（无机化学专业论文）fclprolleuglyome二茂铁肽的合成、结构分析及其电化学性质.pdf

i 、t i 1 。 原创性声明 i i l ll l ii ll1 11 1 111 1iiii y 1719 9 91 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名：! 盈：日期：型! 旦年上月笪日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 中南大学硕士学位论文摘要 摘要 二茂铁( f e r r o c e n e ，f c ) 是一类富电子化合物，具有良好的电化学活 性，且二茂铁基团具有亲脂性、氧化还原活性、稳定性及低毒性。因 此二茂铁的衍生物具有优良的电化学和生物活性，在生物、医学、微 生物学等方面已得到广泛应用。 p l g 是一种小分子三肽，即l 脯氨酸一l 一亮氨酸一l 一甘氨酸 ( l p r o l y l l l e u c y l g l y o m e ) ，它又称为促黑激素的抑制激素 ( m e l a n o c y t es t i m u l a t i n gh o r m o n e i n h i b i t i n gh o r m o n e ，m i f 1 ) ，可抑制黑 色素细胞刺激释放因子( m e l a n o c y t es t i m u l a t i n gh o r m o n e ，m s h ) 的释 放。大量临床实验证实，p l g 可用于治疗帕金森氏症。 以二茂铁甲酸、p r o 、l e u 、和g l y 为起始原料，采用液相合成法， 以h b t u 和h o b t 为缩合剂，将具有电化学活性的二茂铁和具有治疗 帕金森氏症的p l g 多肽耦联，合成了两种新的二茂铁一肽分子 f c p r o l e u g l y - o m e 和f c p r o l e u g l y n h 2 ，得到的产物产率分别为： 3 l ，2 5 。 采用x r a y 衍射法在1 0 0 。c 解析其晶体结构，得到的f c p l g o m e 晶体属于单斜晶系，空间点群为c 2 ，晶包参数为：a = 2 0 8 0 3 ( 3 ) a ， b = 6 4 4 2 8 ( 4 ) a ，c = 2 0 5 5 7 ( 2 ) a ，a = 9 0 。，1 3 = 11 5 4 9 8 ( 5 ) ，t - - 9 0 。，z = 4 ， r = 0 0 4 5 1 ；两个二茂铁环形成的二面角为1 7 8 4 1 h ) o ，被取代的二茂铁 环与脯氨酸环形成的二面角为1 4 0 0 ，在甘氨酸的n 1 3 和脯氨酸的0 11 之间形成强烈的氢键( d ( n o ) = 2 8 3 5 a ) 使得整个分子形成一个1 3 一t u m 的 结构。 采用循环伏安法对f c p l g 在甲醇溶液中的电化学性质进行了检 测，氧化峰和还原峰分别为0 4 7 5v 和0 3 9 2v ，峰电流密度之比为 i p a i p c - 1 0 1 2 ，峰电位之差a e p = 8 3m v 。并证明了f c p l g 在甲醇溶液 中的电化学行为是一种单电子转移的准可逆过程。 关键词f c p l g ，合成，晶体结构分析，电化学性质 中南大学硕十学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t f e r r o c e n ea n di t sd e r i v a t i v e sd u et ot h e i rb i o l o g i c a la c t i v i t y , h i g h l i p o p h h i l i c i t y , r e d o xa c t i v i t y , s t a b i l i t y , l o wc y t o t o x i c i t ya n dd i s t i n c t i v e e l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o rh a v e b e e nw i d e l yu s e di nb i o l o g y , m e d i c i n ea n d m i c r o b i o l o g y p l g ( l p r o l y l l l e u c y l - g l y o m e ) i s a ne n d o g e n o u st r i p e p t i d e f o u n di nt h ec e n t r a l n e r v o u s s y s t e m i ti sa l s ok n o w na s m e l a n o c y t e s t i m u l a t i n gr e l e a s ei n h i b i t i n gf a c t o r - 1 ( m i f - 1 、) i tc a nc o n t r o l t h er e l e a s eo fm e l a n o c y t e s t i m u l a t i n gh o r m o n e ( m s h ) an u m b e ro f c l i n i c a ls t u d i e sh a v es h o w e dt h a tp l gp o s s e s s e ds u b s t a n t i a lt h e r a p e u t i c a c t i v i t i e si np a r k i n s o n sd i s e a s e f i r s t l y , t h e f e r r o c e n e c o n j u g a t e sf c p r o l e u g l y - o m e a n d f c p r o l e u g l y - n h 2w e r es y n t h e s i z e df r o mf e r r o c e n e ，p r o l i n e ，l e u c i n e ， g l y s i n ea c i db yl i q u i dp h a s es y n t h e s i s ，u s i n g h b t ua n dh o b ta s c o u p l i n ga g e n t s t h es t r u c t u r eo ft h ec o m p o u n dw a sc h a r a c t e r i z e db y i r s p e c t r u m ，u v - v i ss p e c t r u m ，1 hn m ra n de s i m s t h e i ry i e l d sw e r e 31 a n d2 5 s e c o n d l y , t h ef c p l gc r y s t a ls t r u c t u r ew a sa n a l y t i c a la t 一10 0 b y d i f f r a c t i o n t h ec r y s t a lw a sm o n o c l i n i c s p a c eg r o u pc 2w i t ht h ee e l l p a r a m e t e ri sa = 2 0 8 0 3 ( 3 ) a ，b = 6 4 4 2 8 ( 4 ) a ，c = 2 0 5 5 7 ( 2 ) a ，a = 9 0 0 ， 1 3 = 115 4 9 8 ( 5 ) o ，丫_ 9 0 0 ，z = 4 ，r = 0 0 4 51 t h et w i s ta n g l eb e t w e e nc pr i n g s i s17 8 4 0 , t h ea m i d ep l a n ei sr o t a t e do u to ft h ec pr i n gp l a n eb y14 1o a s t r o n gh y d r o g e nb o n db e t w e e nt h eg l ya m i d en i t r o g e nn 13a n dp r o a m i d e o x y g e n i s t y p i c a l f o rt h es t r u c t u r em o t i fo fa- t u r n ( d ( n o ) = 2 8 3 5 a ) am e t h o do fc v ( c y c l i cv o l t a m m e t r y ) w a sc a r r i e do u tt oo b s e r v et h e e l e c t r o c h e m i c a lp r o p e r t i e so ff c p r o l e u g l y o m ea n di tw a sp r o v e dt h a t i tw a saq u a s i r e v e r s i b l ee l e c t r o c h e m i c a lp r o c e s si nm e t h a n o l ，t h eo x i d a t i o n p o t e n t i a l ( e a ) a n dr e d u c t i o np o t e n t i a l ( e c ) w e r eo b s e r v e da t 0 4 7 5va n d 0 3 7 2vt h eo x i d a t i o np e a ks h i f t e da b o u t8 3m vt oa n o d i ca n dt h er a t i oo f i p aa n di p cw a s1 0 1 2 k e yw o r d s f e r r o c e n e p e p t i d e ，s y n t h e s i s ，c r y s t a l s t r u c t u r ea n a l y s i s ， p r o p e r t yo f e l e c t r a lc h e m i s t r y l i 中南大学硕士学位论文 目录 目录 摘要i a b s t r a c t “i i 第一章文献综述l 1 1 二茂铁概述1 1 1 1 二茂铁的制备、结构及性质一l 1 1 2 含二茂铁基化合物的生物活性3 1 1 3 二茂铁衍生物的电化学性质及应用”5 1 2p l g 的研究现状5 1 2 1 多肽6 1 2 4p l g 的研究现状8 1 2 5l 一脯氨酸，l 亮氨酸和p l g 三肽的物理化学性质一9 1 2 6p l g 在生物医学上的应用9 1 3 晶体1 1 1 3 1 晶体的培养方法1 1 1 3 2 晶体的分类1 1 1 3 3 单晶的结构1 2 1 4 本课题研究内容及意义1 2 第二章f c p r o l e u g l y - o m e 的合成、酰胺化及表征1 4 2 1 引言”1 4 2 2 实验仪器及药品1 4 2 - 3 产物分离及表征1 4 2 3 1 薄层色谱法1 4 2 3 2 柱色谱法15 2 3 3 产物的表征方法1 6 2 4 合成部分实验路线设计1 7 2 4 1 实验反应路线17 2 4 2 化合物b o c - l e u g l y - o m e ( 2 ) 的合成1 8 2 4 3 化合物n h 2 l e u g l y - o m e ( 3 ) 的合成一1 8 2 4 4 化合物b o c p r o l e u g l y - o m e ( 4 ) 的合成1 9 2 4 5 化合物n h 2 - p r o l e u g l y - o m e ( 5 ) 的合成1 9 2 4 6 化合物f c - p r o - l e u g l y - o m e ( 6 ) 的合成2 0 2 4 7 化合物f c - p r o - l e u g l y - n h 2 ( 7 ) 的合成2 1 2 5 结果与讨论2 1 中南大学硕+ 学位论文 目录 2 5 1 多肽合成条件2 l 2 5 2 酰胺化的反应条件2 2 2 5 3 产品鉴定及提纯分析2 3 2 5 4 目标产物表征2 4 2 6 小结”2 7 第三章f c p r o l e u g l y - o m e 晶体结构解析及电化学性质2 8 3 1 实验部分2 8 3 1 1 晶体的培养2 8 3 1 2 晶体结构的解析2 8 3 2 结果与讨论”2 9 3 - 3 循环伏安实验3 6 3 4 小结”3 9 第四章总结4 0 参考文献4 l 致谢4 8 攻读学位期间主要的研究成果4 9 中南大学硕士学位论文第一章文献综述 1 1 二茂铁概述 第一章文献综述 金属有机化合物( o r g a n o m e t a l l i cc o m p o u n d ) - - 般是指金属和有机基团以金属 和碳直接成键而形成的化合物。1 9 5 1 年，k e a l y 和p a u s o n 1 】拟由环戊二烯基溴化 镁与三氯化铁反应合成富瓦烯( f u l v a l e n e ) 时，意外地发现了双环戊二烯基铁 ( c 5 h 5 f e c 5 h 5 ) 。原来f e 3 + 被格氏试剂还原为f e 2 + ，再与c 5 h 5 m g b r 反应，生成了 c 5 h 5 f e c 5 h 5 。几乎在同一时间，m i l l e r 等【2 】却用环戊二烯和铁在3 0 0 及常压下反 应制得了二茂铁。次年，w i l k i n s o n 和w o o d w a r d t 3 】通过红外光谱、磁化率以及偶 极距的测定，确定它是一个夹心结构( s a n d w i c hs t r u c t u r e ) 的金属络合物，具有芳香 性，从而命名为二茂铁( f e r r o c e n e ) 。二茂铁的发现与兀键型的夹心结构的阐明， 使有机金属化学的发展出现了一个飞跃，从此金属有机化合物逐渐成为一个独立 的分支学科。五十多年来，大量新型二茂铁衍生物在实验室中合成成功，同时对 二茂铁及其衍生物的应用研究不断深入，使二茂铁化学的发展呈现出一派前所未 有的欣欣向荣的景象，成为金属有机化学的热门领域之一。 二茂铁有单取代、单环二取代、双环二取代等多种取代产物，这些取代基可 以相同，也可以不同。目前合成的二茂铁衍生物达数十种。随着二茂铁衍生物的 合成及研究地不断深入，二茂铁及其衍生物在催化、医学、分析方面、添加剂、 敏化剂、电化学及光电功能材料以及医药添加剂、吸收剂等各个领域均得到广泛 应用。例如，在医药方面二茂铁衍生物具有疏水性( 亲油性) 、低毒性【4 】。能顺利通 过细胞膜，与细胞内各种酶、d n a 、r n a 等物质作用，因而有可能作为治疗某些 疾病的药物等。有关二茂铁衍生物的合成、性质及结构的研究目前十分活跃，二 茂铁衍生物层出不穷，不断扩宽了有机金属化学的研究范畴，开辟了有机金属化 学的一个新领域。 其中，二茂铁氨基酸是二茂铁衍生物研究中的重点，原因是二茂铁具有电化 学活性，同时，氨基酸、蛋白质是组成生物体的基本单元，是生命的物质基础， 是参与体内各种生物化学变化最重要的部分。 1 1 1 二茂铁的制备、结构及性质 自五十年代初k e a l y 和p a u s o n 意外地得到二茂铁以来，人们已从研究合成理 论和开发工业生产等目的出发，找到了许多合成二茂铁的方法。常用的实验室合 成方法有两种，一是环戊二烯基钠与氯化亚铁在四氢呋喃中反应，一是环戊二烯 在二乙胺存在下直接与亚铁盐反应【5 ，后者产率可达8 0 以上，是较好的实验室 中南大学硕士学位论文第一章文献综述 制法。而目前工业上生产的二茂铁主要采用电解合成法【7 1 ，这种方法具有连续操 作的优点。取代二茂铁的制备主要有两种途径：一是由取代环戊二烯基负离子与 二价铁离子反应，这是合成两个茂环上有相同取代基的二茂铁衍生物的一种重要 方法；一是由二茂铁通过取代反应制备。 二茂铁的分子结构已用x 射线衍射法【8 1 进行了详细地研究。二茂铁是夹心结 构化合物的代表，其结构式如图1 - 1 所示。 4 5 1 i2 f e 5 i 4 垒1 3 2 图1 1 二茂铁的结构 f i g 1 1s t r u c t u r eo f f e r r o c e n e 它是一种橙色棱柱状晶体，具有两个平行的环戊二烯负离子，中间镶嵌着一 个f e ( i i ) 离子，亚铁离子对称的夹在两个茂环平面之间，所以碳一碳( c c ) 键和碳 铁( c f e ) 键的键长都相等，分别为0 1 4 0 3n n l 和0 2 4 0 5n m 【9 1 ，两个茂环平行距离 为0 3 3 2n n l 。它的晶体结构随温度不同而异，室温为单斜晶系，9 8k 为正交晶系， 两个茂环旋转能很小，约4k j t o o l ，因此在溶液中，二茂铁两个茂环的旋转是自 由的。 二茂铁在1 0 0 以上易升华，m p l 7 3 ，b p 2 4 9 ，可溶于乙醇、乙醚和烃 类溶剂中，不溶于水。二茂铁的夹心结构，使其呈现出特殊的化学性剧1 0 】，它不 能进行环戊二烯那样的加成反应，不易发生还原反应；但茂环上t 1 5 一c 5 h 5 在c c 键 级上同苯环相似，易发生亲电取代反应，具有突出的芳香性，因此，茂环在性质 上与苯环有许多相似之处【1 1 1 ，且反应活性比苯高，例如：二茂铁与氯磺酸或三氧 化硫反应可以制备二茂铁磺酸，可以发生f r i e d e l c r a f t s 酰化亲电反应；二茂铁的 两个茂环上能引入含有各种基团的取代基，如醛、酮、酸和酰氯、胺、卤素、金 属等；在三氯化铝存在下直接通二氧化碳可生成二茂铁甲酸；可以与甲醛和有机 胺发生缩合反应生成胺基化合物；与锂化试剂反应可以得到双取代二茂铁甲醛， 此外，二茂铁在硫酸一甲醇存在下，与醛、酮发生反应，可以得到双二茂铁基烷烃； 二茂铁与芳基重氮盐反应生成芳基二茂铁等，上述官能团的化学性质活泼，是合 成二茂铁衍生物的重要原料和中间体，由于氧化作用，二茂铁环上的硝化和卤化 反应不能直接进行。由于其特殊的化学性质，其在工业、农业、医药、航天、节 能、环保等行业中具有广泛的应用，开发利用前景广阔。 2 中南人学硕十学位论文 第一章文献综述 1 1 2 含二茂铁基化合物的生物活性 二茂铁衍生物之所以能在医学、药学、生物学、微生物学等方面得到广泛应 用，是因为它们具有特殊的结构与性质。二茂铁衍生物具有亲脂性，氧化还原可 逆性、芳香性、易于发生取代反应；同时，二茂铁衍生物稳定性好、毒性较低， 具有多种生理( 物) 活性，如抗肿瘤、杀菌、杀虫、治贫血、抗炎、调节植物生长、 抗溃疡、酶抑制剂等。因此，二茂铁衍生物在生物学、医学、微生物学等领域有 广泛的应用前景。 ( 1 ) 抗贫血活性铁元素，作为人体所必须的微量元素，如果缺乏，则会造成 缺铁性贫血和其他疾病。但同时铁离子又属于重金属离子，普通的铁盐直接摄入 体内会具有相当强的毒性，因为大量的重金属离子进入人体将会杀死体内蛋白质。 二茂铁作为含铁化合物，相对于普通的铁盐具有无可比拟的优势：低毒性。2 0 世 纪7 0 年代，前苏联澳斯米扬诺夫基于二茂铁的低毒性这一点，设计并合成了一种 含二茂铁基优良的抗贫血剂一邻苯二茂铁甲酰基苯甲酰钠盐。其结构如图1 - 2 所示 d 2 1 。 n a 图1 2 邻苯二茂铁甲酰基苯甲酸钠的分子结构 f i g1 - 2o - f e r r o c e n ea c y lm o l e c u l a rs t r u c t u r eo fs o d i u mb e n z o a t e ( 2 ) 抗病毒和抗菌活性目前人们常用的抗菌药物有很多都是广谱抗生素类 药物，长时间使用会导致细菌对该药物产生耐药性，这就要求抗菌药物要不断的 更新换代。二茂铁，本身就具有一定的抗菌活性，而且其可塑性很好，用它来修 饰其它的化合物可得到意想不到的效果。因此用二茂铁修饰具有生物活性的分子， 以调控其生物活性在抗菌药物更新中使用得比较多，其中典型的就是e d w a r d s 等 人i l3 】将二茂铁引入青霉素和头孢菌素，使其杀菌性大大提高了。 ( 3 ) 抗肿瘤活性癌症对人类健康存在着巨大威胁由来已久，寻找高效的、抗 癌谱广、低毒性的抗癌剂是许多化学家和药物家共同关心的课题 1 4 1 。k o e p f l 等人 u 5 j 1 9 8 4 年发现二茂铁类化合物具有抑制癌细胞生长活性的性质。k o e p f 认为二茂 铁抗癌化合物主要有下述两个特点：首先它们一般是离子型有机化合物，类似于 盐类结构包含有二茂铁基阳离子和x 阴离子，其次它们并不像顺铂类化合物有两 3 中南大学硕士学位论文第一章文献综述 个顺式的卤原子在分子上，这个结论引起了大家的极大兴趣，将二茂铁基团引入 顺铂是一种潜在的抗癌药物【1 6 】。h o u l t o n 认为阴离子部分应该使化合物具有更好的 水溶性和更好的对细胞膜的穿透力，并且认为二茂铁化合物的抗癌活性和阳离子 的价态有关，应该有生物上的还原潜力而且需要正确的分子方向【l 。7 1 。 一些水溶性的二茂铁衍生物相继被合成，用于抑制肿瘤生长，如乳腺癌，直 肠癌等 1 8 , 1 9 。其中，比较典型的抗癌药物有j a o u e n 【2 l 】等研究的一种用做治疗乳腺 癌的药物三苯氧胺( t a m o x i f e n ) ，如图1 3 所示，在此药物上引入二茂铁基团，可以 提高药物的抗雌性激素能力以及对m c f 7 细胞活性的抵抗能力。 f n 、 图1 - 3 二茂铁基一三苯氧胺结构式 f i g 1 - 3s t r u c t u r eo ff e r r o c e n l y t a m o x i f e n 对于二茂铁化合物具有抗癌活性的原因k e l l e r 等人进行了研究，认为是二茂 铁基团对d n a 的识别和捆绑效应。d o m b r o w k s i 则认为有可能是因为茂环之间的 距离和碱基对之间的距离有着相互的影响【2 1 1 。p i c c i a l l i 等人认为二茂铁基团可以和 胸苷反应，并进而与低核苷酸发生相互作用【2 2 1 。由于二茂铁化合物上缺少明显的 能与生物分子配位的结构，人们对于其抗癌的机理还存在着不同的说法。 ( 4 ) 杀菌活性普通的含二茂铁的金属有机化合物作为杀虫剂很多，例如， 二茂铁模拟除虫菊系列化合物、n ，n 二甲酰联氨类系列化合物、二茂铁甲基叠 氮化物等。这些不同类的化合物对不同的蝇虫有着特殊的毒杀作用，二茂铁模拟 除虫菊对家蝇具有很高的活性，二茂铁甲基叠氮化物能杀死菜虫上的二斑点蝴蝶。 ( 5 ) 调节植物生长活性二茂铁衍生物具有植物生长调节活性主要是由于两 方面：一、二茂铁具有一定的催化活性，依靠调解离子和电子的传递来调节植物 对营养元素的吸收；二、二茂铁与其它化合物相结合，改变了其原有的溶解性以 及亲水性，使原本对植物生长调节没有活性或者活性不明显的化合物具有活性。 二茂铁衍生物既可以作为植物的促长剂，如二茂铁三氮唑的衍生物，也可抑制一 些对植物生长，如含二茂铁基的除草剂。 4 中南大学硕士学位论文第一章文献综述 1 1 3 二茂铁衍生物的电化学性质及应用 二茂铁衍生物种类繁多，具有特殊的化学结构，在化学性质方面十分独特， 在许多领域有着广泛的应用。本文主要介绍一下二茂铁及其衍生物的电化学性质 及应用。 二茂铁由于结构的特殊性，在电化学及光学应用方面也表现出其特殊的性质 1 2 3 1 。利用二茂铁基团可逆的氧化还原性，通过其可逆的电化学反应，使得控制 其衍生物的光化学特性成为可能，从而实现氧化还原的开关效应，这类氧化还原 开关材料在电致变色、光电记忆和光通讯领域具有良好的应用前剥州。 二茂铁酞基衍生物制成的聚合物膜修饰电极，对h + 浓度有很快的电位响应， 而且呈直线关系，可作为电位传感器【2 5 】得到应用；二茂铁甲酸被广泛用于修饰 多种氧化还原酶，特别是葡萄糖氧化酶( g o d ) t 2 6 1 ，用于制作安培葡萄糖生物传感 器，例如：二茂铁乙酸以共价键接在葡萄糖酶上，可得到介质改良酶，对葡萄糖 有很好的反应性，且酶电极的储存稳定性好，在此二茂铁衍生物作为电子转移中 间体，在酶和电极之间架起桥梁，使葡萄糖氧化酶( g o d ) 的活性得到提高。 二茂铁及其衍生物的电化学研究是一个很有意义而且有待深入探索和开发 的课题，已经越来越引起科学家们的兴趣。预计今后的研究将在以下几个方面深 入进行：( 1 ) 合成具有不同结构特点的二茂铁衍生物，深入研究其结构和电化学 性能间的关系；( 2 ) 合成对各类金属离子、n h 4 + 、有机阴离子具有识别能力的二 茂铁衍生物，并通过选择性作用后电位的变化，对各类离子进行分析；( 3 ) 自组 装具有氧化还原活性的二茂铁衍生物，开发其在分子器件方面的潜在应用；( 4 ) 以二茂铁衍生物作为供电子体，c 6 0 等作为电子受体，研究两者在共轭体系中的 电子传递；( 5 ) 通过二茂铁衍生物修饰电极研究层在电催化和电分析中的应用。 1 2p l g 的研究现状 随着人类基因组序列分析和蛋白功能组学工作的进一步展开，越来越多的人 发现在生命活动中( 如：分子识别、信号转导、细胞分化及个体发育等) 起着决定性 作用的并非是那些分子量大、结构复杂的蛋白质体，而是那些结构相对简单的小 分子多肽物质。如何利用分子生物学、基因工程、多肽合成技术去从不同来源( 动 物、植物、微生物、人类) 获取更多的具有生物活性的多肽，日益成为一个引起关 注的研究方向。 脯氨酸一亮氨酸一甘氨酸( p r o l e u g l y , p l g ) 是垂体催产素末端三肽，是一种神 经性三肽，它又称促黑激素的抑制激素( m i h ) ，可以抑制黑色素细胞刺激释放因子 ( m s h ) 的释放，经临床实验证明它可用于治疗帕金森氏症，并有抗忧郁等作用。 5 _ - 。 中南人学硕士学位论文 第一章文献综述 其结构如图1 4 。 1 2 1 多肽 o n h o o u nh 2 图1 4p l g 三肽的结构图 f i g1 - 4s t r u c t u r eo fp l gt r i p e p t i d e ( 1 ) 多肽的研究现状蛋白质是有机体内最重要的一类生物大分子。目前被广 泛地作为药物用于人类疾病的治疗。然而，由于蛋白质类药物具有分子量大、制 备困难、抗原性强、毒副作用多等缺点，其在临床上的使用又往往受到限制。随 着人类基因组序列分析和蛋白功能组学工作的进一步展丌，越来越多的人发现在 生命活动中( o n ：分子识别、信号转导、细胞分化及个体发育等) 起着决定性作用的 并非是那些分子量大、结构复杂的蛋白质体，而是那些结构相对简单的小分子多 肽。因此现今对蛋白质类药物的研究，多集中在如何将大分子蛋白质变成分子量 较小的多肽并从中寻找活性中心，以达到更好的药效。目前已有数十种多肽类药 物上市，如谷胱甘肽( 3 肽) 、促甲状腺释放激素( 3 肽) 、胸腺五肽( 5 肽) 、奥曲肽( 8 肽) 、催产素( 9 肽) 、环孢素a ( 11 肽) 、生长抑素( 1 4 肽) 等，另有4 0 余种多肽类药 物已进入临床研究阶段，主要集中在多肽疫苗、多肽抗生素、抗病毒多肽、心血 管活性肽、细胞因子模拟肽和抗肿瘤多肽【2 7 】。如何利用分子生物学、基因工程、 多肽合成技术并从不同来源( 动物、植物、微生物和人类) 获取更多的具有生物活 性的多肽，正日益成为一个引人关注的研究方向。 ( 2 ) 多肽合成基本原理将不同的氨基酸按一定的序列合成多肽，主要通过两 种氨基酸之间形成一个确定的肽键来实现，包括以下三个步骤：1 ) 需要制备部分 基团被保护的氨基酸，氨基酸的两性离子结构不再存在；2 ) 形成肽键的两步反应， n 一保护氨基酸的羧基必需先活化为活性中间体，随后形成肽键。这一偶合反应既 可作为一步反应进行，也可作为两个连续的反应进行；3 ) 对保护基进行选择性脱 除或完全脱除。多肽形成的简要化学反应如图1 5 所示。此过程中氨基酸的羧基 被一个较强的吸电子基团取代，使羧基活性增强，碳原子亲电性同时增强，另一 个氨基酸的氨基的亲核性进攻更加容易而发生偶联反应；肽键形成之后，将保护 基团y 1 ，y 2 去掉【2 8 】。 6 中南大学硕士学位论文第一章文献综述 食h 3 凡堂巡 r 2 活化 o n h k n 砷i x h 火uh y p h 簧z 糊耳 哕并警士卯 o ，h 一2 n 站爻爿2 。y ”y 、o 一 图1 5 多肽的多步反应示意图 f i g 1 - 5s c h e m a t i cr e a c t i o no ff o r m e dt h ep e p t i d e s y 1 = 氨基保护基y 2 = 羧基保护基r 1 ，r 2 = 氨基酸的侧链 多肽合成主要有两个方式：液相合成和固相合成。最早的多肽合成是将需要 合成的氨基酸或短肽配成溶液，其中的氨基端和另外的羧基端以及不发生反应的 侧链基团被有效的化学基团保护，而参加反应的氨基端和羧基端则分别活化，在 溶液中偶联在一起，发生化学反应。反应完毕后，需要各种方法将未参加反应的 原料试剂、活化试剂分离除去，以纯化合成产物【2 9 1 。由于其操作步骤烦琐，未反 应试剂及原料难以完全清除，因此最后产品的肽段很难纯化，并且反应后切割保 护基团的方法较为复杂，因此液相合成法目前较少被采用。 固相多肽合成法是目前多肽合成中最常用的方法，他是由m e r r i f i e l d 于1 9 6 3 年成功创立的，其原理是把多肽c 端第一个氨基酸通过其羧基偶联固定在不溶于 树脂上，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基， 并同过量的活化羧基组分反应接长肽链，重复( 缩合、洗涤、去保护、中和和洗涤。 及下一轮缩合) 操作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来， 经过纯化等处理，即得到所需多且太【2 7 1 。 ( 3 ) 多肽的应用多肽的医药方面同样具有很大作用。它作为药物具有分子量 小，无免疫原性，较为安全；分子较小，易于合成，成本低；结构相对简单。功 能较明确，特异性强，副作用低；多肽药物易于多途径吸收；合成的多肽纯度高， 7 8 v o r 又 t0，t_ln h 奠 j 护一保一 业 选一 ep， l 、 眦o o 洲 中南大学硕士学位论文第一章文献综述 不存在热源问题等优点。目前已有2 0 多种多肽药物上市( 如血脂康、地奥血脂康 等) ，按其作用功能可分为多肽疫苗、抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、导向多肽、细胞 因子模拟肽、抗菌活性肽、降压降脂多肽等【3 0 】。 随着对多肽研究的深入，人们越来越重视食品的第三功能，即调节人体生理 功能。譬如从不同蛋白质来源分离得到具有如类吗啡活性降压、提高机体免疫力、 抗氧化、低过敏及抗血栓等生理功能的小分子多肽物质，包括大豆蛋白及大豆多 肽类、乳蛋白活性多肽类、抗性蛋白多肽类、胶原多肽类、水产多肽类等【3 1 1 。运 用多肽研究涉及的常规技术，可以进一步对多肽类物质的动力学以及体内动态变 化过程进行研究，例如c h e n 等【3 2 】采用t r i t c 试剂对大鼠血浆中脑啡肽进行衍生 化，经h p l c 分离并用激光诱导荧光检测器进行检测，提高对其动力学的敏感度。 又如h i r a o k a 等【3 3 】运用m e c c 定量检测脑髓液中低分子量蛋白质，分析其与某些 疾病之间的平行关系。 1 2 4p l g 的研究现状 p l g 三肽一直被公认为可以抑制黑色素细胞刺激释放因子( m s h ) 的释放，即 促黑激素的抑制激素【3 4 1 。近年来，有许多研究证明p l g 不仅具有抑制m s h 释放 的功能，它还对中央神经系统( c n s ) 有直接的药理学和生物化学作用，p l g 的这 一药理作用说明它对治疗帕金森病有很大的作用【3 5 】。 p l g 的药理特征充分地说明此三肽具有潜在的治疗帕金森病的性能以及调节 多巴胺能系统的作用。例如，p l g 已经被证明：1 ) 可以增强多巴胺受体激动剂如 d o p a 、阿朴吗啡的治疗作用【3 6 3 7 3 8 1 ；2 ) 可以抵抗由氧化震颤素引起的震颤【3 8 4 0 1 ； 3 ) 可以衰减由吗啡和安定药诱导的僵；4 ) 可以抑制由吗啡或安定药引起的多巴胺 受体超敏症状【4 3 m 4 5 】；5 ) 保护由m p t p 引起的变性黑质多巴胺能通路【4 6 1 。 中央神经系统的多巴胺受体，根据它们与多巴胺结合的亲疏关系及腺苷酸环 化酶的关系可以分为d 1 、d 2 两种受体【3 5 4 7 】，而d 2 多巴胺受体易与腺苷酸环化酶 反向耦合，这一点涉及到神经的错乱，如精神分裂症、迟发型运动障碍及帕金森 症等。 事实上，p l g 治疗帕金森病的机理经初步探讨认为是，p l g 可以调节多巴胺 受体对多巴胺受体激动剂的灵敏度，即加强它们两者之间的结合【5 3 , 5 4 】，有c h i u 、 b h a r g a v a 等利用放射配体结合技术证明p l g 可以加强多巴胺受体激动剂如【3 h 】- 阿朴吗啡对纹状体多巴胺受体之间的结合【4 4 ，5 5 1 ，j o h n s o n 等利用另一种多巴胺受体 激动剂【3 h a d t n 也得到了类似的结果【5 6 1 。 8 中南人学硕士学位论文第一章文献综述 1 2 5l 脯氨酸，l 亮氨酸和p l g 三肽的物理化学性质 表1 1l - 脯氨酸，l 一亮氨酸和p l g 三肽的物理化学性质b 7 5 3 1 t a b l el - 1l - p r o l i n e l - l e u c i n ea n dp l g t r i - p e p t i d ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s 1 2 6p l g 在生物医学上的应用 自从1 9 7 1 年c o l i s 等【5 9 】首先发现存在脑内的肽酶分解催产素( 九肽) 而得到的 小分子三肽p l g ，并经实验研究和临床观察证明p l g 具有抗帕金森病的作用，p l g 三肽就引起各国学者广泛关注与研究兴趣。 ( 1 ) 帕金森病简介帕金森病( p a k i n s o n sd i s e a s e ，p d ) 又称震颤性麻痹 ( p a r a l y s i sa g i t a n s ) ，由p a r k i n s o n ( 1 8 1 7 年) 首先描述，是发生于中年以上的黑质与 黑质纹状体通路变性的疾病。临床表现在进行性运动迟缓、静止性震颤、肌强直、 姿势反射障碍等。主要的发病机制有基因突变、蛋白质水解应激、氧化应激、免 疫异常等。它的主要病理特征是产生多巴胺神经递质的神经元细胞的恶化与死亡， 大部分的神经损伤发生在黑质，黑质是中脑的一小块区域，那里包含可以产生多 巴胺的神经元细胞【6 0 ，6 l 】。本病的发现已经有1 9 0 余年的历史，但是由于其病因和 发病机制非常复杂，至今仍未十分明了。现有研究结果表明其发病机制可能与氧 化应激、线粒体功能缺陷、蛋白错误折叠和聚集、胶质细胞增生及炎症反应等有 关。目前p d 的治疗仍以对症为主，临床上最常用和最有效的药物为左旋多巴及 其复方制剂，但是随着此类药物的应用以及病情的进展，绝大多数患者于发病3 5 年内不可避免地出现运动并发症如疗效减退、“开关 现象和剂末效应等，严重 影响生活质量。近年来的研究表明，新型多巴胺受体激动剂的不断研制成功为p d 9 中南大学硕士学位论文 第一章文献综述 的治疗带来新的希望，在p d 的早期使用多巴胺受体激动剂不仅能改善临床症状， 而且有可能延缓患者对左旋多巴的需要、减少运动并发症的发生；在中、晚期p d 患者中与左旋多巴联合应用，可改善运动症状和日常生活质量，并能减少左旋多 巴的用量。近年来国外研究发现，麦角类多巴胺受体激动剂培高利特因存在胸膜、 肺纤维化和心脏瓣膜病变等相关副作用，现已禁止其临床应用，新型非麦角类多 巴胺受体激动剂普拉克索不仅无上述不良反应，疗效显著，而且可能有神经保护 作用。自该药2 0 0 7 年3 月在中国市场上市以来，我们在国内较早的开展该药用于 帕金森病治疗研究，取得较好的疗效。它的主要病理特征是产生多巴胺神经递质 的神经元细胞的恶化与死亡，大部分的神经损伤发生在黑质，黑质是中脑的- d , 块区域，那里包含可以产生多巴胺的神经元细胞 6 0 , 6 1 】。 ( 2 ) 多巴胺受体激动剂对p d 运动症状改善的临床研究在p d 的早期使用多 巴胺受体激动剂，不但改善临床症状，而且能延迟p d 病人对左旋多巴的需要， 减少运动并发症( 如异动症) 的发生，并对晚期的p d 病人有效。多巴胺受体激动剂 减轻运动并发症的机制：在正常的生理环境下，纹状体多巴胺水平和多巴胺受体 的激动是相对持续的。在p d 病人中，外源性的多巴胺补充是短暂的，例如服用 左旋多巴后血浆和纹状体多巴胺的水平呈波动性，间断性刺激多巴胺受体，这种 现象称为脉冲性或波动性或波动性多巴胺z f j , 匕i - - , 刺激。这种病理生理学变化引起了纹 状体神经元的分子水平改变、苍白球的生理学异常，与运动并发症的发生相关。 在p d 动物模型中进行了类似的研究，证实脉冲性多巴胺刺激增加了运动并发症。 研究者发现，在动物模型中，给予短效药物如左旋多巴或短效多巴胺受体激动剂 可以导致异动症，而给予长效药物特别是多巴胺激动剂能减轻运动并发症的严重 程度和发生频率。 ( 3 ) p l g 三肽与p d 病经研究发现，帕金森病患者体内的m s h 含量增加，m s h 的增加会加强帕金森病的病情 6 2 】。而p l g 可以抑制m s h 的释放。另外，p l g 可 以加强多巴胺受体与多巴胺受体激动剂之间的化学键，从而可以灵敏地调节多巴 胺的受体达到治疗帕金森病的作用，这一假设得到了体外放射配合结合研究的结 合的证实，研究中表明p l g 可以选择性加强多巴胺受体激动剂如a d t n 6 3 , 6 4 , 6 5 】， n p a 6 6 , 6 7 , 6 8 1 和多巴胺受体之间的结合，且p l g 不影响多巴胺受体激动剂与多巴胺 受体之间的结合方式，p l g 的这个功能表明它对治疗帕金森病和精神分裂症有潜 在疗效【6 9 7 0 】。 1 0 中南大学硕士学位论文第一章文献综述 1 3 晶体 1 3 1 晶体的培养方法 单晶培养的方法多种多样，最简单常用的有溶剂缓慢挥发法、液相扩散法、 气相扩散法、温差法、接触法、高压斧法【7 l 】。 (