（营养与食品卫生学专业论文）微波合成低聚木糖及其抗氧化与降血脂作用研究.pdf

摘要 摘要 低聚木糖，作为新型的食品添加剂，由于具有比其他低聚糖更优越的特性及功能性 而越来越被人们所关注。低聚糖的合成通常采用酶法技术，合成时间长，纯度低而且存 在废液污染。微波固相合成低聚糖以单糖或双糖为反应物，其反应速度快，合成率高且 清洁无污染。本研究以木糖为反应物，在微波加热条件下固相合成寡糖混合物，探索了 合适的反应条件，确立了合成工艺路线，对合成产物体外清除自由基活性进行了探讨， 并研究了产物对高脂血症小鼠的抗氧化及降血脂功能。 经单因素和正交实验得出以木糖为底物，以酸a 为催化剂，利用微波固相合成寡糖 最适反应条件为：微波功率1 0 0 0w ，微波处理时间3 5r a i n ，引发剂的添加量1 7 ，催 化剂的添加量为9 ，合成率为8 4 8 6 。h p l c 分析：产物中二糖占1 3 4 5 ，三糖占 7 4 2 ，四糖及以上占6 3 9 9 。 对微波加热固相合成的不同聚合度的低聚木糖( 低聚合度( l l ) 、中聚合度( m l ) 、 高聚合度( h l ) ) 清除羟自由基( o h ) 及d p p h 自由基活性进行了研究。实验结果 表明，低聚木糖对o h 具有较好的清除活性，高聚合度的低聚木糖对o h 的清除作用 最显著，i c s o 为1 4m g m l 1 。低聚木糖对d p p h 自由基几乎没有清除能力。 为了解低聚木糖的抗氧化与降血脂作用，以小鼠为研究对象，用高脂饲料诱导高脂 血症模型，同时在高脂饲料中添加不同百分比的低聚木糖，观察不同实验组小鼠的血浆 和组织自由基水平、s o d 、g s h - p x 及c a t 活性、t - a o c 、m d a 含量以及血脂水平。 结果表明：与正常对照组相比，饲喂高脂日粮可导致小鼠氧化应激，降低机体抗氧化能 力，提高小鼠血浆t c ，t g ，l d l - c 的水平，降低h d l - c 水平。高脂日粮中添加低聚 木糖能显著降低高脂血症小鼠体内自由基水平，显著增强血浆及组织中s o d 、g s h p x 及c a t 活性，增加t - a o c ，显著降低m d a 含量。低聚木糖还能显著降低小鼠血浆总 胆固醇( t c ) 、甘油三酯( t g ) 、低密度脂蛋白胆固醇( l d l c ) 和动脉粥样硬化指数 ( 触) ，显著升高高密度脂蛋白胆固醇( h d m ) 。因此，低聚木糖具有抗氧化和降血 脂作用。 关键词：低聚木糖微波合成抗氧化清除自由基氧化应激降血脂 a b s t r a c t x y l o o l i g o s a c c h a r i d e , a san e w t y p eo ff o o da d d i t i v e , 谢t l li t sd i s t i n c t i v ec h a r a c t e r i s t i c s a n db e t t e rf u n c t i o nt h a no t h e ro l i g o s a c c h a r i d e s ，i sr e c e i v i n gg r e a t e ra t t e n t i o n o l i g o s a c c h a r i d e i s u s u a l l ys y n t h e s i z e db ye n z y m e s ，w h i c ht a k e sal o n gt i m e a n dh a sl o wy i e l d m i c r o w a v e - a s s i s t e ds y n t h e s i so fo l i g o s a c c h a r i d e si ns o l i ds t a t eh a sar a p i ds p e e da n dh i g h 姐e l d ，i ta l s oh a sn oe n v i r o n m e n tp o l l u t i o n i nt h i st h e s i s ，o l i g o s a c c h a r i d e sw e r es y n t h e s i z e d a s s i s t e d 诵mm i c r o w a v ei ns o l i ds t a t e , x y l o s e 鹊t h er e a c t a n t , a c i daa st h ec a t a l y s t p r o p e r m e t h o d so fs y n t h e s i st e c h n o l o g yc o n d i t i o n sa s s i s t e dw i mm i c r o w a v ew e r es t u d i e d ，n 圮丘 r a d i c a l ss c a v e n g i n ge f f e c to ft h es y n t h e t i co l i g o s a c c h a r i d e sw e r es t u d i e d ，a n dw ea l s o i n v e s t i g a t e d t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t e sa n dh y p o l i p i d e m i ce f f e c t so ft h e s y n t h e t i c o l i g o s a e c h a r i d e si nh y p e r l i p e m i ar a t s t h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r ei n v e s t i g a t e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ta n d o r t h o g o n a lt e s ta n dt h eo p t i m u mr e a c t i o n c o n d i t i o n sa r e m i c r o w a v ep o w e r10 0 0嘭 m i c r o w a v ei r r a d i a t i o nt i m e3 5r a m , a d d i n g1 7 i n i t i a t o r , a d d i n g9 a c i daa st h ec a t a l y s t 砀ey i e l do fp r o d u c tw a s8 4 8 6 乃ep r o d u c tw a sc h a r a c t c d z e db yh p l ca n a l y s i s 砀e c o n s t i t u t e ro fp r o d u c tw a se s t a b l i s h e d 嬲f o l l o w s ：d i s a c c h a r i d e s13 4 5 ，t d s a c c h a f i d e s 7 4 2 ，t e t r s a e c h a r i d e sa n do t h e rp o l y s a e e h a r i d e s6 3 9 9 ，n l ch y d r o x y lr a d i c a l s ( 。o h ) a n dd p p hr a d i c a l s s c a v e n g i n ge f f e c t so fx y l o - o l i g o s a e c h a r i d e si nd i f f e r e n td e g r e e so fp o l y m e r i z a t i o n s ( d p s ) s y n t h e s i z e da s s i s t e dw i t h m i c r o w a v ei ns o l i ds t a t ew e r es t u d i e d n er e s u l t ss h o w e dt h a tx y l o - o l i g o s a c c h a r i d e sh a d s a t i s f a c t o r ys c a v e n g i n ga c t i v i t i e st o o h ，a m o n gt h et h r e ex y l o - o l i g o s a e c h a r i d e si nd p s ( l l 、 m l 、h l ) ，t h ex y l o - o l i g o s a c c h a r i d e so f h i g hp o l y m e r i z a t i o nd e g r c c ( h l ) h a sm o s tr e m a r k a b l e s c a v e n g i n ge f f e c t so n o h ，i c 5 0w a sa b o u t1 4m g 。m l 1 a n dt h ex y l o - o l i g o s a c c h a r i d e sh a d h a r d l ys c a v e n g i n ge f f e c t so n d p p hr a d i c a l s i no r d e rt o i n v e s t i g a t et h e a n t i o x i d a n ta c t i v i t i e sa n dh y p o l i p i d e m i ce f f e c t so f x y l o - o l i g o s a c c h a r i d e s ，t h eh y p e r l i p i d e m i cr a tm o d e li n d u c e df r o mh i g h - f a tf e e dw a su s e da s e x p e r i m e n t a lm a t e r i a l d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fx y l o o l i g o s a c c h a r i d e sw e r ea d d e di n 1 l i 曲- f a tf e e d ，t h e nc h a n g e so ff i e er a d i c a l s ( f r ) ，s o d ，g s h p ) 【，c a t ，f a o c ，m d aa n d h y p o l i p i d e m i ce f f e c tw e r eo b s e r v e d 耽er e s u l t ss h o w e dt h a th i g h - f a td i e tc o u l dr e s u l ti nm t s o x i d a t i v es t r e s sa n dr e d u c ea n t i o x i d a t i o nc a p a b i l i t yo fr a ts i g n i f i c a n t l y , a n dt h el e v e l so ft c ， t ga n dl d l - cw e r ei n c r e a s e da n dh d l - cw e r ed e c r e a s e d 鹤c o m p a r e dt on o r m a le n e r g y d i e t s a d d i t i o no fx y l o - o l i g o s a c c h a r i d e si nt h eh i 萨f a td i e t sc o u l de n h a n c et h ea c t i v i t i e so f s o d ，g s h - p x ，c a t , i n c r e a s et h et h el e v e lo ft - a o c ，d e c r e a s et h ef ra n dt h ec o n t e n to f m d ai ns e r u ma n dt i s s u ee f f e c t i v e l y i ta l s od e c r e a s e dt h el e v e l so ft c ，t g ，l d l ca n da i ， i n c r e a s e dt h el e v e lo fh d l - cs i g i n i f i c a n t l y 1 1 1 er e s u l t si n d i c a t e dt h a tx y l o o l i g o s a c c h a r i d e s h a da n t i o x i d a n ta n dh y p o l i p i d e m i ce f f e c t s k e y w o r d s ：x y l o - o l i g o s a c c h a r i d e s m i c r o w a v es y n t h e s i sa n t i o x i d a t i o n s c a v e n g i n g r a d i c a l so x i d a t i v es t r e s s h y p o l i p i d e m i ce f f e c t s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是泰人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签 名： 三丕 日 期：口子多，) 关于论文使用投权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签 名： r 乎 j 勿、导师签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 低聚木糖概述 1 1 1 低聚木糖的理化性质、生理功能及应用 低聚糖又称寡糖，是1 扫2 - - 1 0 个单糖通过糖菅键连接形成的直链或支链一类寡糖的总 称，其分子通式一般可表示为( c 6 h l 0 0 5 ) n ，n 为2 - - 1 0 ，其分子量约为3 0 0 - - 2 0 0 0d a ， 分为功能性低聚糖和普通低聚糖两大类 1 , 2 1 。其中，功能性低聚糖是指那些具有糖类某些 共同特性，可直接替代糖料作为甜食配料，但是不被人体胃酸、胃酶降解，不能被小肠 吸收，可以直接到达大肠，能促进人体双歧杆菌的增殖的群3 1 。 低聚木糖又称木寡糖，是指2 1 0 个d 木糖残基以b 1 ，4 糖苷键连接而成的低聚 糖。和其它低聚糖如低聚果糖、乳果糖、异麦芽糖等一样，低聚木糖是新近发展起来的 一种功能性低聚糖。低聚木糖产品的主要成分为木糖、木二糖、木三糖及少量木三糖以 上的木聚糖。 低聚木糖具有一些独特的理化性质及生理功能。1 、稳定性：和其他的功能性低聚 糖相比，低聚木糖的一大突出特点是稳定性好，具有较高的耐热和耐酸性能。在p h 2 扣8 0 的范围内相当稳定，在此p h 范围内经1 0 0 加热1h ，低聚木糖几乎不分解m 。2 、水 分活度和粘度：低聚木糖具有降低水分活度的作用，此外，低聚木糖的粘度也比其他的 低聚糖低，在各种形式产品中的加厂处理上，显得极为方便5 一。3 、对有益菌( 尤其是 双歧杆菌) 有显著的增殖作用能改善肠道环境：由于低聚木糖中的其中两种主要有效成 分木二糖和木三糖，属于不消化但可发酵的糖，几乎不被人体内的消化液所降解，不能 被人体直接利用吸收，因此可以直接到达肠道，被肠道有益菌优先利用，可大量增殖双 歧杆菌和乳酸菌【4 】从而抑制有害菌如梭状芽孢杆菌、大肠杆菌及沙门氏菌等的生长并减 少有毒发酵产物的形成，改善肠道微生物环境，提高人体的免疫力。低聚木糖还具有防 止便秘的功能，能够润肠通便，可以有效改善大便的水分含量，使之保持在8 0 左右， 并且具有双向调节功能，可以使泻痢或便秘状态得到缓解 6 - 9 1 。4 、其他一些生理功能： 低聚木糖是一种膳食纤维，它能够抑制病原菌，对其有较强的吸附力，由于低聚木糖的 难消化性，可携带吸附的病原菌一起排除体外；低聚木糖可以减少有毒代谢产物形成， 减轻肝脏分解毒素的负担，而起到保护肝脏的作用瞵- 9 】；此外，低聚木糖还具有防龋齿 性【6 】、低甜度，低热量川、促进钙的吸收、无毒性，安定性【8 】的特点。 此外，值得一提的是有报道还表明，低聚木糖能够降低血压、血浆胆固醇、甘油三 酯及游离脂肪酸 8 , 1 0 - 1 1 】。 由于低聚木糖具有良好的理化特性，因此，在食品、农业、药物等方面的应用研究 广泛，其中值得一提的是低聚木糖在饲料方面的应用。随着饲料行业的快速发展和竞争 日趋加剧，人们对动物食品安全饲料安全的呼声越来越高，饲用低聚木糖无污染、无 毒副作用、无残留，既具有防病抗病能力，提高饲料利用效率，又能大幅度提高畜禽的 生产性能，完全符合绿色、安全、环保饲料的要求【l 2 1 。 江南大学硕士学位论文 1 1 2 低聚木糖抗氧化性研究初探 最近，抗氧化、清除自由基已成为生物、食品以及医学方面研究的热点。如上文所 述，低聚木糖具有诸多优良的生理功能。可是关于低聚木糖的抗氧化性功能方面，目前 还鲜有报道。那么，低聚木糖是否具有抗氧化性，抗氧化作用大小如何，作用机制又是 什么等等，带着这一系列问题我们开始了对低聚木糖抗氧化性的探讨。 活性氧自由基对机体具有巨大的损伤作用，如引起蛋白质损伤、酶失活、膜质过氧 化，导致衰老、肿瘤、动脉粥样硬化等许多疾病的发生【1 3 1 。而抗氧化活性物质则能够保 护机体免受自由基的损害，减少疾病的发生，延缓衰老，增强机体免疫力等1 1 4 】。低聚糖 属多羟基类化合物，近年来研究发现它们具有许多药理学功能，尤其化学合成技术的重 大突破，可以成功实现工业化开发利用，所以成为近年来研究和开发的热点，其中它的 抗氧化、清除自由基特性更受到人们的普遍关注。 低聚糖化合物具有优良的抗氧化性质，目前学术界已经通过不同途径对多种低聚糖 类化合物的抗氧化活性进行了研究。对抗氧化物质的抗氧化活性研究可以从体内、体外 两个角度展开。现已观察到一些低聚糖如琼胶寡糖、阿魏酰低聚糖、甲壳低聚糖等对自 由基具有清除作用【1 孓1 7 1 。但是上述针对低聚糖的抗氧化作用是在体外清除自由基的基础 上进行的，目前国内外对于低聚糖体内抗氧化作用的研究甚少。另外，研究某种抗氧化 剂的抗氧化性还可以从它结构和功能的关系方面来探讨，这就有可能涉及到量子化学方 面的知识。郭清泉、林淑英等采用量子化学计算法探讨二氢杨梅素抗氧化机制，确定了 二氢杨梅素分子的抗氧化活性中心【1 8 1 。王朝杰等对不同取代基对酚羟基抗氧化活性的影 响进行了计算研究【1 9 1 。 对抗氧化剂的抗氧化性研究已经成为热点，但是对抗氧化剂的作用机制的研究由于 一些技术问题等实际困难还有一定局限性。对抗氧化机理研究的比较透彻的有茶多酚 2 0 l 、黄酮类抗氧化剂【2 1 】等少数。迄今认为抗氧化剂的作用机制至少包括三种：通过酚羟 基与自由基进行抽氢反应生成稳定的半醌自由基，从而中断链式反应以完成抗氧化作用 2 2 1 。通过抗氧化剂的还原作用直接给出电子而清除自由基【2 3 1 。通过抗氧化剂对金属离子 的络合，降低若干需金属离子催化的反应，如f e n t o n 反应的速率，从而间接实现抗氧 化作用 2 4 3 。一般认为，第一种机制在大多数情况下是最重要的，因而研究最多。而清除 自由基的途径有：( 1 ) 直接清除自由基：对于由各种理化因素引发的自由基链反应， 此类化合物重要的抑制机制就是阻断自由基链的传链过程，中断链锁反应。另外，黄酮 化合物可经由单电子转移方式直接清除0 2 ，还可清除o h 、单线态1 0 2 等【2 5 之6 1 。( 2 ) 间接清除自由基：清除体内自由基有两种方式，一种是与蛋白质进行沉淀，作用于自由 基有关的酶。槲皮素等大多数黄酮醇可抑制黄嘌呤氧化酶的活性 2 5 】。槲皮素、桑色素等 对细胞色素p 4 5 0 也有抑制作用；另一种是与诱导氧化的过渡金属离子络合：体内的许 多氧化过程是在过渡金属离子的参与下进行的。已证实槲皮素、芦丁等在f e 2 + 参与的 氧化体系中的抗氧化活性与其络合f e 2 + 的能力有关【2 6 1 。抗氧化作用是一个很复杂的反 应，抗氧化剂抗氧化能力的大小取决于它们夺氢反应、还原作用及生成自由基的稳定性 等诸因素【2 7 1 。 第一章绪论 对于低聚木糖而言，作为优良的双歧杆菌增殖因子，由于具有：高选择增殖双歧杆 菌、减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生、抑制病原菌和腹泻、保护肝脏功能、降低 血压、降低血浆胆固醇、增强机体免疫力，抗癌、抗疲劳等诸多功能而受国内外消费者 普遍青睐【8 】。但是，查阅相关文献，在低聚木糖的这么多功能中几乎没有关于其抗氧化 功能方面文章报道，其主要原因可能对低聚糖的抗氧化方面的研究在目前看来还处于初 始阶段，尚不成熟，并且对于上述低聚木糖各种功能的机理大部分还没研究透彻，所以 很难将它们与低聚木糖的抗氧化功能相联系。目前由于低聚糖的分离检测的方法、技术 尚不完善，从结构与功能之间的关系探讨低聚木糖的抗氧化性尚存在一定难度。而事实 上很多疾病的发生、发展以及身体的自我防御保护等等功能都与体内自由基的变化及抗 氧化息息相关，因此我们可以尝试从体内体外两个角度来研究低聚木糖的抗氧化性，并 对其抗氧化机理进行探讨 1 1 3 低聚木糖的生产概况 由于低聚木糖功能优异，所以是一种市场前景看好的功能性食品添加剂。在日本， 木低聚糖被认为是最有前途的功能性低聚糖之一，目前其年产量已超过1 5 0 0t 。在国内， 低聚木糖尚未实现工业化生产。1 9 9 7 年后，许多学者，特别是江南大学的多位学者，陆 续报道了他们关于低聚木糖的研究成果。目前，国内多以玉米芯为原料进行低聚木糖的 提取，少数以小麦麸皮为原料进行提取。迄今为止，低聚木糖的制备方法，大体可归纳 为四种：( 1 ) 酸水解法【2 8 】；( 2 ) 热水抽提法 2 9 - 3 3 】( 含蒸汽喷爆法) ；( 3 ) 酶水解法 【3 q ( 含物理或化学酶联合法) ；( 4 ) 微波降解法阴。但这几种方法分别存在一些实 际问题而未能广泛应用。主要由于稀酸水解法需要耐酸、耐压、耐热设备，技术要求高， 投资大；而且速度快，很难将反应停止在低聚木糖阶段，并且酸水解反应会伴随有害物 质生成，造成产品的精制工艺烦琐，得率低，不适合工业化生产。热水抽提制备低聚木 糖的方法精制工艺烦琐，产品得率低。微波降解法目前仅限于实验室研究。我国的研究 多集中在酶法制备低聚木糖，以木聚糖为底物，通过内切木聚糖酶水解木聚糖的b 1 ，4 糖苷键而得以木二糖、木三糖和木四糖等为主要成分的木低聚糖混合物【4 】。目前多选取 微生物酶源。用于低聚木糖生产的木聚糖酶的微生物分布很广，有几十个属、一百多个 种，放线菌、真菌以及某些酵母均能产木聚糖酶。目前国内多以霉菌为产酶菌种，少数 以细菌为产酶菌种。但酶法合成普遍存在酶易失活，产物分离纯化困难，合成产物产率 不高，生产过程较为复杂且生产中不可避免会产生环境污染等问题【3 6 】。 1 2 低聚木糖微波合成探索 上段中低聚木糖的一些生产方法，大都存在一些实际生产中未能解决的问题。一般 来说，获得低聚糖的途径主要有5 种：从天然原料中提取；利用转移酶、水解酶催 化的糖基转移反应合成；天然多糖的酶水解；天然多糖的酸水解；化学合成f 3 7 1 。 而这些方法中尚缺少对低聚木糖化学合成的探索。 在合成化学中，一些加速反应进行的化学方法已被人们广泛研究，例如应用超声波、 微波辐射加快反应的进行等。而微波辐射更是以其特有的优点受到了人们的广泛关注。 江南大学硕士学位论文 微波是指波长范围在l m - - l m m 之间的电磁波。而有机微波化学，是指利用微波幅射 来加速有机反应、改变反应机理或启通新的反应通道的一门交叉学科。一般来说，在微 波催化反应中，影响反应速率的因素有微波的加热速率、溶剂的性质、反应体系组成以 及微波的输出功率等等。此外，在微波催化反应中，反应物吸收微波能量的多少和快慢 与分子的极性有关。还有反应容器的大小、反应物的体积等都对反应速率有影响。不同 的反应需通过实践才能得到最佳条件。 总之，微波作用于反应物后，加剧了分子的运动，提高了分子的平均能量，降低了 反应的活化能，大大增加了反应物分子的碰撞频率，使反应迅速完成。这是微波提高化 学反应速度的主要原因。微波以“内加热 的方式对物质进行加热。当介质处于电场 中时，随意取向的介质中偶极子会按电场方向同一取向，当电场方向每秒钟改变数亿次 时，处于电场中的偶极子的取向排列也随之急剧变化，造成分子间相互碰撞，从而产生 热量，在较短的时间内达到较高温度【3 引。 到目前为止，用微波辐射实现糖与糖之间缩合反应制备寡糖的反应目前国内还没有 报道。与之相关的反应总结起来有如下几种： 1 ) 半乳糖1 ，4 内酯的合成反应 陆模文等研究发现 3 9 1 ，在半乳糖l ，4 内酯的合成反应过程中，一般的方法只能得 到2 2 3 8 的产率，而选用微波辐射来进行反应，则可得到6 0 6 6 的产率，反 一 r 。詈分? 徽波 1 v h o 应时间仅需1 0 分钟。 2 ) 利用微波辐射制取烷基多苷 烷基多苷是糖类化合物与高级醇的反应产物，它一般由葡萄糖与高级醇通过缩合反 应制得。郭明林t , o l f l 了i e 辛醇和结晶葡萄糖直接制备烷基多苷。方法为在三颈瓶中加入正 辛酵，以对甲苯磺酸为催化剂，微波加热至9 5 ，在2 7k p 压力下，除去水，再加入 部分葡萄糖，除水。分批加入葡萄糖，减压除水，最后得几乎透明的浅黄色溶液烷基多 苷。反应4h ，产率为6 5 。 3 ) 微波辐射利用淀粉水解制葡萄糖 奚祖威等( 2 0 0 0 ) 4 1 】研究发现，在微波辐射条件下用盐酸水解淀粉时，刚开始随着 酸用量的增大，葡萄糖收率大幅度增加，但当葡萄糖收率达到9 2 0 7 后，继续加热收 率反而下降。他们研究认为，这种现象是由于随着时间的增加，水解生成的葡萄糖在微 波辐射下发生复合反应和分解反应，复合反应使葡萄糖分子间经1 , 6 一糖苷键结合成异 麦芽糖、龙胆二糖、潘糖和其他低聚糖。 4 ) 微波辐射相转移催化合成茉莉醛 苏桂发等【4 2 j 研究了利用微波辐射结合相转移催化技术在无溶剂条件下利用苯甲醛 与庚醛发生羟醛缩合反应制备茉莉醛的反应。他们以氢氧化钾为碱，以氧化铝为载体， 三乙基苄基氯化胺( t e b a c ) 为相转移催化剂，微波辐射功率5 6 0w ，辐射时间6 0s ， 第一苹绪论 合成产物茉莉醛的产率达9 0 4 0 。在同样的条件下，他们分别利用苯甲醛与辛醛、苯 乙酮发生羟醛缩合反应合成了a 已基肉桂醛和查尔酮，产率分别为8 2 8 0 和7 8 8 0 。 微波辐射一般能显著加快极性分子间的化学反应，糖分子是极性分子，从理论上说 其在微波场中能迅速吸收电磁波的能量，通过分子偶极作用以每秒数十亿次的高速旋转 产生热效应，微波辐射还会加剧糖分子的运动，提高分子的平均能量，从而降低反应的 活化能，大大增加反应物分子的碰撞频率，使反应迅速完成。寡糖的合成反应可以看作 羟基与羟基之间的脱水缩合反应，因此虽然利用微波辐射合成寡糖目前在国内外还鲜见 报道，但从理论上说是完全可行的。 应用微波辐射制备寡糖，其产物是混合物。但产物中极有可能含有目前所知的功能 性寡糖或目前未知的新型功能性糖类。本实验以木糖为原料，微波固相合成系列低聚木 糖的混合物。木糖主要是通过无机酸水解农业废料来制取。在一定压力、温度下，将无 机稀酸加入到富含半纤维素的原料中，半纤维素中主要成分为多缩戊糖，多缩戊糖加酸 可以水解为木糖母液。从理论角度讲，只要含有半纤维素的植物均可作为木糖的生产原 料，我国生产木糖原料较广泛采用玉米芯、蔗渣、稻壳等，这些原料半纤维素含量高、 来源广、产量大、易集中、木糖收率高【4 3 】。而我国具有丰富的玉米芯、蔗渣、稻壳等制 备木糖的原料，因此，从经济可行的角度出发，以木糖为原料，微波固相合成系列低聚 木糖的混合物具备一定可行性。 1 3 立题的意义 低聚木糖作为一种附加值高、市场前景看好的功能性食品添加剂，是目前国内外竞 相研究开发的功能性低聚糖之一。它除了具有功能性低聚糖的一般特性外，与其他功能 性低聚糖相比，还具有有效用量小、耐热、耐酸等特点 4 4 - 4 5 , 9 ) 。此外，它可高选择性地 促使双歧杆菌增殖，提高人体免疫力和抗癌能力，抑n j i 源性病菌对人体的侵入，防治 肠道疾病，降低人体胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸，促进钙吸收，由于其代谢不受胰 岛素的控制，可作为糖尿病和肥胖病患者的矫味剂【2 1 1 。 目前，低聚木糖的生产主要是采用酶法制备，但是酶法合成普遍存在酶易失活，产 物分离纯化困难，合成产物产率不高，生产过程较为复杂且生产中不可避免会产生环境 污染等问题。而微波催化可以促进羟基之间的缩合反应，也就可以促进糖与糖之间的缩 合反应。程景雄( 2 0 0 5 ) 川、王芳分别以葡萄糖和甘露糖为原料，应用微波催化固相合 成低聚葡萄糖和低聚甘露糖，其生产工艺简洁易操作，产率高且加热时间短，反应快， 能耗低。由于我国用于制备木糖的原料丰富，且制备工艺相对简单，本实验以木糖为原 料，微波固相合成低聚木糖。目前关于低聚木糖的抗氧化及降血脂作用研究甚少，因此 本文在合成了低聚木糖的基础上，研究了低聚木糖对高脂血症小鼠氧化应激的遏制作用 与降血脂作用，并试图探讨抗氧化与降血脂两者之间的关系。为低聚木糖的合成开创一 种新思路，并为今后低聚木糖的抗氧化及降血脂作用研究提供一定参考借鉴。 1 4 研究的内容 本实验以木糖为反应物，微波固相合成低聚木糖，并研究其抗氧化活性和降血脂作 江南大学硕士学位论文 用以及两者之间的关系： ( 1 )以木糖为原料，微波催化合成低聚木糖工艺研究及优化； ( 2 ) 低聚木糖组分初步分析及体外清除自由基活性研究； ( 3 ) 低聚木糖对高脂日粮小鼠抗氧化能力的影响、降血脂的作用及抗氧化与降血 脂的关系。 第二章微波固相合成低聚木糖的工艺优化 第二章微波固相合成低聚木糖的工艺优化 2 1 引言 低聚木糖在日本被认为是最有前途的功能性低聚糖之一【4 7 】，已实现工业化生产并广 泛应用，目前其年产量已超过1 5 0 0t 。我国低聚木糖的生产目前还处于研制阶段，尚未 有工业化产品面市。1 9 9 7 年蔡静平等【4 8 】报道了真菌分解玉米芯生产低聚木糖的研究。 1 9 9 9 2 0 0 0 年吴克 4 9 1 洪枫【5 0 1 ，袁其朋【5 1 1 ，杨瑞金【4 】等陆续报道了他们制备低聚木糖的 研究结果。酶法制备是目前生产低聚木糖的主要方法，利用内切木聚糖酶水解木聚糖底 物得到的以木二糖、木三糖为主要成分的混合物，但是酶法合成时间长，纯度低而且存 在废液污染，合成成本高和产物分离纯化困难等问题。 微波是指波长范围在l m - - - l m m 之间的电磁波。1 9 8 6 年，加拿大的g c d y c 等人 发现，微波加热能促进有机化学反应的进行，而微波提高化学反应速度的主要原因是： 微波作用于反应物后，加剧了分子的运动，提高了分子的平均能量，降低了反应的活化 能，大大增加了反应物分子的碰撞频率，使反应迅速完成。糖分子是极性分子，在微波 场中能迅速吸收电磁波的能量。据此启迪了我们实验室开始低聚糖的微波合成研究。 我国用于制备木糖的原料丰富，且制备工艺相对简单，因此本文以木糖为原料，微 波辅助合成低聚木糖，对合成的工艺条件进行了研究，确定了最佳条件，为低聚木糖的 制备拓展了思路。 2 2 实验材料 。 2 2 1 主要试剂 木糖( c 5 h l 0 0 5 ) ( b r 级) 酸催化剂a 亚硫酸钠 酒石酸钾钠 3 ，s _ 二硝基水杨酸( 化学纯) 苯酚 其他试剂均为国产分析纯 2 2 2 实验仪器 p a n a s o n i c n n $ 5 6 3 j f 型变频微波炉 超级恒温水浴锅 电磁炉 7 2 2 分光光度计 7 国药集团化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 中国国药集团化学试剂有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 松下公司 上海市化学仪器总厂 美的集团有限公司 上海第三分析仪器厂 扛雨大学硕士学位论文 2 3 实验方法 2 3 1 低聚木糖的合成 采用微波辅助，杂多酸a 催化，水引发合成方法，具体合成路线为t 反应物一催化剂、引发剂混匀叫微波辐射反应( 间隔搅拌) 叫 粉碎叫产物 2 3 2 寡糖得率测定 寡糖得率= ( 反应初始木糖量一剩余木糖量) 反应初始木糖量x10 0 2 3 3 木糖含量的测定 2 3 3 1 木糖标准曲线的绘制降2 5 3 l 称取干燥至恒量的木糖1 0 0m g ，溶解后定容至1 0 0m l ，吸取该液0 ，0 2 ，0 4 ，0 6 ， 0 8 ，1 0m l 于6 支试管中，加蒸馏水稀释至lm l ，得系列木糖标准液，浓度分别为0 ，2 0 0 ， 4 0 0 ，6 0 0 ，8 0 0 ，1 0 0 0t t g m l 。在lm l 木糖标准液中分别加人d n s 显色剂3m l ，沸水 中煮沸显色1 5r a i n ，冷却，加蒸馏水2 1m l ，摇匀，得反应液。用7 2 2 型可见分光光度 计在特定波长下比色( 以lm l 蒸馏水代替糖液作空白对照) ，测各反应液o d 值，每 一浓度重复三次，取其平均值。以o d 值对木糖含量( m g m l ) 作图，得标准曲线： y = 0 2 7 1 7 x 一0 0 0 3 9 ，r 2 = 0 9 9 9 3 。 0 3 o 2 5 眈 i 0 1 5 o 1 o 晒 0 0 5 木糖浓度，磬1 i f l l i l 2 1 木糖标准曲线 f i g 2 1t h e s t a n d a r dc u r v eo f x y l o s e 2 3 3 2 样品含量测定 吸取样品溶液1m l 按上述步骤测得反应液o d 值，以标准曲线计算木糖含量。 2 3 4 寡糖合成条件的单因素实验 在其他条件相同的前提下，分别研究不同功率( 3 3 0w 、5 1 0w 、7 0 0w 、8 2 0w 、1 0 0 0 w ) 、时间( 1 5m i n 、2m i n 、2 5m i n 、3m i n 、3 5r a i n ) 、催化剂添加量( 3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、1 0 ) 、引发剂添加量( 5 、8 、1 1 、1 4 、1 7 、 2 0 、2 3 、2 6 、2 9 ) 等单因素对寡糖合成率的影响。 r 第二章微波固相合成低聚木糖的工艺优化 2 3 5 寡糖合成的正交实验 在上述单因素实验的基础上，以微波加热时间、微波功率、催化剂用量、引发剂添 加量四因素为主要因素，依次用a 、b 、c 、d 表示，分别取四个水平，做l 1 6 ( 4 4 ) 即四因素四水平正交实验，如表2 1 。以寡糖的合成率为筛选指标，确定微波辅助合成 低聚木糖的最佳工艺参数。 表2 1 正交实验因素与水平表 t a b 2 1m i b o ff a c t o rl e v e l s 注：微波最大功率：1 0 0 0w ，催化剂、引发剂添加量以1g 为1 0 0 。 2 4 结果与讨论 2 4 1 缩合反应条件的影响 2 4 1 1 微波功率对缩合反应的影响 实验研究了微波功率为3 3 0 、5 1 0 、7 0 0 、8 2 0 、1 0 0 0w ，引发剂2 3 ，催化剂9 微波处理时间3 嗽件下对木糖缩合反应的影像，结果见图2 2 。 零 诗 l 3 0 05 0 07 0 09 0 01 1 0 0 功率w 图2 - 2 微波功率对缩合反应产率的影响 f i 9 2 2e f f e c to f m i c r o w a v ep o w e ro i lt h ey i e l do f p r o d u c t 微波具有一定的穿透能力，可以对物体进行“整体加热 。当微波进入物料时，物 料会吸收微波能量并将其转化为热能，同时随着微波进入物料内部，微波的场强和功率 就不断地衰减，因此，通常提高微波的功率可以加强微波的穿透能力，加速反应的进行。 如图2 2 所示，在一定的辐射时间下，随着微波功率的提高，寡糖的得率随之增加，当 9 卯如加 江南大学硕士学位论文 微波功率大于7 0 0w 时，寡糖得率大于7 0 。从经济快速的角度出发，本实验采用微 波炉的最大功率1 0 0 0w 作为实验功率。 2 4 1 2 微波加热时间对缩合反应的影响 实验采用微波处理1 5m i l l 、2r a i n 、2 5r a i n 、3r a i n 、3 5m i l l ，考察微波反应时间对 缩合反应的影响。其他条件为微波功率1 0 0 0w ，引发剂2 3 ，催化剂9 。 摹 静 攫 1 1 5 2” 33 j4 时间n i a 图2 - 3 微波处理时间对缩合反应产率的影响 f i g 2 - 3e f f e c to f m i c r o w a v ei r r a d i a t i o nt i m eo i lt h ey i e l do f p r o d u c t 图2 3 结果表明，微波辐射时间在1 5 2r a i n 内，产物得率随时间延长增加幅度很 大；当微波辐射时间为2r a i n 时，产物得率已超过7 0 ；2r a i n 以后，产物得率的升高 趋势大幅减慢，3r a i n 以后，随时间延长，产物得率的增加很不明显，趋于停滞；3 5r a i n 时，产物得率接近8 0 。根据实验结果，可选时间2m i l l 、2 5r a i n 、3r a i n 和3 5r a i n 进 一步做正交实验。 2 4 1 3 催化剂的添加量对缩合反应的影响 以酸催化剂a 不同添加剂量对缩合反应中产物寡糖得率作图，其他条件为微波功率 1 0 0 0 w ，时间3r a i n ，引发剂2 3 ，结果见图2 - 4 。 结果表明，随着催化剂用量的提高，寡糖得率逐渐升高。当催化剂用量为9 时， 寡糖得率为最大。杂多酸a 在寡糖微波缩合反应中起到催化剂作用，添加一定量的酸， 能大大加快反应，缩短缩合反应所需时间，但是，当酸的量添加过多时，糖的缩合反应 容易产生焦糊，影响产品色泽、气味及外观。本实验在寡糖微波缩合反应中，采用间隔 搅拌，起到反应均匀、加速反应以及防止产物焦糊的作用。一般认为，在高浓度的糖液 中，酸易取代极性溶剂中的水或扩大聚阴离子之间的距离而进入液相，在某种意义上， 吸收了大量极性分子的酸a 类似于一种浓溶液，其状态介于固体和液体之间，称之为“准 液相，在反应体系中，由于木糖分子链较短，与酸a 分子能充分混合接触，从而使大 多数杂多酸形成“准液相”，只有少量的杂多酸形成高度分散的固体颗粒，这种多相催 化体系使得催化剂与木糖接触面积大大增加，从而促进了糖的聚合反应【蚓。 1 0 竹协：8贷如够鲐 第二章微波固相合成低聚木糖的工艺优化 鋈 诗 l 2468l o1 2 催化剂 图2 4 催化剂的添加量对缩合反应产率的影响 f i g 2 - 4e f f e c to f c a t a l y s to i lt h ey i e l do f p r o d u o t 2 414 引发剂的量对缩合反应的影响 本实验分别采用5 、8 、l l 、1 4 、1 7 、2 0 、2 3 、2 6 、2 9 的水作 为引发剂，考察引发剂用量对缩合反应的影响。结果表明( 见图2 5 ) ，产物得率随引发 剂的量的增加而提高，在引发剂加入量为2 6 时，寡糖得率达到最大值，糖的聚合反 应是受酸的催化，并主要是在反应混合物的极性相( 水相) 中进行【5 5 1 。当引发剂加入量 较少时，由于微波辐射可促进水的快速挥发，加入的引发剂不能起到有效吸收微波能量 的作用。引发剂的量过少，酸与糖不能均匀混合，酸浓度分布不均匀，浓度大的局部在 微波处理时易发生焦糊，酸就不能起到较好的催化作用。当引发剂加入量达n z 6 时， 催化剂杂多酸a 与木糖已经能够很均匀的接触，达到一种饱和的状态，所以寡糖产率 最高，由此当引发剂的量继续增加时，产率不再升高。 9 0 跖 鋈踯 铬 l7 5 7 0 6 5 05 1 01 52 02 53 0 3 5 引发剂惕 图2 - 5引发剂水的添加量对缩合反应产率的影响 ( 催化剂9 ，反应时间：3 r a i n ，微波功率：1 0 0 0 w ) f i g 2 - 5e f f e c to fi n i t i a t o ro nt h ey i e l do f p r o d u c t 2 4