等( 2 0 0 0 ) 从茶扦插苗根腐性苗枯病的病原菌中鉴定出其中之一致病腐霉为刺腐霉。 袁高庆等在南宁地区的腐霉研究中，鉴定了1 3 种，并命名和发表了其中的2 个新种， 分别为镰雄腐霉( p f a t c 咖r m e ) 和南宁腐霉( 尸n a n n i n g e n s e ) 。楼兵干和张炳欣( 2 0 0 4 ) 在对腐霉的研究中，发现了一个中国新记录种。最近，苏晓庆在一次室外蚊虫生物防 治实验中，鉴定出腐霉属的一个新种，并命名为贵阳腐霉( p y t h i u mg u i y a n g e n s e ) 。截 至目前，中国已报道的腐霉共计有6 0 种。 1 3 广西对腐霉的研究 广西位于中国的南疆，跨越中亚热带、南亚热带和热带等三个气候带，南临北部 湾海洋，年降雨量在12 0 0 - - 20 0 0m m 之间，雨量充沛，年均温达到1 7 - - 2 3 ，无霜 期比较长，雨热通常在同一个时期，植物全年都能生长，生物资源非常丰富多样，已 知的植物种类数量在全国名列第三位，有国家重点保护的珍稀动物4 0 多种。除此之 外，广西动植物特有种类也很繁多。广西动植物种群如此丰富多样，相信相应的菌物 资源也必然是十分丰富的。袁高庆( 2 0 0 1 ) 等在广西中南部的南宁地区的共分离得到 腐霉1 1 种，其中有新种两个，广西新记录种5 个。刘慧( 2 0 0 4 ) 等在广西南部低纬 度地区共鉴定出的腐霉有2 9 种，其中2 0 种为广西新记录种。付岗( 2 0 0 5 ) 等也先后 对广西北部地区的水田和旱地进行了腐霉调查，共鉴定出腐霉1 6 个种，其中2 种为 广西新记录种。而对于广西林地腐霉的资源调查至今仍然是一个空白，有待于研究； 同时，腐霉的分子系统学研究在我国的研究也是比较少地。 1 4 本研究的目的 腐霉能引起苗木猝倒病、瓜果腐烂病等严重的植物病害，近年来，又先后发现豌 豆、草坪、白术、玉米、甜菜、番茄、棉花、柠檬、茶、柑桔、落葵、大蒜、条斑紫 菜等多种植物发生腐霉性病害。而依靠形态大小来鉴定腐霉常常需要比较长的时间， 准确而快速鉴定腐霉，以适应生产的需要已成为紧迫的课题。为此，我们开展广西北 部林地腐霉的资源和生态多样性调查，增加收集腐霉菌种，进一步开展腐霉分子系统 发育关系研究，剖析腐霉的形态特征与分子特征的相互联系，探讨腐霉属的种间亲缘 关系，促进腐霉的快速分子鉴定技术的形成。 广西大掌硕士学位沦文广西j 匕匍5 林地腐霉资嗣e 调- i t 与曩 霉的分子誓 定研究 2 材料与方法 2 1 腐霉的分离与鉴定 2 1 1 土壤标样的采集 2 0 0 7 年3 月至2 0 0 8 年7 月先后在广西北部桂林的兴安县、永福县、河池的罗城 县、金城江县、百色的乐业县、田林县、柳州的三江县、融水县等8 个有代表性的县 份采集林地土壤，采集了来自不同林分、不同海拔和不同深度土层的1 3 0 份土壤标样 ( 见表1 ) ，对每个采样点进行海拔、林分、土层深度等方面的记录。每个标样3 5 0 5 0 0 9 盛于洁净塑料袋，带回实验室立即分离，若不能及时分离的土壤标样则放于冰 箱内进行保存。但是，土样存期不宜过长，两周要分离完，以免土样中菌相改变。 表1 土壤标样的采集情况 t a b l e1t h ec o l l e c t t i o nt a b l eo fs o i ls t a n d a r ds a m p l e 时间地点编号及数量( 个)林分 2 1 2 培养基的制作 c m a 培养基：加热l0 0 0m l 水至沸腾，称取3 0 9 玉米粉，将少量冷水搅匀的玉 米粉液倒入沸水中并搅拌均匀，煮沸2 0m i n ，八层纱布过滤玉米液，滤液加水定溶至 10 0 0m l 加热，再加入琼脂1 7 9 。 2 1 3 腐霉的分离与鉴定 标样分离参考余永年的方法并稍加改进，主要采用平皿分离法进行。 6 广西大掌硕士掌位论文广西j 匕部林地腐霉资蔫e 调查与腐霉的分子簟 定研究 平皿分离法：是在直径9 c m 的灭菌培养皿内进行的；培养基采用玉米粉琼脂培养 基( c m a ) 。待培养基冷却到5 0 - 5 5 c 时，在l0 0 0 m l 培养基中加入链霉素3 0 r a g 混 匀，倒入培养皿。待培养基冷却凝固，每皿培养基表面挑取0 1 o 2 5 m g 土粒放置于 培养基表面，放置三处呈三角形；在2 5 c 恒温培养箱里培养，待有菌丝长出切取菌 落边缘的菌丝，移植到c m a 平板中培养进行进一步的纯化。，每份土样处理重复3 5 次。 腐霉的鉴定：主要是综合考虑腐霉的孢子囊、雄器、藏卵器、及卵孢子形态特征 进行鉴定。本实验主要参考余永年主编的中国真菌志( 第六卷霜霉目) 以及a j v a nd e rp l a t t s - n i t e r i n k 主编的m o n o g r a p ho f t h e g e n u sp y t h i u m 的描述进行鉴定。对在 培养基中培养出来的菌物直接进行挑取菌丝体制片或用玻片培养法连续进行镜检，描 述出腐霉的培养性状，菌丝分枝形式，及在繁衍中无性繁殖体与有性繁殖体的形态性 状；并观察和测量培养中腐霉的孢子囊、藏卵器、雄器及卵孢子的形状与大小，卵孢 子壁的厚度；对腐霉的形态进行综合描绘并显微拍照。 2 2 生态环境因子的测量与记录 对采样点进行相关的生态因子记录。 海拔高度：每到一个地方，即用气象部门用的g p s 进行测量，采样时直接读取， 记录。 标样土壤类型：直接记录。 标样林地主要植被：直接记录。 2 3 腐霉的分子鉴定研究 2 3 1 供试腐霉菌株 供分子鉴定的菌株见表2 。 2 3 2 腐霉菌丝的培养与收集 将单孢纯化好的菌种移植于c m a 液体培养基上，2 5 c 黑暗振动摇床中培养3 - - - 4 天，待菌落长小团块时停止培养，置于5 1 2 冰箱中备用。 2 3 3 腐霉菌基因组d n a 的提取 采用十六烷基溴化乙胺( c t a b ) 法。步骤如下：( 1 ) 从培养基中取约5 0 m g 的新鲜 菌丝放入研钵，加入液氨，快速研磨成糊状，放入1 5 m l e p 管中，加入6 0 0 m l 提取 7 广西大学硕士掌位论文 广西北部林地腐霉资源调查与腐霉的分子鉴定研究 液；( 2 ) 冰上放置3 0 m i r a ( 3 ) 加入等体积苯酚氯仿( v ：v = i ：1 ) 混匀，4 c ，1 00 0 0 r p m 离心1 0m i n ，吸取上清夜移入另一个e p 管中，重复2 次；( 4 ) 吸取上清液移入 另一个e p 管，加入1 1 0 体积k a c 溶液，加二倍体积的无水乙醇，在冰上放置3 0 m i n 后，于4 c ，1 00 0 0r p m 离心2 0m i n ，弃其上清液，再用7 5 酒精洗涤沉淀2 3 次： ( 5 ) 待沉淀自然干燥后，用5 1 x l 的t e 缓冲液使其溶解：( 6 ) 制作0 8 琼脂糖凝胶， 取5 p l 的d n a 样品和5 “l 的1 0 x l o a d i n gb u f f e r 混匀后，加入上样孔，在电压8 3 v 下 电泳3 0 m i r a ( 7 ) 凝胶电泳检测取5 1 a l 的扩增产物与5 1 a l 的l o x l o a d i n gb u f f e r 混匀后， 在0 8 琼脂糖凝胶上电泳，再经溴化乙锭染色液染色3 0m i n 后，用自来水漂洗两次 后，在凝胶成像系统下观察及记录结果。 2 3 4p c r 反应体系和循环参数 ( 1 ) p c r 反应引物为： i t s 4 ：5 t c c t c c g c t t a 丌g a t a t g c 3 ， i t s 5 ：5 g g a a g t 从a a g t c g l a a c a a g g 3 ( 2 ) p c r 反应体系 p c r 反应所用的材料及试剂的量见表3 。 ( 3 ) p c r 扩增反应程序如下： 9 5 预变性 3 m i n 9 4 变性4 0 s 、 l 5 5 。c 退火 i m i n 3 5 个循环 7 2 ( 2 延伸 1 m i l l 7 2 延伸 1 0 m i n 曩 广西大掌硕士学位论文 广西北部林地腐霉资滠调查与腐霉的分子鉴定研究 2 3 5p c r 扩增 p c r 反应体系配好后，放置p c r 仪进行扩增反应，反应后取5 1 a l 的扩增产物与 5 l1 0 l o a d i n gb u f f e r 混匀后，在o 8 的琼脂糖凝胶上电泳，再经溴化乙锭染色液( 浓 度0 6 5 i r t g m 1 ) 染色3 0 m i n 后，自来水漂洗2 次后，在凝胶成像系统下检查扩增结果。 2 3 6d n a 分子序列测定及比对分析