（农业昆虫与害虫防治专业论文）转Bt基因水稻稻谷对储藏特性及仓储节肢动物群落的影响.pdf

华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 如需保密，解密时间年月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究x - 作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同2 r _ 作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 僦摊：砂举时间莎一川月伊 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版 和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存，汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传 播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 蝴黼张午导杨考 撕兮吖户期：岬年$ 月矽日 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 摘要 本文以转b t 基因【c ，) 工4 彻c 秒z 4 】水稻稻谷汕优6 3 为材料，非转基因亲本水 稻稻谷汕优6 3 为对照品种，首先研究了转b t 基因水稻稻谷在储藏过程中对储藏特 性的影响，并且测定分析了转b t 稻谷b t 毒蛋白含量的变化情况，然后系统研究了 转b t 基因水稻稻谷在储藏过程中对麦蛾种群生长发育的影响以及对整个仓储节肢 动物群落的影响。 储藏特性试验研究表明：b t 稻谷的水份和粘度变化与同年收获的非b t 稻谷相比 没有明显差异，而发芽势、发芽率降低速率，脂肪酸值增加速率均明显低于同年收 获的非稻谷。可见，本研究中的b t 水稻稻谷比其亲本非转基因稻谷更耐储藏。 毒蛋白测定显示：转b t 稻谷米粒和谷壳中的毒蛋白含量差异极显著，且米粒中 的毒蛋白含量高于谷壳中的毒蛋白含量；经过不同的储藏期后，转b t 稻谷中的毒蛋 白含量几乎没有变化，毒蛋白降解不明显。 转b t 基因水稻稻谷对麦蛾种群生长发育的影响试验表明：转b t 稻谷对麦蛾未 表现出抗性，对其存活几乎不存在负面影响，但与对照稻谷相比转b i 稻谷中麦蛾发 育历期显著延长。 转b t 基因水稻稻谷对仓储节肢动物群落的影响研究表明：转b t 稻谷对仓储节 肢动物群落种类无影响；转b t 稻谷对仓储节肢动物群落的几个主要参数动态影响很 小，在外界条件非常适合仓储节肢动物发生的情况下，转b t 稻谷中的节肢动物群落 反而有趋向简单，呈现出少数几个物种优势度极高的格局；从优势种动态来看，在 大部分调查时间里，转b t 稻谷与对照稻谷中的优势种均为谷蠹和嗜卷书虱，其中谷 蠢为调查前期的优势种，而嗜卷书虱为调查中后期的优势种：被害率结果表明，在 调查期内转b t 稻谷与对照稻谷被害率均呈上升趋势，转b t 稻谷受仓储害虫的为害 明显低于对照稻谷。 总之，本研究所有结果均表明，与对照非转基因亲本稻谷相比，转b t 稻谷对仓 储节肢动物群落没有明显不利影响。 关键词：转b t 稻谷；仓储节肢动物群落；麦蛾；储藏特性；b t 毒蛋白测定 转m 基因水稻稻谷对储藏特性及仓储节肢动物群落的影响 a b s t r a c t t oe v a l u a t et h eb i o s a f e t yo ft r a n s g e n i cb a c i l l u s 砌i 廊l g f 研s 西( b t ) r i c ef f o n o w c da s b tr i c e ) d a r i n gt h es t o r a g e ，as e r i a lo fs t u d i e so nb tr i c ee x p r e s s i n gc r y l a b l c r y l 4 cg o n e a n di t sp a r e n tr i c e ( c o n t r 0 1 ) w e r ec o n d u c t e di nt h ew a r e h o u s eo fu r b a ne n t o m o l o g y i n s t i t u t eo fh u a z h o n ga g r i c u l t u r a lu n i v e r s i t y f i r s t ，t h ec h a n g e si ng e r m i n a t i o nt r e n d ，g e r m i n a t i o np e r c e n t a g e ，f l e ef a t t ya c i d ( f f a ) a n dv i s c o s i t yo ft h eb tr i c ew a so b s e r v e da ti n t e r v a l sd u r i n g2 4m o n t h ss t o r a g ep e r i o da t a m b i e n tt e m p e r a t u r ea n dr e l a t i v eh u m i d i t y r e s u l ts h o w e dt h a t 丛s t o r a g ep e r i o dw a s p r o l o n g e d , t h e r ew a s n os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nt h ep h y s i c o c h e m i c a lp r o p e r t i e so f b tr i c ea n dt h ec o n t r o l , f f ai n c r e a s e d , w h i l eg e r m i n a t i o np e r c e n t a g e ，a n dv i s c o s i t yo fr i c e d e c r e a s e d h o w e v e r , r a t e so fc h a n g e so ff f aa n dg e r m i n a t i o nr a t ei nb tr i c ew c r el o w e r t h a ni nc o n t r o lr i c e o u ro b s e r v a t i o n sw e r et h e r e f o r es u g g e s t i v et h a tt r a n s g e n i cb tr i c e u s e di nt h i ss t u d yh a dl o n gt e r ms t o r a b i l i t y s e c o n d , t h ec h a n g eo fc o n t e n to fb tt o x i ni nb tr i c ew e r et e s t e db ye l i s am e t h o da t t h ed i f f e r e n ts t o r a g et i m e t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta ss t o r a g ep e r i o dw a sp r o l o n g e d ，t h e c o n t e n to fb tt o x i nw a sa l w a y ss i g n i f i c a n th i g h e ri nt h ek e r n e lt h a ni nt h eh u s k , h o w e v e r i tw e r en o td e c r e a s e db o t hi nt h ek e r n e la n di nt h eh u s k4 y e a r sa f t e rs t o r e d t h i r d , t h ei m p a c to fb tr i c eo nt h ed e v e l o p m e n to fs i t o t r o g ac e r e a l e l l a ，a n g o u m o i s g r a i nm o t h , w a si n v e s t i g a t e db yl i f er u b l em e t h o d t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h e r ew a s r i o n e g a t i v ee f f e c t so nt h ed e v e l o p m e n to ft h i ss t o r a g ep e s te x c e p tt h ed e v e l o p m e n tt i m eo f l a r v aa n dp u p ad e l a y e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t ht h o s er e a r e do nt h ec o n w o lr i c e f o u r t h ，t h ei m p a c to fb tr i c eo nt h ea r t h r o p o dc o m m u n i t yi nt h es t o r a g ew e r es t u d i e d b ys a m p l i n gi nt h eb tr i c ea n dt h ec o n t r o lp e r1 5d a y sd u r i n gt h e1 2m o n t h ss t o r a g e p e r i o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb tr i c eh a dn on e g a t i v ee f f e c to nt h ed i v e r s i t y , r i c h n e s so f s p e c i e s ，e v e n n e s sa n dc o n c e n t r a t i o no ft h ea r t h r o p o dc o m m u n i t y t h ed o m i n a t es p e c i e s 0 1 1b tr i c ea n dt h ec o n t r o lw a ss i m i l a r ：r h i z o p e r t h ad o m i n i c ai nt h ee a r l ys a m p l i n g ， l i p a s c e l i sb o s t r y c h o p h i l u si nt h em i d d l ea n dl a t e rs a m p l i n g t h ed a m a g ec a u s e db y s t o r a g ei n s e c tw a ss i g n i f i c a n tl o w e ro nt h eb tr i c et h a no nt h ec o n t r o l , h o w e v e 毛i t i n c r e a s e db o t h0 1 1t w or i c ev a r i e t i e sa st h es t o r a g et i m ew a sp r o l o n g e d i ns h o r t ，a l lt h er e s u l t so ft h i ss t u d ys h o wt h a tb tr i c ew a ss a f ef o rt h ea r t h r o p o d c o m m u n i t yd u r i n gt h es t o r a g e k e yw o r d s ：b tr i c e ；a r t h r o p o dc o m m u n i t y ；s i t o t r o g ac e r e a l e l l a ；p h y s i c o c h e m i c a l p a r a m e t e r s ；b tt o x i nt e s t 2 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 刖吾 自2 0 世纪8 0 年代中期以来，利用转基因技术将苏云金杆菌( b a c i l l u s t h u r i n g i e n s i s ，b t ) 杀虫蛋白基因导入农作物，使其获得抗虫性的研究已取得巨大进 展。水稻c o r y z as a t i v al ) 本身没有足够抗虫的基因，r 基因是水稻基因工程中可 资利用的主要抗虫非水稻基因库源材科之一。将b t 杀虫蛋白基因转入水稻中，可提 高水稻对某一昆虫的抗性。全球有许多实验室在进行转b t 基因水稻的研究工作，有 大量文献报道获得m 转基因抗虫水稻植株，2 0 多个研究组已生产出b t 水稻。转基 因作物正在或已成为害虫防治史上划时代的重大飞跃。培育转基因水稻抗虫新品系， 可望成为水稻虫害管理的新方法与途径( 刘雨芳，2 0 0 4 ) 。然而，转b t 基因作物的 安全性自其诞生之日起就引起广大研究学者的重视，转b t 基因水稻的生态安全性评 价是转基因作物安全性研究的重要组成部分。 1 苏云金杆菌毒蛋白及其杀虫机理 苏云金杆菌( b a c i l l u st h u r i n g i e n s i s ) 毒蛋白基因，即b t 毒蛋白基因，被广泛应用于 植物抗虫基因工程中，其原因在于它能合成一种对大多数鳞翅目害虫具有毒杀作用 的蛋白( 王忠华等，1 9 9 9 ) 。苏云金杆菌是一种革兰氏阳性、杆状、能形成内生芽 孢的土壤细菌。苏云金杆菌在芽孢形成过程中产生许多蛋白质，并以结晶方式出现， 因此被称为伴孢晶体，它们具有特异性的杀虫活性，通常被称为杀虫结晶蛋白 ( i n s e c 玎c i d a lc r y s t a l p r o t e i n ，即i c f ) 或d 一内毒素( d - e n d o t o x i n ) 或苏云金杆菌毒蛋白 ( 所t o x i c p r o t e i n ) 。b t 毒蛋白在伴孢晶体内是以原毒素( p r o t o x i n ) 的形式存在，当被昆 虫摄食之后，在昆虫幼虫的肠道内经蛋白酶水解，转变为较小的毒性多肽分子，它 可以与敏感昆虫中肠道上皮细胞表面的特异受体相互作用，诱导细胞膜产生一些非 特异性小孔，扰乱细胞的渗透平衡，并引起细胞肿胀甚至裂解，从而导致昆虫幼虫 停止进食而最终死亡( 林良斌等，1 9 9 7 ；李文兰，2 0 0 4 ) 。2 0 世纪8 0 年代中期以 来，b t 毒蛋白基因被广泛引用于农作物的抗虫研究中。 2 转b t 基因水稻及其抗虫性的研究进展 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约有一半左右人口以稻米为食，仅我 国就有8 亿人( 杨友才等，2 0 0 3 ) 。水稻生产在我国的农业生产中占有举足轻重的 3 转h 基因水稻稻谷对储藏特性及仓储节胜动物群落的影响 地位，然而，水稻也是受虫害侵袭最为严重的粮食作物。从2 0 世纪年代后期开 始，转b t 基因水稻的研究便拉开了序幕。 1 9 8 9 年中国农科院生物技术中心杨虹等首次报道了用原生质体电融合技术将 b t 基因导入水稻“台粳2 0 9 ”( 杨虹，1 9 8 9 ) 。1 9 9 1 年谢道听又用花粉管通道技术将 b t 基因导入水稻栽培品种“中花1 1 号”( 谢道听，1 9 9 1 ) 。杨虹、谢道昕所用b t 基 因是直接从苏云金杆菌中分离纯化得至的，经分子生物学检验，证明b t 基因已整合 到水稻基因组中。但是，这些开创性的研究未见后续报道。 日本植物研究科学家f u j i m o t 0 1 9 9 3 年用原生质体电激法获得了转b t 基因粳稻植 株，并检测出b t 蛋白量占可溶性总蛋白的0 0 5 ，对水稻二化螟和稻纵卷叶螟二龄 幼虫的最高致死率分别达4 5 和5 5 ，并首次报道了经修饰的c r y l ( a ) b 基因能在转 基因植株中高效表达，并能稳定地遗传到r 2 代，也首次提出了昆虫对b t 基因产生 抗性的预防策略( f u j i m o m ，1 9 9 3 ) 。 瑞士苏黎士植物科学研究所w u n n l 9 9 6 年报道了用基因枪法将c r y l ( a ) b 基因导 入籼稻“巧8 ”，在r 0 、r l 、r 2 代对鳞翅目水稻害虫有明显杀虫效果，对二化螟、 三化螟的最高致死率为1 0 0 ，并从叶片中检测出矾蛋白量占可溶性蛋白的0 0 0 9 ， 还指出b t 蛋白表达量随着水稻的生长发育而呈逐渐增加的趋势( w u n n ，1 9 9 6 ) 。 印度持续农业与农村发展研究中心n a y a k l 9 9 7 年报道了用基因枪法将c r y l 翻) c 基因导入籼稻“i r 6 4 ”，同时选择了玉米u b i 基因( 玉米泛素转移蛋白基因) 作为 c r y l ( a ) c 的启动子。研究指出c r y l ( a ) c 基因在“i r 6 4 ”中表达更有效，检测出毒蛋 白量约为可溶性蛋白的0 舵0 ，0 2 5 ，对三化螟的最高致死率为9 2 4 ，并对 c r y l “j c 基因的遗传行为作了研究，f 1 侧交抗感比例为1 ：1 ，f l 自交f 2 抗感比例为 3 ：1 ，故c r y l ( a ) c 基因表现为单基因显性遗传( n a y a k ，1 9 9 7 ) 。 国际水稻所( i r r d g h a r e y a z i l 9 9 7 年报道了用基因枪法得到转c r y l ( a ) b 基因的香 粳品系“8 2 7 ”，能表达分子量为6 7 k d a 的毒素蛋白，表达量相当于可溶性蛋白的 0 1 ，t 2 代植株叶片对1 龄二化螟、三化螟有高度抗性，同时，i r r i 的这项研究用 玉米c 4 p e p 羧化酶基因为启动子，并指出该启动子使c r y l “归基因在水稻籽粒灌浆 期功能叶片中高效表达。而在水稻籽粒中即胚和胚乳中不表达，这项研究结果对解 决人类食用抗虫水稻稻谷的安全性问题提供了思路( g h a r e y a z i ，1 9 9 7 ) 。 1 9 9 8 年加拿大渥太华大学生化系农业生物技术实验室c h e n g 等报道，用“农杆 菌介导法”将以玉米u b i 基因为启动子的c r y l 似曲、c r y l ：a ) c 基因导入水稻，获得 4 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 了b t 蛋白高效表达的转基因植株。在凡代检测出高达1 3 的可溶性蛋白含量， 较以往的报道高出1 0 1 0 0 倍，r 1 代植株高抗二化螟、三化螟，致死率为9 7 1 0 0 。 浙江农业大学1 9 9 8 年也用农杆菌介导法成功地将加拿大渥太华大学惠赠的b t 基因导入水稻栽培品种“秀水1 1 ”，并获得稳定的b t 转基因品系“t s 5 ”、“t s 9 ”，并 检测出b t 毒蛋白的含量占可溶性蛋白的0 5 3 ，对二化螟、稻纵卷叶螟的1 巧 龄幼虫有1 0 0 的毒杀作用。遗传研究认为转基因表现为单位点显性遗传，并首次报 道了转基因己稳定地遗传到第5 代。渥太华大学和浙江农业大学所得转基因品系b t 毒蛋白的高效表达，可能与所用转基因技术、启动子b t 基因中g + c 碱基含量等因 素有关。 此外，1 9 9 7 年国际水稻研究所植物遗传育种和生物化学系报道了用基因枪法把 以水稻a c t i ni 基因作为启动子的b t 基因导入粳稻品种“台粳3 0 9 ”，对三化螟高抗， 最高致死率为1 0 0 。同年国内中山大学生物工程中心许新萍也报道了将以a c t i ni 为启动子的c r y l 口归基因导入“台粳3 0 9 ”。这两篇报道都没有检测转基因植株的 b t 毒蛋白表达量，对所用的启动子的应用前景未作评价( 杨杰等，1 9 9 9 ) 以上用于水稻的抗虫基因最多的是c r y l a 基因。此外，m a q b o o l 等用基因枪首 次将c r y 2 a 基因导入籼稻品种b a s m a t i 3 7 0 和m 7 中，分子检测表明c r y 2 a 基因己 整合到r 0 及r - 代转基因水稻植株基因组中，并且杀虫晶体蛋白的表达量高达5 ， 对三化螟和稻纵卷叶螟的抗性也有所增强，同时后期的研究发现该基因能够稳定遗 传到r 3 代( 李桂英等，2 0 0 3 ) 。 王世贵等测定了转e r y l a b 基因水稻“克螟稻1 号”对二化螟幼虫的致死和亚致 死作用。结果表明，1 龄、3 龄、5 龄幼虫持续取食“克螟稻1 号”时，死亡率极高 5 龄虽存活了较长时间，但不能正常化蛹。而当取食“克螟稻1 号”一段时间后，改以亲 本对照“秀水1 1 ”为食时，除在初期死亡较多外，死亡率不随时间而显著上升，能存活 至下一龄期，部分还可化蛹，且幼虫总的历期与对照组差异不显著。幼虫取食一定时间 的“克螟稻1 号”后改食对照时，除1 龄外，3 龄和5 龄幼虫经处理后所得的蛹均能羽 化，其中3 龄幼虫经处理后所得的成虫体重和体长与对照组差异不显著，而5 龄幼虫经 处理后所得的成虫体重和体长均显著低予对照组，但羽化率和产卵量并不显著低于 对照组( 王世贵等，2 0 0 3 ) 。 5 转瑚基因水稻稻谷对储藏特性及仓储节肢动物群落的影响 3 转b t 基因水稻安全性研究进展 转基因作物安全性的争论主要在两个方面：一是通过食物链对人类产生影响， 二是通过生态链对环境产生影响。食物安全性因素：转基因产物的直接影响：包括 营养成分、毒性或增加食物过敏性物质的可能；转基因问接影晌：经遗传i 程修饰 的基因片段导入后，引发基因突变或改变代谢途径，致使其最终产物可能含有新的 成分或改变现有的成分的含量所造成的间接影响；植物里导入了具有抗除草剂或毒 杀害虫功能的基因后，它是否也象其它有害物质一样能通过食物链进入人体内；转 基因食品经由胃肠道的吸收而将基因转移至胃肠道微生物中，从而对人体健康造成 影响。环境安全性因素：转基因生物对农业和生态环境的影响；产生超级杂草的可 能；种植抗虫转基因作物后可能使害虫产生免疫并遗传，从而产生更加难以消除的 “超级害虫”；转基因向非目标生物漂移的可能性；其它生物吃了转基因食物是否 会产生畸变或灭绝；转基因生物是否会破坏生物的多样性等( 刘洋，2 0 0 5 ) 。 转b t 基因水稻安全性评价同样包括食品安全性和生态安全性两个方面。 3 1 转b t 基因水稻食品安全性 由于b t 杀虫蛋白只能特异地与靶标昆虫中肠上皮细胞的受体结合，而在哺乳动 物组织中无此类特异性受体。因此，有些专家认为其转基因产品是安全的，不需要 做动物急性毒理试验( f r o n s o n a l ，1 9 9 8 ) 。但除插入基因及其表达产物外，由外源 基因表达产物引起的次级效应及基因随机插h b i 起的位置效应，有可能会产生有害 的成分( c o n n e r aj ，1 9 9 9 ) ；同时，稻米作为人们日常生活中的主食，其消费数量 也相当可观，因此，对其转基因产品进行动物毒理试验是必要的。另外，由于人们 在构建载体时除目的基因外，还串联一些报告基因和选择性标记基因，这些基因表 达产物的安全性目前尚无定论( 贾士荣，1 9 9 7 ) 。因此更有必要对其转基因产品进行 动物毒理性分析。目前研究表明，以克螟稻米粉为材料进行经口急性毒理试验和大 鼠9 0 d 喂养试验，试验结果未见试验动物出现明显中毒症状，大鼠解剖也未见异常 病理改变，表明k m d 2 稻米在6 4 9 k g 体重的剂量内对哺乳动物是安全的，对蒸煮 后的米饭进行e l i s a 检测，结果未检测到b t 杀虫蛋白( 数据未显示) ，表明蒸煮后 稻米中的b t 杀虫蛋白可能发生降解或变性( 王忠华等，2 0 0 2 ) 。家蚕进食抗虫转基 因纯合品系熟米粉后，其体重、全茧量和茧层量、熟蚕数、结茧数、熟蚕整齐度和 6 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 食桑量等生理指标与对照相比，均未发生明显变化：病理切片电镜分析也未发现其 中肠亚显微结构有明显变化。其分析认为这是c r y l a b 蛋白在蒸煮过程中发生变性的 结果。这进一步验证了b t 转基因抗虫水稻稻米经蒸煮后的确检测不到c r y l a b 蛋白。 但是家蚕进食抗虫转基因纯合品系生米粉后，由于生米粉中具有较高含量的b t 杀虫 蛋白，影响了家蚕主要消化器官一中肠的亚显微结构，进而降低家蚕的消化和吸收 功能，最终导致家蚕生长发育的延缓和推迟( 王忠华等，2 0 0 2 a ) 。经大鼠急性中毒 试验确定，转b t 基因抗虫水稻稻米属无毒级。大鼠9 0 d 喂养结果显示，各试验组大鼠 体重、进食量和食物利用率与对照组均无显著差异。对大鼠肝、肾、胃、肠及睾丸 进行组织切片检查，均未见病理性改变。大鼠脏体比、血象及血生化指标均在正常范 围内，试验组与对照组无明显差异( 王忠华等，2 0 0 2 b ) 。王忠华还利用微核、精子 畸变和a m c s 试验检测了转戡基因水稻稻米对小鼠骨髓嗜多染红细胞 ( p o l y c h r o m a t i c e r y t h r o c y t e s ，p c e ) 微核率( m i c r o n u c l e u s f r e q u e n c y ，m n ) 和小鼠 精子畸形发生率( s p e r mm a l f o r m a t i o nr a t e ) 及组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株 回变菌落数的影响。结果表明，在本实验条件下，b t 水稻稻米对小鼠体细胞和性细 胞均无诱变活性，且无剂量效应；该受试物对t a 9 7 a 、t a 9 8 、t a l 0 0 和t a l 0 2 菌 株无论在有无代谢活化系统存在的条件下，各剂量组回变菌落数均处于正常水平。 证明本试验的b t 水稻稻米无致突变作用( 王忠华等，2 0 0 4 ) 。 3 2 转b t 基因水稻生态安全性 人类所有的活动，包括政治、经济和军事在内的活动都必须依托于所栖息的生 态环境，生态系统为人类提供了必不可少的生命维护系统，提供了从事各种活动所 必需的最基本的物质资源。生态安全是指一定区域内人类赖以生存和持续发展的以 环境资源为物质基础、以环保产业为救济手段的生态系统的综合平衡。生态安全是 国家安全四要素之一，也是其它安全要素得以保障的载体和基础。 转b t 基因水稻是通过现代生物技术产生的转基因生物，是改变了水稻的某些生 物学特性、代谢产物甚至某些生命活动的过程而产生的、在自然界暂时尚不存在的 水稻新品种，可能给人类和环境带来一定的危险和长期的负面影响。因此，在环境 释放前，必须对其进行严格的生态安全性评价( 林良斌等，1 9 9 7 ；杨杰，1 9 9 9 ；朴 红梅，2 0 0 5 ) 。 7 转m 基因水稻稻谷对储藏特性及仓储节肢动物群落的影响 目前，转b t 基因水稻生态安全性评价主要集中在以下几个方面：转b t 基因水 稻对稻田生物群落的影响；转矾水稻茎根的田间残留对土壤动物群落的影响：转 m 水稻花粉飘移对昆虫的影响；转b t 水稻稻谷对储粮害虫群落的影响等。 3 2 1 转b i 基因水稻对稻田生物群落的影响 陈丽娟等2 0 0 1 年、2 0 0 2 年研究表明转基因水稻田和常规稻田生境中蜘蛛的数 量及种类无显著差异，而且对稻田水生生物诸如鱼虾、水生昆虫等的数量及种类也 无明显影响( 陈晓娟等，2 0 0 2 ) 。崔旭红等在进行转b t 基因水稻抗虫性田间测定工 作的同时，观察了转基因水稻对非靶标昆虫稻飞虱和水稻害虫的主要天敌蜘蛛种群 数量的影响，其结果表明，转b t 基因水稻对蜘蛛天敌功能团没有不良影响( 崔旭红 等，2 0 0 2 ) 。刘志诚等就转b t 基因籼稻田对稻田节肢动物群落的影响作7 较系统的 评价。大多数情况下转m 基因水稻田与对照田之间功能团优势度、功能团内科组成 及其优势度、群落主要参数( 物种丰富度、s h a n n o n w i e n e r 多样性指数、均匀性指 数、优势集中性指数) 及其时间动态基本无明显差异；转b t 基因水稻田与对照田间 植食类、寄生类、捕食类亚群落和整个节肢动物群落的相异性大多较低。可见，转 基因水稻对稻田节肢动物群落基本无明显的负面影响( 刘志诚等，2 0 0 3 ) 。陈茂 等通过连续3 年的调查证实，b t 稻区向对照稻区扩散的飞虱、叶蝉两类害虫的数量 明显大予对照稻区向b t 稻区扩散的数量，说明飞虱、叶蝉对转b t 基因水稻没有偏 好性，它们的卵寄生蜂也存在这一现象。可见转b t 基因水稻并不会引起田间非靶标 类群同翅目害虫数量的上升，相反，对这类害虫还有一定的驱避作用( 陈茂等，2 0 0 3 ) 。 陈茂等还同时比较测定了褐飞虱在转b t 基因籼稻及其亲本对照上的取食与产卵行 为。在自由选择寄主植株条件下，褐飞虱于转b t 基因籼稻上的着虫比率、产卵选择 性和产卵量与其对照相比均无显著差异。在非自由选择寄主条件下，褐飞虱于转b t 基因釉稻上的取食总痕数显著多于其对照，而取食7 4 h 后排泄的蜜露则恰反之。综 合可见，转b t 基因水稻对褐飞虱取食是不利的，而对产卵则无显著的影响( 陈茂等， 2 0 0 4 ) 。贾乾涛研究了转b t 基因水稻生育期几种重要成分含量的变化、转b t 基因水 稻对二化螟凸如s u p p r e s s a l i sw a l k e r 生物学习性的影响以及不同种植方式下稻田生 物群落的种群动态变化等。结果表明，b t 基因的插入使水稻的生理生化过程发生了 变化，从而造成生化物质含量的差异；转b t 基因水稻对二化螟的影响主要是其对二 化螟的抗生性，即b t 毒蛋白对二化螟的毒杀作用，而对其它生物学习性无显著影响；在1 5 8 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 种植方式和1 1 0 种植方式下，转基因水稻对靶标昆虫和其他主要害虫及天敌无显著 影响( 贾乾涛，2 0 0 5 a ) 。蔡万伦的研究结果表明，整体上，块块种植和列列混栽方式对 b t 稻田节肢动物群落多样性、均匀度和优势集中性无显著影响：但混栽方式下的b t 稻田节肢动物群落个体密度和物种丰富度显著偏低，在水稻发育中期，混栽方式下 b t 稻田节肢动物群落季节动态与块块种植方式下的明显不同，其多样性，均匀度，优 势集中性指数均类似于同种植方式下非m 稻上各参数的季节动态。混栽方式下的庇 护所效应更明显( 蔡万伦，2 0 0 5 a ) 。焦晓国以转c r y l a b c r y l a c 基因水稻汕优6 3 ( 以 下简称汕优6 3 b t ) 为材料，亲本汕优6 3 ( 以下简称汕优6 3 ，c k ) 为对照，在田间自然感 虫条件下研究汕优6 3 b t 对稻田几种非靶标害虫种群消长动态的影响。结果表明，汕 优6 3 b t 上稻苞虫p e l o p i d a s m a t h i a s ( f a b r i c i u s ) 和稻眉眼蝶m y c a l e s i s g o t a m a m o o r e 幼 虫数量都显著低于对照品种，但汕优6 3 b t 对稻苞虫的毒性强于稻眉服蝶。汕优6 3 b t 上稻飞虱( 白背飞虱s o g a t e l l a f u r c i f e r a ( h o r v a t h ) 和褐飞虱n i l a p a r v a t al u g e n s ( s t a l ) ) 混 合种群数量通常与对照品种基本一致，在少数调查时间显著高于对照品种。相反， 除少数调查时间与对照品种没有显著差异外，稻叶蝉( 黑尾叶蝉n e p h o t e t t i x c i n c t i c e p s ( u h l e r ) 和二点黑尾叶蝉_ l v v i r i s c e n s ( d i s t a n t ) ) 混合种群数量通常显著高于对 照品种，稻飞虱和叶蝉成为汕优6 3 b t 上的主要害虫( 焦晓国等，2 0 0 6 ) 。周霞等比 较研究了转c r y l a b 水稻克螟稻( k m d l 和k m d 2 ) 与其亲本秀水1 1 对非靶标害虫 白背飞虱种群增长的影响。结果表明，以克螟稻为食可对白背飞虱的产卵期和每雌 产卵量产生一定影响。以k m d 2 为食的白背飞虱的产卵期为7 6 天，每雌产卵量为 9 5 0 粒，均显著低于以母本秀水1 1 为食的白背飞虱的1 2 7 天和1 6 7 5 粒。但是，以 k m d l 为食的白背飞虱仅产卵期( 8 6 天) 显著变短，其每雌产卵量与以其母本秀水1 1 为食的白背飞虱无显著差异。稻苗氨基酸含量分析结果表明，k m d 2 引起白背飞虱 种群生殖力显著下降可能与其游离氨基酸的总量和丙氮酸含量的显著下降以及谷氨 酸含量的显著上升有关。因此，转c r y l 4 b 水稻可对白背飞虱种群增长产生影响，但 其影响因转c r y l a b 水稻品种而异( 周霞等，2 0 0 6 ) 。 3 2 2 转b t 水稻茎根的田闻残留对土壤动物群落的影响 由于水稻成熟后只有一部分被收获，而大部分则会重新返回土壤( 如秸秆还田) ， 作物残体存留于土壤。延长了土壤微生物与植物组织内存在的转基因产物( 包括基 础代谢产物和次生代谢产物) 的接触时间，而且作物残体在土壤中的降解产物也可 9 转m 基因水稻稻谷对储藏特性及仓储节肢动物群落的影响 能对微生物群落产生一系列影响( 王洪兴等，2 0 0 4 ) 。有研究表明，由苏云金芽孢杆 菌产生的b t 蛋白进入土壤后，与土壤粘粒和腐殖酸迅速结合；结合态的b t 蛋白仍 保持杀虫活性，而且不易被土壤微生物分解，保持杀虫活性的结合态b t 蛋白在土壤 中存留时间至少可达2 3 4 d ( 孙彩霞等，2 0 0 3 ) 。王洪兴等研究表明，转b t 基因处理 细菌数量显著低于非转基因处理，其秸秆降解对细菌群落具有负面影响。但是转b t 基因处理对真菌的影响不同于细菌，转基因水稻秸秆降解反而更有利于真菌的繁殖 增长，转基因数量远远高于非转基因和对照，达到了极显著水平。放线菌、反硝化 细菌在降解过程中的数量变化没有明显规律，转基因和非转基因放线菌之间的差异 在有些阶段没有达到显著水平：转基因处理对反硝化细菌活性有定负面影响，但 其数量波动性较大，需要进一步研究探讨。解磷微生物的数量、种类、活性等与植 物的生长发育同样具有重要意义，试验结果显示水稻秸秆降解对解磷微生物这一功 能类群的增殖没有促进作用，对于解磷细菌的解磷活性，转基因和非转基因之间没 有差别，转基因处理对解磷细菌的活性没有明显影响g e 洪兴等，2 0 0 4 ) 。 孙彩霞等研究了盆栽种植转m 基因水稻对土壤酶活性的影响，结果表明转b t 基因水稻在生长发育过程中可以向土壤中释放杀虫晶体蛋白，而且杀虫晶体蛋白的 释放量与水稻生长发育时间有关；与非b t 基因水稻相比，转b t 基因水稻生长1 5d 时，土壤脲酶活性显著下降，土壤酸性磷酸酶活性显著升高，而土壤芳基硫酸酯酶、 蔗糖酶和脱氢酶活性的变化差异不显著( 孙彩霞等，2 0 0 3 ) 。 白耀宇等以转b tc r y l a b 基因水稻克螟稻1 号( k m d l ) 和克螟稻2 号( k m d 2 ) 黄熟期的茎叶为材料，室内测定了其经浸水处理后( 2 8 0 ，l 1 6 ：d 8 ) 残体和水体中 c r y a b 杀虫蛋白的含量；测定了k m d l 与早籼稻嘉早9 3 5 培育成的r 稻华池b 6 分 蘖期稻田水体中c r y l a b 蛋白的含量，同时调查了该b t 稻和对照稻嘉早9 3 5 在分蘖 初期、盛期和末期稻田3 类水生昆虫的数量。结果表明，k m d l 和k m d 2 茎叶经浸 水1 0 0 d 后，水体中残留有c r y l a b 杀虫蛋白。华池b 6 分蘖期稻田水体中没有检测到 c r y l a b 蛋白：除分蘖末期华池b 6 稻田中的蜉蝣目昆虫个体数量显著高于对照田嘉早 9 3 5 外，其他2 类水生昆虫摇蚊( s p p ) 和鞘翅目甲虫( s p ) 在两类稻田间均无显著差异 ( 白耀宇等，2 0 0 6 ) 。 3 2 3 转b t 水稻花粉飘移对昆虫的影响 樊龙江等在水稻花期对我国的主要养蚕地区一杭嘉湖地区进行了多点实地调查 1 0 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 和取样，获取了实地田间状态下桑叶上飘落水稻花粉的浓度，结果证明水稻花粉可 飘落到桑叶上，试验同时证实转b t 基因水稻和非转基因水稻植株的花粉飘飞能力没 有差异，因此转b t 基因水稻在我国南方养蚕地区推广将可能对家蚕的生长发育造成 负面影响( 樊龙江等，2 0 0 3 ) 。王忠华等研究了转b t 基因水稻“克螟稻”花粉对家蚕 生长发育的影响，结果表明与正常无花粉处理相比，无论是非转基因水稻花粉处理， 还是转b t 基因水稻花粉处理，对初孵家蚕幼虫的致死率无多大影响，而对家蚕的体 重有较大影响，其中三龄期家蚕体重存在极显著差异。研究还发现水稻花粉处理组 家蚕在3 龄时期大小很不一致，这是由于采用人工抖粉桑叶上花粉浓度不均匀造成 的；鉴于实际生态条件下桑叶上的花粉浓度可能远远低于试验条件。因此，在实际 稻桑共作环境下，转b t 基因水稻“克螟稻”花粉对家蚕生长发育可能不会造成太大 的影响( 王忠华等，2 0 0 1 ) 。崔旭红研究了转b t 基因水稻花粉对菜青虫和柑橘凤蝶 幼虫的影响，结果表明转b t 基因水稻花粉对菜青虫和柑橘风蝶幼虫的致死率有较大 的影响。转b t 基因水稻花粉处理的菜青虫和柑橘凤蝶幼虫食欲减退，行动迟缓，对 接触刺激反应迟钝( 崔旭红等，2 0 0 3 ) 。白耀宇等用e u s a 法测定了转b t 基因水稻 克螟稻1 号( k m d l ) 和克螟稻2 号( k m d 2 ) 花粉中c r y a b 含量。将转b t 基因水稻和 其亲本对照秀水1 1 ( x s l l ) 花粉加入到草蛉人工干粉饲料中，评价了对中华草蛉成 虫产卵和寿命等参数的影响。其研究结果表明，b t 水稻花粉中c r y a b 杀虫蛋白对该草 蛉成虫产卵和寿命等参数无显著的负面影响( 白耀宇等，2 0 0 5 ) 。 3 2 4 转b t 水稻稻谷对储粮害虫群落的影响 在水稻生产中，储藏稻谷是生产中一个重要环节，储粮害虫群落中主体是鞘翅 目昆虫，但也有危害很大的鳞翅目昆虫如麦l 霾s i t o t r o g a c e r e a l e l l a ( 钟良才等，1 9 9 4 ： 黄雄伟等，2 0 0 4 ) 。蔡万伦通过对在自然条件下不同储藏期b t 稻谷与非b t 稻谷抽样调 查。结果表明，随着稻谷储藏期的延长，在储藏1 7 1 , - 月后b t 稻谷上的虫蚀率依次为 o 7 0 ，1 2 0 ，显著低于另外两种非b t 稻谷上的虫蚀率( 汕优6 3 ：1 7 ，2 o ：9 3 1 1 稻：2 7 0 ，3 0 0 ，p o 0 5 ) 。但b t 稻谷和非b t 稻谷中的赤拟谷盗、谷蠹、书虱、麦蛾 数量，在1 9 个月储藏期内，大部分调查结果差异不显著( 蔡万伦等，2 0 0 6 ) 。转b t 稻谷对储藏特性的影响如何? b t 毒蛋白在稻谷中随着储藏时间推移是否会发生降 解? 对储粮害虫群落的影响如何? 以上这些方面均尚少有报道。 1 1 转m 基因水稻稻谷对储藏特性及仓储节肢动物群落的影响 4 结语 综上所述，转b t 基因稻谷是在现代分子生物学基础上研究出来的一种抗虫新品 系，在害虫治理上已展现出了良好的应用前景，其发展也可以说是日新月异，然而， 其商品化必须建立在一系列的食品安全性与生态风险性评价的基础上，否则就有可 能影响它的持续利用，甚至产生一些不良后果。对于转默水稻的食品安全性学术界 争议很少，对于其生态安全性评价的研究目前主要集中在对稻田昆虫群落的影响和 对昆虫的抗性方面以及其茎叶根在田闻残留对土壤动物群落的影响方面。本研究来 源于国家重点基础研究发展规划9 7 3 项目农业重要转基因生物安全性研究项目 0 4 课题，主要研究了转b t 水稻稻谷收获后，在其储藏环节中对仓储节肢动物群落 及储藏品质的影响。这方面的研究目前在国内外尚无报道。 华中农业大学2 0 0 7 届硕士学位论文 第一章转b t 水稻稻谷对储藏特性的影响 1 材料和方法 1 1 试验材料 供试水稻稻谷系转m 基因水稻汕优6 3 ( s y 6 3 偈t ，以下简称b t 水稻) ，该品种 通过基因枪法导入受体基因组培育获得，含来自b t 的c r y l a b c r y l 4 c 基因，对照为 未转基因的亲本汕优6 3 ( s y 6 3 c k ，以下简称非戡水稻) 。以上品种均由华中农业 大学作物遗传改良国家重点实验室提供。 上述2 个品种分别于2 0 0 4 年，2 0 0 5 年5 月1 4 日播种，并于各年1 0 月1 4 一1 5 日收获，其稻谷经1 天曝晒，除杂后备用。 1 2 试验方法 采用对比储粮方法，用大瓷缸分装收获后的稻谷，每缸1 5 k g ，分别设置矾水 稻稻谷和非b t 稻谷处理，每处理设置3 次重复，自然条件下储存在华中农业大学城 市昆虫研究所粮食储存室中。 稻谷发芽率( g e r m i n a t i o np e r c e n t a g e ，g p ) 、发芽势( g e r m i n a t i o nt r e n d ，g t ) 按照 g b5 5 2 0 _ _ 8 5 测定。 稻谷水分( w a t e rc o n t e n t ，w c ) 按照g b5 4 9 7