（分析化学专业论文）高灵敏度荧光免疫分析方法研究.pdf

硕l j 学伊垒文 摘要 发展高灵敏度的免疫分析技术一直以来是免疫分析领域研究的一个重要方 面，它对于实现一些重要疾病标志物的检测有着至关重要的意义。荧光仪具有简 便、灵敏、重现性好等优点。因此，开发新的荧光信号增强免疫分析技术无疑可 以推动免疫分析的发展。为此，本文主要在高灵敏度的荧光免疫分析方法方面做 了一些工作： 1 ) 提出了一种新的基于磁性纳米颗粒的荧光免疫检测方法。利用磁性纳米颗粒 上的氨基固定c 3 抗原。研制了一种基于磁纳米颗粒作为生物载体，用于c 3 检测荧光免疫分析方法，将辣根过氧化物酶标记抗体( h r p a b ) 和磁性纳米 颗粒上固定的c 3 ( m n p s c 3 ) 与待测c 3 发生竞争性免疫反应，h r p a b 可以 催化荧光底物3 ，37 ，5 ，5 四甲基联苯胺( t m b ) 发生淬灭，所以待测c 3 浓度可由 底物溶液荧光猝灭的大小来判断。 2 )提出了一种基于磁性纳米颗粒的人胸苷激酶l ( h t k l ) 荧光免疫分析方法。 h t k l 通过共价吸附到核壳结构的磁性颗粒表面，与样品中的h t k l 共同竞争 辣根过氧化物酶标记的抗体( h r p a b ) 然后以对羟基苯丙酸( h p p a ) 为底物， 通过测定酶催化下荧光强度的增加来间接测定样品中抗原的浓度。应用于人血 清中h t k 的测定，在0 0 1 1n g m l 之间呈线性关系，检测限为0 0 0 8n g m l 。 3 ) 提出了一种基于循环富集辣根过氧化物酶的用于检测人i g g 的新型荧光酶 免疫分析方法。脱硫生物素与亲合素的结合常数比较小，当其与亲合素结合后， 在生理条件下即可被生物素取代，利用此取代反应可对辣根过氧化物酶进行循 环富集。当用缓冲液代替抗原进行实验时，发现即使循环富集步骤达到七次其 产生的背景信号也相当低，这种特性使得本方法能够检测到o 0 5n g m l 人 i g g 。 关键词：荧光免疫分析，磁性纳米颗粒，生物传感器 i i 苛灵敏蔓的荧光免疫分析_ 7 法的研究 a b s t r a c t d e v e l o p i n go fs e n s i t i v ei m m u n o a s s a yt e c h n o l o g yi so n eo f t h ei m p o r t a n tt a s k si n i m m u n o a s s a y ，w h i c hi sc r u c i a l f o rr e a l i z i n gt h ed e t e c t i o no fs o m ev i t a ld i s e a s e s f l u o r e s c e n ta p p a r a t u sa r es i m p l e ，s e n s i t i v ea n dg o o dr e p r o d u c t i v i t y s oi ti su n d o u b t e d t h a tt h es t u d yo fn e wf l u o r o i m m u n o a s s a yw i t hs i g n a le n h a n c e m e n tc a na c c e l e r a t et h e d e v e l o p m e n to fi m m u n o a s s a y t h e r e f o r e ，t h i sr e s e a r c h f o c u s e so nt h es e n s i t i v i t y e n h a n c e m e n to ff l u o r o i m m u n o a s s a y t h ed e t a i lc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： 1 ) af l u o r e s c e n c ei m m u n o a s s a yb a s e do nm a g n e t i cn a n o p a r t i c l ei m m o b i l i z a t i o n w a sd e v e l o p e d c 3a n t i g e ni sf i x e db ya m i n oo nt h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s h a s b e e nd e v e l o p e db a s e do nm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sa sab i o l o g i c a lc a r r i e r ，f o rd e t e c t i n g f l u o r e s c e n c ec 3i m m u n ea n a l y s i s ，w i l lb et a g g e da n t i b o d yh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p a b ) a n dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e so naf i x e dc 3 ( m n p s c 3 ) a n dt h eq u e s t i o nc 3 m e a s u r e m e n tc o m p e t ei m m u n er e s p o n s e ，h r p a bc a nb ec a t a l y t i cf l u o r e s c e n t s u b s t r a t e3 ，3 ，5 ，5 - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e ( t m b ) i nq u e n c h i n g ，s ot h ec o n c e n t r a t i o n c a nb em e a s u r e da tt h ee n do fc 3s o l u t i o nf l u o r e s c e n c e 2)af l u o r e s c e n c ee n h a n c i n gi m m u n o a s s a y f o rh t k 1 ，u s i n gm a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s ( m n p s ) a st h eb i o m o l e c u l a ri m m o b i l i z a t i o nm e d i a t o rw a sd e v e l o p e d t h eh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e l a b e l e dh t k 1m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( h r p a b ) c o m p e t i t i v e l yr e a c t e dw i t ht h ef r e eh t k li nt h ed e t e c t i o ns o l u t i o na n d t h eb o u n dh t k l o nm n p s a f t e rs e p a r a t e db yam a g n e t i cf i e l d ，t h eb o u n dh r p - a bo nm n p sc a t a l y z e d t h eo x i d i z a t i o no f3 - ( p - h y d r o x y p h e n y l ) - p r o p i o n i ca c i d ( h p p a ) t of o r maf l u o r e s c e n t d i m m e rp r o d u c t ，2 , 2 d i h y d r o x y b i p h e n y l 一5 ，5 - d i p r o p i o n i ca c i d ，l e a d i n gt oa ne n h a n c e d f l u o r e s c e n t s i g n a l a t4 0 7a mw h i c hw a si n v e r s e l yp r o p o r t i o n a lt ot h eh t k 1 c o n c e n t r a t i o n t h eh t k lc a nb el i n e a r l yd e t e r m i n e di nt h er a n g eo f0 01 1n g m la n d t h ed e t e c t i o nl i m i tr e a c h e so 0 0 8n g m l s e v e r a ll i v ec a n c e rp a t i e n ta n dn o r m a lh u m a n s e r u ms a m p l e sw e r ee v a l u a t e db yt h ed e v e l o p e dn u o r o i m m u n o a s s a y t h i sn e w i m m u n o a s s a ys y s t e mc a nb e e x t e n d e dt od e t e c to t h e rb i o m a r k e rm o l e c u l e sa n dh a s b r o a dp o t e n t i a la p p l i c a t i o n si nc l i n i c a ld i s e a s ed i a g n o s i s 3 ) an e wf l u o r e s c e n te n z y m ei m m u n o a s s a yb a s e do nc y c l i ca c c u m u l a t i o n o f h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) w a sp r o p o s e df o rh u m a ni g g t h ed i s s o c i a t i o nr e a c t i o n b e t w e e nd e t h i o b i o t i na n da v i d i ni nt h ep r e s e n c eo fb i o t i np r o v i d e de f f i c i e n tw a yf o rt h e c y c l i ca c c u m u l a t i o no fh r pu s e df o rt h ef i n a la n a l y t i c a lq u a n t i f i c a t i o n t h eb l a n k l i i 硕i ：学位论之 e x p e r i m e n tw i t h o u ta d d i t i o no ft h ea n a l y t es h o w e da ne x t r e m e l yl o wb a c k g r o u n de v e n w i t hs e v e na c c u m u l a t i o nc y c l e sr e a c h e d t h ep r o p o s e dm e t h o dp r o v i d e sap o s s i b i l i t y f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd o w nt o0 0 5n g m lh u m a ni g g k e y w o r d s ：f l u o r o i m m u n o a s s a y ，m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s ，b i o s e n s o r i v 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 铄笱啥吼钟9 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名： 导师签名： e l 期：肿 日期：沙睁 乡月g e t 夕月厂日 。够 历 妙 了 羔了驰墨曼 顶 j 学位论文 第1 章绪论 免疫学是一门既古老而又新兴的科学。免疫学的发展是人们在实践中不断探 索、不断总结和不断创新的结果。它是近现代生物化学和医学的一个重要分支， 是人们在长期与疾病斗争的实践过程中产生的一门重要学科。免疫学的发展经历 了四个时期即经验免疫学时期、经典免疫学时期、近代免疫学时期和现代免疫学 时期。免疫分析，就是指抗原对其抗体进行免疫结合进行的分析。通常的抗原是 指人体内存在的激素，酶，小分子的多肽，特异蛋白等。对于其它动物，就异体 物质，一旦把这些物质引入动物体内，其免疫系统就会做出反应，产生出专一结 合抗原的抗体( 即免疫球蛋白) 。抗原和抗体的反应是一一对应的，具有高度专一 性，靠这种免疫反应进行的分析，就叫免疫分析法。 1 1 免疫分析方法 免疫分析方法作为免疫学研究的工具，主要是利用抗体( a n t i b o d y ，a b ) 能够与相 应抗原( a n t i g e n ，a g ) 及半抗原发生自发的、高选择性的特异性结合这一性质，通过 将特定抗体( 抗原) 作为选择性试剂来对相应待测抗原( 抗体) 进行分析测定的方法。 特异性是免疫反应最重要的特点，也是免疫学诊断与防治的理论依据。抗体和抗原 之间存在的弱的相互作用力，使得抗原可以被抗体高特异性地“分子”识别形成稳定 的复合物。免疫分析的提出及发展是2 0 世纪以来在生物分析化学领域所取得的最 伟大的成就之一，目前全世界每年要进行数亿次的免疫分析。 1 2 免疫分析的分类 根据免疫反应方式的不同，免疫分析可分为异相免疫分析和均相免疫分析两大 类。抗原和抗体之间特殊的结合力也导致溶液体系中均相免疫分析和固相界面免 疫传感的高灵敏度【2 】。按照检测方法的不同又可分为放射免疫分析( r i a ) 、酶免 疫分析( e i a ) 、荧光免疫分析( f i a ) 、时间分辨荧光免疫分析( t r f i a ) 、电化学 免疫分析( e c l i a ) 、化学发光免疫分析( c l i a ) 等。 1 2 1 放射免疫分析( r i a ) 放射免疫测定( r a d i oi m m u n o a s s a y ，r i a ) 是1 9 5 9 年y a l o w 和b e r s o n 【3 “j 首先 创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。由于此项技术灵 敏、特异，并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外 已成功地应用r i a 检测的物质多达数百种，国内研究的被测物质也达百余种，试制 苛灵敏度的荧光免疫 圻方法的研究 的r i a 试剂盒已超过6 0 余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。r i a 的基 本原理：是基于标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合或竞争性抑制 反应。在r i a 反应系统中，标记抗原( a g 幸) 、末标记抗原( a g ) 和特异性抗体( a b ) 三者同时存在时，由于两种抗原具有相同的决定簇，互相竞争结合抗体的能力相 同，结果形成a g * 一a b 和a g a b 复合物。当a g * 和a b 的量固定时，二者结合 形成免疫复合物就受到a g 含量的制约。如反应系统中a g 含量高时，对a b 的 竞争结合能力就强，a g a b 复合物的形成量就增加，a g * a b 复合物则相对减少； 反之，当a g 含量低时，对a b 的竞争结合能力弱，a g * a b 复合物的形成量即 增多。因此，a g * a b 复合物的形成量与a g 含量之间呈定的负相关函数关系。 在放射性免疫分析中，最早也是最常使用的标记物是1 2 5 i ，它标记抗体或抗原 的方法有两种，第一种是标记具有酪氨酸侧基的蛋白质。在氯胺t 或乳糖过氧 化酶h 2 0 2 存在下，n a l 2 5 i 和蛋白质的酪氨酸侧基反应，1 2 5 i置换芳香环上的氢， 形成稳定的标记化合物【5 】。对于无酪氨酸侧基的蛋白质、多肽及激素等物质的标记 可以用1 2 5 i 先和能与蛋白质反应的任意化合物先反应，然后再使之与蛋白质反 应，得到1 2 5 i 标记的蛋白质【6 】。放射性免疫分析法具有以下几个优点：1 、因为很 少受到干扰，信号稳定：2 、检测灵敏度高，可达1 0 7 m o l ；3 ，由于放射性标记 物体积比较小，标记后的生物分子受到空间位阻的影响亦比较小，基本上不影响 蛋白质的生物活性。当然，放射性物质在分析体系中的应用，也带来了一些缺陷： 1 、放射能的危险性( 由于放射性污染的危险性。因而其输送、储藏、使用均有严 格的法律限制，同时放射性废弃物的处理更是麻烦) ；2 、放射性测定前，游离型 标记蛋白质必须除去，这不利于实现自动化；3 、放射性同位素的不稳定性使得其 标记的蛋白质实际的储存寿命只有数周或一两个月，且无论使用多么安定的放射 性同位素进行标记，也必须每天测定工作曲线且一段时间后必须重新标记。 1 2 2 酶免疫分析法 酶免疫分析法( e n z y m ei m m u n o a s s a y ，e i a ) 是将抗原抗体的特异性免疫反应 和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法【。1 9 6 6 年a v r a m e a s 和 u r i e l 首先将酶偶联于抗原和抗体【8 j ，开创了酶免疫分析的临床应用。酶免疫法的 检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来确定被测物的量。 用作标记物的酶有辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) 、碱性磷酸酶 ( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a l p ) 和半乳糖苷酶( b d 。g a l a c t o s i d a s e ，简称g l a ) 等。 酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是 目前使用广泛的免疫分析技术。e i a 法包括酶联免疫吸附分析法( e n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 、酶免疫试验法( e n z y m e m o n i t o r e di m m u n o t e s t ， e m i t ) 、竞争结合酶免疫分析法( c o m p e t i t i v eb i n d i n ge n z y m ei m m u n o s o r b e n ta s s a y ) 硕 学位论文 和免疫酶分析法( i m m u n o e n z y m o m e t r i ca s s a y ，i e m a ) 。其中基于竞争吸附的酶联免 疫法( e l i s a ) 是酶免疫法中应用最广泛的一种，常被用作检测其它方法可靠性的 标准方法。e l i s a 的基础是抗原或抗体的固定化及抗原或抗体的酶标记。结合在 固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其 免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，待测样品( 测定其中的抗体或抗原) 与固 相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复 合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体，通过免疫反应而结 合在复合物上。此时固相上的酶量与待测样品中受检物质的量呈一定的比例。加 入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的 量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析，定量分析一般用紫外一 可见分光光度法测定。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果， 使测定方法达到很高的敏感度。同放射免疫分析法相比，该法所需仪器简单，且不会 对人体造成伤害，但是也存在着酶不稳定、测量范围窄等不足之处。 1 2 3 电化学免疫分析 电化学免疫分析是将免疫技术和电化学检测相结合的一种标记免疫分析方 法。电化学免疫分析可分为直接电化学免疫分析和间接电化学免疫分析。通过测 定免疫反应前后界面电容、电势、电导、电流等的变化可以直接测定抗原抗体间 的结合。n e w m a n 等【9 】将相互交叉的铜电极固定在玻璃表面，用二氧化硅隔离各铜 电极并固定抗原，再用聚二甲苯层覆盖电极，该方法可通过电容降低直接测定相 应的抗体。在间接电化学免疫分析法中，抗原抗体的结合反应是通过标记有电活 性物质或酶的免疫结合物的反应间接表现出来的。直接电化学免疫分析法又称非 标记电化学免疫分析法，这种方法不需要标记免疫试剂，它依靠免疫结合后引起 转换器的电荷密度或导电性的变化而实现分析检测的目的，方法简单、快速，有 着广阔的应用前景，尤其是在活体检测方面受到了越来越多的重视。在间接电化 学免疫分析法中，抗原抗体之间的结合需要通过与标记试剂的反应间接表现出来。 由于电化学标记具有很高的检测灵敏度，如安培检测可以检测到10 q o a 的电流， 因而间接电化学免疫分析方法往往具有更高的分析灵敏度，且所用仪器亦非常简 单。 1 2 4 荧光免疫分析( f i a ) 上世纪4 0 年代，c o o n s 等采用荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原， 首次创建了荧光抗体检测技术【l o l 。目前荧光化合物在荧光标记，高效液相色谱柱 前及柱后衍生化、d n a 分析、流动细胞计数和免疫分析中都有广泛的应用。比较 重要的荧光标记化合物有荧光素和罗丹明及它们的衍生物【 1 2 】。荧光素和罗丹明 衍生物具有较高的荧光量子产率和结构稳定性，但它们在免疫分析中的灵敏度只 高灵敏度的荧光免疫分析方法的研宄 有l o 。om 左右，这主要是受以下几方面的限制：1 、背景荧光干扰大【1 3 l ，生物分 子在3 5 0 - 6 0 0n m 多有强荧光信号，与常规荧光化合物的发射光谱相互重叠。导 致方法灵敏度剧烈下降，例如用荧光素标记测定血清中的白蛋白或i g g 的灵敏度 要比在缓冲溶液中测定的灵敏度低1 0 一5 0 倍。另外许多固相测定材料( 包括聚苯 乙烯塑料) 都有定的背景值；2 、光散射的干扰，主要来源于仪器和样品( 包括 t y n d a l l ，r a y l e i g h ，r a m a n 现象) 的杂散光严重影响测定结果；3 、淬灭现象，外界 环境的变化，例如p h ，极性，含氧水平和与其它重原子或吸收基团靠近等等，都 会引起荧光强度的变化；4 、s t o k e 位移小，一般荧光化合物的s t o k e 位移约为2 4 - - - 5 0 n m 。这使散乱光及固相材料的影响更加严重。给予此，发展新型高性能荧光标 记越来越受到重视。 近年来出现的含有大量荧光报告分子( 包括稀士螫合物、有机染料等) 的纳米颗 粒可以免受溶荆的干扰，荧光发射强而稳定，成为目前免疫标记领域的又一研究 热点之一4 1 川。通过浸染的方法制各了表面带有一n h 2 的聚乙烯乙二醇链包被的 1 0 6 7n me u ( 1 1 1 ) 荧光纳米颗粒，利用异双功能偶联剂s m c c 与表面氨基作用引入 马来酰哑胺基，它可以与抗体的f a b 片断的筑基反应，实现抗体片断的定向偶联， 在甲胎蛋白的非竞争固相免疫分析中检测限达到o 0 4n g l h a n n a 等i m 0 8 l 实验发 现，纳米颗粒标记的抗体在干燥溶解后仍然可以保持其荧光活性、生物活性和单 分散的胶体状态。荧光纳米颗粒出于可以实现很岛的f p 值，对于实现商灵敏的 荧光免疫分析提供了很好的应用f j 景。但是荧光纳米颗粒与生物分子的偶联方法 比较复杂精细，在免疫分析中的表现也有别于传统的荧光标记物，所以它在免疫 分析中的实际应用仍然需要很多基础性的研究工作积累经验。 酶联放大荧光免疫分析是以酶为标记物，将酶的催化放大作用与荧光检测技 术结合起来的免疫分析，该技术已广泛应用于临床检测药物分析和生化分析等方 面【l 弘2 2 1 。标记酶的高效催化作用使得酶联荧光免疫分析技术具有极高的检测灵敏 度，与常规的荧光免疫分析技术相比一般可高2 个数量级。d i a m a n d i s 等【2 3 2 7 将 长寿命稀土离子( 如e u 3 + 、t b ”) 配合物的磷酸脂作为底物，分析灵敏度得到了进 一步的提高。 1 2 5 时间分辨荧光免疫分析 时间分辨荧光免疫分析是用镧系金属离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激 素、抗体、核酸探针或生物活性细胞，与其螫合剂、增强液( 有一部分不需要) 在待 测反应体系( 如抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细 胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生反应后，用时间分辨荧光仪测定最后产物巾的荧 光强度根据荧光强度和相对荧光强度比值，推测反应体系巾分析物的浓度，达到定 量分析的同的。时间分辨荧光免疫分析利用时间分辨技术，很好的消除了普通荧 硕i j 学位论文 光免疫分析方法中荧光背景散射光等的影响，方法简便，灵放度极高。y u a n 等1 2 s 】 合成了一种稳定的能发出强烈荧光的e u 3 + 络合剂4 ，4 二( 1 ，l ，2 ，27 3 ，37 七氟 4 6 己二酮- 6 辇) 氯磺酰一邻三联苯( b h h c t ) ，作为标i 己物直接固相检测，已用圆 相t r f i a 法测定甲胎蛋白( a f p ) 、i g e 、促甲状腺激素( t s h ) 等，其灵敏度肯极 大提高2 9 枷】。w u 等3 2 1 在y u a n 工作的基础上合成两种新螫合物其中一种已用 于t 4 的检测。国内潘利华等1 3 3 1 利用自建的分析方法，在二定条件下使b c p d a 与 铕离子形成稳定的b c p 2 d a 2 e u 3 + 2 ( h b s a b ) i g g 标记物，测定了标记过程的有关 参数并对标记物的某些光学特性进行了研究。时间分辨荧光免疫分析还应用于其 它很多方面，如q i n 等”4 垮艮道了一种t r f i a 测量尿微量自蛋白的方法仅仅需要 1 2m i n 。k u r o g o c h i 等【j5 】报道了荧光标记p 2 半乳糖苷酶催化机制及其运用。还有 研究【36 j 用t r f i a 对细胞内的溶酶颗粒中p e r f o r i n 蛋白进行定量测定。 1 2 6 化学发光免疫分析( c l i a ) 化学发光分析法与荧光分析法之间的主要区别在于荧光需要激发光，而化学 发光不需要激发光。发光物质按其发光的原理，可以分为物理发光、化学发光和 生物发光三类，后两者与免疫反应相结合得到广泛应用。物理发光有萤火虫荧光素 和细菌荧光素。化学发光系氧化化学反应，电子激发后回到基态以光子的形式释放 能量，常用的发光剂为氨基苯二酰肼( 异鲁米诺和鲁米诺) 和丫啶酯类【3 7 】。1 9 7 6 年 s c h r o e d e r 报道异鲁米诺标记生物素进行化学发光测定，发光免疫分析得到迅速发 展，并分别形成了化学发光酶免疫分析、生物发光酶免疫分析和最新发展的电化学 发光免疫分析，检测灵敏度得以迅速提高。其中电化学发光( e c l i a ) 是一种在电 极表面由电化学引发的化学反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程，故是 化学发光的一种发展l 驺3 引。 1 3 免疫分析定量方法 1 3 1 夹心型免疫分析法 夹心型免疫分析原理如图1 1 所示： s u b s l r 稿l e 一 囝爹蛀 菏j 灵敏度的荧光免疫分析方法的研究 h 觚霸嘲y 嘲删蝣嘲黪孵 图1 1 夹心型免疫分析流程图 先将抗体固定于传感嚣表面，加入抗原培育后，抗原抗体特异性结合形成复 合物，洗掉未反应的抗原，再加入酶标抗体培育，最后在测试体系中加入底物， 从而得出待测抗原的含量。一般夹心法适用于检测大分子抗原，灵敏度高，但反 应步骤较多，比竞争法繁琐。 1 3 。2 竞争型免疫分析法 竞争型免疫分析法是建立在酶标记物与待测物质同某种特异试剂竞争结合的 基础上。原理如图1 2 所示： a n l i g e n a n t i g e n e n z y m e e m = l ju g a t c 图l - 2 竞争型免疫分析流程图 将抗体固定于传感器上并将其在用酶标记抗原与相应待测抗原的混合液中 培养，让它竞争结合于固定的抗体上，溶液中待测抗原越多结合在传感器表面上 的酶标抗原越少从而催化产物越少。竞争型免疫分析方法比较夹心型免疫分析方 法少了一个反应和洗涤分离步骤，有利于缩短分析时间，但这种竞争反应不利于 检测下限的提高，主要用于小分子抗原的免疫分析。 1 3 3 无分离竞争抑制法 近年来，发展了一种无分离步骤的异相免疫分析技术f 40 1 。这种方法是用酶及 生物素标记抗体，它与待测的抗体竞争吸附到固定有抗原的乳胶板上，未参与免 竖塑 始一 令 匕 m 一 “型 参 l 卜 坐唑 e 一 影il 学位论2 = 疫反应的示踪物将吸附在固定有亲和素的乳胶板上，这部分酶标物中的酶将由于 生物素与亲和素之间的相互作用而失活。在测试体系中加入溶液，只有参与反应 的酶标物能催化底物的转化而产生相应信号，未参与免疫反应的酶标物因失活无 需洗脱。 1 4 免疫固定方法 在免疫分析过程中，抗原抗体的固定是影响其性能的一个重要因素。抗原抗 体的固定方式、数量及活性等直接影响免疫分析的灵敏度、检测限、准确度等性 能。通常抗原抗体的固定主要有吸附法、交联法、物理包埋法和共价键合法等基 本方法。 1 4 1 吸附法 吸附法是一种通过物理吸附作用将免疫组分固定于换能器表面的方法，换能 器表面经过适当地处理或修饰后，用抗原( 抗体) 溶液浸泡或涂覆抗原( 抗体) 由于分 子间作用力而直接固定在换能器表面，形成具有识别功能的生物敏感层。常见的 吸附法有高分子膜吸附法、无机材料吸附法、纳米颗粒表面吸附法等。k a r y a k i n 4 1 】 小组报道了利用抗体本身的疏基能与金相互作用的特点将其吸附固定在金电极表 面，也是一种吸附固定法。 1 4 2 交联法 交联法是通过采用双功能团试剂，在生物活性单元之间或生物活性单元与凝 胶聚合物之间交联形成网状结构而使生物活性单元固定化的方法。最常用的交联 试剂为戊二醛，顺丁烯二酸酐等。交联法分为辅助蛋白交联法、吸附交联法、载体 交联法。应太林4 2 1 采用牛血清白蛋白戊二醛交联方法固定化酶，然后再滴加到已 制备好的n a f i o n n 甲基吩嗪修饰电极上制成了h 2 0 2 生物传感器。该传感器选择 性好，灵敏度高，响应时间少于3 0 s 。宫志龙4 3 1 以辣根过氧化物酶为辅酶，戊二醛为 交联剂，分别将g o d 和尿酸氧化酶固定于氨基化的硅胶上，制成了葡萄糖光纤传感 器和尿酸光纤传感器，其分析结果同光度法一致，传感器寿命为6 0 天。 s c h u l e r 4 4 】利 用交联剂将g o d 交联与带有氨基或环氧基等功能团的硅橡胶膜上，实现了酶的固 定化。 1 4 3 物理包埋法 物理包埋法是采用凝胶聚合物包埋酶分子或细胞并固定在高分子聚合物三 维空间网状结构中。包埋法可以分为f 4 5 4 8 1 高分子载体包埋法、电聚合高分子包埋 法、碳糊包埋法。该技术的特点是：i 对酶活性影响较小；i i 膜的孔径和几何形状 可以任意控制；i i i 可以采用温和的试验条件和多种凝胶聚合物；i v 大多数酶可以 荔灵敏度的荧光免疫i ) i 听芍泫0 研究 容易地掺入到聚合物膜中，一般不产生化学修饰；v 包埋的酶不易泄漏，也可以采用 其它固定化技术如交联法和共价键合法进一步提高包埋的稳定性。程发良【4 9 l 用电 化学方法在吡咯聚合的同时，将脲酶掺杂进聚吡咯膜中形成以聚吡咯为基质的脲酶 电极。该电极稳定性和重现性较好，l5 天后，酶活力下降6 4 。 a n s g a r 等x t 5 0 j 利 用聚氨基甲磺酰胺凝胶包埋固定肌氨酸氧化酶，以铁氰化物为媒介体，在丝网印刷 电极上制成了厚膜传感器，用于h 2 0 2 的测量，效果满意。 1 4 4 共价键合法 共价键合法是通过化学试剂将生物活性单元通过共价键与电极表面结合而固 定在转换器表面的方法。 5 1j 通常要求在低温( 0 ) 、生理p h 和低离子强度条件下进 行，并加入酶的底物以防止酶因其活性部位与电极表面发生键合作用而失活。一般 是通过硅烷试剂或生物素亲和素蛋白共价键合。 5 2 - 5 6 文i j 盛辉用3 氨基丙基三乙氧 基硅烷在石墨电极表面硅烷化以导入氨基，然后用乙基( 3 二甲基丙基) 碳二亚胺盐 酸盐作为偶联活化剂，通过5 端磷酸基以磷酸氨基酯键的形式将单联d n a ( s s d n a ) 共价固定在石墨电极表面。固定化后的s s d n a 的杂交特性未发生变化，能够有效地 与溶液中的互补链c d n a 进行杂交反应。h y u n 等【57 】用胱胺对金电极氨基化后，将 经1 0 4 。氧化后带有大量醛基的g o d 和带有许多氨基的树枝状的聚酰氨基胺交 替键合到金电极表面上，形成层状膜结构。该电极对葡萄糖的敏感度为1 4 7 1 x a m m o l c m ，电极制作简单，其敏感度和膜厚度可以控制，并且固定化酶可以是一 种也可以是多种。 1 5 免疫分析的应用及发展前景 免疫分析具有特异性高、灵敏度高( 检测极限可达1 1 0 0 0n g m l ) 、方便快 捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点。一般不需要贵重仪器，对使用人 员的专门技术要求不高，容易普及和推广。因此，免疫分析技术是2 l 世纪最具竞争 性和挑战性的检测分析技术。 免疫分析技术在食品卫生、医学诊断、农业、畜牧业、环境检测等领域有着 广泛的应用和发展前景。在食品卫生领域，对于粮食等农产品，主要为农药及其 代谢物的残留，几乎所有的化学合成杀虫剂在产品或环境中残留时间较长，且残留 成分复杂。而免疫分析则较好地解决了这一难题。在疾病诊断应用方面，如流行 病的调查、妊娠诊断及排卵期预测、毒品( 检测尿样中毒品如吗啡、海洛因) 检验等。 最近，利用量子点标记、基于免疫学原理的方法也成功地用于细菌的检测。李 等人【58 】用量子点作荧光标记物，结合免疫磁分离技术，采用蓝色发光二极管( l e d ) 激发光源、c c d 为检测器的便携式光谱仪进行大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 的测定。量子 点独特的性质基于它自身的量子效应，当颗粒尺寸进入纳米量级时，尺寸限域将引 硕i j 学位论文 起尺寸效应、量子限域效应、宏观量子隧道效应和表面效应，从而派生出纳米体系 具有常观体系和微观体系不同的低维物性，展现出许多不同于宏观体材料的物理化 学性质在非线形光学、磁介质、催化、医药及功能材料等方面具有极为广阔的应 用前景，同时将对生命科学和信息技术的持续发展以及物质领域的基础研究产生深 刻的影响【5 引。相信纳米量子点标记在未来的医学快速诊断、食品安全检测控制，尤 其在检验检疫领域会有广泛应用。有专家预测，2 l 世纪初几项以芯片、微流体和 生物传感器为基础的新技术将运用到临床实验室，其中多数为免疫测定、e l i s a 或酶免疫测定的延伸。这些新发明也越来越广泛、越来越深入地与分子识别领域 互相渗透、互相结合、互相促进。 1 6 本论文的工作构思 在广泛查阅有关荧光免疫分析法的相关文献的基础上，结合本实验室原有工 作、实验条件，主要针对人胸苷激酶、日本血吸虫抗体等重要疾病标志分子，利 用磁性纳米颗粒，发展响应性能良好、高灵敏度的酶催化荧光免疫分析方法，并 通过与传统固定化方法相比较，初步验证所开发的固定化程序的潜在优势以及建 立的免疫分析技术用于临床实际诊断的可行性。 ( 1 ) 提出了一种新的基于磁性纳米颗粒的荧光免疫检测方法。利用磁性纳米 颗粒上的氨基固定c 3 抗原。研制了一种基于磁纳米颗粒作为生物载体，用于c 3 检测荧光免疫分析方法，将辣根过氧化物酶标记抗体( h r p a b ) 和磁性纳米颗粒 上固定的c 3 ( m n p s c 3 ) 与待测c 3 发生竞争性免疫反应，h r p a b 可以催化荧光 底物3 ，3 ，5 ，57 四甲基联苯胺( t m b ) 发生淬灭，所以待测c 3 浓度可由底物溶液荧光 猝灭的大小来判断。 ( 2 ) 提出一种基于磁性纳米颗粒的人胸苷激酶l ( h t k l ) 荧光免疫分析方法。 h t k l 通过共价吸附到核壳结构的磁性颗粒表面，与样品中的h t k l 共同竞争辣根 过氧化物酶标记的抗体( h r p a b ) 然后以对羟基苯丙酸( h p p a ) 为底物，通过 测定酶催化下荧光强度的增加来间接测定样品中抗原的浓度并应用于人血清中 h t k 的测定。 ( 3 ) 发展高效酶催化放大方法，利用脱硫生物素及生物素与亲合素的竞争综 合反应，提出一种基于循环富集辣根过氧化物酶的用于检测人i g g 的新型荧光酶 免疫分析方法。脱硫生物素与亲合素的结合常数比较小，当其与亲合素结合后， 在生理条件下即可被生物素取代，利用此取代反应实现对辣根过氧化物酶进行循 环富集。 高灵敏叟的荧七免疫分析方法盯1 研究 第2 章基于磁性颗粒的人血清补体c 3 荧光免疫分析 2 1 前言 补体以c 表示，为一组血清蛋白，共9 种成分( c 1 c 9 ) ，约占血清总蛋白的 lo ，但含量各不相同，在各种肾小球疾病的发病机制中，几乎都有补体参与， 它是导致炎症反应、造成组织损害的重要介质，除具有增强免疫球蛋白对相应细 胞的免疫杀伤作用外，在激活过程中所产生的补体碎片及其复合物，还具有促进 吞噬、免疫粘附、过敏毒性、白细胞趋化及溶细胞等生物活性。补体的激活途径 有两种：经典途径和旁路途径。补体c 3 是补体系统中含量最多、最重要的一个组 分，是补体两条激活途径的中心环节，有着重要的生物学功能，其正常值为5 0 0 1 5 0 0 m g l 。 c 3 降低主要见于免疫复合物引起的。肾炎，系统性红斑狼疮，反复性感染，皮 疹，肝炎，肝硬化，关节疼痛等；而其增高主要见于各种传染病和急性炎症，肝 癌等。因此测定血清补体c 3 对肾炎等的诊断、治疗和判定预后都具有重要意义 6 0 - 6 5 j ，发展高灵敏补体c 3 的快速检测方法仍是一件重要的工作。 现代荧光免疫分析作为一种高灵敏分析技术已被广泛应用到医学，生物学和 环境学等领域【6 6 , 6 7 】，尤其是酶促荧光免疫分析，利用具有潜在荧光的底物作为酶 标物催化放大的显示系统，由于累积放大和荧光的高敏感性，使方法学的灵敏度 提高很多。但传统的免疫反应都是在酶标板中进行，反应界面相对较小，造成反 应不均匀，耗时长。近年来，随着材料科学的发展，磁性颗粒也广泛应用到分析 科学领域，磁性颗粒性能稳定，功能化后可方便地实现抗原或抗体的固定化，并可 均匀分散在液相中与相应的抗体或抗原反应，在外加磁场的作用下，可快速有效地 实现免疫复合物与反应液的分离，具有固定均匀、特异性高、分离快、重现性好等 特点，为样品的分离、富集和提纯提供了很大方便【6 8 , 6 9 】。在本文中，研制了一种基 于磁纳米颗粒作为生物载体，用于c 3 检测荧光免疫分析方法，将辣根过氧化物酶 标记抗体( h r p a b ) 和磁性纳米颗粒上固定的c 3 ( m n p s c 3 ) 与待测c 3 发生 竞争性免疫反应，h r p a b 可以催化荧光底物3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯胺( t m b ) 发生 淬灭，所以待测c 3 浓度可由底物溶液荧光猝灭的大小来判断。由于磁性纳米颗 粒的用量非常少，该方法可以进行快速方便的抗原抗体检测，而且检测限低，可 满足临床分析的要求。 22 实验部分 2 21 试剂和仪器 c 3 和i i r p a b j i ! f 博荚生物科技有。糙公刊( 合肥) 。3 ，3 + ，55 t _ 四甲琏蛾苯胺 f t m b ) 、蒜m 过氰化碑( i i r p ) 和3 氰基一已氧j 硅烷( a p t e s ) 购臼s i g m a 公剐。3 0 过钮化氲和十血清白赁白( b s a l 购臼上海试剂公司。不同口h 的磷酸 盐缓冲溶液( p b s ) 山o0 1 mn a 2 h p 0 4 和o0 1 mk h 2 p 0 4 成比例配成。其余试剂均 为分# r 纯，实验川水为超纯水。 荧光弧度用i ? 一4 5 0 0f l 荧光分光仪( h 本门立公司) 洲得。 222 磁性纳米颗粒的制备 磁性纳米颗粒按如下方法制备得到。将f e c i36 h 2 0 和f e c l 24 h 2 0 溶于20 m 的h c i 溶液。t 使得f c 2 + 和f e 卜的浓度分别为04m 和o8 m 。将i ：e 2 + f e 3 * 混 什溶液( 4m l ) 倒入