（分析化学专业论文）某些染料及其金属配合物和蛋白质作用的研究与分析应用.pdf

abs t r a c t t h e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f p r o t e i n s i s v e r y i mp o r t a n t i n b i o a n a l y s i s a n d c l i n i c a l a n a l y s i s . i t i s a n a c t i v e f i e l d i n b i o a n a l y s i s t o d e v e l o p n e w me t h o d s o f h i g h s e n s i t i v i t y . t h e ma i n c o n t e n t o f t h e t h e s i s i s :t h e i n t e r a c t i o n s o f s e v e r a l d y e s a n d a d y e 一 me t a l c o mp l e x w i t h p r o t e i n s we r e s t u d i e d a n d a p p l i e d t o t h e d e t e r mi n a t i o n o f p r o t e i n s . t h e r e w e r e f i v e c h a p t e r s : j .t h e r e w a s a r e v i e w a b o u t t h e d e v e l o p me n t o f a n a l y s i s o f p r o t e i n s i n r e c e n t y e a r s , i n c l u d i n g t h e a p p l i c a t i o n s o f s p e c t r o p h o t o me t r y 、 f l u o r o me t r y 、 r e s o n a n c e l i g h 卜 s c a t t e r i n g 、e l e c t r o c h e mi s t r y 、c h e mi c a l l u mi n e s c e n c e , et c. 2 . t h e r e s o n a n c e l i g h t 一 s c a t t e r i n g s p e c t r o s c o p i e s o f t h e i n t e r a c t i o n s b e t we e n x y l e n o l o r a n g e a n d p r o t e i n s we r e s t u d i e d a n d x y l e n o l o r a n g e c a n b e a p p l i e d t o t h e mi c r o a n a l y s i s o f p r o t e i n s . 3 . t h e r e s o n a n c e l i g h t 一 s c a t t e r i n g s p e c t r o s c o p i e s o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n 2 一 n a p h t h y l a z o 一 8 一 h y d r o x y q u i n o l i n e 一 5 - s u l f o n i c a c i d a n d p r o t e i n s w e r e s t u d i e d . t h e 2 - n a p h t h y l a z o 一 8 一 h y d r o x y q u i n o l i n e 一 5 一 s u l f o n i c a c i d e n h a n c e d r e s o n a n c e l i g h t - s c a t t e r i n g s y s t e m c a n b e a p p l i e d t o t h e mi c r o a n a l y s i s o f p r o t e i n s 4 . t h e a b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p i e s o f t h e i n t e r a c t i o n s b e t we e n 2 一 ( 5 一 b r o mo 一 2 一 p y r i d y l a z o ) 一 5 一 d i e t h y l a mi n o p h e n o 一 c d ( 1 1 ) c o m p l e x a n d p r o t e i n s w e r e s t u d i e d a n d t h e c o m p l e x l a b e l l e d p r o t e i n s we r e d e t e r mi n e d . 5 . t h e a b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p i e s o f t h e 2 一 ( 2 - t h i a z o l y l a z o ) - 5 一 d i me t h y l a mi n o b e n z o i c a c i d 一 c u ( i i ) p r o t e i n s y s t e m w e r e s t u d i e d a n d t amb 一 c u ( l l ) l a b e l l e d p r o t e i n s we r e d e t e r mi n e d二 ke y wo r d s :p r o t e i n ; r e s o n a n c e l i g h t 一 s c a t t e r i n g ; x y l e n o l o r a n g e ; 2 一 n a p h t h y l a z o 一 8 一 h y d r o x y q u i n o l i n e 一 5 一 s u l f o n i c a c i d ; 2 一 ( 5 一 b r o mo 一 2 一 p y r i d y l a z o ) 一 5 一 d i e t h y l a mi n o p h e n o l ; 2 一 ( 2 - t h i a z o l y l a z o ) 一 5 一 d i me t h y l a mi n o b e n z o i c a c i d ; s p e c t r o p h o t o me t r y m 第一章 绪论 第一章绪论 蛋白 质是一类重要的生物大分子， 它和核酬司 是构成细胞内原生质的主要成 分，是生命现象的物质基础。蛋白质自身种类与结构的多样性决定了其生物功能 的多样性。它是有机体的重要结构成分; 它可以调节或控制细胞的生长，分化 和遗传信息的表达; 所有的酶都是蛋白质，起接受和传递信息作用的受体也是 蛋白 质;另外， 高等动物的免疫反应主要也是通过蛋白 质来实现的。 蛋白质是如此的重要，对它的研究也就成为诸多领域的重要课题.其中蛋 白质的定量分析在生化，药物，食品和临床中具有重要的实践意义。例如， 尿 原蛋白的检验是骨髓肿瘤等疾病的诊断手段之一。近年来，这一领域发展迅速， 不断有新方法报道。现回顾一下这些进展。 第一节 蛋白 质的分光光度法测定 测定蛋白 质含量常用的分光光度法包括双缩脉法， l o w r y 法， 4 - 哇琳甲酸法， 丹宁酸法以及基于蛋白质与染料或其金属配合物结合的光度法等。 双缩脉法4 1 是基于蛋白 质的 双缩脉反应的 分析方法。 在强碱性溶液中，蛋 白质多个肤键上的氮原子可以和铜 ( 工 i )配价结合，反应生成紫红色配合物，在 一定范围内， 最大吸收峰5 4 0 n m 处吸光度值与蛋白质的浓度成正比。本法简便、 快速，对红白蛋白产生颜色反应相近，是传统的测定蛋白质的方法。但是本法灵 敏 度不高， 0 . 0 1 吸 光 度相当 于 1 6 6 . 7 g 蛋白 ， 并 且易 受氨基酸缓冲液， t r i s 缓 冲液和g o o d s 缓冲液等的于扰。因此近年来有不少文章报道了本法的改进方案。 如测定前先用三氯乙酸使蛋白完全沉淀，除去干扰物质( z 1 ;或改用 n i ( 工 i ) 等其 他金属离子进行双缩脉反应 3 1 ，但结果都不甚理想。故本法现应用不广。 l o w r y法 4 1 是定量测定蛋白 质的一种常用方法。它结合了双缩脉法中铜盐反 应与f o l i n - c i o c a l t e a u 试剂反应的特点，通过芳香族氨基酸残基 t r y 和 t y r的 迅速反应及与肤链或极性侧链或两者的铜络合物较慢的反应， 酸发色团还原成暗兰色，在波长 7 5 0 n m处测定 a . . . . l o w r y 而把磷钥酸、磷钨 法线形范围较宽 第一n 绪论 ( 5 0 0 - 1 0 0 0 g / 1 )，检出限为 0 . l g / l ，操作较简便，但也存在易受 扰，蛋自质 / 蛋白质间测值差异较大及标准曲线非线形等缺点。针对这些缺点，许多研究者 提出了改进方法 齐 吐 来消除二硫苏 。如加入碘乙酸盐、脱氧胆酸盐s 或 n 一 乙酸马来酞亚胺 6 1 等试 、糖醇( d t t ) . 2 - 琉基乙醇和半肤氨酸等含一 s h化合物的 f 扰。 用可溶性核糖核酸或脱氧胆酸钠( d o c ) 作共沉淀的方法浓缩蛋白质样品溶液，离 心除去上清液后，用 l o w r y法测定沉淀蛋白 质的量收到良 好的效果! 7 这些对 l o w r y 法的改进，都包括了加f o l i n 试剂后放置三十分钟的条件。l a r s o n 等提出 了加入还原剂二硫药糖醇于 l o w r y反应体系中以促使呈色反应迅速完成的改良 法， 缩短了 分 析周期， 提高了 色泽强 度fs l 4 - 哇琳甲酸法( b c a法) ” 是8 。年代发展起来的 种新方法。在碱性溶液 ， 蛋白质将c u ( 1 1 ) 还原为c u ( 工 ) , c u ( 1 ) 与b c a 形成紫红色配合物， 最大吸收峰山4 0 0 n m移至 5 6 2 n m处，在一定范围内，配合物的吸光度与蛋白质的浓度成正比。本 法灵敏度较高，不同蛋白质间测值差异较小，工作试剂的稳定性好，但受葡萄糖 干扰较大。 丹宁酸法是利用丹宁酸用来沉淀蛋白质， 但沉淀结构松散， 可用 c a i i l n e取代 蛋白， 蛋白游离出后用免疫法或空氮法测定。 本法灵敏度较高， 线性范围为0 . 0 5 - 1 . 8 g / l ， 但操作麻烦， 不便应用。 在蛋白质的临床分析中，基于蛋白质与染料结合的反应是应用最为广泛的光 度分析方法。染料结合法具有简便，快速，经济，准确的特点，因而得到了广泛 的应用。 1 9 7 6年，b r a d f o r d提出了一个灵敏，快速定量测定微量蛋白质的方法，即现 广泛使用的考马斯亮蓝法 ( c b b g - 2 5 0 ) ， 。当染料考马斯亮蓝与蛋白质结合后， 其最大吸收峰从4 6 5 n m 移至5 9 5 n m 处，且在5 9 5 n m 处吸光度的增加与蛋白质的量 呈线性关系，可用于蛋白质的测定。此方法重现性好，染料与蛋白质的结合反应 在两分钟左右即可完成且 一 小时内丛本稳定。钠离f . 钾离r 、镁离子、 按离r 、 乙醇和碳水化合物如蔗糖对体系无干扰或有微弱干扰。在强碱性缓冲济液. i 颜色 较弱，但通过选择合适缓冲溶液可得到满意结果。相对高浓度的表而活性剂 _ 烷基磺酸钠 s d s ) . t r i t o n x - 1 0 0 和玻璃器皿洗涤剂对此法有较大干扰。 由t r i s , e d t a 、乙酸、2 - 疏基乙醇、蔗糖、甘油和痕量表面活性剂 s d s , t r i t o n x - 1 0 0 和 h e m o s o l引起的微弱干扰可通过选用适当缓冲溶液消除，但大量表面活性剂存在 _ 一一一m - #. 9 竺一一一一一 引起的干扰不能消除。b r a d f o r d法与 l o w r y法相比具有快速、简易、灵敏等优 点，但它也存在一定不足，如易受一些表面活性物质的干扰，不同蛋白质间测值 差异较大，某些蛋白质测定时标准曲线非线性等。 考马斯亮蓝属于酸性三苯甲烷类染料，此类染料中常用于蛋白质测定的还有 澳甲酚绿 1 i 1 澳酚蓝 12 1 和滨甲酚紫f 划 。浪甲酚绿法是染料结合法中使用最旱也 最为广泛的方法之一。 在p h 4 . 2 时， 溟甲酚绿与蛋白质结合， 最大吸收峰从4 4 5 n m 移至6 2 8 n m 处，且在6 2 8 n m 处吸光度的增加与蛋白 质的浓度呈线性关系。本法简 便，快速，灵敏，精密度好，试剂稳定。不足之处在于澳甲酚绿与白蛋白反应的 非特异性 1 4 1 ，为了 消除干扰，必须对反应时间进行严格控制。 此外，藻红 1 5 1 等酸性咕吨染料，茜素红 1 6 等羚基葱醒类化合物以及偶氮肿 i i i t 7 等变色酸双偶氮类化合物也是此类方法的常用试剂。 对于 这 些 探针与 蛋白 质 作 用的 机理 有以 下 两 种 观点: f a z e k a s d e s t g r o t h l 1 在研究普施安亮蓝 r s和考马斯亮蓝 r - 2 5 0 ( c b b r - 2 5 0 ) 时提出， 染料离子是与蛋白 质上的 一 n h , 依靠静电引力相结 合的。 s e d m a r k 1 1 也持上述观点， 他在解释不同的 蛋白 质对 c b b g - 2 5 0响应不同时认为， 这是由于不同的蛋白 质含有一 n h , 数目 不同， 从而导致了对染料不同的响应。与此相对应， 许多研究者认为有机小分子是与蛋 白 质上的碱性氨基酸残基相结合的 2 0 , 川， 这些碱性氨基酸残基包括赖氨酸、组氨 酸、精氨酸和n 端氨基。 m o s h e丁 a 1 1 2 1 在研究c b b r 与蛋白 质反应时发现， c b b r 在 不同蛋白质上的结合数与蛋白质所带正电荷数成正比， 染料结合数目和电荷数目 比 为 1 . 5 - 3 . 0 : t o c b b r 上存在着一 s 0 3 - ， 它就是依靠 - s 仇 一 与蛋白 质碱性氨基酸残 基作用的。l i n d 2 2 ) 曾对蛋白 质上的碱性基团进行修饰， 他将碱性基团乙酞化、乙 二醛和梭甲基化.结果发现， 蛋白质对滨酚蓝的亲和性降低， 亲和性降低的程度正 比于被修饰的带正电的基团。现在普遍认为在蛋白质的碱性氨基酸残基中， 精氨 酸和赖氨酸残基起着重要作用。k r a g h - h a n s e n (2 3 1 通过实验详细地研究了静电力 在有机小分子酚红与血清白蛋白间所起的作用。这些都说明静电力在有机小分子 探针与蛋白质的结合中起着重要的作用。此外， 利用疏水作用力和蛋白质的疏水 部位相结合也被广泛地认为是有机小分子和蛋白质相互作用的一种方式。 l a k i n 12 0 1 曾 指出c b b g - 2 5 0 可以与蛋白 质的疏水部位依靠疏水作用力相互作用。 m o s h e t a l 1 2 u 也认为虽然蛋白质所带正电荷决定了所结合染料数目， 但仅仅依靠静电力是不能 紧密结合的。在许多种情况下， 有机小分子与蛋白质的反应不仅是某一种力的单 一 一 一一一竺-进竺一一一一一一 独作用， 而是多种力协同作用的结果， 这些力包括: 静电引力、疏水作用力、范德 华力等。 近几年来利用金属离子和有机染料形成的金属配合物作为蛋白质的光谱探针 的方法发展很快。1 9 8 3 年，日 本的f u j i t a 等将金属配合物与蛋白 质的结合反应 用于蛋白 质的定量分析，开辟了分光光度法定量测定蛋白质的新领域。他们先后 研究了邻苯三酚红一 钥( v i ) 2 4 1磺基苯基荧光酮一 钦( i v ) 2 5 1 、 铬天青b - 披( i i ) 2 6 1 络合物与蛋白 质的作用，并选择最优测定条件。这些体系在适宜的条件下和蛋白 质反应形成新的复合物大分子， 改变了原体系的光谱性能， 从而能定量测定蛋白质 的含量。此类方法具有灵敏度高，选择性好，特别是蛋白 质间测值差异较小的优 点。 分析工作者利用金属配合物光谱探针法测定蛋白质取得了举世瞩目 的成就， 所 用染料( 包括显色剂和荧光试剂) 加入不同的表面活性剂或乳化剂， 对许多体系进 行了检验， 有的应用于临床， 有的用于商品供应， 发现在灵敏度、选择性和重现性 方面优于澳甲酚绿、澳甲酚紫等染料结合法。在这些金属离子的报道中， 有关 m o ( v i ) , t i ( v i ) 和 v ( v i ) 的报道较多。在这些报道中为增大反应灵敏度， 一般都 加入表面活性剂或乳化剂。例如， 借助t i - 4 , 5 一 二澳苯基荧光酮( b d p f ) - t w e e n - 8 0 体系与蛋白质的显色反应可测定尿蛋白。当 p h = 2 . 9 ， 血清蛋白能与 t i - b d p f - t w e e n - 8 0形成蓝色络合物， x m a x = 6 0 5 n m ， 加入少量的乙醇可提高方法的灵敏度与 稳定性， 牛血清蛋白 在。- 6 m g / l 范围内服从比耳定律， 在该体系中t w e e n - 8 0 为表 面活性剂1 2 1 1 . f u j i t a 利用邻苯二酚紫一 m o ( v i ) 与蛋白质在弱酸性介质中形成配合 物， 在6 8 0 n m 处测定范围为0 -3 0 m g / l 白蛋白， 加入表面活性剂聚乙 烯醇用于临床 尿样总蛋白的测定 2 8 1 1 9 8 6 年s a i t o k 等提出使用络天青s - a 1 ( i i i ) 配合物体系， 在x m a x = 6 3 0 n m 处测 定 人 血 清中 的 蛋白 质 含量 ， 检出 范围 为1 . 2 5 - 2 5 m g / 1 12 1 1 . 在我国，北京大学的童沈阳研究组也建立了一些利用金属配合物作为光谱探 针测定蛋白 质的新方法。 如澳邻苯三酚红一 z n ( 工 i ) 体系3 6 1 等。 本实验室的郭忠先 博士等从事这方面的研究， 从理论和实践上解决了许多实际问题。他们提出了水 杨基荧光酮- m o ( v i ) 加乳化剂 o p与蛋白质形成有色配合物， 在x m a x = 5 7 5 n m处定 量测定蛋白质， 检出范围为 0 - 2 5 m g / l ， 得到很好的效果， 而且体系稳定， 待测时间 长、准确度高 3 1 1 。他们还发现三经基荧光酮是一类优良的显色剂和荧光试剂。 其 第一章 绪论 配合物是蛋白 质的良 好探针和定量试剂; 并发现二溟轻基苯基荧光酮， 即 2 , 6 , 7 - 三轻基一 9 ( 3 , 5 一 二4 4 - 4 - y e e 基) 苯基荧光酮- 3 ( d b h p f ) ， 可以和 m o ( v i ) 络合， 在室温 下与蛋白 质快速结合形成稳定的络合物， 从而改变了原配合物的吸收光谱， 这一体 系线性范围为0 -2 0 m g / 1 ( b s a ) 和 0 - 1 7 . 5 m g / 1 ( h s a ) ， 检出限 分别为 1 . o p g / m 1 b s a 和0 . 8 6 r g / m 1 h s a , 稳定性 可达2 4 h ， 且 选择性好， 可用于 尿样和血样的 分析， 结 果与 b r a d f o r d 即c o o m a s s i e 亮蓝法相同 3 3 1 金属离子一 染料结合法中的金属离子一般使用含电荷高、离子外层含有较多 空余的瞬间杂化轨道， 这样， 当其与含有一 o h或= 0的有机染料相遇时， 氧原子中的 孤对电子可顺利地进入杂化轨道， 形成稳定的配合物， 由于这种结构易产生瞬时偶 极， 大分子复合物中的氢易解离。当这种大分子复合物遇到结构不对称的蛋白质 分子时， 互相极化产生静电作用而结合成新的大分子团。另外， 大分子内部易形成 氢键作用， 蛋白质分子中的芳香氨基酸残基与有机染料分子中的芳香结构都具有 疏水作用而互相靠近也是可能的。有机染料大分子中含有多个一 o h 基， 而一 o h中的 氧原子进入金属离子外层瞬间杂化轨道， 特别是受溶剂极性分子的影响， 使一 o h中 的氢易解离， 所以又将金属离子一 染料体系看作是多元酸 h r ， 在这一体系中存在 多元酸的解离平衡。所以它与蛋白质的结合， 受体系中 p h值的影响， 体系必须在 适宜的酸度条件下进行蛋白质的定量测定。这种配合物的结合原理， 目前学术界 正在探讨。 金属离子一 有机染料( 包括显色剂和荧光染料) 体系定量测定蛋白质是近年兴起 的一种新方法， 从理论到运用有些还不够成熟。人们在不断的实践中对己有体系 进行改进， 并开发新体系。本文就将在前人工作的基础上讨论建立新的此类方法。 近年来还发展了一些新的微量蛋白 质定量法. 如银结合法3 3 1 ， 胶体金亲合法 3 4 1 等。这些方法也存在各自 的优点与不足，分析人员可根据需要选择适当的方法。 第二节 蛋白 质的荧光法测定 荧光法是定量测定蛋白质的另一种常用方法，通常较光度法更灵敏。含有苯 环的氨基酸 ( 苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)都是荧光性物质，由于蛋白质中存在 着色氨酸和酪氨酸， 所以蛋白 质本身能吸收2 7 0 - 3 0 0 n m 的紫外光而发生荧光。 在 血清白蛋白，蛋白蛋白，花生球蛋白，胃蛋白酶，酪蛋白和玉米蛋白等蛋白质的 _一一一一进- *壑 一一一一一一一 荧光光谱中均呈现3 1 3 n m 和3 5 0 n m 两个荧光峰，二者分别与酪氨酸和色氨酸的荧 光峰相符合 3 5 , k o n h e v 等用2 8 0 n m 的紫外光照射动物组织的蛋白 质中 性萃取液， 然后于3 4 0 - 3 5 0 n m 处测量荧光强度，可用于牛乳中蛋白 质的测定，再测定条件下 核 酸， 嚎吟 和 嗜 吮 都 不 发 生 荧 光， 不 千 扰测 定s s . 3 e g a r c i a l - b o r r o n 等 用二阶 导数荧光法测定了蛋白 质中酪氨酸和色氨酸的含量3 8 1 与光度法类似，蛋白质在与某些荧光染料结合后，能使溶液荧光强度增强或 淬灭，并且其变化量与蛋白 质浓度成正比。这就是荧光探针法测定蛋白 质浓度的 基本原理。如血管黄素 ( v a s o f l a v i n e )的碱性溶液具有微弱的兰色荧光，激发 峰位于 3 6 0 n m ,荧光峰位于 4 4 0 n m ， 当与h s a反应后，激发峰移至 3 9 0 n m , 荧光峰 移至4 2 0 n m ， 且荧光强 度大大增加， 可测定0 - 5 m g / l 范围内h s a o 在p h 4 . 5的缓冲溶液中，蛋白质与藻红b ( e b ) 结合，用 3 1 7 n m 紫外光激发， 荧光峰位于 5 5 0 n m ，可定量测定蛋白 质4 0 ) 。 对 b s a , h s a 、工 g g等蛋白 质的线性 范围为1 . 3 6 - 2 0 . 4 m g / l 。反应室温下一分钟内即可完成，荧光强度在2 小时内保 持稳定，并且操作非常简便。 在p h 3 . 0 的柠檬酸缓冲溶液中 ( 也可用乳酸、 甘氨酸、酒石酸缓冲溶液) ， h s a 与铬天青 s ( c a s ) 结合，激发峰位于 4 8 5 n m ,荧光峰位于 6 1 6 n m ， 并且荧光强度发 生 变化。 对h s a 的 线性范围为1 - 1 6 m g / l 4 1, 4 2 o y u t a k a 等通过对 1 0 种分子结构与铬天青s 相似的染料与h s a 复合物的吸收光 谱和荧光光谱进行比较，得出可电离的狡基是染料一 h s a复合物具有荧光的必须 基团的结论。并发现埃铬青 r ( e c r ) 可能比铬天青 s更适用于荧光法测定蛋白质 4 3 。慈云祥等将埃铬青r 用于h s a 的测定，在p h 4 . 6 柠檬酸缓冲溶液中，e c r 与 h s a相结 合， 激发峰位 于3 0 8 n m , 荧光峰 位于4 2 3 n m , 荧光强 度有大幅 度增加， 可 测定0 . 5 - 1 2 m g / l 范围内h s a ， 检测限 可达0 . 5 t g / m l 4 4 3 0 荧光素异硫氰酸醋 ( f t t c )与 n - ( 7 一 二甲氨基一4 一 甲基邻轻基丙烯基) 一顺丁 烯二酞亚胺 ( d a c m )作用导致后者荧光淬灭，当溶液中存在酪蛋白时，被淬灭的 荧光又得到增强， 激发峰位于3 8 5 n m ,荧光峰位于4 7 0 n m ， 可测定 0 - l 0 0 g g / l 范 围内酪蛋白，也可用于胰蛋白酶的测定4 6 j + , (3 , 7 , 8 一 四 ( 4 ， 一 梭苯基)叶琳 ( t c p p ) 在 p h 3 . 0的b - r缓冲溶液中，与 白蛋白生成复合物，激发峰位于 4 2 5 n m ,荧光峰位于 6 5 5 n m ，在十二烷基磺酸钠 ( s d s )存在时，t c p p与球蛋白产生荧光。因此可以用一种试剂同时测定白蛋白 第一章 绪论 和球蛋白。 线性范围 为0 . 0 9 - 1 2 p g / m l ， 对白 蛋白 和球蛋白的 检测限分别为6 0 n g / m l 和9 0 n g / m l 0 5 7 0 k i n o s h i t a 4 7 . 4 9 7 等 利用次氯酸盐与蛋白 质的。 一 氨基酸进行酞基化反 应， 然后 用亚硝酸盐除去活性氯，最后通过维生素 b ; 的氧化作用生成硫代铬黄 ( t h i o c h r o m e )， 于3 7 0 n m 处激发，4 4 0 n m处检测荧光强度。 t o s h i o 4 9 在此基础 上实现了 流动注射荧光法测定蛋白 质，线性范围为2 0 n g - 2 h g ，检测限为l o n g o 3 - ( 4 - 狡基苯甲酞基) 哇琳- 2 - 梭基乙醛 ( c b q c a )也是荧光法检验蛋白质的灵 敏试剂。用4 3 0 - 4 9 0 n m的可见光激发它与蛋白质反应的产物，在5 2 5 - 6 0 0 n m 范围 内 产生荧光， 荧光峰位于5 6 0 n m 附 近， 可测定 l o n g - 1 5 0 f t g ( 1 0 0 - 2 0 0 川) 范围内 蛋 白 质4 9 7 荧光染料四磺基铝钦著 ( a 1 s , p c )作为荧光探针可用于荧光淬灭测定 h s a ，由 于激发光与发射光之间波长间隔很大，而且发射光位于近红外波段，有利于避开 试样背景荧光及散射光的 千扰， 使方法具有较高灵敏度和准确度 5 0 . 5 1 7 荧光探针法还可用来间接测定测定蛋白质。如蛋白质在碱性条件下发生水解， 得到的氨基酸与邻苯二甲醛和 2 - 琉基乙醇反应生成有荧光的产物，激发峰位于 3 4 0 n m , 荧光峰 位于4 5 0 n m ， 可 测定0 . 0 5 - 2 p g 范围内 蛋白 质， 检测限为2 5 n g 5 2 7 0 荧光法测定蛋白质与前文提到的分光光度法相比，最显著的优点是灵敏度高。 但其缺陷在于仅适用于具有荧光的体系。这大大限制了它的使用范围。因此，分 析化学家们还寻找出了其他的优秀方法。 第三节 蛋白质的共振光散射法测定 光的散射是指一束光通过介质时，在入射方向以外的各个方向观察到的一种 光辐射现象。共振散射是散射光波长等于入射光波长的散射。其中散射粒子 ( 如 分子)远小于入射光波长产生的弹性散射，其散射强度与波长的四次成反比，称 为 瑞利( r a y l e i g h ) 散射。 瑞利散射在化学研究当中 主要用于分子量测定5 3 7 、 分 子旋转半径、形状和尺寸测定 5 4 . 5 5 7 ，及反应过程的动态行为研究5 6 . 5 7 7 等，它可 为化学研究提供一些有价值的信息，但是也存在着信号水平低和选择性差的缺 点。由于信号水平低，必须使用价格昂贵的激光光源，通常采用的单一波长激光 光源不仅不能提供较完整的瑞利散射光谱，而且即便使用激光光源，对于研究一 第一章 绪论 些极稀释溶液中物质的浓度和结构信息也非常困难:而选择性差，则限制了它在 复杂体系中的应用。 但是当瑞利散射位于或接近于它的吸收带时，由于电子吸收电磁波的频率与 其散射频率相同，电子因共振而强烈吸收散射光的能量发生再次散射，其散射强 度通常较单一的瑞利散射提高几个数量级，并且不再遵守 i - 1 /人 4 的瑞利散射 定律。这种吸收再散射的过程称为共振瑞利散射 ( r r s ) 。由于共振瑞利散射有极 高的强度，因此入射光可用普通光源，这不仅使方法简便，而且普通光源 ( 如氮 灯)通过单色器可提供连续波长的入射光，这就为研究共振瑞利散射光谱创造了 条件。 目 前 r r s的分析应用主要集中于两个方面:( 1 )利用某些离子缔合物络合产 生强烈的 r r s 6 6 而用于痕量金属 6 9 - 6 0 非金属 6 1 的测定;( 2 )利用生色团在生物 大分子上的聚集作用导致 r r s显著增强而蛋白质、核酸等生物大分子的定量测 定。 有机染料用作蛋白 质光散射分析测定，其基本原理可用下式说明: n r - + p = p r . 其中r 代表带m个负电荷的试剂探针，p 代表带 m x n个正电荷的蛋白质，由 于静电、疏水的协同作用而结合，形成以蛋白质为核心，带相反电荷的有机染料 包被的电荷聚集体。 从光散射基本理论可知， r a y l a i g h体系的浓度很小，在静电力和疏水力的协 同作用下，有机染料吸附在蛋白质的表面，形成的聚集体的体积比有机染料大的 多，因此得到被蛋白质增强的光散射信号。继续加大蛋白质的浓度，可以得到更 多的聚集体，由 于r a y l e i g h 散射与单位体积内的 粒子数目 成正比 6 2 1 ， 所以， 在 一定范围内，光散射信号的强度与蛋白 质的浓度呈线性关系。但是，当蛋白 质的 浓度更大时，有更多的聚集体生成，体系的散射变得复杂，不再属于 r a y l e i g h 体系，因而，光散射信号与加入的蛋白 质质量不呈线性关系。因粒径大于 o . l a 时同一粒子的不同部位产生的光散射有内干涉。若粒子彼此靠的很近，每个粒子 产生的 散 射光互 相千涉， 即 外 千涉。出 现外 千涉会使散 射变得更复 杂6 3 1 从已发表的共振光散射测定蛋白 质方法 6 4 - 6 9 1 可知，几乎所有的散射峰都位于 有机染料的吸收峰峰谷，二者似乎有对映关系，但这并不表明最大光散射峰一定 位于吸收峰峰谷。 r a y l e i g h光散射在有色物质的吸收峰附近 ( 红边)产生共振 一一一一 m -些丝一一一一一一一一 增强现象。由于光吸收，光散射信号降低，在吸收峰处散射强度最低。对于吸收 峰强烈而且红边特别陡的有机染料， 其光散射峰与吸收峰波长很相近. 如变色酸， 吸收峰波长为 3 1 5 n m ，对应的散射峰波长为 3 2 4 n m ，差值仅为 9 n m 。而对于吸收 峰宽而且红边拖尾的有机染料如邻苯二酚紫，产生的共振光散射峰与其吸收峰则 相差很远， 其 3 3 2 n m 和 4 4 1 n m 处的吸收峰所对应的散射峰分别为 3 7 0 n m 和 5 5 5 n m , 差值为 3 8 n m和 1 1 4 n m ，实验结果表明，在 2 7 0 - 6 0 0 n m之间有一个吸收峰就会有 一个散射峰，r a y l e i g h光散射的强度与波长成反比。对于 6 0 0 - 7 0 0 n m范围，光 散射一般很小，吸收太强就不会有光散射峰。加入蛋白质之后，体系的光散射峰 形一般不会改变，峰位置也不变。 目 前己发表的用作蛋白质分析的光散射探针大多数属于三苯甲烷类( 7 0 - 7 3 . 6 4 - 6 6 ， 还有叶 琳 类7 3 - 7 5 ， 偶 氮 类6 7 . 7 6 等。 澳 酚 蓝、 铬天青s 、 铝试剂、四 碘酚 磺 酞均属于非联苯型三苯甲 烷试剂，而澳连苯三酚红、茜素紫和茜素莆绿属于联苯 型染料。这些染料的共同特点是带有一个以上的轻基、梭基或磺酸基。 偶氮类探针偶氮肿i i i 属于变色酸偶氮化合物，而酸性铬蓝k 是轻基、磺酸基、 乙二胺取代的偶氮苯试剂，二者的共同点是苯环上带有一个以上的轻基和磺酸 基. 水溶性叶琳试剂t s t p , t c p p , t p p s ; 也被用作蛋白 质的光散射探针， t s t p 和 t p p s ; 分子各 带有4 个磺酸基， t c p p 分子含4 个狡基。 黄酮类试剂的 母体是五轻 基黄酮，其分子式中含5 个轻基。基于以上光散射探针的结构特点，我们可以推 测更多的偶氮类染料和三苯甲烷类染料可作为蛋白质光散射探针。 研究发现荧光黄、二氯荧光黄、四碘荧光素染料空白的光散射信号太强以至 于观察不到蛋白质的光散射增强效应。酚酞不能用作蛋白质的光散射探针的原因 是蛋白质对其光散射信号无放大作用。在酸性条件下酚酞以醒式结构存在，不能 与蛋白 质以静电作用结合，因而无法生成大的散射聚集体。 以下是对共振光散射法测定蛋白质所使用的主要试剂的简要介绍. 叶琳类试剂 阴离子u 卜 琳试剂a ， 0 , , r , 6 一 四 ( 5 一 磺基唾嗯基)u 卜 琳 ( t - ( 5 - s t p ) ) 7 6 在 蛋白质存在下发生 j 一 型聚集，产生增强的共振光散射信号，最大散射峰位于 4 3 6 . l n m ，散射强度随着蛋白 质浓度的增加而增加， 对 b s a和 h s a的线性范围均 为0 - 5 m g / l ，检测限分别为2 6 . 4 和2 6 . 8 n g / m l . o 酸性三苯甲烷染料 -一一一 堑 * 些竺一一一一一一一 嗅酚蓝 ( b p b ) 0 p h 3 . 9 8时，澳酚蓝与蛋白 质的结合导致了溶液共振光散 射光谱的变化，在3 3 4 n m 处产生一个最大共振散射峰，其强度与蛋白质浓度成正 比。方法具有灵敏度高 ( 0 . 3 4 -1 8 . 7 p g / m l ) 、简便 ( 一步完成) 、快速 ( 2 m i n ) 的特点，但由于血浆中y 一 球蛋白的影响会导致方法对血浆中白蛋白含量测定时 出现偏差。 铬天青s ( c a s ) 2 在p h 3 . 5 左右的 柠 檬酸 一 n a o h 介质中， 蛋白 质与 铬天青 s通过以 静电引力等分子间作用力结合生成大分子缔合物，产生最大散射波长约 为 3 7 0 n m的共振光散射。基于这一现象可测定低至 0 . 0 2 m g / 1的血清白蛋白，工 作曲 线在0 -1 . o m g / l 范围内 成线性关系，方法的灵敏度比c b b 法高5 0 倍.该 法用于尿液中微量蛋白的测定，结果满意. 四碘酚磺酞 ( t e t r a i o d o p h e n o l s u l f o n e p h t h a l e i n , t i p s p ) 川 四碘酚磺 酞与蛋白 质的反应引起溶液共振光散射强度的提高，最大散射峰位于 3 3 4 n m ，其 强度与蛋白质浓度成正比。四碘酚磺酞与蛋白 质的反应在 2 m i n内即可完成，并 具有较高的灵敏度，对蛋白 质的检出范围是 0 . 3 4 -1 2 . 2 4 m g / 1 。方法的选择性较 好，氨基酸、大部分金属离子及 e d t a等物质对测定无干扰，而一些金属离子、 洗涤剂和盐的干扰也较轻微。 酸性绿 2 5 ( a c i d g r e e n 2 5 , a g 2 5 ) 16 方法是基于酸性绿 2 5与蛋白 质在酸 性条件下反应导致共振光散射强度的提高而建立的微量蛋白质的测定方法。该法 灵敏度高 ( 检出范围 0 . 1 3 6 -1 0 . 2 0 x 1 0 6 m g / 1 ) 、快速 ( 2 m i n ) 、简便，并且选择 性好，氨基酸、e d t a 及大部分金属离子不干扰测定。 酸性咕吨染料 邻苯三酚红 ( p r ) 7 7 在p h 2 . 5 6 - 4 . 1 0 的酸度范围内，邻苯三酚红与蛋白 质 的结合反应导致了溶液共振光散射强度的提高，最大散射峰位于3 6 0 . o n m 处，散 射强度与蛋白 质浓度在 0 - - - 5 . o m g / l范围内成正比。方法干扰小，灵敏度高，用 该法对蛋白质合成样品及人尿中白蛋白含量进行了测定，结果满意。 澳邻苯三酚红 ( b p r ) s s 酸性条件下，澳邻苯三酚红与蛋白质的作用使溶液 的共振光散射得到增强，最大散射峰位于 3 3 2 n m处，散射强度与蛋白质浓度在 0 . 1 3 6 - 6 . 8 0 m g / l 范围内呈线性关系。反应瞬间完成，散射强度至少可稳定3 h . 方法具有较好的选择性。 酸性偶氮染料 _一生皇 m 色一一一一一一一一一一 4 一偶 氮 滨 变 色 酸 苯 基 荧 光 酮 ( 4 - a z o c h r o m o t o r o p i c a c i d p h e n y l f l u o r o n e , a c a p ) p h o . 5 - 1 . 8时， 4 一 偶 氮澳变色酸苯基荧光酮的共振 光散射峰位于3 3 7 n m 处，当有微量的蛋白质存在时，蛋白质与染料的结合反应导 致共振光散射的增强， 最大散射峰仍位于3 3 7 n m 处， 散射强度与蛋白质( b s a , h s a ) 浓度在0 . 2 - 4 . o m g / 1 范围内成正比。方法简便、快速、灵敏度高 ( 对b s a 和h s a 的检出限为 6 8 g g / l 和 7 5 p g / 1 ) ,稳定性好， 对人血浆和尿液中蛋白 质的测定结 果与c b b 法相吻合，可用于微量蛋白质含量的测定。 酸性铬蓝 k ( a c i d c h r o m e b l u e k , a c b k ) 在 p h 3 . 9 6的柠檬酸一 柠檬酸 钠缓冲溶液中，蛋白质与酸性铬蓝k 的结合能导致溶液共振光散射的增强，并在 3 4 5 n m处产生最大散射峰，蛋白质浓度在 0 . 1 3 6 -1 0 . 8 8 m g / l范围内与散射强度 呈成正比。结合反应在 2 m i n内可进行完全，散射信号至少可稳定 3 h 。大部分金 属离子、氨基酸及 e d t a等物质对测定没有干扰，而洗涤剂、一些金属离子和盐 对测定的干扰可以通过稀释而控制到最小程度。 偶氮磺i i i ( s u l f o n a z o l i i ) (7 9 在p h 4 . 2 3 的b r i t t o n - r o b i n s o n 缓冲溶液中， 偶氮磺m仅有微弱的共振光散射，加入蛋白 质后，蛋白质与偶氮磺m的结合反应 引起共振光散射的显著增强并在 3 6 7 n m , 4 4 6 n m 、和 6 0 2 n m出现三个特征的共振 光散 射峰， 散 射强度5蛋白 质浓度在0 . 3 0 - 3 0 . 5 m g / 1 范围 成正比。 反应在2 m i n 内完成，至少稳定 3 h .氨基酸、大部分金属离子及表面活性剂等物质对测定干 扰较小。用该法对人血清中白蛋白含量进行了 测定，结果与c b b 法较吻合。 3 - ( 4 - 磺苯基偶氮) 4 , 5 一 二轻基一 2 , 7苯二磺酸 ( 3 - ( 4 - s u l f o h e n y l a z o ) - 4 , 5 - d i h y d r o x y - 2 , 7 - n a p h t h a l e n e d i s u l f o n i c a c i d , s p a p n s ) ee 0 在p h 2 . 2 - 3 . 0 的酸性介质中，s p a p n s的共振光散射很微弱，当加入蛋白质后，s p a p n s在室温 下很快与蛋白 质反应，引起共振光散射的急剧增强，且共振光散射强度与蛋白质 浓度在 0 . 1 2 5 0 . 1 4 9 m g / l 范围内 成正比 。 将方 法用于人血浆中 蛋白 质浓度的 测 定，结果与经典的c b b 法相符合。 其它试剂 撇皮素 ( q u e r c e i n , q t ) 又名栋精，是共振光散射法测定蛋白 质浓度的又 一灵敏试剂。在p h 4 . 1 0 4 . 3 5的缓冲溶液中，蛋白 质如b s a , h s a 、胃蛋白酶、 。 一 糜蛋白 酶、溶菌酶、纤维素酶等均能与棚皮素发生结合反应，导致共振光散 射强度的提高， 最大散射峰位于4 0 0 n m 和4 7 0 n m 处， 在3 5 0 -3 8 0 n m , 4 1 0 -4 5 0 n m 第一章 绪论 及4 7 5 - 5 1 0 n m 处有肩峰。4 0 0 n 二 处的散射强度与b s a 浓度在 0 -4 . 5 m g / l 范围内 呈正比。方法简便、快速、具有较好的选择性。 从以 上蛋白质光敌射探针可以看出，探针染料含有带电荷的亲水性基团，如 磺酸基、梭基、酚轻基