（野生动植物保护与利用专业论文）rhFGF8a高效表达载体的构建及表达.pdf

摘要 成纤维细胞生长因子- - 8 a ( f i b r o b l a s tg r o w t hf a e t o r - 8 a ，f g f s a ) 是成 纤维细胞生长因子家族( f ib r o b l a s tg r o w t hf a c t o rf a m il y ，f g f s 家族) 的 第8 个成员f g f 8 的a 亚型，不仅是胚胎发育阶段必需的细胞调节因子，更有多 种生物学功能，能够高效安全地促进组织损伤的修复，还在神经于细胞培养过 程中起重要的营养和诱导作用，因此有广阔的临床应用前景。重组人f g f 8 a ( r e c o m b i n a n th u m a nf i b r o b l a s tg r o w t hf a t o r - 8 a ，r h f g f 8 a ) 是将人f g f s a 基因经 过体外改造克隆后以生物工程菌表达得到的多肽。具有与天然f g f 8 a 一致的活 性。同时，与从天然动物组织中提取得f g f 8 a 相比，更具有产量高、成本低， 资源丰富的优点。 本文所阐述的研究内容，是r b f g f 8 a 瀑题的一个部分，是广州拜迪生物医 药有限公司与新西兰皇家科学院合作项目的子课题。主要目的是构建新的高效 表达r h f g f s a 的载体，并选择合适的表达宿主对其进行表达，完成高教表达 r h f g f 8 a 的上游工作。 本研究采用分子克隆技术、p c r 扩增技术和d n a 点突变技术，对r h f g f 8 a 基因进行改造，再分别构建到p e t 2 2 b ( + j 和p e t 2 8 a ( + ) 两质粒上，以大肠杆菌 r o s e t t a ( d e 3 ) 和b l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 进行诱导表达，得到具有活性的r h f g f s a 多肽。并且比较了新构建的两种质粒与前期r h f g f 8 a 课题研究所构建的r h f g f 8 a 原质粒在两种表达宿主中的表达量，发现经过基因改造后的r h f g f 8 a p e t 2 2 b 质粒和p e t 2 8 a r h f g f 8 a 质粒在两种表达宿主中的表达量都大大高于未改造的 r h f g f 8 a 原质粒。两种新的高效表达载体r h f g f 8 a - p e t 2 2 b 质粒和 p e t 2 8 a r h f g f 8 a 质粒已符合工业化生产的需要。 此外，本研究还就r h f g f 8 a 表达工程菌的培养条件、诱导流程，分离纯化 和体外复性进行了初步的探索，为r h f g f 8 a 课题的后续工作提供了参考数据并 具有指导意义。 关键词：r h f g f 8 a 基因改造高效表达载体表达 a b s t r a c t t h em e m b e ro f t h ef i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o rf a m i l i y , f i b r o b l a s tg r o w t h f a c t o r 8 ， i s o f o r ma ( f g f 8 a ) i sa c c e p t e da sac r u c i a lo r g a n i z i n gs i g n a ld u r i n gt h ed e v e l o p m e n t o fv e r t e b r a t ee m b r y o s f u r t h e r m o r e ，t h ef g f 8 ai sa l s oe f f i c i e n ti nh e a l i n g o r g a n i c w o u n d ，c u l m f i n g t h en e u r a ls t e mc e l l sa n di n d u c t i o n o f d o p a r n i n e r g i cn e u r o n s s oi ti s s u g g e s t e dt h a tt h ep o t e n t i a la p p l i c a t i o ni sh u g ef o rf g f 8 at ob e n e f i tt h ec l i n i a c a l t r e a t m e n t o u rs t u d yi sap a r to f t h er h f g f 8 ap r o j e c t ，w h i c hi sc o o p e r a t e db yg u a n g z h o u b i o t e c h n o l o g yc o ，l t da n dn e wz e a l a n dc r o w nr e s e a r c hi n s t i t u t e t h ef o r m e r s t u d i e sh a dc o n s t r u c t e dar h f g f 8 a v e c t o rw j t hl o we x p r e s s i o nl e v e la n dd e m o n s t r a t e d t h ee f f i c a c yo f r h f g f 8 a s ow er e c o m b i n e dt h er h f g f 8 aa g a i na n dc o n s t r u c t e dt w o h i g hl e v e le x p r e s s e dv e c t o r s u s i n gt h et e c h n i q u e so f m o l e c u l a rc l o n i n ga n dd n ap o i n tm u t a t i o ns k i l l ，t h e m a t u r er e c o m b i n a n th u m a nf g f 8 ae d n aw a si n s e r t e di n t ot h ep e t 2 2 b ( + ) a n d p e t 2 8 十) ，w h i c hw a st r a n s f o r m e di n t oe s c h e r i c h ac o l ir o s e t t a ( d e 3 ) a n db l 2 1 ( d e 3 ) p l y s s t h ei n d u c t i o ne x p e r i m e n ta n dp r o t e i na n a l y s eh a v er e v e a l e dt h a tt h e e x p r e s s i o nl e v e l so f t h et w on e wv e c t o r sa r em u c hh i g h e rt h a nt h eo r i g i n a lr h f g f 8 a v e c t o r t h ec e l lc u l t u r ei nv i t r oe x p e r i m e n th a sp r o v e dt h ea c t i v i t yo f r h f g f 8 a p r o t e i n i ns u m m a r y , o u rs t u d yh a v ec o n s t r u c t e dt w on e wv e c t o rt oe x p r e s st h er h f g f 8 a p r o t e i ni nh i g hl e y e l ，t h e yc o u l db ea v a i l a b l ef o rl a r g e s c a l ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o na n d p l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h eb i o l o g i c a la n dc l i n i c a lr e s e a r c ho f r h f g f 8 a k e yw o r d s ：r h f g f 8 a ；p o i n tm u t a t i o n ；h i g hl e v e le x p r e s s e dv e c t o r ； e x p r e s s i o n 2 1 基本介绍 第一章前言 成纤维细胞生长因子- - 8 a ( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r 一8 a ，f g f 8 a ) 是成 纤维细胞生长因子家族( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o rf a m il y ，f g f s 家族) 的 第8 个成员f g f 8 的a 亚型，而成纤维细胞生长因子是一类分泌型多肽细胞因子。 目前，f g f s 中研究得最为透彻的是碱性成纤维生长因子( b f g f ) 和酸性成纤维 生长因子( a f g f ) ，而对f g f 8 的研究尚不算多。 1 1f g f 家族及f g f 8 的发现 1 9 7 4 年，o o s p o d a r w i c z 从牛脑垂体中分离纯化，并命名为纤维细胞生长因 子( f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r ，f g f ) 。这是历史上首次分离出的f g f 。接着 又分离出一种与之高度同源的物质，命名为酸性f 6 f ( a f g f ) ，而最先发现的f g f 随之命名为碱性f g f ( b f g f ) 。其后分离癌基因产物的细胞增殖因子与上述f g f s 结构类似，也被分类在f g f s 家族，并依次命名为f g f 3 9 2 1 。它们相互之间的 氨基酸序列有2 0 5 0 是相同的1 3 一i 。随后，通过同源序列p c r 法【“、基因检索 6 , 7 1 、探索视网膜特异性表达基因 z l 、或在探索嵌合体同源结构域癌蛋白 ( c h i m e r ich o m e o d o m a i no n c o p r o t e i n ) e2 a p b x l 下游目标1 8 】过程中发现了 f g f s 的2 3 个成员。2 0 0 3 年，又发现了f g f 2 4 1 9 i ，这是最近发现的f g f 家族成 员。 f g f 8 基因最早由l o r e n z i 等( 1 9 9 5 ) 从小鼠睾丸克隆得到。经结构分析发 现其与雄激素诱导的生长因子( a n d r o g e nin d u c e dg r o w t hf a c t o r ，a i g f ) 相 似。当时，这一1 6k b 左右的f g f 基因仅在睾丸中发现，却不能在其他成熟组 织中分离出1 1 0 1 。 f g f 8 多肽最早则是从激素依赖的癌细胞系获得的。过去，人们认为成人 f g f 8 表达部位仅限于生殖腺部位。l o r e n zj 等( 1 9 9 5 ) 的研究显示，在胚胎开始 发育的9 - - 1 3 天内，f g f 的表达受限制的程度逐步加强。但z a m m i t 等( 2 0 0 2 ) 发 现f g f 8 在人类乳癌组织及正在泌乳的乳腺中高水平表达，并在人类乳汁中检测 到f g f 8 。并目f g f 8 在结肠、乳房、输卵管、予宫等增生的上皮细胞也有所表 达【1 1 】。 1 2f g f 8 的基因定位 以同位素杂交定位法，m a t t e i 等( 1 9 9 5 ) 发现鼠的f g f 8 基因在1 9 号染色 体的c 3 一d 区【1 2 。y o s h i u r a 等( 1 9 9 7 ) 则证明了人f g f 8 基因位于1 0 q 2 4 区段”l 。 1 3f g f 8 的基因及其蛋白结构 f g f 8 作为f g f 家族的第8 个成员，除具有该家族的共同特性外，还具有自己 的特点。f g f 8 与己发现家族成员具有3 0 4 0 的同源性【l ”。g e m e l 等( 1 9 9 6 ) 揭示了f g f 8 基因的结构和序列。人类f g f 8 基因大约长6 k b ，有6 个外显子， 分别编号为1 a 、l b 、l c 、1 d 和2 、3 ，其中外显子2 、3 编码与鼠科动物的完全 一致。而外显予1 c 和鼠相差4 个氨基酸。外显子l b 则和鼠差异显著，仅前1 2 个氨基酸的密码子与鼠一致。因l b 存在两个终止密码而导致人f g f 8 没有c 、d 、 g 、h 亚型 ”】。y o s h i u r ae ta 1 ( 1 9 9 7 ) 记述了人类f g f 8 的普遍序列，揭示了 人、鼠序列的保守性，包括选择性拼接【1 。 由于r n a 的选择性剪接，鼠共有f g f 8 a 、d 、c 、d 、e 、f 、g 、h8 种有功能 的亚型( i s o f o r m s ) ，是已发现的f g f s 中亚型最多的一个。人类f g f 8 a 、b 亚型 与鼠一致，f g f e 和f 有9 8 同源。与鼠相比，人f g f 8 没有c 、d 、g 、h 亚型。 但是在脊椎动物的发育过程中，f g f 的后几个亚型并不重要【1 ”。 l s o f o r m g f8 a g f s b g f b e g f 8 f s p l i c e dr q r n a e e , x d e ，c ，。t ，e 。d s t z e ( ，b a l 网固 3 3 3 岩黼面f t 1 。3 6 ：6 。 匝珏曩四453 幽lv i n c e n tb r o n d a n ia n df r a n p o ish a m y ( 2 0 0 0 ) 以r t - - p c r 得到的人f g f 8 基因 结构及亚型a ：f g f 8 基因的m r n a 选择性剪切显示了4 组c d n a 所对应的4 种亚型，描述了 引物f t l 、f t 2 和f t 3 的方向。 2 f g f 8 在脊椎动物胚胎发育过程中的作用 作为一种胚胎期高水平表达的生长因子，f g f 8 在脊椎动物胚胎发育过程中 起着至关重要的作用。f g f 8 信号对发育中的胚胎组织有着直接作用，并通过与 其它调控因子( 如f g f s 其它成员、s h h 、w n t 、b m p 、s e f 等) 的交互作用对胚 胎发育间接调控，而在组织发育成熟后受到限制【1 7 】。f g f 8 蛋白质的空间结构揭 示了f g f 8 的功能和胚胎表皮因子( e m b r y o n ce p i t h e l i a lf a c t o r ) 类似，有证 据表明f g f 8 参与胚胎背腹轴形成、原肠胚形成、神经系统发育、骨骼、四肢、 颅面部器官、心脏、肝脏、肾脏等形成。敲除( k n o c ko u t ，k o ) f g f 8 的编码 基因，小鼠在胚胎期就死亡或出生即刻死亡【4 】。 2 1f g f 8 在神经发育过程中的作用 从最初均一的神经上皮细胞到错综复杂的的神经系统，脊椎动物神经系统 的这一发育过程各阶段都少不了f g f 8 的作用。 g u n h a g ae ta 1 ( 2 0 0 3 ) 通过体外培养和对鸡胚胎的研究，寻找导致脑细胞 早期分化的因子。发现在e m x i 的调控下，f g f 8 能促进脊髓细胞的分化。而神 经细胞的分化需要连续不断的f g f 8 信号调控i ”i 。s t r e i te ta 1 ( 2 0 0 0 ) 报道， 在原肠胚形成之前，f g f 8 能诱导鸡e r n i 基因的表达，从而诱导了神经中枢发 育1 1 。 胚胎囊胚期的前脑、中脑、后脑的划分与形成依赖于中脑的界线 ( d i e n c e p h a ic m e s e n c e p h a l i cb o u n d a r y ，d m b ) 也就是“峡部( i s t h m u s ) ” 这一活跃中心表达各种调节因子，其过程需要p a x 6 1 、e n g r a i l e d 蛋白的调 控。而这两种因子的表达和信号传递受f g f 8 调节【2 0 1 。并且，峡部分泌的f g f 8 与i r x 2 在鸡间脑协同表达，从而抑制o t x 2 、诱导g b x 2 ，同时，f g f 8 和促分裂 蛋白( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i n ，m a p ) 激酶以磷酸化作用调节i r x 2 的活 性12 1 1 。其中，f g f 8 a 不能影响o t x 2 、g b x 2 和ir x 2 的表达模式，但能上调e n 2 的表达将间脑转变成中脑。f g f s b 抑制o t x 2 ，但上调g b x 2 和i r x 2 在中脑表达， 将中脑翼板转变成小脑。这一过程调控了小脑从中脑分化出来 2 2 1 。f g f 8 a 还能 诱导f g f 7 和f g f l 8 的分泌，并与后两者及f g f 3 一同调控中脑和后脑的发育和 细胞增殖 2 3 , 2 4 , 2 5 】。 f u k u c h i s h i m o g o r ia n dg r o v e ( 2 0 0 1 ) 发现f g f 8 通过调控前脑细胞的发生 来控制神经形成的范围。他们发现，增加内生f g f 8 前体信号会改变神经形成范 围的边界，减少f g f 8 会使已有的范围缩小，再加入f g f 8 则引起局部范围复原。 这一发现证明，f g f 8 在一定程度上决定了大脑新皮层所处范围2 刚。大脑新皮层 和丘脑的发育过程中各种因子的生理梯度和细胞分化也由f g f 8 控制【”i 。而f g f 8 又受转录因子e m x 2 ( t r a n s c r i p t i o nf a c t o re m x 2 ) 调节 2 8 。a k i r at a n a k a 等 ( 2 0 0 1 ) 在神经系统边缘区和神经中枢后根( d o r s a lt o o lg a n g li a ，d r o ) 的 神经细胞中发现了f g f 8 。并证明了f g f 8 的调控神经范围功能存在于胚胎后期 和成熟期的中枢、外围神经，d r g s ，大动脉交感神经中枢i 扣1 。 2 2f g f 8 在内脏发育过程中的作用 f g f 8 是中胚层发育过程中的首要调控因子【3 0 】，在心血管、肝脏、肾脏、肺 1 3 1 1 等的发生发育过程中起重要的调控作用。 斑马鱼心脏发生区域有f g f 8 表达，f g f 8 缺失型胚胎呈现出特定的心室结构 缺失，并且还可观察到n k x 2 5 和g a t e 4 从表达开始就明显下降这些资料表 明，f g f 8 信号不仅在早期中胚层发育中发挥作用，而且在接下来的阶段直接诱 导了心脏发生转录因子的表达【3 2 1 。如果阻断咽腔内、外胚层的f g f 8 信号将导 致第四咽腔动脉弓、主动脉弓和锁骨下动脉不能正常形成，动脉瓣、腺体缺失 1 3 3 。c bb r o w n 等( 2 0 0 4 ) 还发现t b x l 诱导f g f 8 在咽内皮层表达，后者调控了 心血管和心大动脉、肺动脉平滑肌的形成【3 4 i 。 j u n ge ta 1 ( 1 9 9 9 ) 通过f g f s 研究了哺乳动物肝脏在内皮层的初期发育过 程。发现在哺乳动物的器官发生过程中，不同的f g f 信号调控肝脏不同的发展 阶段。内皮层紧邻贲门处所表达的f g f l 、f g f 2 和f g f 8 导致前肠内皮层发育为 肝脏。其中f g f 8 是肝脏在内皮层发生的关键【3 “。 2 3f g f 8 在胚胎四肢形成过程中的作用 外胚层脊顶( a p i c a le c t o d e r m a lr i d g e ，a e r ) 是肢体近远轴生长的远端 顶部内胚层实质部分，肢、翼发育的信号中枢，为了研究f g f 信号在a e r 的作用， s u n 等( 2 0 0 2 ) 研究了鼠四肢发育不同时期a e r 原始细胞中的f g f 4 和f g f 8 。结果 发现，f g f 4 和f g f 8 控制了早期肢芽( 1j m b b u d ) 的细胞数。而且，远离a e r 的 细胞也必需依赖f g f 4 和f g f 8 而得以生存。根据对于骨骼表现型观测，可以推断： 为了确保有充足的原始细胞来形成正常骨原基和多数其他肢组织，以上调控机制 是非常关键的。若f g f 4 和f g f 8 嫂：有活性，四肢将不能发育 3 6 。在此之前 l e w a n d o s k i 等( 2 0 0 0 ) 也报道，使早期外胚层四肢的f g f 8 失活会导致肢芽严重减 小、s h h 表达延滞、f g f 4 误表达及某些骨原基细胞减少或发育不全af g f 8 是目前 6 所知道的唯一一种四肢发育必需的成纤维细胞生长因子【3 7 i 。s a b i n e 等( 2 0 0 3 ) 发现，f g f 8 激活w n t z b ，后者使转录因子t b x 5 在临近中胚叶侧板处表达，进而诱 发前肢形成，揭示t f g f 8 作用的部分机理【”1 。此外，f g f 8 还在近肌纤维处表达， 对胚胎四肢肌腱的诱发、生长、成型过程中起重要的促进作用1 3 q 1 。 2 4f g f 8 在其它组织的发育过程中的作用 f g f 在颅骨骨膜形成过程中是必需的。对于斑马鱼早期胚胎发育的研究表明， f g f 3 $ i f g f 8 在脊椎动物的头部形成过程中起关键的调节作用。而f g f 8 的作用较 f g f 3 更为温和【4 0 1 。c r e u z e t 等( 2 0 0 4 ) 报道，前脑胞和腮弓处表达的f g f 8 对神经 顶间质细胞( n e u r a lc r e s t ，n c ) 的发生有很大的作用，而后者决定了面部骨 骼的形成【4 1 。 脊椎动物近前脑发生区的外舾层增厚形成耳基板和囊，进而发育成内耳，再 形成了复杂立体的听觉平衡器官。这一过程由f g f 8 5 口f g f 3 信号通路和转录因子 d l x 3 b , d l x 4 b 和s 硼a 一同调控1 4 2 a 3 1 。f g f s y 在其中控制f g f s 其它成员的表达【4 4 1 。 l e g e r 等( 2 0 0 2 ) 报道，f g f 8 缺陷型斑马鱼突变种的内耳发育不全，只有一个耳 石，半规管畸形，动作失常45 1 。和斑马鱼不一样，小鼠的脑后部并不表达f g f 8 “1 ， 而是在将发生耳基板的外胚层表达【4 7 1 。鸡耳基板发育过程也有f g f 8 瞬时表达【4 8 1 。 j a s k o l1 等( 2 0 0 4 ) 发现，不同强度的f 6 f 8 信号调控着胚胎期领下唾液腺 ( s u b m a n d i b u l a rs a li v a r yg l a n d ，s m g ) 的形态发生和在不同时期的发育【4 9 1 。 e m i l y 等( 2 0 0 3 ) 用h o x a l 3 基因缺陷型鼠研究了f g f 8 在生殖泌尿系统发 育过程中的作用，发现t t o x a l 3 基因缺失导致f g f 8 和b m p 在尿道上皮细胞联合 缺失，使尿道下裂。并且，在体外培养的基因缺陷型纯合子中追加f g f 8 ，即可 恢复至野生型的细胞增殖水平，说明f g f 8 是生殖结节增殖发育的关键【5 0 1 。 此外，f g f 8 还能诱导嗅球的形态发生f 5 l 】、促进胸腺发育5 2 1 、调控肋骨形成 5 3 1 、在胚胎发育早期调节分裂线形成的节奏和中轴的位置【5 4 l ，并且是调控原肠 胚形成的关键因子【5 5 】。 至今，对于f g f 8 在脊椎动物胚胎发育过程中的作用的研究仍在继续，并成 为对f g f 8 的一个研究热点。 3 f g f 8 a 的作用机制及其影响因素 f g f 8 a 多肽的n 端具有一大约3 0 个氨基酸残基组成的典型信号序列，可通 过内质网一高尔基复合体的经典途径被高效地分泌到细胞外，对靶细胞作 用。f g f 8 a 的作用机制与f g f s 大多数成员一致，与酪氨酸激酶型受体结合， 被酸性多糖和多种f g f s 拮抗剂调节。但是，一些具体作用机制仍有待研究。 3 1f g f 8 的信号通路 f g f 8 的信号通路与f g f s 的其他成员一样，与存在于细胞表面的f g f s 受体 ( f g fr e c e p t o f s ，f g f r s ) 结合，将信号传递到胞内。 f g f r s 有5 种基因型( f g f r i 5 ) 。在不同的组织部位、组织发育的不同时 期、不同的条件下，f g f 8 所激活的受体不同，在同一环境下也并非只能激活同 一种受体。在问质细胞中，f g f 8 能特异性地激活f g f r 2 一i i i c ，这种结合的特异 性与细胞膜环境和硫酸乙酰肝素有关【5 6 1 。而一般认为在多数情况下，f g f r i 是 f g f 8 的受体 5 7 , 5 8 1 但不是唯一的受体。f g f 8 对f g f r 3 也有显著的亲和力，而对 f g f r 2 吸引力较弱1 5 9 , 6 0 1 。对于f g f 8 与哪些结合的受体仍需要继续探索。下面就 以f g f 与f g f r s 结合作用的普遍模型阐述f g f 8 的信号作用通路。 3 1 1f g f r s 的结构 f g f r s 都是单链跨膜蛋白，主要由3 个部分组成：即胞外区、跨膜结构域 和细胞内酪氨酸激酶结构域。胞外区为受体蛋白，有半胱氨酸分散分布，受体 蛋白包括三个细胞外免疫球蛋白样结构域( 分别称为i gi ，i g i i 和i g l l l ) ，这使 f g f r s 属于受体的免疫球蛋白超家族。在i gi 和i g i i 之间有一个酸性盒，是与 细胞粘附分子肝素结合的部位。f g f r i 、2 、3 、4 都含有酪氨酸蛋白激酶的活性 结构域，并被一亲水序列隔开。但f g f r 5 不含有胞内酪氨酸蛋白激酶功能。根据 f g f r s 选择性拼接的差异，还存在受体蛋白的亚型结构【6 1 1 ，如f g f r 2 的亚结构 f g f r 2 一 i i c 、f g f r 2 一i i i b ，各自均有不同的配体特异性。 3 1 - 2f g f s 与受体的结合及胞外基质的调节作用 与其它生长因子受体酪氨酸激酶类似，配体的结合可诱导f g f r s 构象改变， 发生二聚化，这对于f g f s 的信号转导是必须的。在这一过程中，细胞外基质中 的肝素和硫酸肝素等酸性多糖62 1 ，对f g f s 与f g f r 的结合起调节作用。这些酸 性多糖不仅能提高f g f s 的热稳定性和对蛋白酶解( p r o l e o l y s i s ) 的抵抗性， 也能起到浓集和释放f g f s 等作用。最近研究显示，f g f s 与酸性多糖结合可提 高与f g f r s 的亲和力和稳定性。 以肝素硫酸糖蛋白( h e p a r a ns ulf a t ep e o t e o g y c a n s ，h s p g s ) x 十f g f s 与受 体的结合的调节为例：h s p g s 是由一个硫酸乙酰肝素分子和一个蛋白核心构成的 蛋白聚糖，在二聚化过程中起着重要的作用，可通过两种方式参与二聚体的形成。 一种是h s p g s 、f g f 和f g f r 三个分予以1 ：l ：1 的比例形成三分子复合物，再由两 个这样的三分子复合物形成一个对称的二聚体。在这个模型中，两个f g f r 分子直 接相连。肝素除与三分子复合物内部的f g f 年d f g f r 分子形成广泛的联系外，还与 另一个三分子复合物中的f g f r 相连，由此可见，肝素分子在这个模型中起到连接 器的作用，加强了f g f r s 与f g f s 的相互作用。另一种方式是由f g f i 、f g f r 2 肝素 复合物结构而来，在这个模型中，只有一个h s p g 分子将两个f g f 分子连接在一起 形成二聚体，二聚体又与两个f g f r 分子连接。与第一种方式不同的是，每个f g f 分子只与一个f g f r 相连，f g f r 分子之间并不直接相连。这个模型中h s p g 与两个 f g f s 的连接也不相同，且h s p g 只与一个f g f r 相连，这就使得所形成的二聚体结构 具有了不对称性。这种方式中两个f g f f g f r 单体之间缺乏蛋白分子问直接作用， h s p g s 成为受体二聚化所必须的分子1 6 3 】。受体二聚化后，进而激活酪氨酸激酶，引 起受体自磷酸化。其激活下游信号主要有两条通路，一条是在激活s h c f r s - r a f m a p k k k m a p k k m a p k 通路的基础上，通过大量生成第二信使：磷脂酶 c ( p l c ) 、蛋白激酶c ( p k c ) 、磷脂酰肌醇3 一激酶系统( p i s k ) 引起c a 2 + 浓度升高和 激活s t a t 通路向细胞核内传递信号5 3 ，。另一条是激活r a s r a f i m e k e r k 通路， 以调节细胞的生长和分化。这两条下游信号通路都能将目标蛋白磷酸化以散布酪 氨酸酶信号，启动核内转录因子，启动一些特定的目标基因( 如p e a 3 和日埘基因 6 5 1 ) 表达。胞内吞噬作用和继而并发的溶酶体降解和胞外限制性清除作用决定 t f g f 8 受体的散布范围，从而控* ! j f c f 8 对靶细胞的作用【6 “。目前，对细胞 内f g f f g f r 系统下游其他信号的传递作用仍所知甚少，有待研究揭示。 bk w a b 卜a d d o ( 2 0 0 4 ) 等对f g f 信号通路进行了图示概括( 图2 ) 。 图2 ：f g f 作用信号通路图示i ”l ：f g f 激活受体并与之二聚化，再与适配分子( a d a p t o r m 0 1 e c u l e ) f r s 2 结合，同时增补的适配蛋白g r b 2 和s o no fs e v e n l e s s ( s o s ) 与f g f r 结 合，形成了一个跨膜的复合体。s o s 通过鸟嘌呤磷酸化活化r a s ，然后激活r a s r a f m e r ( m a p k ) 一e r k t 通路。这一反麻再通过将目标蛋白磷酸化以散布酪氮酸酶信号，启动核内转 录因子，从而达到对细胞的作用。这一过稗还受f g f 拮抗因子( 如：s p r o u t y ) 调节，c b l 能通过胞内吞作用对受体蛋白进行下游调节，d n ( d o m i n a n tn e g a t i v e ) 能阻断f g f r 信 号。f g f f g f r 二聚体还能大量生成第二信使ip 1 3 k 、p l cy 和激活s t a t 通路。p ：磷酸化 作用：m t i 一啪p ：m e m b r a n e t y p e im a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 3 2f g f 8 的调节因子 f g f 8 的调节因子主要是w n t 、b m p 和h e d g e h o g 等家族的分泌性信号分子和 s p r o u t y 家族的胞内蛋白，对f g f 8 有促进或抑制作用，同时这些调节因子的信 号通路也会被f g f 8 影响和控制，从而形成与f g f 8 信号之间的c r o s s t a l k ( 交 互调节) ，复杂而有序地控制各自的信号系统，在各种组织中发挥作用6 8 j 。还 有一些细胞调节因子，诸如转录因子类、蛋白激酶类等，通过对f g f 8 的表达或 信号通路的调控，直接或间接影响着f g f 8 的作用。 3 2 1s p r o u t y ( s p r y ) 信号 最早被确认的f g f s 拮抗剂是来自果蝇的s p r o u t y ( s p r y ) 。起初曾认为s p r y 是一种分泌性信号，其后的研究证实s p r y 是一种与细胞膜内侧结a 的n _ 6 j 蛋白 质，s p r y 通过阻碍r a s 信号传递来阻断f g f s 信号 6 9 】。随后，s p r y 也在脊椎动 物得到确认，c h a m b e r s 等( 2 0 0 0 ) 报道，s p r y 过表达将阻碍肢芽形成 7 0 i ，s p r y 表达又被f g f s 诱导，“峡部”的f g f 8 诱导s p r y 2 迅速表达，s p r y 2 又通过于扰 胞外信号调节激酶( e x t r a c e l l u l a f s i g n a lr e g u l a t e d k i n a s e ，e r k ) 的活性 以调整f g f 8 一r a s e r k 通路，以控制中脑和后脑准确分化区域7 ”。多方证据表 明，s p r y 是普遍存在的f g f 8 信号通路抑制剂【7 2 , 7 3 1 。 3 2 2w n t 信号 f g f s 和w n t s 已被证实在多种发育系统中相互作用，包括果蝇的气管发育、 x o n o p u s 的中胚叶诱导及神经成型，还有其它脊椎动物的脑、齿、肾等的发育”1 。 f g f 8 与w n t 之间的大多数交互调节是通过b 链状蛋白( 1 3 - c r y s t a l li n ) 为媒介 的。b 链状蛋白是w n t 信号通路上的重要组成部分，w n t 3 a 能通过t 3 链状蛋白 激活f g f 8 的表达，而后者又可以通过下调e 一钙粘蛋白( e c a d h e r i n ) 的表达， 增加细胞中自由存在的d 链状蛋白，活化w n t 通路，形成交互调节的循环【7 “。 除b 链状蛋白之外，f g f 8 和w n t 之间还有很多其它媒介，最近，a hm o n s o r o b u r q 等( 2 0 0 5 ) 报道，在神经系统发育过程中，w n t 启动转录因子p a x 3 表达，后 者又能直接和间接地上调f g f 8 1 7 6 1 。 3 2 3b m p 信号 骨形成蛋白( b o n em o r p h o g e n e t icp r o t e i n ，b m p ) $ 口f g f s 在齿成形1 7 7 l 、肺 组织培养 7 8 , 7 9 i 、四肢发育8 0 1 、肾脏i8 1 】发育过程中都存在着相互竞争调节的作用。 a h nk 等( 2 0 0 1 ) 利用c r e l o x 系统对肢体外胚层a l k 3 特异性失活的研究发现，b m p 信号对于a e r 的形成平g f g f 8 的表达是必需的，也就是说b m p 为近远轴肢牙的长出所 必需【8 2 1 。a 1s a nb h 等( 2 0 0 2 ) 报道，心脏发生出现于f g f 8 和b m p 表达重叠区域， 后两者对心脏特异基因调节，其协同作用调控早期心脏发生【8 3 j 。jw ii s o na n da s t u c k e r ( 2 0 0 4 ) 发现，在颚间叶细胞中，f g f 8a n db m p 4 也存在联合作用，抑制 b a p x l 的表达，控制下颌的结合位置【8 4 1 。b m p n f g f 8 两信号通路之间的媒介及调 节因子较多，机理也较复杂，还需探索。hh a y a s h i 等( 2 0 0 3 ) 发现b m p i g l 过s m a d 信号通路上调f g f r i 的表达，从而加强f g f 8 的作用弹”。jl a u r j k k a l a 等( 2 0 0 3 ) 也发现了一种新的b m p 竞争性抑制剂e c t o d i n ，并推钡u e c t o d i n 连接t b m p 与 f g f 、s h h 的信号通路f 8 6 1 。 3 2 4s h h 信号 多方研究结果证明，f g f 8 和s o n i ch e d g e h o g ( s h h ) 信号之间存在密切的交 互调节。多数情况下，这种交互调节会促进两者共同作用，但有时也会抑制一方 的活性。c h e ns o kl a m 等( 2 0 0 3 ) 报道，促进多巴胺能神经元及血清素神经元分 化和软骨形成的过程中，f g f 8 平h s h h 有较强的协同增效作用8 7 1 。a r h a t 等( 2 0 0 4 ) 的体外软骨培养和活体实验结果也证明t f g f 8 年g s h h 有很强的协同增效作用，促 进了鸡颅面骨形成、喙的伸长【8 8 j 。而b am o o r e s c o t t 等( 2 0 0 5 ) 最近发现，内 皮层发育晚期的咽发生组织中，s h h 会抑制f g f 8 和p a x l 、b m p 4 的活性，因而此时 阻遏s h h 的活性才能保证咽的正常发育。 s h h 的活性也依赖于m i t o g e n a t l ；i v a t e dp r o t e i nk i d 3 s e ( m a p k ) 。因此后 者成为了连接f g f 8 和s h h 信号通路的媒介之一。要维持基本的m a p k 磷酸化水 平，就需要由s h h 诱导的专性转录因子口，冶幺由此可推测s h h 对f g f 8 调节的 部分机理 9 。yp a r k 等( 2 0 0 3 ) 报道了f g f 8 和s h h 联合控制干细胞的增殖时 两信号通路之间以t r o 为联系”1 。而脊椎动物特有的h e d g e h o g ( h h ) 结合蛋 白h i p l 有抑制h h 的作用，对f g f 8 和s h h 信号的交互调节有一定影响9 2 i 。 3 2 5s e f 信号 s e f ( s i m i l a re x p r e s s i o nt of g f g e n e s ) 分子是近几年发现的- - 种f g f 信号通路 抑制因子。i g o rd a w i d 等( 2 0 0 2 ) 年n f t i r t h a u e r 等( 2 0 0 2 ) 两个研究组都发现异位 表达了s e f 的斑马鱼胚胎缺乏背部的极性，此表型与表达d o m i n a n t - n e g a t i v ef g f 受 体的胚胎的表型很类似，、照明s e f f 韭抑$ ! | f g f 的信号传导。对s e f l 筝j m o r p h o l i n o 反 义核酸实验产生的胚胎与异位表达f g f 8 的胚胎表型也类似9 3 。s e f 编译与f g f 8 共表达的跨膜蛋白。对斑马鱼和鼠的s e 研究显示，s e f 与f g f r l 结合，阻遏了 f g f r l 和f r s 2 磷酸化，还能制约e r i c 活性，从而抑带t j f g f 8 的信号通路1 9 5 1 。f g f 8 一调控s e 珀日表达，在胚胎中过表达f g f 8 能扩大s e f 表达的区域。缺失f g f 8 功能 的突变体或表达d o m i n a n t n e g a t i v ef g f 受体的胚胎则减少t s e f 的表达。 3 2 ，6 其它对f g f 8 有影响的细胞调节因子 各调节因子对f g f 8 信号通路的调节机理至今都没有完全清楚，其中除了涉及 至o f g f 8 与w n t 、b m p 、s h h 等的交互调节之外，还有很多其它的转录因子类、蛋白 激酶类等的分子x 十f g f 8 信号的上、下游进行调节。 k a z u s h ia o t o 等( 2 0 0 2 ) 证明，g r e m l i nc l l 3 缺陷型小鼠的f g f 8 被上调。 说明g r e m l i nc l l 3 是f g f 8 的抑制剂f 9 ，而f g f 8 和s h h 对g r e m l i n 又存在调节 作用9 7 i 。g b x 2 和e n g r a i l e d 蛋白家族的e n 2 是f g f 8 最先诱导表达的基因。 e n 转录因子不能诱导但能维持f g f 8 的表达，f g f 8 对p a x 5 表达的调节作用依 赖于e n 。g b x 2 在f g f 8 对o t x 2 抑制作用的上游进行调节，而f g f 8 对w n t 的 下游抑制也有g b x 2 的作用 9 引。ch o n f i k 等( 2 0 0 4 ) 又发现颅骨形成时，b h l h 转录因子t w i s t 是f g f ，b m p 和s h h 三信号通路之间交互调节的媒介 9 ”。最 近，m i n o r uo m i 等( 2 0 0 5 ) 又证明了表皮生长因子受体( e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r r e c e p t o r ，e g f r ) 也能诱导f g f 8 表达 i ”】。能对f g f 8 信号进行调节的还有锌 指转录因子s o s 和勋9 1 0 “、编码m a p k 磷酸酶的t - - b o x 基因t b x l 和 t b