（动物学专业论文）siv+p27单克隆抗体的制备、性质分析和初步应用.pdf

摘要 猴免疫缺陷病毒( s i m i a ni m m u n o d e f i c i e n c y m s ，s i v ) 在基因 组成、形态、理化特性、分子生物学特性和致病机制等方面与m v 非常相似，因此以s 或s m v ( s 与m v - 1 构成的一种嵌合病毒) 感染动物，建立的灵长类模型成为目前a i d s 研究中最常用的动物模 型。在模型的建立和使用中，血液s 抗原检测对于病毒血症、疾病 过程、早期诊断、判断预后和抗病毒药物的体外筛选十分重要。在 s i v 诸多结构蛋白中，衣壳蛋白p 2 7 因氨基酸序列保守，且具有群抗 原性，被认为是抗原检测的标志物。故本研究选择以纯化的s i vp 2 7 蛋白为免疫原制备单克隆抗体，进而依据双抗体夹心e l i s a 的原理， 初步应用鼠抗s i vp 2 7 单克隆抗体，探索构建检测s i vp 2 7 抗原的试 剂体系，以期成为今后艾滋病及其相关研究的有效方法。 本研究内容主要包括两大部分。第一部分是s p 2 7 单克隆抗体 的制备和特性分析。我们使用质粒重组的s i vp 2 7 蛋白免疫b a l b c 小鼠，采用杂交瘤技术和半固体培养基法建立杂交瘤细胞株，经检测 筛选，最终保留4 株能稳定分泌s i vp 2 7 单克隆抗体的杂交瘤细胞。 使用秋水仙碱将杂交瘤细胞阻断在细胞分裂中期，染色体核型分析表 明4 株细胞确为杂交瘤细胞，其分泌的单抗1 c 3 、2 8 6 为i g g l 类， 2 e 1 2 为i g g 2 b 类，3 g 3 为i g g 2 a 类。w b s t e mb l o t 和间接免疫荧光检 测表明4 株单抗特异性良好，均能识别s i v 的p 2 7 蛋白，与逆转录病 毒s r v 、s 无交叉反应，2 8 6 、2 e 1 2 与vp 2 4 蛋白有交叉反应。 免疫荧光法检测杂交瘤细胞培养上清效价为1 ：8 0 l ：2 5 6 0 ，腹水效价 为1 ：1 0 2 4 0 1 ：4 0 9 6 0 。位点相加实验表明2 e 1 2 与3 g 3 识别不同的抗 原表位。 第二部分是单克隆抗体的纯化和初步应用。我们采用辛酸硫酸 铵法和p r o t e i na 亲和层析两种方法对不同类别的单抗进行纯化，纯 化效果良好。使用简易过碘酸钠法对单抗进行辣根过氧化物酶标记。 经抗体配对实验确定以2 e 1 2 为包被抗体、酶标3 g 3 为检测抗体，棋 盘滴定法确定抗体工作浓度后，探索构建了检测s i vp 2 7 抗原的双抗 体夹心e l i s a 法。应用初步建立的双抗体夹心e l i s a 法，对s 模 型猴血浆标本和s v 模型猴病毒分离培养上清标本进行检测，并将 其结果与c o u l t e r 公司试剂盒检测结果进行了比较。实验数据表明自 建体系可以用于s i vp 2 7 抗原的检测，特异性良好，但灵敏度有待于 进一步提高。 本研究成功地建立了能稳定分泌s i vp 2 7 单克隆抗体的杂交瘤细 胞株，为s i v s a i d s 及其艾滋病相关研究提供了一个重要工具。对 检测s i vp 2 7 抗原的双抗体夹心e l i s a 法的探索构建，为s i v p 2 7 抗 原检测试剂盒的制备奠定了一定的基础。 关键词 s i v ；蛋白质p 2 7 ；杂交瘤；单克隆抗体；e l i s a h y b r i d o m ac e l ll i n e sw e r es e tu pb yu s i n gh y b r i d o m at e c q u ea n d s 锄i s 0 1 i dc u l t u r em e d i 啪i nt o t a lo ff o u rh y b r i d o m ac e l ll i n e s 也a ts t a b l y s e c r e l 尉s l vp 2 7m c a b sw c r eo b t a i n e d ：1 c 3 锄d2 8 6w e r eo ft h ei g g l s u b c l a s s ，2 e 1 2w a so f 廿他i g g 2 bs u b c l 淞s ，3 g 3w a so f t h ei g g 2 as u b c l a s s c 1 1 r d m o s o m ea i l a l y s e sc o n f i 加e dm a tf o u rh y b r i d o m ac e l ll i n e sw e r e p o l y p l o i dc e l l s a l lf o u rm c a b ss 1 1 0 w e ds 仃o n ga m n 毋f o rs p 2 7 p r o t e i nb yu s i n gw b s t 锄1b l o ta i l di m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y ( i f a ) t e s t s ， b u th a dn oc r o s s - r e a c t i v i 够w i ms r vs n h o w e v e r 2 8 6a i l d2 e 1 2h a d c m s s - r e a c t i v i t ) ，w i l vp 2 4p r o t e i l l n l e t i t e r so fh y b r i d o m a s u p e m a t 锄t sw e r e1 ：8 0 1 ：3 2 0a n da s c i t e sw e r e1 ：1 0 2 4 0 l ：4 0 9 6 0 s h o w e db yi f a ，r e s p e c t i v e l y 2 e 1 2a n d3 g 3w e r ei n d i c a t e dt or l e c o 辨i z e d i 腩r e n t 觚t i g e n i ce p i t o p e sb ye l i s at e s t s t h es t u d i e si nt l l es e c o n dp a r tw e r eo np 嘣f i c a t i o n 缸1 d 叩p l i c a t i o n o fm c a b s m c a b sw e r ep 谢f i e db ya i m o n i u ms u l f 乩ea n dp r 0 x b s a t m b t r i s b o v i n es e r u ma l b u n 吐n 牛血清白蛋白 3 ，3 ，5 ，5 也舡锄俄h y lb e i l z i d i n e 四甲基联苯胺 研h y d r o x y m e 也y l 锄i n om 砒a n e 三羟甲基氨基甲烷 e d t a e t l l y l e n e d i a m i n et e 乜聃c c t i ca c i d 乙二胺四乙酸 r p m r e v o l u t i o np e rm 虹l 毗 每分钟转速 t c i d 5 05 0 t i s s u ec l l l t u r e 磕c t i o u sd o s c 组织培养半数感染量 r c fr e l a 虹v ec e n t r i 允g a lf o r c e 相对离心力 d e p c d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 i f a s r v s t l v i m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y 免疫荧光分析法 s i m i 强r e t f o 访r u s s i i n 洫t - c e l ll e u k e m i av i m s 猴逆转录病毒 猴嗜t 细胞病毒 p a g e p o l y a c r y l 唧i d eg e le l e c 们p h o 袱d s丙烯酰胺凝胶电泳 h r p o d k d h o r s e m d i s hp e r o x i d 勰e 辣根过氧化物酶 o p t i c a ld e n s i t y k i l o d a n o n m c a b m o n o c l o n a la n t i b o d y 吸光度 千道尔顿 单克隆抗体 e l i s a e i l z y m el i n l ( e di 衄u n o s o 慨n t 嬲s a y酶联免疫吸附试验 1 9 g p c r d a b i m m l h l o g i o b l l l i ng免疫球蛋白g p o l y m e r 邪ec h a i nr e a c t i o n聚合酶链反应 3 ，3 二d i 锄i n o b e n z i d 岫 7 二氨基联苯胺 1 上1 一 翮f雷 人类获得性免疫缺陷综合征( a c q 试r e di m m u n o d e f i c i e n c y s ”d r o m e ，m d s ) 是一种严重的灾难性和全球性流行性疾病，它是 由人免疫缺陷病毒( h 啪a i li m m u n o d e f i c i e n c yv i m s ，m v ) 引起的一 种继发性免疫缺陷病。1 9 8 1 年美国首次报道了舭d s ，1 9 8 3 年分离出 入i 型免疫缺陷病毒( v - 1 ) ，随后研究人员从非人灵长类动物中发 现了与碰v 相类似的慢病毒：猴免疫缺陷病毒( s i m i a i l i m m u i l o d e f i c i e n c yv i m s ，s i v ) n 1 。继第一株猴免疫缺陷病毒( s i v m a c ) 被分离出后，又先后分离出多种s 病毒：s i v a g m 、s i v i l l i l e 、s s m 、 s i v s t i n 、s i v c p z 等。s i v 是猴获得性免疫缺陷综合征( s i m i a ni m m u l l e d e f i c i e n c ys y n d r o m e ，s 灿d s ) 的主要致病病毒，为典型的c 型病毒 粒子，基因组长度大约为9 2 k b ，基因组成同瑚v - 1 和m v 2 基本相 同阻3 ，其完整的原病毒基因含有二个u r 以及同m v 类似的基因： g 昭、p z ，v 以埘、，纠、鲫v 和n 疥所有基因在s 的排列顺序同 m v 完全一样。s 感染主要破坏免疫系统，可损害体内的c d 4 十t 细胞、巨噬细胞、树突状细胞，导致细胞免疫和体液免疫缺陷。s i v 有自然宿主，但分离获得的s i v 病毒除s i 、饨m 外，均可实验性感染 不同种类的亚洲猕猴，引发s a j d s ，其发病过程与m v 感染人的过 程极为相似。由于s i v 在基因组成、形态、理化特性、分子生物学特 性和致病机制等方面与 v 的极大相似性嘲，以s i v 或s m v ( s i v 与m v - 1 构成的一种嵌合病毒) 感染动物，建立的灵长类模型成为目 前似d s 研究中最常用的动物模型，广泛用于艾滋病的流行病学、发 病机制、抗病毒药物筛选、治疗和免疫预防等方面的研究n 5 6 ”。 在模型的建立和使用中，s i v 病毒及其相关标志的检测均是重要 的评价指标。s i v 感染标志可分为三大类：病毒性标志、免疫性标志 和相关性标志。病毒性标志是指通过病毒培养或用分子生物学方法直 接从动物体内分离出s i v 或检测病毒核酸凹“。免疫性标志是指s 感染所致的s i v 抗原、抗体、c d 4 淋巴细胞、c d 8 淋巴细胞等免疫物 质”1 。相关标志是指与s i v 感染状态密切相关的细胞因子、合 并感染的病原体以及病理依据，如白细胞介素、干扰素、卡氏肺囊虫 等n 3 “”1 。这些标志的检测相互补充，对于评价模型建立是否成功 以及抗病毒药物、疫苗是否安全和有效具有重要的指导意义。在诸多 的检测指标中，s i v 抗原因为先于抗体出现在血清中，被认为是病毒 复制的间接标志，同时与病情进展情况密切相关，因此其检测对于早 期诊断、判断预后和抗病毒药物的体外筛选尤为重要。 s i v 属逆转录病毒科慢病毒属，主要的结构蛋白包括核心蛋白 ( g a g ) 、酶蛋白( p 0 1 ) 、囊膜蛋白( e n v ) 。g a g 蛋白为大的蛋 白前体，在病毒蛋白酶的作用下，被加工成为基质蛋白( m a ) 、衣壳 蛋白( c a ) 、核衣壳蛋白( n c ) 等。p 2 7 即为衣壳蛋白，它构成s i v 病毒粒子双层壳的内壳，可保护病毒r n a 免受外界核酸酶的破坏，在 病毒的生命周期中起着重要的作用。同时相对于囊膜蛋白，其氨基酸 序列比较保守，而且同属病毒的衣壳蛋白具有相同或相似的抗原性， 即具有群抗原性，因此被认为是s i v 抗原检测的标志物。目前国外已 有商品化的p 2 7 抗原检测试剂盒出售，但国内未见报道。 动物血清及培养物中s i v 抗原的检测常用e l i s a 法，e l i s a 是 1 9 7 1 年由e n g v a l l 等建立的检测可溶性物质的一种方法n ”，具有微量、 特异、高效、经济、方便和安全等特点，目前己成为一类较为成熟的 方法，并不断得到改进，被广泛用于生物学和医学领域。该法操作简 便，易于普及使用，灵敏度可达p g 级。建立e l i s a 检测法的关键在于 特异性高的抗体，抗体的性质直接决定e l i s a 方法的成功与否。高亲 和力的抗体可以提高检测方法的灵敏度，降低本底，缩短反应时间； 高特异性的抗体可以排除其他物质的干扰，避免假阴性和假阳性结 果；稳定性好的抗体在较剧烈的反应条件下仍能保持良好的生物学活 性。单一、均质的单克隆抗体在亲和力、特异性、稳定性方面均有一 定的优势。 在前期s i v s 越d s 研究工作中，我们先后建立了病毒分离、p c r 检测、抗体检测等诊断方法，但抗原检测因为缺少特异性强的高效价 抗体，一直没能建立和应用。基于上述考虑，本研究选择以纯化的s i v p 2 7 蛋白为免疫原制各单克隆抗体，进而依据双抗体夹心e l i s a 的原 理，初步应用鼠抗s i vp 2 7 单克隆抗体，探索构建检测s i vp 2 7 抗原的 试剂体系，以期成为今后艾滋病及其相关研究的有效工具。 第一部分s i vp 2 7 单克隆抗体的制备 和特性分析 材料和方法 1 实验材料 1 1 细胞系 骨髓瘤细胞选择s p 2 0 细胞，本室保存；c n 饭1 7 4 细胞，本室 保存。 1 2 免疫用抗原 用含有s 核心蛋白p 2 7 基因片段( g 昭，7 6 7 b p ) 的重组质粒 p _ b v s g 转化大肠杆菌d h 5q ，表达出的蛋白经c o u l t e rs c o r e a n t i g e n a s s a y 和s d s - p a g e 证实为s i v p 2 7 蛋白。 1 3 实验动物 免疫用小鼠为b a l b c 雄鼠，6 周龄，s p f 极，购自北京实验动 物中心；生产腹水用小鼠为b a l b c 雌鼠，8 1 0 周龄，清洁级，购 自本所繁育厂；制备饲养细胞用小鼠为b a l b c 鼠，3 4 龄，清洁级， 购自本所繁育厂。 1 4 病毒株 s i v m a c 2 5 1 ，由美国a a m nd i 锄o n d 艾滋病研究中心m a r x 博士 惠赠。 1 5p c r 引物 引物为美国哈佛医学院r 1 肌m r 1 脉e c h t 教授研究小组设 计，上海生工生物工程技术服务有限公司3 9 1 型d n a 自动合成仪合 成。 1 6 主要试剂 1 6 1 胎牛血清( f c s ) 、弗氏完全佐剂和不完全佐剂、5 0 x h a t 浓缩 液、1 0 0 h t 浓缩液、t r i z o l 为美国i n v i n o g e n 公司产品。 1 6 28 杂氮鸟嘌呤( 8 一a g ) 、甲基纤维素、二甲基亚砜( d m s o ) 、 f i t c 标记的抗小鼠i g g 抗体、h e p e s 、t e m e d 、单克隆抗体 i g 类与皿类检测试剂盒( s i g m ai m m u l l 0 1 卯e 珊k i t ) 为美 国s i g m a 公司产品。 1 6 3 谷氨酰胺、过硫酸铵、巯基乙醇、丙烯酰胺、n n 亚甲双丙 烯酰胺、甘氨酸、盐酸胍、3 ，3 二氨基联苯胺( d a b ) 为美 国姗s c o 公司产品。 1 6 4 s d s 、p e g 2 0 0 0 0 为美国m e r c k 公司产品。 1 6 5 促融剂p e g l 5 0 0 为美国r o c h e 公司产品。 1 6 6蛋白质分子量触r 为m if e 皿e n t a s 公司产品。 1 6 7 蛋白质浓度检测试剂盒为美国p i e r c e 公司产品。 1 6 8 实时荧光定量p c r 试剂盒( q u 锄t i t e c ts y b rg r e e nr 1 ：p c r ) 为q i a g e n 公司产品。 1 6 9 其他各种试剂为国产市售分析纯。 1 7 主要仪器 c 0 2 培养箱美国t h e n n o 公司 荧光显微镜 日本o l y m p u s 产品 倒置显微镜 荧光定量p c r 仪 酶标仪 高速冷冻离心机 超高速冷冻离心机 垂直电泳仪 高速台式离心机 解剖镜 超声粉碎仪 磁力搅拌器 1 8 主要培养基 日本n i k o n 公司 美国r d c h e 公司 美国b i o r a d 公司 日本t o m y 公司 美国b e c k m a n 公司 日本煳陌o 公司 上海安亭科学仪器厂 北京电子化学设备厂 英国m s e 公司 美国，i k h n o l y i l e 公司 1 8 1r p m l l 6 4 0 培养基：取r p m 【1 6 4 0 干粉1 包溶于8 0 0 i l ：1 l 新鲜的 三蒸水中，充分搅拌溶解后，加入2 9n a h c 0 3 、3 9h e p e s ， 继续搅拌。待其完全溶解后，加三蒸水定容至1 0 0 0 m l ，用 0 2 2 啪滤膜过滤除菌，分装后4 保存。 1 8 2d m e m 培养基：取d 啪b m 干粉l 包溶于8 0 0 i i l l 新鲜的三蒸 水中，充分搅拌溶解后，加入2 9n a h c 0 3 、3 9h e p e s 、o 3 9 谷氨酰胺，继续搅拌。待其完全溶解后，加三蒸水定容至 1 0 0 0 1 l ，用o 2 2 啪滤膜过滤除菌，分装后4 保存。 注：本文所用培养基，除特别注明外，均含1 双抗、1 0 f c s 。 1 8 3 8 一a g 选择性培养基：取1 0 m l 无血清1 6 4 0 培养基，溶解8 a g 粉末，8 - a g 浓度为6 6 1 0 。3 m ，2 0 保存。在1 6 4 0 完全培 养基中按2 的使用浓度加入适量8 a g 储存液，配制选择 性培养基。 1 8 4 2 甲基纤维素半固体培养基：称取2 9 甲基纤维素，加5 0 m l 三蒸水溶解，高温高压灭菌后，4 电磁搅拌过夜。加入预先 配好的2 x d m e m 无血清培养基5 0 n 1 l ，拨动搅拌子，4 电 磁搅拌至完全混匀。 1 9 主要溶液 1 9 。1双抗储存液：4 0 0 m l 三蒸水经1 2 1 、3 0 m i n 高压灭菌后，溶 解4 0 0 万单位青霉素和4 0 0 万单位链霉素，振摇使其完全溶解 后，分装，- 2 0 保存。 1 9 2 细胞冻存液：4 0 的无血清培养基( r p m 1 6 4 0 或d m e m ) 、 5 0 f c s 、1 0 d m s 0 混匀。 1 9 - 30 1 5 mp h 7 4 磷酸盐缓冲液( p b s ) ：o 2 9 卿0 4 、2 9 9 n a 2 唧0 4 1 2 h 2 0 、8 9n a c l 、o 2 9k c l 溶于8 0 响l 蒸馏水 中，搅拌溶解后，加水定容至1 0 0 0 m l 。用5 n n a o h 调节p h 至7 4 。 1 9 4s i v 病毒裂解液：3 m 盐酸胍，o 0 1 mp h 8 0t r i s ，l ( v ，v ) 巯基乙醇。 1 9 5 e l i s a 所用溶液 1 9 5 1 包被缓冲液( 0 0 5 mp h 9 6 碳酸盐缓冲液) ：1 5 9 9n a 2 c 0 3 ， 2 9 3 9n a h c 0 3 ，加蒸馏水至1 0 0 0 m l 。 1 9 5 2 洗涤缓冲液：吸取0 5 l lt w e e n 一2 0 溶于1 0 0 0 m l0 1 5 mp h 7 4 融合前收集处于对数生长期的骨髓瘤细胞，1 0 0 0 印m 离心5 m i n ，弃 上清，用无血清培养基悬浮细胞进行计数。取( 1 2 ) 1 0 7 个细胞用 于融合，用无血清培养基洗涤细胞。 2 1 3 饲养细胞的准备 取一只健康的3 4 周龄b a l b c 小鼠，摘除眼球放血，拉颈处 死。小鼠用流水洗涤后，置于0 1 新洁而灭中浸泡5 r n i n 。按无菌操 作规程，剪开胸部皮肤，顺着胸骨两侧剪至腋下，打开胸腔，取出位 于心脏上方的胸腺置于平皿中。用注射器内芯加以研磨，加入5 m l 无血清培养基，以l o o 目铜网过滤。滤液转入离心管中，1 0 0 0 r d m 离 心5 m i n ，弃上清。加入1 m ld m b m 悬浮细胞。一只小鼠一般可取 1 0 8 个胸腺细胞。 2 1 4 免疫脾细胞的准备 冲击免疫后7 2 h ，摘除小鼠眼球放血，拉颈处死。血清留作阳性 对照。小鼠用流水洗涤后，置于o 1 新洁而灭中浸泡5 m i n 。按无菌 操作规程，打开腹腔取出脾脏，在小平皿中压碎研磨。加入5 m l 无 血清培养基，以l o o 目铜网过滤。收集滤液，离心计数，取1 1 0 8 个 细胞，离心弃上清，加入2 m ld m e m 悬浮细胞。 2 1 5 细胞融合 将准备好的骨髓瘤细胞和脾细胞转移至一个5 0 m l 离心管中，离 心，吸除上清，将细胞摇成松散的糊状。将离心管置于3 7 水浴中， 吸取1 瑚_ l p e g 溶液，慢慢加入细胞中，边加边搅，1 m i n 加完。静置 1 m i n ，再吸取1 0 m l 无血清d m e m 培养基，缓慢加入。边加边缓慢 搅拌，先慢后快，前2 i i l i n 加入2 m l ，后2 m i n 加入剩余的培养基， 以稀释p e g ，减少毒性作用。8 0 0 r p m 离心5 m i n ，吸除上清。将细胞 团摇散，加入少量d m e m ，随后依次缓慢加入1 0 m l 进口f c s 、准 备好的饲养细胞悬液、2 m l5 0 托坝以及2 5 m l2 甲基纤维素半固 体培养基，充分混匀后，均匀倒入2 0 个直径3 5 m m 的培养皿中。将 培养皿置于湿盒中，于5 c 0 23 7 培养箱进行培养，尽量避免晃动。 融合细胞在平皿中培养1 0 d 后，肉眼可见针尖大小的白色细胞克隆。 2 1 6 转移克隆 准备转移克隆的前一天，制备饲养细胞，配置含有2 0 f c s 、 2 1 0 6 个m l 胸腺细胞以及h t 的d m e m 选择性培养基。取9 6 孔培 养板，每孔加入2 0 0 u l 培养基。在解剖镜下，用加样器小心吸取平皿 中的克隆，转入9 6 孔板中继续培养。 2 1 7 阳性克隆的筛选 2 1 7 1s i v 抗原片的制备 将c e m x l 7 4 细胞培养至对数生长期，按1 0 t c i d 5 0 接种s i v 病 毒。当细胞出现融合病变至卅或+ + + + 时，收集细胞。p b s 洗涤后， 将感染s i v 病毒的c e m x l 7 4 细胞调至1 0 7 个细胞m l ，均匀涂于玻 片孔中，同时设正常c e ( 1 7 4 细胞孔对照。自然干燥后，4 冷丙 酮固定3 0 m i n ，即为抗原片，3 0 冻存备用。 2 1 7 2 克隆的检测 细胞克隆于9 6 孔板中培养两天后，开始筛选。挑选细胞生长超 过5 0 的孔，吸取培养上清，采用间接免疫荧光法( i f a ) 进行检测。 连续筛5 7 天，阳性克隆转移至2 4 孔板中改用含1 5 f c s 、不含饲 养细胞和h t 的d m e m 继续培养。对阳性孔反复测试3 次以上，保 留稳定分泌抗体的细胞株并编号。 i f a 法具体检测步骤： ( 1 )1 0 牛血清( p b s 稀释) 封闭抗原片，即用1 0 牛血清滴 加所有抗原孔，包括正常抗原孔和病毒抗原孔，滴加好的玻 片置于湿盒中，3 7 水浴孵育3 0 m i n 。 ( 2 )取出玻片，用p b s 洗3 遍，每次2 m i n 。 ( 3 )玻片晾干，将杂交瘤细胞培养上清倍比稀释后，滴加于s 抗 原片上。同时设阳性及阴性血清对照。玻片放湿盒内3 7 孵 育3 0 m i n 。 ( 4 )取出玻片，用p b s 洗3 遍，每次5 m i n ，其间轻轻震摇数次。 ( 5 ) 取出玻片晾干，滴加用o 0 0 5 ( i n v ) 伊文斯兰1 ：1 0 0 稀释 的f i t c 标记抗鼠i g g 抗体，放湿盒内3 7 再次孵育3 0 m i n 。 ( 6 ) 取出玻片，用p b s 漂洗3 遍，每次5 m i l l ，其问轻轻震摇数次。 ( 7 ) 玻片用蒸馏水漂洗l 遍后，5 0 甘油封片，荧光显微镜下观 察结果。 2 1 8 杂交瘤细胞的扩增和冻存 阳性克隆在2 4 孔板中继续培养，细胞大量扩增后，离心收集细 胞，加入l m l 冻存液，冻存于一7 0 超低温冰箱，次日转入1 9 6 液 氮中长期保存。对克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞及时冻存，以免因 细胞在传代过程中染色体丢失，丧失分泌抗体的能力而前功尽弃。对 2 0 杂交瘤细胞培养上清，采用间接免疫荧光法检测p 2 7 单抗同s r v - 1 、 s r v - 2 、s r v _ 5 、s 1 1 1 的交叉反应性，方法同2 1 7 。 2 2 4 2w e s t e mb l o t 分析 2 2 4 2 1s d s p a g e 蛋白电泳 采用t r i s 一甘氨酸一s d s p a g e 。使用不连续缓冲系统，分离胶浓 度为1 2 ，积层胶为5 。 具体步骤如下： ( 1 )安装干净的玻璃板，将分离胶灌入两层玻璃板中间的间隙中 至适当高度，在分离胶上覆盖一层去离子水，室温静置 4 0 m i n 。凝胶聚合后，倒掉去离子水，用纸巾吸干残存的液体。 ( 2 )小心插好梳子，将积层胶灌至分离胶上，排除气泡。待胶聚 合后取下梳子，将胶放入电泳槽，在上下槽中加入瞄s 甘氨 酸电泳缓冲液。 ( 3 )取1 0 u ls 总蛋白液，加入等体积的2 上样缓冲液，水浴 煮沸5 m i n 。将经变性处理的s i v 总蛋白和蛋白m a r k e r 上样 进行电泳，先以5 6 v 电泳至样品进入分离胶，再以1 0 8 v 电 泳至溴酚蓝刚泳出分离胶。 ( 4 )电泳结束后，从电泳装置上卸下玻璃板，小心撬开，取出凝 胶。将凝胶浸于考马斯亮兰染色液中，在摇床上室温染色1 2 h 。移出染液，加入脱色液，脱色2 3 h ，其间更换脱色液3 4 次，脱色至背景干净，条带清晰。 2 2 4 2 2w b s t e mb 1 0 t ( 1 )s i v 总蛋白经s d s p f 迢电泳后，得到已电泳的凝胶块。剪 下一块与凝胶大小相同的硝酸纤维素膜( n c 膜) 和6 张厚滤 纸，在转膜缓冲液中浸泡1 5 m i n 。将凝胶与n c 膜贴紧放在 滤纸中间，排除气泡，再将滤纸两侧各放一块海绵及塑料板， 夹紧放入电转槽中，n c 膜的一侧朝向负极。在电转槽中加入 转膜缓冲液，恒压1 0 v 室温电转1 6 2 2 h 。 ( 2 )转膜结束后，取出n c 膜，将膜用丽春红染液染色1 0 m i n ， 然后用蒸馏水脱色，直到出现清晰的红色蛋白条带。切下蛋 白m 列( e r 晾干保存，按泳道将n c 膜剪成窄条。 ( 3 )将n c 膜窄条装入杂交袋中，根据n c 膜面积以0 1 m l c m 2 的量加入封闭液，室温l h 或4 过夜。弃去封闭液，用t b s 厂r 洗涤3 遍，每次1 x 抗，用t b s t 洗涤3 遍，每次1 0 m i n 。 ( 6 )将经漂洗的n c 膜移至一浅托盘中，按n c 膜面积以 o 1 2 5 m l c m 2 的量加入底物液，室温轻轻摇动作用5 1 0 m i n 显色。弃底物液，用蒸馏水漂洗1 遍，晾干保存。 2 2 5 抗体识别表位分析啪3 2 2 5 1 杂交瘤细胞株腹水饱和浓度的测定 ( 1 )采用棋盘滴定法确定抗原包被浓度和酶标二抗的使用浓度。 ( 2 ) 包被：用缓冲液将s 总蛋白稀释至2 5 呲加入酶标板中， 每孔1 0 0 u l ，置于湿盒中4 2 曲。甩掉包被液，每孔加入洗 液2 0 0 u l ，在震荡器上震荡洗涤3 次，2 m 耐次。 ( 3 )封闭：每孔加入含2 b s a 的p b s1 5 0 u l ，置于湿盒中4 过夜或3 7 2 h 。洗涤同上。 ( 4 )加待测样品：将腹水倍比稀释，每孔加入1 0 0 u l ，置于湿盒 中3 7 孵育1 h 。洗涤同上。 ( 5 ) 加酶标二抗：将 强标记的羊抗小鼠i g g1 ：5 0 0 0 稀释，每孔 加入1 0 0 u l ，置于湿盒中3 7 孵育l h 。洗涤同上。 ( 6 )显色；每孔加入1 0 呲n 位底物液，置于湿盒中3 7 孵育1 5 3 0 l n i l l 。 ( 7 )终止：每孔加入5 0 u l2 m h 2 s 0 4 终止反应。 ( 8 ) 判定结果：酶标仪4 5 0 、6 3 0 砌双波长测定0 d 值，凡晰 2 1 为阳性( p n = 待测孔o d 值阴性对照o d 值) 。当腹水 浓度增加而o d 值变化不大的最低浓度即为饱和浓度。 2 2 5 2 位点相加实验 抗原包被过夜、封闭后，将待测m c a b s 两两配对，每组做3 孔。 前2 孔分别以5 0 饱和度加入m c a b l 、m c a b 2 ，每孔加1 0 0 u l ，其 值分别记录为a 1 、a 2 。第3 孔先以5 0 饱和度加入第一种m c a b ， 每孔加1 0 0 u l ，3 7 孵育1 h ；洗涤后再加入第二种m c a b ，每孔加 1 0 0 u l ，3 7 再孵育1 h ，其值记录为a l + 2 。根据公式a i = ( 2 a 1 + 2 a l + a 2 一1 ) 1 0 0 判定结果。如果a i 5 0 ，提示两株单抗识 别不同的抗原表位；反之，则认为两株单抗识别相同的抗原表位。 2 2 6 阳性杂交瘤细胞染色体核型分析 ( 1 )将阳性杂交瘤细胞培养至对数生长期，细胞单层，长势良好。 ( 2 )弃旧培养基，加入含秋水仙碱的d m e m ，3 7 继续培养1 0 h 。 秋水仙碱终浓度为o 6 u 幽n l 。 ( 3 ) 水平摇动细胞培养瓶，脱落细胞收集于1 5 m l 离心管，1 0 0 0 r p m 离心l o m i n 。 ( 4 )吸除上清，加入预温到3 7 的o 0 7 5 mk c l 溶液，3 7 温箱 中静置2 0 3 0 m i n 。 ( 5 )在悬液中加入l m l 新鲜的冰醋酸：甲醇( 1 ：3 ) 固定液，吹打 混匀。 ( 6 ) 1 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，吸除上清，加入1 0 m l 冰醋酸：甲醇固 定液，吹打混匀，3 7 温箱中静置1 5 2 0 m i n 。1 0 0 0 r p m 离 心1 0 m i n ，吸除大部分上清，余0 5 1 m l ，吹打混匀。 ( 7 ) 取出预冷的载玻片，将一滴细胞液自高处滴落在玻片中央， 自然干燥。 ( 8 )用g i e m s a 染液( g i e m s a 原液：p b s 为l ：9 ) 染色1 0 m i n ，水洗， 自然干燥。镜下观察有效细胞5 0 个，进行染色体计数。 结果 1s i v 全病毒裂解蛋白的制备 将s i v 病毒进行体外扩增，共收集病毒液8 2 0 h l l 。超离后浓缩 至8 2 n 1 l ，实时荧光定量p c r 测定病毒载量为6 1 0 7 拷贝，札。病毒 裂解后，b r a d f o r d 法测定蛋白浓度。l ：l o 稀释的s i v 蛋白液吸光度为 0 3 7 9 ，根据标准曲线计算得s i v 总蛋白浓度为4 2 1 m g m l 。 表1 不同浓度b s a 在5 蛄n m 处的吸光度 t 抽1 o p 廿c a id e n s i 触o fd n u t e db s a s t 叠n d a r d sa t5 蜡n m 重o l o 盛o 蜊0 芸o 蝥 oo 5 11 52 2 5 b s a 浓度( m g m 1 ) 图1b s a 在5 9 5 n m 处的标准曲线 f i g 1 t h es t a n d a r dc u r v eo fb s aa t5 9 s n m 2 8 2 杂交瘤细胞系的建立 2 1 动物免疫 以纯化的s i v p 2 7 重组蛋白免疫2 只b a l b c 小鼠，加强免疫后 小鼠血清抗体效价i f a 结果见表1 。从i f a 结果看，鼠2 抗体效价高 于鼠1 ，故选择鼠2 进行冲击免疫，并取其脾细胞进行细胞融合。 表2 免疫小鼠的血清抗体效价 t a b 2a n t i s e r at i t e r so fi 衄u n i z i e d 皿i c eb yi f a 2 2 阳性克隆的筛选 融合后共获得2 7 8 个克隆，其中阳性克隆5 9 个，阳性率为 2 1 2 2 。一部分阳性杂交瘤细胞在扩增培养的过程中抗体检测转为阴 性。经体外连续培养并进行抗体效价检测后，保留4 株杂交瘤细胞株， 分别命名为l c 3 、2 8 6 、2 e 1 2 、3 g 3 。这4 株单抗体外连续培养3 个 月，液氮冻存复苏后，仍生长良好，能稳定分泌抗体，且抗体效价无 明显降低。 3 单克隆抗体的鉴定 3 1 i g 类别和亚类 经检测，l c 3 、2 8 6 为i g g l 类，2 e 1 2 为i g g 2 b 类，3 g 3 为i g g 2 a 类。 3 2 抗体亲和力测定 3 4 2 位点相加实验 位点相加实验表明2e 1 2 与3 g 3 的m = 5 2 4 0 5 0 ，因此认 为2e 1 2 与3 g 3 识别不同的抗原表位。 表4 位点相加实验结果 堡垒：! ! 墅堡! 堂! ! 垦三! ! 坠! 坚堕堕塑塑! 腹水稀释度4 5 0 砌测定值 理论值 灿( ) l c 31 ：5 0 2 e 1 2 1 ：5 0 2 8 6l ：1 0 0 3 g 3l ：8 0 0 l c 31 ：5 0 + 2 e 1 21 ：5 0 1 c 31 ：5 0 + 2 8 61 ：1 0 0 1 c 31 ：5 0 + 3 g 31 ：8 0 0 2 e 1 21 ：5 0 + 2 8 6l ：1 0 0 2 e 1 21 ：5 0 + 3 g 31 ：8 0 0 o 4 7 1 0 5 0 3 1 0 4 3 1 1 6 1 0 6 5 7 0 9 4 4 1 1 9 5 1 0 5 6 1 2 6 8 o 9 7 4 1 5 1 4 1 6 3 2 1 5 4 6 1 6 6 4 3 4 9 l 2 4 7 0 4 6 4 5 3 6 6 1 5 2 4 0 1 墅! ! ! ! 垒j 箜! i ! ! 垒! ：兰! ! ! ：呈! 兰! ! ：! 1 3 5 染色体核型分析 对4 株杂交瘤细胞株各选择染色体分散好，无重叠的5 0 个细胞 进行观察并计数。结果见表5 。l o o 油镜下观察，杂交瘤细胞染色体 大多为端着丝点染色体，极少数为中部或亚中部着丝点染色体。见图 5 。 表s 杂交瘤细胞株染色体计数 t 曲5c h m m o m en u m b e 瑙o f f o u rs t 瞪i h y b d o m ac e i l s 细胞 例数 染色体均数标准差 1 c 3 5 0 1 0 32 5 6 2 8 6 5 0 9 7 2 e 1 25 0 9 6 3 4 2 1 8 7 3 g 3 5 01 0 1 3 6 4 图5 杂交瘤细胞3 g 3 的染色体核型 f i g 5 t h ec h m m 憾o m a im o r p h o i o g yo f 伯eh y b r 试o m a3 g 3 讨论 单克隆抗体是指由单个克隆细胞产生的抗体分子。b 啪e t 的抗体 选择学说认为，每个b 淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特 异性抗原决定簇的抗体，从一个祖先b 细胞分裂增殖而形成的纯细 胞系称为克隆。来自克隆系的细胞基因是完全相同的，产生的抗体也 完全相同。这些分子在结构、抗原识别特异性、与抗原的亲和力等特 性方面都完全一样。自抗原抗体反应的特异性被识别以来，制备均一 的、针对特定抗原决定簇的抗体的尝试就从未间断过。1 9 7 5 年，k o h l e r 和m i l s t e i n 利用小鼠骨髓瘤细胞p 3 - x 6 3 a g 与绵羊红细胞免疫的小鼠 脾细胞进行融合，成功地创立了杂交瘤技术，为制备特异性抗体提供 了全新的手段。这一技术的问世，在医学生物学领域产生了重大的影 响，被广泛应用于免疫学、微生物学、肿瘤学等各个研究领域。近年 来，单克隆抗体技术取得了巨大的进展，又相继发展了基因重组嵌和 抗体技术、噬菌体展示以及转基因动物制备人源性抗体技术。但到目 4 前为止，技术最完善，应用最广泛的还是小鼠，j 、鼠b 淋巴细胞杂交 瘤技术。本研究所需制备的单克隆抗体仅用于体外诊断，不存在主要 组织相容性抗原和超敏反应问题，故仍采用成熟的小鼠一小鼠b 淋巴 细胞杂交瘤技术。 正确选择免疫原和免疫程序是制备高亲和力高特异性单克隆抗 体的基础。就免疫原而言，影响免疫效果的因素主要有2 个方面：一 是抗原的特点，一般来说颗粒性抗原比可溶性抗原免疫效果好，天然 抗原比重组表达抗原免疫效果好；二是抗原的分子量，对于可溶性抗 原，分子量大的抗原( 5 万以上) 容易产生好的免疫效果，分子量小 的抗原( 2 4 万) 较难产生好的免疫效果。但是为了提高杂交瘤细胞 株的筛选效率，减少非特异性克隆的产生，我们还是选择了以重组 s i v p 2 7 蛋白免疫纯系b a l b c 小鼠。p 2 7 蛋白分子量较小，仅为2 7 k d ， 因此初次免疫时，我们用弗氏完全佐剂乳化p 2 7 蛋白，加强免疫时， 用弗氏不完全佐剂乳化p 2 7 蛋白。通过佐剂的使用，减慢抗原的降解， 使抗原在免疫部位缓慢持久地释放，同时活化巨噬细胞，促进巨噬细 胞与b 淋巴细胞、t 淋巴细胞的相互作用，以加强免疫效应。经过先 后5 次的免疫，小鼠血清效价达到较高水平，取其脾细胞与本身不分 泌免疫球蛋白的骨髓瘤细胞s p 2 o 进行融合。 阳性克隆经检测筛选，最终保留4 株能稳定分泌抗p 2 7 蛋白单克 隆抗体的杂交瘤细胞。正常小鼠脾细胞的染色体数目为4 0 ，s p 2 o 骨 髓瘤细胞的染色体数目为6 2 6 8 ，两者所生成的杂交瘤细胞染色体数 目应接近亲本细胞染色体之和。4 株杂交瘤细 1 0 3 不等，从一个侧面说明融合是成功的，4 株细胞确为杂交瘤细胞。 4 株杂交瘤细胞经连续传代三个月和反复冻融后，分泌抗体的能力变 化不大，抗体效价无明显降低，也表明细胞融合得比较成功，杂交瘤 细胞株很稳定。 s i v 、s r v 、s 1 i 同属猴逆转录病毒，结构蛋白中均包括一个 2 7 k d 的衣壳蛋白p 2 7 ，因此在对单抗特异性进行分析时，采用了间 接免疫荧光法检测s i vp 2 7 单抗与s r v 、s t l v 的交叉反应性。在筛 选过程中我们发现单抗l c 5 与s t l v 1 有交叉反应。文献n 3 报道，在 各种反转录病毒之间，在c a 中有一段长约2 0 个氨基酸残基的高度 保守区域，称为主要同源区。针对主要同源区的抗体可与大多数反转 录病毒反应。因此我们认为1 c 5 与s t 【肛1 发生交叉反应，是由其针 对的抗原表位所决定的，它识别的抗原表位可能为反转录病毒的主要 同源区。此外，文献报道，v _ 1 、m v - 2 和s i v 的核心蛋白有血清 学交叉反应，因此我们还采用了w 色s t e mb l o t 方法进行检测分析，实 验结果表明保留的4 株单抗中2 8 6 、2 e 1 2 与 vp 2 4 蛋白有交叉反 应。 单克隆抗体的大量制备主要有两种方法：体外培养和动物体内诱 生。由于单克隆抗体的产量只与细胞密度和细胞存活时间有关，故体 外培养获得的单克隆抗体量极为有限，抗体含量仅为1 0 5 0 u 卧n l n 。因此我们将杂交瘤细胞接种到组织