（分析化学专业论文）共振瑞利散射测定核酸和抗生素的新方法研究.pdf

共振瑞利散射测定核酸和抗生素的新方法研究 一一一 摘要 ( 共振瑞利散射( r r s ) 方法是近几年迅速发展起来的新分析技术，因其灵敏度 高、选择性好、操作简便等显著特点而备受分析工作者的关注。目前，它已广泛应 用于攘酸、蛋白质等生物大分子及痕量元素的测定，用于抗生素类药物的分析鲜见 报道本文研究了盐酸氯丙囔一核酸，氨基糖苷类抗生素核酸，阳离子表面活性剂 核酸，酸性双偶氮一氨基糖苷类抗生素和镧( i i i ) 四环素类抗生素等五种新体系的 r r s 光谱极其在核酸和抗生素测定中的应用，探讨了它们的光谱特性、影响因素、 分析参数和实际应用，建立了方便、快速测定核酸和抗生素药物的新方法。其中， 阳离子表面活性剂一核酸体系可用于纳克级核酸的分析；氨基糖营类抗生素一核酸体 系中庆大霉素和卡那霉素对d n a 测定具有很好的特异性，对r n a 不产生响应信 号；镧( i i i ) 一四环素类抗生素体系对测定金霉素和强力霉素有很高的选择性，而结 构与性能相似的四环素类其他成员如土霉素及四环素则无r r s 响应，这与量子化 学半经验稗序计算结果一致。 盐酸氯丙嗪核酸体系 p h 2 3 的b r 缓冲溶液中，核酸与盐酸氯丙嗪作用，产生强烈的共振瑞利散 射信号，最大散射峰位于4 0 0 n m 。以小牛胸腺d n a 为例，研究了体系适宜条件及 疗法的选择性。d n a 浓度在o 4 o g g m l 、r n a 浓度在o 8 2 9 9 m l 范围内与散射 强度成线。r l ：关系检测限分别为7 6 n g m l ( c t d n a ) 、1 1 3 n g m lf h d n a ) 、1 1 5 n g m l ( s d n a ) 和2 84 n g m l ( y r n a ) 。用于四个合成样的分析，准确性高，重复性好。 氨躲糖营类抗生素核酸体系 n 泻日酸性b r 缓冲溶液中，核酸与新霉素、卡那霉素、妥布霉素和庆大霉素等 氰j 占栅_ 1 = 炎抗生素反喧，产：生强烈的共振瑞利散射信号，四种抗生素一核酸体系具有 相似的r r s 光谱图最大共振峰位于4 7 0 n m 附近。用于核酸的测定，线性范围广 ( c t d n a ：0 - 1 0 9 9 m l ，y r n a ：0 1 6 1 a g m l ) 。灵敏度高，检测限分别为c t d n a ( n g m l ) ： 厂、 一 1 3 2 ( g e n ) ，1 7 4 ( k a n a ) ，l i 4 ( t o b ) ，1 3 8 ( n e o ) ；h d n a ( n g m l ) ：15 6 ( g e n ) ，2 0 6 ( k a n a ) ，12 4 ( t o b ) ，l6 5 ( n e o ) ；y r n a ( n g m l ) ：3 9 6 ( t o b ) ，2 6 7 ( n e o ) 。其中，庆大霉素和 k 那霉素对d n a 测定具有很好的特异性，对r n a 无信号响应。用于合成样品的分 析，结果满意。 三阳离子表面活性剂核酸体系 在弱酸或弱碱性b r 缓冲介质中，溴化十六烷基吡啶( c p b ) 、溴化十四烷基毗 啶( t p b ) 、氯化十六烷基二甲基苄铵( c d b a c ) 、氯化十四烷基二甲基苄铵( z e p h ) 和溴化十六烷基三甲铵( c t a b ) 与小牛胸腺d n a 和酵母r n a 混合，因静电引力 及长链烷基的疏水作用而导致共振瑞利散射显著增强，最大共振峰位于4 7 0 n m 处。 方法对d n a 测定有很高的灵敏度，五个体系检测限在6 6 1 3 3 p g m l 之间；对r n a 测定则有较宽的线性范围，均超过8 0 1 t g m l 。文中重点讨论了各体系灵敏度与阳离 子表面活性剂( c s ) 性质的关系；总结出r r s 强度与c s 的浓度和分子量之间的规 律以及c s 的浓度对核酸构象的影响。方法用于合成样品中核酸的测定，结果满意。 四某些酸性双偶氮染料氨基糖苷类抗生素体系 依文思蓝( e b ) 、曲利本蓝( t b ) 、曲利本红( t r ) 和滂胺天蓝( p s b ) 等酸性双偶氮染 料在酸性条件下，与硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、硫酸庆大霉素和硫酸妥布霉素等 氨基糖苷类抗生素形成离子缔合物，从而产生强烈的共振瑞利散射信号，最大散射 峰分别位r4 0 0 n m ( t r ) 、3 6 0 n m ( e b ) 及3 7 0 n m ( t b 和p s b ) 。线性范围0 - 6 0 1 a g m l ， 榆测限1 4 4 3 6 8 n g m l 。四种染料用于测定抗生素，t r 抗生素体系灵敏度最高；对 j ：嗣种染料，测定灵敏度从高到低的顺序依次为k a n a n e o t o b g e n 。用于 i ；抚，素注射液或滴耳液分析，获得满意结果。 血l a 。四环素类抗生素分析 在弱碱性 i r i s h c i 缓冲溶液中，三价金属镧离子与金霉素( c t c ，、强力霉素 ( d o t c ) 生成稳定六元螯合物，产生r r s 增强，特征峰位于4 5 0 n m ( c t c l a ”) 、 4 2 2 n , n d o t c l a 。) 。灵敏度l u 达( x 1 0 。9m o l l ) 7 0 ( d o t c ) 和8 3 ( c t c ) 。方法 埘测定会霉素和强力霉素有特异性，而结构和性能相似的四坏素族其他药物如四环 素( t c ) 及土霉索( o t c ) 对分析不干扰。这与量子化学半经验程序( a m l ) 计 算结果一致。由此建立测定上述药物的高选择性、高灵敏度r r s 法，用于合成样 i l e l , c t c 及d o t c 的测定，结果满意。，1 | 、 a s t u d y o nt h en e wm e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d sa n d a n t i b i o t i c sb yr e s o n a n c e r a y l e i g hs c a t t e r i n g a b s t r a c t r e s o n a n c er a y l e i g hs c a t t e r i n g ( r r s ) i san e wt e c h n o l o g yd e v e l o p e di nr e c e n ty e a r s f o ri t sr e m a r k a b l ec h a r a c t e r i s t i c so f h i g hs e n s i t i v i t y , h i g hs e l e c t i v i t ya n ds i m p l eo p e r a t i o n ， t h i sm e t h o db r i n g st om o r ea t t e n t i o na n di n t e r e s t i n ga n dh a sb e e na p p l i e dw i d e l yt ot h e d e t e r m i n a t i o no f b i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e ss u c ha sn u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n s m o r e o v e r t h i st e c h n o l o g yh a sb e e nu s e dt ot h es t u d ya n dd e t e r m i n a t i o no f t r a c ea m o u n t so f i n o r g a n i c i o n s h o w e v e r ，t h e r ei sr a r e l yr e p o r ta b o u tt h i st e c h n o l o g yu s e dt o t h ea n a l y s i so f a n t i b i o t i cd r a g s i nt h i sp a p e lt h er r s s p e c t r aa n dt h e i ra p p l i c a t i o no ft h en e wf i v es y s t e m ss u c ha s c h l o r p r o m a z i n eh y d m c h l o d d u m n u c l e i ca c i ds y s t e m s ，a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s n u c l e i c a c i ds y s t e m s ，c a t i o ns u r f a c t a n t s - n u c l e i ca c i ds y s t e m s ，s o m eb i s a z od y e - a m i n o g l y c o s i d e a n t i b i o t i c s y s t e m s a n dl 矿- t e t r a c y c l i n ea n t i b i o t i c s s y s t e m s f o rt h ed e t e r m i n a t i o no f n u c l e i ca c i d sa n da n t i b i o t i c sh a v eb e e ns t u d i e d t h e s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s ，t h e i n f l u e n c i n gf a c t o r s t h ep r o p e r t i e so fa n a l y t i c a lc h e m i s t r ya n dt h e i ra n a l y t i c a la p p l i c a t i o n s h a v eb e e n i n v e s t i g a t e d t h en e w , s i m p l e ，f a s ta n d a c c u r a t em e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o n o fn u c l e i ca c i d sa n da n t i b i o t i c sh a v eb e e nd e v e l o p e d a m o n g t h e m ，t h ec a t i o ns u r f a c t a n t n u c l e i ca c i ds y s t e m sc a nb ea p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d sa t n a n o g r a m l e v e l s g e n t a m i c i na n dk a n a m y c i ni nt h ea m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s n u c l e i ca c i ds y s t e m s h a v ev e r yh i g hs p e c i f i c i t yf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd n aa n dh a v en os i g n a lo fr r sf o r r n a l a 3 - t e t r a c y c l i n e a n t i b i o t i c ss y s t e m sh a v ev e r yh i g hs e l e c t i v i t yf o rt h ed e t e r m i n a t i o n o fc h l o r t e t r a c y c l i n e ( c t c ) a n dd o x y c y c l i n e ( d o t c ) o t h e rt e t r a c y c l i n ea n t i b i o t i cd r u g s w i t hs i m i l a rs t r u c t u r e sa n d p r o p e r t i e ss u c h a so x y t e t r a c y c l i n e ( o t c ) a n d t e t r a c y c l i n e ( t c ) h a v e n7 ts u c hr r s r e s p o n s et ol a 。t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t sa r ec o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l t s c a l c u l a t e db ys e m i - e m p i r i c a lp r o g r a mo f q u a n t u mc h e m i s t r y , a m im e t h o d 1 c h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d u m - n u c l e i ca c i ds y s t e m s i nb r i t t o n r o b i n s o nb u f f e rs o l u t i o no fp h2 - 3 ，t h er e a c t i o n so fn u c l e i ca c i d sw i t h c h l o r p r o m a z i n eh y d r o c h l o r i d u m c a n p r o d u c e i n t e n s i v e s i g n a l s o fr r s ，w h i c hi t s m a x i m u mr r sp e a l ( i sl o c a t e da t4 0 0n n l t a k i n gc t d n af o ra l le x a m p l e ，t h es u i t a b l e r e a c t i o nc o n d i t i o n sa n dt h es e l e c t i v i t yo ft h em e t h o dh a v eb e e ns t u d i e d t h ei n t e n s i t yo f r r si sd i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o ni nt h er a n g eo f0 - - 4 0l a g m lf o rd n a a n d 8 2p g m lf o rr n a t h em e t h o dh a sh i g hs e n s i t i v i t y , a n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti s7 6 n g m lf o rc t d n a ，i 1 3 n g m lf o re d n a ，i 1 5 n g m lf o rs d n a a n d2 8 4n g m lf o r y r n a t h em e t h o dh a s b e e na p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d si nf o u r s y n t h e t i cs a m p l e s w i t h h i g ha c c u r a c ya n dg o o dr e p e t i t i o n 2 a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s - n u c l e i ca c i ds y s t e m s i nw e a ka c i d i cb r i r o n - r o b i n s o nb u f f e rs o l u t i o n ，t h er e a c t i o n so fn u c l e i ca c i d sw i t h s o m e a m i n o g l y c o s i d e a n t i b i o t i c ss u c ha s k a n a m y c i n ( k a n a ) ，g e n t a m i c i n ( g e n ) ， t o b r a m y c i n ( t o b ) a n dn e o m y c i n ( n e o ) c a np r o d u c ei n t e n s i v es i g n a l so fr r s t h e r e s o n a n c e r a y l e i g hs c a t t e r i n gs p e c t r ao f t h ef o u rs y s t e m sa r es i m i l a ra n dt h e i rm a x i m u m r r s p e a k s a r ea l ll o c a t e dn e a r4 7 0n l n t h el i n e a rr a n g e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i c a c i d sa r ew i d ea n dt h ei n t e n s i t yo fr r si sd i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o ni nt h e r a n g eo f0 - 1 0 0i x g m l f o rc t d n a ，0 - 1 6 0p , g t m lf o r y r n a t h em e t h o dh a sh i g h s e n s i t i v i t ya n dt h ed e t e c t i o nl i m i tf o rc t d n a i s13 2n g m l ( g e n ) ，17 4n g m l ( k a n a ) ， i1 4 n g m l ( t o b ) a n d13 8n g m l ( n e o ) t h ed e t e c t i o nl i m i tf o rh d n a i s15 6n g m l ( g e n ) 2 0 6n m l ( k a n a ) ，12 4 n g m l ( t o b ) a n d16 5n g m l ( n e o ) a n dt h e d e t e c t i o nl i m i tf o ry r n ai s3 9 6n g m l ( t o b ) a n d2 6 7n g m l ( n e o ) a m o n g t h e m ，t h e 4 、 t w os y s t e m so fg e n - n u c l e i ca c i da n dk a n a - - n u c l e i ca c i dh a v eh i g hs p e c i f i c i t yf o rt h e d e t e r m i n a t i o no fd n aa n dh a v en os i g n a lo fr r sf o rr n a t h em e t h o dw a s a p p l i e dt o t h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d si ns y n t h e t i cs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 3 c a t i o ns u r f a c t a n t s - n u c l e i ca c i ds y s t e m s i nw e a ka c i d i co rw e a kb a s i cb f i r o n r o b i n s o nb u f i e rm e d i u m t h er e a c t i o n so f c t d n aa n dy r n aw i t ht h ec a t i o ns u r f a c t a n t ss u c ha sc e t y l p y r i d i n i u mb r o m i d e ( c p b ) ， t e t r a d e c a n e p y r i d i n i u mb r o m i d e ( t p b ) ，c e t y l d i m e t h y lb e n z y l a m m o n i u m c h l o r i d e ( c d b a c ) ，t e t r a d e c y l d i m e t h y lb e n z y l a m m o n i u m c h l o r i d e ( z e p h ) a n d c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ( c t a b ) b yv i r t u e o fe l e c t r o s t a t i ca n dh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nf o r c e sc a nl e a dt ot h eg r e a te n h a n c e m e n to fr r s i n t e n s i t y t h em a x i m u mr r s p e a k sa r el o c a t e da t4 7 0n m t h em e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fd n a h a sv e r yh i g h s e n s i t i v i t ya n dt h ed e t e c t i o nl i m i t so ft h ef i v es y s t e m sa r eb e t w e e n6 6g g m la n d13 3 g g m l t h el i n e a rr a n g e sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fr n a a r ew i d e ，w h i c ha r ea l lo v e r8 0 m lt h e d i s c u s s i o nc e n t r e do nt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h es e n s i t i v i t i e so ft h es y s t e m s a n dt h ep r o p e r t i e so ft h ec a t i o ns u r f a c t a n t s ( c s ) t h el a wo ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e r r s i n t e n s i t ya n d c o n c e n t r a t i o n sa n dm o l e c u l a rw e i g h t so fc sa sw e l la st h ee f f e c to f t h e c o n c e n t r m i o no fc so nt h ef o r mo fn u c l e i ca c i d sh a sb e e ns u m m a r i z e d t h em e t h o dw a s a p p l i e d t ot h ed e t e r m i n a t i o no fn u c l e i ca c i d si ns y n t h e t i cs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t s 4 s o m eb i s a z od y e - a m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i cs y s t e m s i na c i db r i t t o n - r o b i n s o nb u f f e rm e d i u m ，s o m ea m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c s s u c ha s k a n a m y c i n ( k a n a ) ，g e n t a m i c i n ( g e n ) ，t o b r a m y c i n ( t o b ) a n dn e o m y c i n ( n e o ) r e a c t w i t hb i s a z od 、e ss u c ha se v a n sb l u e ( e b ) ，t r y p a n b l u e ( t b ) ，t r y p a nr e d ( t r ) a n d p o n t a m i n es k yb l u e ( p s b ) t of o r mt h ei o na s s o c i a t i o nc o m p l e x e st h e s er e s u l ti nt h e s i g n i f i c a n te n h a n c e m e n to f r r s i n t e n s i t y t h em a x i m u mr r s p e a ki s a t4 0 0n mf o rt r a n t i b i o t i c s 3 6 0n mf o re b a n t i b i o t i c sa n d3 7 0 n mf o rt b a n t i b i o t i c sa n dp s b a n t i b i o t i c s 、 s e p a r a t e l y t h e l i n e a rr a n g e so ft h ea m i n o g l y c o s i d ea n t i b i o t i c sa r eb e t w e e n0a n d6 0 p m lt h ed e t e c t i o nl i m i t sa r eb e t w e e n14 4n g m la n d3 6 8n g m l a m o n gt h e m ，t h e s e n s i t i v i t i e so ft h et r a n t i b i o t i c sa r et h eh i g h e s t t h eo r d e ro ft h es e n s i t i v i t i e sf r o m h i g ht ol o w f o rt h es a m ed y ei sk a n a n e o t o b g e n t h em e t h o dw a ss u c c e s s f u l l y u s e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fa n t i b i o t i c si ni n j e c t i o n so fa n t i b i o t i c sa n de a r d i p ss a m p l e s 5 l a 3 + - t e t r a e y e l i n ea n t i b i o t i c ss y s t e m s i nw e a kb a s i c ir i s h c ib u f f e rs o l u t i o n ，l a ”c a nr e a c tw i t ht e t r a c y c l i n ea n t i b i o t i c ss u c h a sc h l o r t e t r a c y c l i n e ( c t c ) a n dd o x y c y c l i n e ( d o t c ) t of o r mt h es t a b l ec h e l a t e s ，w h i c h c a nr e s u l ti nt h eg r e a te n h a n c e m e n to fr r s i n t e n s i t y t h em a x i m u m r r s p e a ki sl o c a t e d a t4 5 0a mf o rc t c l a 3 + a n d4 2 2n l nf o rd o t c l a ”r e s p e c t i v e l y t h em e t h o dh a s h i g h s e n s i t i v i t ya n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti s8 3 x 1 0 4 m o l lf o rc t c a n d7 o x l 0 4 m o l lf o rd o t c m o m o v e l t h et w o s y s t e m sh a v eh i g hs p e c i f i c i t yf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fc t c a n dd o t c o t h e r t e t r a c y c l i n e a n t i b i o t i c d r u g s w i t hs i m i l a rs t r u c t u r e sa n d p r o p e r t i e s s u c ha s o x y t e t r a c y c l i n e ( o t c ) a n dt e t r a c y c l i n e ( t c ) d o n t i n t e r f e r et h ed e t e r m i n a t i o n t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t sa r ec o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l t sc a l c u l a t e db ys e m i e m p i r i c a lp r o g r a m o l q u a n t u mc h e m i s t r y ( a m im e t h o d ) t h e r e f o r e ，ah i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v er r s m e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fa b o v ed r u g sh a sb e e nd e v e l o p e da n dw a sa p p l i e dt ot h e d e t e r m i n a t i o no ft r a c ea m o u n t so fc t ca n dd o t ci ns y n t h e t i cs a m p l e sw i t hs a t i s f a c t o r y r e s u l t s 用共振瑞利散射测定核酸和抗生素的新方法研究 前言 一核酸 核酸是由数十至数十亿个核苷酸( n u c l e o t i d e ) 通过3 ，5 磷酸二酯键连接而成 的一类生物大分子，它是生命现象中不可缺少的物质，也是生物遗传信息的载体， 并控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能。从1 8 6 9 年瑞士科学家f r i c d r i c h m i e s c h e r 发现核酸，到1 9 5 3 年w a g o n 和c r i c k 阐明d n a 双螺旋结构，到今天的 分子生物学、分子遗传学和基因治疗学的迅速发展，无不标志着核酸研究工作的活 跃。核酸大分子与药物小分子或蛋白质大分子的相互作用已成为研究生物大分子识 别和药物合理设计的基础。人类基因组计划的进行正逐步揭开生命的奥秘并造福于 人类。而核酸的定量测定无论对于生物学还是临床医学都是一项重要且基本的工 作，因此，进一步研究和发展高灵敏度、高选择性、简便快速的测定核酸的方法， 是分析工作者关注的课题。 在测定核酸的诸多方法中，分光光度法和荧光法最常见。此外，近几年迅速发 展起来的新分析技术一共振瑞利散射方法用于核酸的测定，因其灵敏度高、选择性 好、操作简便等显著特点而受到分析工作者的广泛关注。 1 分光光度法 分光光度法是测定核酸的经典方法。它包括基于核酸分子含磷、含核糖或脱氧 核糖的定磷法、定糖法和基于核酸杂环碱基上共轭双键结构的紫外光度法等。 1 1 定磷法 用浓硫酸将核酸样品消化，使有机磷转化成无机磷，再用钼蓝光度法法测定。 如利用钼酸赫与磷酸根反应生成磷钼杂多酸，再用抗坏血酸还原为磷钼蓝，通常可 在6 6 0n m 处测量吸光值，在一定磷浓度范围内，吸光曲线度与浓度成j 下比：。刘笑 美等3 用于胎盘组织液核酸含量的测定，回收率9 9 9 。定磷法准确性好，灵敏度 较高，可作为紫外吸收法和定糖法的基准方法4 。 1 2 定糖法 酸性条件下，核酸的嘌呤核苷键先水解断裂成含有戊糖醛基的去嘌呤酸，而后 进一步转变为糖醛衍生物，后者与某些试剂呈显色反应，由此可对核酸进行定量测 定。定糖法多用于大分子核酸的测定，此法准确性、灵敏度较差，干扰物质甚多， 其优点是可以鉴别r n a ，d n a 。根据所用试剂不同可分为以下几种方法： 二苯胺法 在强酸性溶液中，d n a 水解产物与二苯胺反应显蓝色，最大吸收 波长位于6 0 0 n m 处。d n a 测定范围2 5 - 2 5 0 1 - l g m l 5 。该方法费时( 需1 6 - 2 0 h ) ，反 应条件苛刻，易造成样品损失。b u r t o n 等对方法加以改进，提高了灵敏度，并用于 组织d n a 的测定”，文献9 。o 缩短了实验时间。 硫代巴比士酸法d n a 的酸水解液中，加入高氯酸和硫代巴比士酸( 又称丙 二酰硫脲) ，呈粉红色，在5 3 2 n m 处有最大吸收，用于d n a 的测定，范围为 o 5 5 0 0 p g m l ，r n a 和蛋白质不干扰测“。 二氨基苯甲酸法将d n a 二氨基苯甲酸二盐酸( d a b a ) 混合液加热( 6 0 ) 3 0 r a i n ，最大吸收峰位于4 2 0 n m 处，用于测定d n a ，线性范围2 5 1 0 0 0 p g m l ”。 地衣酚法( 又称苔黑酚法)r n a 酸解后生成嘧啶核苷酸、嘌呤碱基及核糖。核糖 脱水环化生成糠醛，在c u 2 + 或f e c i ，催化下，糠醛与地衣酚( 3 ，5 二羟基甲苯) 作用 显蓝绿色，最大吸峰位于6 7 0 n m ”。处。在一定范围内，吸收强度与r n a 的浓度成 正比，用以测定r n a 及其衍生物，灵敏度为o 0 1 5 1 m l o l l ”。此法用于湖水和海水 中r n a 测量，低于1 0 m g m l 的氨基酸、糖类不产生干扰拍。 1 3 紫外光度法 核酸中的嘌呤碱基和嘧啶碱基都具共轭双键，强烈吸收2 5 0 , 一2 9 0 n m 的紫外光， 最大吸收值在2 6 0n r n 左右，不同的核苷酸有不同的吸收特性。根据此性质可用紫 外分光光度计对核酸进行测量”。方法简便、快速，灵敏度较高。但在测定粗制品 时，蛋白质、色素等其他紫外吸收杂质有干扰”。 1 4 染料结合法 多核苷酸中两个单核苷残基之间的电离具较低的p k 值( p k ，- 1 5 ) ，当溶液的 p h 值大于4 时，全部离解，呈多阴离子状态”，具有与部分阳离子染料结合的能力。 染料结合法测定核酸具有简便、快速、经济、准确等优点，但蛋白质对测定干扰严 重。如有蛋白质存在，需采取适当的办法， 核酸的染料是一些阳离子染料，如甲基紫、 醌亚胺类染料的甲苯胺蓝等。 1 4 1 甲基绿 预先除去2 “。目前，作为标记物测定 乙基紫、结晶紫、甲基绿以及作为碱性 在p h 7 9 的t r i s - h c i 缓冲溶液中，将甲基绿与核酸的混合液加热至4 5 3 , 3 h 之后，在最大吸收峰6 3 0n l n 处测吸光度，用该法可测定o 3 0 0 1 a g 1 0 m l 的d n a ， 检测限为2 p g 1 0 m l ”。 1 4 2 甲苯胺蓝 甲苯胺蓝水溶液的最大吸收峰位于6 2 8 i l t i 处，当有痕量d n a 存在时，会导 致吸光值降低，降低强度与d n a 浓度成正比。可用于测定亚微克级的d n a ，线 性范围为o 4 0 p , g m l 检测限o 0 4 8 t t g m l 2 3 。与甲基绿法相比，该法灵敏度高、反 应迅速，室温操作即可。因此甲苯胺蓝法是目前测定痕量d n a 的较好方法。 1 4 3 乙基紫 在p t i 6 4 7 4 条件下，乙基紫的特征吸收峰位于5 9 5 n m 处，当加入d n a 后， 乙基紫的吸收峰显著下降，且在5 0 7 n m 处出现新的吸收峰。根据5 9 5 n m 吸收峰下 降的程度，可用于d n a 的定量测定”。响应范围为0 1 0 8 1 0 m o l l ，表观摩尔 吸光系数e 。= 7 2 4 x1 0 4 l m 0 1 c m 。方法操作简便，灵敏度高，选择性好，反应迅 速( 2 m i n 后即可测定) 。 1 4 4 甲基紫 在中性条件下，甲基紫在5 9 7 n m 处有最大吸光度，随着核酸的加入，发生明显 的减色效应，减色强度随核酸浓度增大而加强，据此建立测定核酸的方法。线性范 围分别为o 5 0 m g l ( c t d n a ) 和0 - 1 0 1 m g l ( y r n a ) ”。 1 5 金属螯合阳离子 文献2 6 首次报道了碱性条件下。用黄色的二元金属配合物c o ( i i ) 一5 c 1 p a d a b 与核酸反应后，生成紫红色三元金属配合物，其最大吸收峰位于5 4 5 n m 处，由此建 立了痕量核酸的测定方法。线性范围o q o p g m l ，检测限位于4 0 4 9 n g m l 之间。 方法具有较好的重复性和高的灵敏度，且提高了测定核酸的选择性。 在p h 5 9 7 5 六次甲基四胺h c i 缓冲溶液中且在0 6 的对辛基聚乙醛乙二醇苯 基醚存在条件下，p d ( i i ) 一5 b r - p a d a p 配合物最大吸收峰为5 8 2 n m ，室温下加入核酸 作用7 m i n ， 即产生导致5 8 2 n m 处吸光度降低的新物质，c t d n a ，f s d n a y r n a 线 性范围依次为o - 5 0 p g m l ，0 - 6 0 t g m l ，0 - 3 5 p g m l ；检测限分别为4 4 n g m l ，4 8 n g m l ， 4 3 n g m l 。文中还用r o s e n t h a n l 和w o l f e 图示法估算了c t d n a 和配合物的结合常 数，四分子p d ( i i ) 一5 b r p a d a p 配合物( 金属离子与配体比为1 ：1 ) 能结合一对c t d n a 碱基。方法用于稻米及人脑中d n a 提取物的测定，结果与溴乙啡啶法接近”。 2 荧光法 荧光法是定量测定核酸的另一种常用方法，它是基于荧光试剂的加入，导致溶 液中荧光强度增强或猝灭的原理来测定核酸，通常较光度法有更高的灵敏度。目前， 用于核酸研究和测定的荧光试剂有金属离子、金属配合物、有机荧光小分子试剂及 染料。 2 1 金属离子及金属配合物 近年来，以金属离子或金属配合物作为荧光探针标记和测定核酸得到了很大的 发展，尤其是三价镧系元素，由于它们的共振能带正好与核酸受紫外光激发时的三 线态相重叠，因而能有效的发生从有机配体到中心离子之间的能量转移，使得具有 弱内源荧光的中心离子荧光得到加强，从而成为荧光量子产率高的荧光探针。 常用作核酸探针的金属离子有t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 2