（分析化学专业论文）bin1b防御素调控细胞的差异蛋白组学研究.pdf

摘要 摘要 差异蛋白质组学是目前蛋白质组学研究的一种重要研究策略。它着重于筛选 和鉴定不同种类或状态下各样本之问蛋白质组的区别与变化，具有很强的可实现 性。它可以确定与疾病相关的目标靶分子，为临床诊断、病理研究、药物筛选、 新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据和基础。 b i n l b 是抗菌肽的一种，抗菌肽是生物体内天然存在的一类具有杀灭细菌和 真菌等多种病原微牛物的小肽。有些抗菌肽还具有杀灭病毒和癌细胞的作用，此 外有些抗菌肽还具有促进精子运动，免疫调节等多种作用。此外，从基因水平上 得知b i n l b 还能促进未成熟精子的运动。为了深入研究b i n l b 调节细胞表达的机 制，本文用蛋白质组学方法从蛋白质水平找出由b i n l b 基因高表达引起蛋白质的 变化。本文首次采用差异蛋白质组学方法研究野牛型r m 1 细胞和b i n l b 稳定转 染细胞的蛋白质组的表达差异，得到了野牛型r m 1 细胞和b i n l b 稳定转染细胞 蛋白表达图谱，找出差异蛋白并分析差异蛋白所表达的功能，找出了由b i n l b 基 因高表达引起蛋白质水平的变化，为研究b i n l b 基因奠定了基础。 本文采用了双相凝胶电泳( t w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ，2 - d e ) 和基质 辅助激光解吸电离( m a t r i x a s s i s t e dl a s t e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ，m a l d i ) 方法研究 了野生型r m 1 细胞和b i n l b 稳定转染细胞的蛋白质组的表达差异。首先应用双 向凝胶电泳技术对蛋白质进行分离，每一例样本均分别进3 次双相电泳进行重复 性实验，用p d q u e s t 分析软件对两组的全蛋白质组表达谱进行差异分析，总共 发现1 5 个差异蛋白点( 3 倍以上差异) 。对差异蛋白进行了胶内酶解，酶解后的肽 段用m a l d i t o f t o f 质谱分析，将质谱数据送入n c b i 非冗余数据库，通过 m a s c o t 搜索引擎检索。最后l o 个差异蛋白得到成功鉴定。研究中发现b i n l b 可能通过影响微管，肌动蛋白，以及它们的相互作用改变细胞骨架结构，影响细 胞的运动及细胞内物质运输，并可能通过蛋白质二硫键异构酶等蛋白影响细胞外 蛋白的结构，同时p r o f i l i n - 1 的高表达也会影响细胞内的信号转导过程。进一步 验证了b i n l b 与精子运动有一定的相关性，而微管和肌动蛋白的改变可能是它作 用机制的一个重要环节。本文中的蛋白质双向凝胶实验所得到的蛋白表达变化为 进一步深入研究b i n l b 在促进细胞运动、影响信号转导方面提供了重要的提示。 本研究实验结果更进一步证实了b i n l b 可以促进细胞的运动并且有抗菌、抗病毒 摘要 的作用，为研究b i n l b 的机理和深入理解相关分子c l s u 提供了重要的参考。 关键词：差异蛋白质组学，质谱，双向凝胶电泳，抗菌肽，b i n l b a b s t r a c t d i f f e r e n t i a lp r o t e o m i c sr e s e a r c hi sa ni m p o r t a n tp r o t e o m i c sr e s e a r c h i tf o c u s e s o i ls c r e e n i n ga n di d e n t i f i c a t i o no ft h ec h a n g eo fp r o t e i ni nd i f f e r e n tt y p eo rc o n d i t i o n ， w h i c hh a sb e e nu s e dw i d e l y i tc a nd e t e r m i n et h ed i s e a s e r e l a t e dt a r g e tf o rc l i n i c a l d i a g n o s i s ，p r o v i d et h e o r e t i c a lb a s i sa n df o u n d a t i o nf o rp a t h o l o g i c a lr e s e a r c h ，d r u g s c r e e n i n g ，d r u gd e v e l o p m e n ta n d m e t a b o l i cs t u d i e s i nt h i sp a p e r ，d i f f e r e n t i a lp r o t e o m i c sm e t h o d su s e df o rt h ef i r s tt i m et or e s e a r c h t h ew i l d t y p er m 1c e l l sa n ds t a b l et r a n s f e c t e db i n l bc e l l si np r o t e i ne x p r e s s i o n a n a l y s i st h ed i f f e r e n c e si nt h ee x p r e s s i o no fp r o t e i n ，i d e n t i f i e db yt h eb i n lbg e n e e x p r e s s i o nc a u s e db yc h a n g e si nt h el e v e lo fp r o t e i nf o rt h es t u d yo fg e n eb i n l b f o u n d a t i o n b i nlbi sa l la n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，a n t i m i c r o b i a lp e p t i d ei s ak i n do f p e p t i d ec o m p o s e do f 3 0 8 0a m i n oa c i d sc a p a b l eo fk i l l i n gb a c t e r i a ，f u n g u sa n dm a n y o t h e r sm i c r o b e s o m ek i n do fa n t i m i c r o b i a la l s oc a na n t i v i r u sa n dk i l lt u m o rc e l l s t h e r ea r es t i l ls o m ea n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sc a np r o m o t et h em o b i l i t yo fs p e r m ，a n d r e g u l a t ei m m u n es y s t e mo fm a m m a l i a na n i m a l s i no r d e rt os t u d yt h ee x p r e s s i o no f b i n l b ，t h i sa r t i c l ea t t e m p t st ou s ep r o t e o m i c sa p p r o a c ht or e a r c hb i n l bf r o mt h e c h a n g ei np r o t e i nl e v e l 。 t h i sp a p e rs t u d i e st h ed i f f e r e n c e sb e t w e e nt h er m 一1c e l l sa n ds t a b l et r a n s f e c t e d b i nl bc e l l si np r o t e i ne x p r e s s i o n a p p l i c a t i o no ft w o d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s f o rp r o t e i ns e p a r a t i o n ，e a c hc a s es a m p l e sw e r et w o p h a s ee l e c t r o p h o r e s i si n t o3t i m e s t oe n s u r er e p e a t a b i l i t y , i m a g em a s t e rs o f t w a r ew i t ht w of u l l p r o t e o m ed i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o np r o f i l i n ga n a l y s i s ，at o t a lo f15d i f f e r e n c e si np r o t e i ns p o t s ( 3t i m e st h a n t h ed i f f e r e n c e s ) c a r r i e do u to nt h ed i f f e r e n c ei np r o t e i n - g e ld i g e s t i o n ，p e p t i d e sa f t e r d i g e s t i o nw i t hm a l d i t o f t o fm a s ss p e c t r o m e t r ya n a l y s i s ，d a t as e n t t on c b i n o n r e d u n d a n td a t a b a s e ，t h r o u g ht h em a s c o ts e a r c he n g i n e s f i n a l l y , 10d i f f e r e n t i a lp r o t e i n sw e r es u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e d b i n lbi sf o u n dt h a t m a ya f f e c tm i c r o t u b u l e s ，a c t i n ，a n dt h e i ri n t e r a c t i o nc h a n g e si nc y t o s k e l e t a ls t r u c t u r e ， t h ei m p a c to fc e l lm o v e m e n ta n di n t r a c e l l u l a rm a t e r i a lt r a n s p o r t ，a n dm a yb ea d o p t e d ， s u c ha s p r o t e i n ，p r o t e i nd i s u l f i d ei s o m e r a s e a f f e c tt h ee x t r a c e l l u l a rp r o t e i n t h e i i i s t r u c t u r e ，a tt h es a m et i m eh i g h - p r o f i l i n 一1e x p r e s s i o nw i l la l s oa f f e c tt h ec e l ls i g n a l t r a n s d u c t i o n b i nl bs p e r mm o t i l i t ya n dac e r t a i nd e g r e eo fr e l e v a n c e ，a n dt u b u l i na n d a c t i nt oc h a n g ei t sm e c h a n i s mm a yb ea ni m p o r t a n tp a r t i nt h i sp a p e r , t h ec h a n g i n g o ft h ep r o t e i ne x p r e s s i o nb yt w o d i m e n s i o n a lg e lp r o t e i ne x p e r i m e n tp r o v i d e s a n i m p o r t a n tr e m i n d e rf o rf u r t h e rs t u d yo ft h a tb i n lbi np r o m o t i n gc e l lm o v e m e n ta n d t h ei m p a c to fs i g n a lt r a n s d u c t i o n k e yw o r d s ：d i f f e r e n t i a lp r o t e o m i c s ，m s ，2 - d e ，a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e ，b i n l b i v 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 晁阳 础年弓月 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名： i 三l 口 ：j bp 目 坪3 月1 1 日 第1 章引言 第1 章引言 1 1 蛋白质组学概述及其研究进展 人类基因组序列图谱初稿的公布，在揭示基因组的精细结构的同时，也 现 出基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性，这与生命现象的复杂性和多变性 之间存在巨大反差。这种反差促使人们意识到：基因只是遗传信息的载体。要研 究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是远远不够的，这也使 得人们对于生命活动的直接执行者一蛋白质的重要性有了更深的理解。因此，对 蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面和深入的研究成为 生命科学研究的迫切需要和重要任务。一个以“蛋白质组 ( p r o t e o m e ) 为研究重 点的生命科学新时代己悄然到来【1 j 。 “蛋白质组”一词的英文是“p r o t e o m e ”，它由p r o t e i n s 和g e n o m e 两个 词组合而成，意思是p r o t e i n se x p r e s e db yag e n o m e ，即基因组表达的蛋白质【2 儿3 1 。 广义上讲，蛋白质组是指“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质 ， 它是对应于一个基因组的所有蛋白质构成的整体，而不是局限于一个或几个蛋白 质。由于同一基因在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同，即使是同一细 胞，在不同的发育阶段、不同的牛理条件下、不同的环境影响下，其蛋白质的存 在状态也不尽相同。因此，蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体h 1 5 j 。 蛋白质组学( p r o t e o m e ) 研究的目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋 白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之问相互作用与联系，揭示蛋 白质功能与细胞生命活动规律【6 】【7 】。要对“全部蛋白质”进行研究是非常闲难的， “功能蛋白组学( f u n c t i o n a lp r o t e o m e ) 的提出解决了这一难题【8 【9 1 ，其研究对象 是功能蛋白质组，即细胞在一定阶段或某一生理现象相关的所有蛋白质，它是介 于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组 学研究之间的层次，并把目标定位在蛋白质群体上，这一群体可大可小，从局部 入手研究蛋白质的各个功能亚群体，以便将来把多个群体组合起来，逐步描绘出 接近于牛命细胞的“全部蛋白质 的蛋白质图谱【1 0 】【1 2 】。功能蛋白质组学的研究 为实际运作带来方便，人们可利用现有的技术手段来研究蛋白质组以及现群体中 的各个蛋白质功能亚群，从理论和技术上使以“全部蛋白质为研究对象的蛋白 质组学的抽象概念具体化，使研究者们更易动态、整体、深入地研究生理状态下 第1 章引言 同一组织在不同发育阶段或同一组织细胞在不同个体问或同一基因在不同组织 细胞间，以及病理情况下同一疾病的不同发展阶段的蛋白质表达模式和功能模式 的变化，揭示一些重要的生命现象和一些重大疾病的发生发展规律。狭义上讲， 蛋白质组是指不同条件下细胞内蛋白质的变化，比如正常细胞和异常细胞之问， 细胞用药和不用药之间的蛋白质表达谱的区别，这在疾病研究和药物筛选上很有 意义，是目前蛋白质组学在应用研究方面最具前景的领域【1 3 】【1 6 1 。当然，随着蛋 白质组研究的不断发展，蛋白质组学的概念也将不断发展和深化。 1 1 1 蛋白质组学的技术方法进展 蛋白质组学的科学研究之所以能够取得蓬勃的发展，主要依赖于大规模高通 量分离和分析技术的突破性进步。在蛋白质组研究中，目前最成熟、最有效的技 术仍然是双相凝胶电泳分离一生物质谱鉴定技术，即首先用双相凝胶电泳分离纯 化蛋白质，结合计算机定量分析得到的电泳图谱，再进一步用牛物质谱技术对分 离出的蛋白质进行鉴定，并运用现代牛物信息学的技术对所得到的天文数字的数 据进行处理，对蛋白质以及它们执行的生命活动做出尽可能精细、准确及本质的 阐述。下面简要介绍一下目前蛋白质组学主要技术的发展。 ( 1 ) 双相凝胶电泳技术 双相凝胶电泳( 2 d e ) 是目前蛋白质组学中最成熟的方法。双相电泳是指第一 向为等电聚焦( 等电点信息) ，第二向为s d s 一聚丙烯酞胺凝胶电泳( 分子量信息) 。 样品经过电荷和质量两次分离后，可以得到分子的等电点和分子量的信息。一次 双相电泳可以分离儿千甚至上万个蛋白，这是目前所有电泳技术中分辨率最高， 信息量最多的技术。它能够根据蛋白的等电点和分子量，使疏水性和相对丰度不 同的复杂蛋白混合体系得到分离。根据所采用的胶的大小和胶条p h 梯度的不同， 2 d e 可以同时分离5 0 0 0 个蛋白点( 通常的也能分离2 0 0 0 个蛋白点) 。而且它能提 供一个完整的蛋白表达的图谱，从而可以反应出蛋白表达量的变化情况、异构体 ( i s o f o r m ) 或者翻译后修饰的情况。而l c m s m s 的方法鉴定的是肽段，因此等电 点和分子量的信息丢失了，而且需要用同位素标记进行定量比较。2 一d e 的一个 优点就是能够研究蛋白的翻译后修饰( 磷酸化、糖基化等) ，因为在很多情况下， 蛋白质点分布在水平或者垂直的轴线上，此时蛋白很可能发生了翻译后修饰。但 是双相凝胶电泳技术仍然存在许多不足。目前对双相凝胶电泳技术的改进丰要集 中在憎水性蛋白质样品的制备，分离能力的改善，以及染色方法等方面。 2 第l 章引言 ( 2 ) 生物质谱技术 生物质谱在最近几年得到了迅猛发展。由于其灵敏、迅速以及多样化的功能 牛物质谱已经成为蛋白质组学的支撑技术。 生物质谱技术在离子化方法上主要有两种软电离技术，即基质辅助激光解吸 电离( m a t r i x a s s i s t e d l a s t e rd e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ，m a l d i ) u7 j 和电喷雾电离 ( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n ，e s i ) | 1 8 】。e s i 使分析物从溶液相中电离，适合与液相分离 手段( 如液相色谱和毛细管电泳) 联用。而m a l d i 是在激光脉冲的激发下，使样 品从基质晶体中挥发并离子化。m a l d i 适于分析简单的肽混合物而液相色谱与 e s i m s 的联用( l c m s ) 适合复杂样品的分析。 软电离技术的出现大大拓展了质谱的应用空间，而质量分析器的改善也大大 推动了质谱仪器技术的发展。对于牛物质谱来说，最重要的性能是灵敏度、分辨 率、质量精度和串级质谱能力。牛物质谱的质量分析器主要有四种：离子阱( i o n t r a p ，i t ) 、飞行时间( t o f ) 、四极杆( q u a d r u p o l e ) 和傅立叶变换离子回旋共振( f o u r i e r t r a n s f o r mi o nc y c l o t r o nr e s o n a n c e ，f t i c r ) 。它们的结构和性能各不相同，每一种 都有自己的长处与不足。它们可以单独使用，也可以互相组合形成功能更强大的 仪器。 离子阱质谱灵敏度较高，性能稳定，具备多级质谱能力，因此被广泛应用于 蛋白质组学研究。不足之处是质量精度较低。最近发展起来的线性( 或称两维) 离 子阱与传统的三维离子阱不同，离子可储存在一个圆柱状的空问内，显著改善了 离子阱质谱的灵敏度、分辨率和质量精度【1 9 】。与离子阱相似，傅立叶变换离子 回旋共振质谱也是一种可以“捕获 离子的仪器，但是其腔体内部为高真空和高 磁场环境。它具有高灵敏度宽动态范围、极好的分辨率和质量精度( 质量准确度 很容易地小于lp p m ) 。这使得它可以在一次分析中对数白个完整蛋白的分子进行 质量测定和定量。g o o d l e t t 等【2 0 】的工作表明通过f t i c r m s 测得的单个肽段的 精确质量，结合其他一些易得的限制条件，即可通过数据库搜索鉴定蛋白。 f t i c r m s 的一个重要功能是多元串级质谱。与通常的只能同时选一个母离子的 串级质谱方式不同，f t i c r - m s 可以同时选择几个母离子进行解离，这无疑可以 大大增加蛋白质鉴定工作的通量。但是它的缺点也很明显：操作复杂、肽段断裂 效率低、价格昂贵等。这些缺点限制了它在蛋白质组学中的广泛应用。 m a l d i 通常与t o f 质量分析器联用分析肽段的精确质量，而e s i 常与离 子阱或三重四极杆质谱联用通过碰撞诱导解离( c o l l i s i o n i n d u c e dd i s s o c i a t i o n ，c i d ) 获取肽段的碎片信息。 3 第l 章引言 近年来新型的质谱技术层出不穷，对蛋白质组研究将产生潜在的深远影响 m a l d i q t o f 这一先进平台的出现，为自动化高通量的应用提供了广阔的前 景。q t o f 优异的质量精度、灵敏度和碰撞伴随电离( c a d ) 能力改善了数据库搜 索结果，并使其成为手工测序( d en o v o ) 的有力工具。 ( 3 ) 两维、多维色谱分离技术 液相色谱( 1 i q u i d eh r o m a t o g r a p h y , l c ) 、毛细管电泳( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ， c 日等高效分离技术具有多种分离模式，其分离度高、耗样量少且易于和质谱检 测技术实现在线联用，已成为生物大分子快速分离鉴定的有利工具。 色谱技术近年来有了飞速的发展，亲和色谱、反向色谱等技术随着色谱柱技 术的完善，其分离时间和分离效率均有显著的改善。毛细管电泳是另一种高效的 分离技术，因其分离度高、分离速度快且易于和电喷雾离子化质谱技术( e s i m s ) 实现在线连接，在蛋白质分析中的应用也极为广泛。 确定蛋白质分子的性质，尤其是面对其复杂多变的翻译后修饰作用，就使得 一维的分离手段显得力不从心。h a n c o a k 等探讨了以h p l c 、h p c e 两维分离技 术，m s 检测的方法用于蛋白质组的研究亦有用两维液相色谱联用分离蛋白质， m s 在线检测。两维分离的结果明显优于一维，在复杂的牛物大分子的分析中具 有应用前景。毛细管等电聚焦电泳一电喷雾质谱己被认为是取代二维凝胶电泳法 最有效的技术。 ( 4 ) 蛋白质芯片技术 蛋白质芯片是将蛋白质排列在玻璃片( g l a s ss l i d e s ) ，多孔胶片( p o r o u sg e lp a d s l i d e s ) 或微井( m i c r o w e u s ) 上，将标记后的探针靶分子与微点阵( m i c r o a r r a y s ) 进行 杂交，用合适的检测系统即可确定蛋白质之间是否存在交互作用。确定蛋白质问 的相互作用，可以对细胞活动机制及功能有更深一层的了解。一个生命活动的发 生，常常是多个蛋白质共同作用的结果。酵母双杂交系统是一种应用极为广泛的 鉴定蛋白质相互作用的方法，但操作复杂，而新兴的蛋白质芯片技术则是高通量 分析蛋白质相互作用的有利工具。 蛋白质分离芯片是蛋白质芯片研究的另一个丰要领域，是以玻璃、多孔硅或 一些高分子材料作为基质，通过一定的技术在基质上刻蚀出各种形式的孔道，通 过色谱、电泳不同的分离模式或不同方法和模式的组合，实现蛋白质或肽段的分 离。蛋白质芯片以其上样量小、分辨牢高、设备简单、相对成本低等特点越来越 引起广大研究者的关注。 ( 5 ) 酵母双杂交技术 4 箜! 童呈堕 蛋白质是各种生命活动的主要执行者，因此构建蛋白质相互作用的网络图对 于准确理解蛋白质功能、揭开各种细胞活动的奥秘十分重要。酵母双杂交系统是 目前国际上公认的研究蛋白质相互作用的重要关键技术之一。经过多年的应用和 发展，无论在操作技术和应用范围等方面都得到了很大的提升和扩展。它也是一 种可以把基因组研究和蛋白质组研究顺利衔接的有效方法。因此，目前酵母双杂 交技术仍然在建立蛋白质相互作用的连锁谱中发挥着重要的作用，这 已经在多种牛物的基因组和蛋白质组研究中得到了证明。 高通量、大规模地实验操作并获得组学视野的实验结果和数据是蛋白质组学 研究的需要。酵母作为一种模式生物因其特有的牛理和遗传性状尤其适合满足这 种需要。利用酵母不同交配型细胞的接合技术和自动化机器人的操作、检测分析 系统就可以组建成高通量、大规模操作的酵母双杂交技术平台。它将极大地提高 蛋白质相互作用研究的规模和效率，在相同时间内能比个别地、分散地进行实验 更快、更多地获取数据。这不仅可以大幅度加快研究的速度，而且更完整的数据 也有利于对研究结果进行组学规模的全面分析。由此而建立的蛋白质相互作用组 学对于理解蛋白质的功能有重要的意义。 ( 6 ) 串联亲和纯化( t a p ) 技术 双杂交技术已经广泛用于研究蛋白蛋白间相互作用，但由于其筛选步骤复 杂，假阳性结果较多，难于量化，且不易研究高级复合物问的相互关系，故远远 不能满足大规模蛋白质组研究的需要，因此，与质谱联用的蛋白纯化技术己成为 当前蛋白质组学研究的重要工具。r i g a u t 等人【2 l 】于1 9 9 9 年首先提出了串联亲和 纯化t a p 技术，它是利用一种经过特殊设计的蛋白标签，经过两步连续的亲和 纯化获得更接近自然状态的特定蛋白复合物的技术，在一定程度上打破了制约蛋 白质组研究的瓶颈。 t a p 技术在低浓度情况下，也能高效富集目的蛋白，并且纯化多在天然条件 下进行，故可较好的保持靶蛋白复合物的空间结构，得到的产物可用于活性检测 及结构分析。即可用于分析在稳定复合物中的蛋白间相互作用，也可分析反应中 蛋白间的瞬时相互作用，鉴定与靶蛋白发生直接或间接相互作用的配体( 核酸、 脂类及多肽) ，这都是传统双杂交技术所不可比拟的。目前这一技术已在酵母蛋 白质组研究中广泛应用。与质谱连用的t a p 技术是我们研究蛋白质组学的有力 工具，必将在解析生物蛋白复合体的功能方面发挥重要作用。 第l 章引言 1 1 2 蛋白质组学在疾病研究中的应用 运用蛋白质组学研究手段，通过比较正常和病理情况下细胞或组织中蛋白质 在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，可以发现与病理改变有关的蛋白质 和疾病特异性蛋白质，这些蛋白质即可为疾病发病机制提供线索，也可作为疾病 诊断的分子标记，还可作为治疗和药物开发的靶标【2 5 】【2 7 1 。 目前疾病蛋白质组学所依赖的技术平台仍然以2 d e m s 为主，即首先用 2 - d e 比较疾病状态与正常状态的蛋白组，通过差异图谱分析找到差异表达蛋白， 然后用m s 对这些差异蛋白进行鉴定，并试图从这些差异蛋白出发找出疾病发生 发展的机理、诊断标志物或治疗靶点，该平台被广泛地应用于多种人类重大疾病 的研究，包括：癌症、神经病理学、心血管病和传染病等【2 8 】【3 0 】。 1 1 3 小结与展望 蛋白组质组学一经出现，就有两种研究策略。一种可称为“竭泽法 ，即采 用高通量的蛋白组研究技术分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质，这种 观点从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，也更符合蛋白质组学的本质。 但是，由于蛋白质表达随空间和时问不断变化，要分析牛物体内所有的蛋白质是 一个难以实现的目标。另一种策略可称为“功能法，即研究不同时期细胞蛋白 质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白种类为 主要目标。这种观点更倾向于把蛋白质组学作为研究生命现象的手段和方法。 早期蛋白质组学的研究范围主要指蛋白质的表达模式( e x p r e s s i o np r o f i l e ) ，随 着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰 研究已成为蛋白质研究的重要部分。蛋白质一蛋白质相互作用的研究也己被纳入 蛋白质组学的研究范畴，但目前仍独树一帜。 在基础研究方面，近两年来蛋白质组研究技术已被应用到各种生命科学领 域，如生物学、神经生物学等。在研究对象上，覆盖了原核生物、真核牛物、植 物和动物等范围，涉及到各种重要的生物学现象，如信号传导、细胞分化、蛋白 质折叠等。在未来的发展中，蛋白质组学的研究领域将更加广泛。 在应用研究方面，蛋白质组学将成为寻找疾病分子标记和药物靶标最有效的 方法之一。在对癌症、老年性痴呆等人类重大疾病的临床诊断和治疗方面蛋白质 组技术也有十分诱人的前景，目前国际上许多大型药物公司正投入大量的人力和 物力进行蛋白质组学方面的应用性研究。 6 第1 章引言 在技术发展方面，蛋白质组学的研究方法将出现多种技术并存、各有优势和 局限的局面，而难以像基因组研究一样形成比较一致的方法。除了发展新方法， 建立新的平台外，更强调各种方法间的整合和互补，以适应不同蛋白质的不同特 征。另外，蛋白质组学与其它学科的交叉也将日益显著和重要，这种交叉是新技 术、新方法的活水之源，更重要的是，蛋白质组学与其它大规模学科如基因学、 生物信息学等领域的交叉所呈现的系统生物学研究模式，将成为未来生命科学最 令人激动的新前沿。可以设想今后几年在传统2 d e m s 方法的基础上将会不断 发展出日益多样化的改进或替代技术，使蛋白质组技术将不仅能全面和系统地完 成细胞和组织中各类蛋白质定性和定量分析，而且能够检测出更多的蛋白质功能 状态，使蛋白质组分析更接近综合性和多维度的牛物学功能分析。特别是随着质 谱检测参数的不断提高和分析过程的自动化、生物信息学快速发展以及与细胞生 物学技术的紧密结合将使大规模检测基因表达的诱导和抑制、鉴定蛋白质复合体 并确定亚细胞定位和移位以及蛋白质磷酸化等翻译后修饰成为可能，增进人们对 细胞信号传导过程中复杂网络有更全面地了解。因此，m a l d i t o f 等各种生物 质谱以及技术在生命科学实验中会越来越普及，牛命科学对复杂现象和机制的研 究将会越来越依赖e s i m s m s 、在线h p l c e s i m s m s 、m a l d i q t o f m s 和 m a l d i t o f t o f m s 的帮助，并有助于发展更快、更精细的牛物信息学工具。 1 2 蛋白质组研究策略 目前尚没有合适的方法能简便地一步实现对复杂蛋白质混合物的定性和定 量分析，必须把分离、鉴定、定量以及数据处理手段进行整合。文献报道的蛋白 质组学策略多种多样，但是主要有两种路线：第一种是传统的2 d e 蛋白分离、 胶内酶解与m s 鉴定相结合的方法，这也是目前最常用的一种路线。第二种即所 谓的“s h o tg u np r o t e o m i c s 方法，先将混合蛋白酶解，经过适当的色谱分离手 段之后，对肽段进行m s m s 分析并据此实现蛋白的鉴定。如果需要进行定量比 较，可以对蛋白或肽段进行稳定同位素标记。无论采用哪一种路线，如果想进行 高通量的分析，都需要进一步发展数据处理和存储的技术。 在第一种路线当中，蛋白质通过2 - d e 进行分离，染色后根据蛋白质着色的 深度粗略判断其表达量的多少。然后可以将感兴趣的蛋白质切下、酶解后用质谱 鉴定。2 - d e 经过2 5 年的发展己经成为一项成熟的技术。用m a l d i t o f 或 e s i m s m s 对胶内酶解蛋白质的鉴定也已经被广泛证明是行之有效的。采用该 7 笙! 皇曼! 壹 路线进行的许多研究结果表明，不论研究体系如何，许多鉴定的蛋白质都是相同 的，这说明该方法的动态范同很有限。对酵母蛋白质组的系统研究也表明该方法 通常只能看到高丰度的蛋白质。这恐怕也是该路线所面临的最大问题。针对这种 网难和挑战，2 d e 的技术也在不断的发展和完善之中，包括更灵敏的染色方法， 更高分辨率的分离胶和2 - d e 分离前样品的预处理措施等等。 第二种路线是最近几年发展起来的，其起源可追溯到1 9 9 2 年。h u n t 及其同 事首先用l c m s m s 的方法对蛋白复合物进行了研究。但是他们的方法用于蛋 白质组学的定性和定量研究还有很多困难：首先，对于复杂的蛋白质体系，酶解 之后的肽段数目极多，一维色谱的峰容量不足。第二，无论是m a l d i m s 还是 e s i m s ，都不是理想的定量检测器。第三，对于实验产生的大量数据，需要有 相应的处理和分析手段。近几年来在这些方面已经出现了许多重大进展，使该平 台的性能不断提高。为了提供足够的峰容量，提出了许多多维的蛋白质和肽段的 分离体系。最常用的是肽段的两维( 强阳离子交换反相色谱) 和三维( 强阳离子交 换抗牛物素蛋白反相色谱) 色谱分离体系。有研究表明理论上该方法可以检测到 丰度很低的蛋白，尽管这需要进行仔细的实验设计和足够量的样品。 与基因组学相比，蛋白质组的技术平台尚不完善，需不断优化和完善现有的 平台，并建立与发展新的平台。蛋白质组学的技术研究给分析化学研究人员提供 了一个广阔的前沿领域，而分析化学的发展，特别是在高通量分离和分析方面的 进展，为蛋白质组学的研究奠定了有效的基础。分析化学将寻求和创造更快速、 更大规模、更高通量的分离和分析方法的建立，将为生命科学界提供海量的功能 蛋白质组的数据，并将与生物和医学研究人员合作完成对基因功能的研究，可 以相信今后将有更多的分析化学研究人员加入到蛋白质组学的研究中，对生命科 学的研究不断注入惊人的活力。 1 3 本文主要内容及创新点 本文借助复旦大学蛋白质组学研究中心的技术平台，利用2 d e - m s 方法研 究了b i n l b 稳定转染小鼠前列腺癌细胞的蛋白质组和对照组野生型小鼠前列腺 癌细胞的蛋白质表达差异。首先对两组样本同时进行模拟感染，然后提取蛋白质， 进行双向凝胶电泳分离，染色，染色后的2 - d e 胶用i m a g es c a n n e r 扫描仪透射扫 描获取图像，用2 - d e 分析软件p d q u e s t 找出b i n l b 稳定转染小鼠前列腺癌细胞 的蛋白质表达上调3 倍以上的点为差异蛋白质，对所选出的1 5 个差异蛋白质点 r 第1 章引言 进行手动切胶，酶解，进入m a l d i t o f m s m s 质谱仪进行肽指纹谱和串极质 谱分析获取数据，采用m a s c o t 自动检索软件系统和n c b im s 数据库检索， 成功鉴定出来差异蛋白质1 0 个，其中b i n l b 稳定转染小鼠前列腺癌细胞蛋白高 表达的蛋白质有9 个，低表达的有1 个。差异蛋白可以归结为以下三类：微管 机动蛋白、蛋白质二硫键异构酶以及谷胱 j 肽转移酶m u l 三类。这些差异蛋白 参与了影响或者改变微管，肌动蛋白，以及它们的相互作用，或者改变细胞骨架 结构，影响细胞的运动及细胞内物质运输，这对于验证b i n l b 能够促进细胞运动 起到了一定的作用，并且对于验证b i n l b 能够促进精子的运动方面有了蛋白质水 平上的解释。b i n l b 转基因小鼠前列腺癌细胞蛋白高表达的还有蛋白质二硫键异 构酶，这种蛋白可以影响细胞外蛋白的结构，并且起到了抗病毒的作用。同时 p r o f i l i n 。l 的高表达也会影响细胞内的信号转导过程。本研究实验结果为研究 b i n l b 的机理和深入理解相关分子机制提供了重要的参考，可见与野生型小鼠前 列腺癌细胞相比，b i n l b 转基因小鼠前列腺癌细胞在感染过程中抗感染能力提高。 本文的创新之处在于本课题研究是首次从蛋白质水平找出b i n l b 基因高表达 是引起蛋白质变化的原因。运用蛋白质组学方法研究b i n l b 抗菌肽在生物体内表 达的机制，通过差异蛋白质的分析更好的解释b i n l b 在体内调节牛命活动的机制。 首次从蛋白质水平上发现b i n l b 可能通过影响微管，肌动蛋白，以及它们的相互 作用改变细胞骨架结构，影响细胞的运动及细胞内物质运输，并可能通过蛋白质 二硫键异构酶等蛋白影响细胞外蛋白的结构，同时p r o f i l i n 1 的高表达也会影响 细胞内的信号转导过程。 9 第2 章差异蛋白质组学方法研究 第2 章差异蛋白质组学方法研究 1 9 9 4 年，m a r cw i l k i n s 在s i e n a 双向凝胶电泳( 2 d e ) 会议上最早提出了 蛋白质组( p r o t e o m e ) 概念，并于1 9 9 5 年7 月的e l e c tr o p h o r e s i s 杂志上发表【3 1 1 ， 当时定义为微生物基因组表达的整套蛋白质，后来定义为一个基因组所表达的蛋 白质。蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 是一门以全面的蛋白质性质研究为基础，在蛋白 质水平对疾病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学。其中，差异蛋 白质组学是蛋白质组学研究的一种重要研究策略，着重于筛选和鉴定不同种类或 状态下各样本之间蛋白质组的区别与变化，具有很强的可实现性。 2 。1 差异蛋白质组学的产生背景 根据研究内容，蛋白质组学可以分为结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结 构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间 结构的解析、种类分析及数量确定；功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研 究，包括蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用。在对结构蛋白质组学研究的初期， 许多研究者在人类基因组计划成功完成的鼓舞下，力图“查清 人类大约3 万到 4 万多基因编码的所有蛋白质，建立蛋白质文库。在这方面美国及其他一些国家 的政府和大公司投入了巨额资金，但是蛋白质组与基因组相比迄今还不具备像基 因组研究中的大规模基因组测序技术和高通量的基因芯片技术相应的技术基础， 而且d n a 大规模的高通量研究是建立在4 种碱基及其配对性质的相对单一和简 单的原则基础上的，但对蛋白质的识别和鉴定的原则要复杂得多。随着对蛋白质 组学的深入理解和具体工作的开展，人们逐渐认识到在短时间内建立人类蛋白质 组学“完整的 数据库和实现网络资源共享是难以实现的，或者说条件尚未成熟 【3 2 】。于是结构蛋白质组学研究着重于寻找和筛选任何有意义的因素引起的2 个 样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程、本质、对外界环境 刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分 析，这样差异蛋白质组学应运而牛【3 3 | 。 l o 第2 章差异蛋白质组学方法研究 2 2 差异蛋白质组学研究技术的进展 目前差异蛋白质组学研究多采用传统的蛋白组学技术，例如双向电泳、质谱 等，但2 - d e 检测不到低拷贝蛋白和难溶蛋白，而且极酸或极碱的蛋白在电泳过 程中易发生丢失，对分子量过大( 2 0 0 k d ) 或过小( 1 0 k d ) 的蛋白也难以分 离，因此远不能捕获细胞内的全部蛋白质1 3 4 1 。质谱在蛋白质分析方面虽然具有 高分辨率和高灵敏度的优点，但它需要在检测之前对样品进行必要的纯化，因而 无法实现高通量的蛋白质分析【3 5 1 。此外，质谱是通过分子的飞行时间和带电荷 多少来计算分子的分子质量的，因而它无法区分分子和带电荷相同的同分异构体 的质量。这些技术的缺憾阻碍了差异蛋白质组学研究在当前大规模地迅速开展， 但近几年一些新技术的发展为差异蛋白组学的发展提供了条件。 2 2 1 激光捕获微切割技术 选择具有高度可比性、特异性差异显著的对比对象是差异蛋白组学的关键。 由于样本成分复杂，实验者为保证差异蛋白确实存在及其与研究因素的相关性， 一个重要的策略就是减少干扰因素或个体差异，提高样本的均一性。激光捕获微 切割技术( 1 a s e rc a p t u r em i c r o d i s s e c t i o n ，l c m ) 的出现和发展促进了差异蛋白组学 研究中具有高度可比性标本的选择。该技术的工作原理