（分析化学专业论文）纳米电极的制备及其在快速检测水体中大肠杆菌的电分析化学研究.pdf

学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名；辑之晕 日期 枷饥t ，晦 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名：宿埠 导师签名：弓坎丈 日期：团皇：l 篁日期：至塾女：1 萝 纳米电极的制各及其在快速检测水体中大肠杆菌的电分析化学研究摘要 纳米电极的制备及其在快速检测水体中 大肠杆菌的电分析化学研究 摘要 水体中微生物的检测，特别是致病性细菌的检测在疾病预防、控制传染病以 及保障人民身体健康方面具有十分重要的意义。大肠杆菌是一种寄居在人和动物 肠道上的最常见菌群。然而，当大肠杆菌侵入肠道外的其他器官或组织时，可引 起如尿道炎、膀胱炎、胆囊炎、阑尾炎等疾病；婴儿、老人或免疫功能下降的病 人，大肠杆菌感染可引起败血症( 导致高达3 0 的死亡率) 。另外，大肠杆菌还 可引起人类腹泻，造成大面积食物中毒。因此，大肠杆菌已经成为食品安全、公 共卫生、环境保护和临床医药化学等领域中的重要检测对象。 对大肠杆菌的检测常采用美国公共卫生协会、美国f d a 或a o a c 规定的传 统方法，主要包括多管发酵法、平板计数法和显微直接计数法等。但是这些方 法存在着检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点。如多管发酵法根据大 肠杆菌能发酵乳糖产酸、产c 0 ：的特性，利用含乳糖培养基培养不同稀释度的 大肠杆菌水样，经初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个检验步骤，操作过 程复杂，耗时7 2h 以上，很难满足快速检测大肠杆菌的需要。因此，发展快速、 简单的大肠杆菌检测方法已经成为众多科学家所面临的巨大挑战。目前，专家 和学者已经发展了一些新方法来实现对大肠杆菌的快速检测，包括荧光和化学 发光法、免疫分析法、电分析化学方法。 虽然发展的新方法大大提高了检测大肠杆菌的速度，缩短检测时间到几个小 时以内，但是却往往牺牲了检测的选择性和灵敏度，如有的方法不能检测浓度低 于1 o 1 0 6c f u m l 的大肠杆菌。而目前使用较多的免疫法提高了选择性，也提 高了灵敏度，但是却增加了检测的操作难度，增加了检测的成本。因此，发展快 速、灵敏、高选择性的检测大肠杆菌的方法成为众多科学家和学者的一大挑战， 也激发了广大科学工作者的热情，世界各国和地区的科研工作者正在展开广泛的 研究。 目前，纳米材料的所具有的电、磁、光、热等方面的许多优异特性使其在电 纳米电极的制备及其在快速检测水体中大肠杆菌的电分析化学研究摘要 分析化学中的应用越来越广泛。我们利用纳米技术先后制备了一系列纳米修饰电 极，包括纳米二氧化锡电极、酶修饰纳米氧化铟电极纳米铋修饰玻碳电极，应 用这些电极实现对水体中大肠杆菌的快速检测，检测时间都在几个小时以内，最 低检测限可以达到1 0 0c f u m l 。另外，我们还采用电分析化学、光度分析方法 研究了铜、不锈钢材料对细菌的抗菌生物效应，希望能够寻找一种广谱抗菌的方 法。因此，我们做了以下几个方面的研究： 1 纳米二氧化锡电极的制各及其用于水体中大肠杆菌的快速计数研究。 制备了新型纳米二氧化锡电极，用该电极作为工作电极，采用计时电流法对 水体中大肠杆菌进行了快速计数研究。由于水在纳米二氧化锡电极表面电解产生 的o h 能够引起大肠杆菌细胞膜脂质过氧化，从而在电极上产生氧化电流，根 据氧化电流变化与大肠杆菌数量的关系，对大肠杆菌进行快速计数，检测下限可 达1 1 0 3c e l l s m l _ 1 。通过大肠杆菌脂质过氧化后丙二醛含量的检测，本文也 对大肠杆菌在纳米二氧化锡电极上的电化学响应机理进行了初步的探讨。 2 基于分子自组装的双酶传感器快速计数大肠杆菌的研究。 采用3 氨基丙基三乙氧基硅烷【( 3 一a m i i l o p m p y l ) t r i e t h o x y s i 】a n e ，a p t e s 】分子 在铟锡氧化物电极( r r o 电极) 上的自组装，通过戊二醛形成席夫碱，将多元 酚氧化酶( 1 a c c a s e ) 和辣根过氧化酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) 化学键合在 r r o 电极上，制成双酶传感器。该传感器检测多元酚时具有较高的灵敏度和较 低的检测限。由于大肠杆菌在含水杨酸的培养液中代谢时能够产生多元酚( 主要 为2 ，5 二羟基苯甲酸，2 ，5 一d i h y d r o x y b e n z o i ca c i d ( 2 ，5 - d h b a ) ) ，且产生的多元 酚量与大肠杆菌数量成正比。因此，我们以双酶传感器为工作电极，采用计时电 流法实现了对大肠杆菌的快速计数，所花时间仅需要3h 。该方法检测大肠杆菌 的线性范围为1 6 1 0 3 1 o 1 0 7c e l l s m l ，检测限为9 7 1 0 2c e l l s m l 。 3 基于b i 纳米薄层修饰玻碳电极流动注射安培分析快速检测水体中大肠杆菌的 研究。 将b i 纳米薄层修饰电极用于流动注射分析中来快速检测大肠杆菌。在脱氧 2 纳米电极的制各及其在快速检测水体中太肠杆菌的电分析化学研究摘要 胆酸钠( d o c ) 培养基中，大肠杆菌被甲基葡萄糖醛酸钠( m e t h y l b d 一西u c u m n i d e s o d i u m ，m e t g l u ) 诱导，在细菌体内产生特异性葡萄糖醛酸酶( b d 醇u c u r o n i d a s e ) 。 通过膜渗透剂p o l y i n y x i nbn o n a p e p t i d eh y 出o c h l o r i d c 口b n ) 和溶菌酶l y s o z y m e 对大肠杆菌细胞膜的作用，葡萄糖醛酸酶从大肠杆菌细胞中释放出来。当在培养 液中加入底物p n i t r o p h e n y lb 。d 一尊u c u r o n i d e ( p n p g ) 时，葡萄糖醛酸酶能够催 化分解p n p g 而产生4 一硝基酚，而4 硝基酚的量与溶液中大肠杆菌的数量成正 比关系。为了提高检测4 硝基酚的灵敏度，利用电沉积的方法制备了b i 纳米薄 层修饰电极，此电极具有高的氢过电位，好的电催化活性，能够较灵敏地检测 4 ，硝基酚。由于4 硝基酚在电极上的响应电流与大肠杆菌浓度成正比，因此，我 们将b i 纳米薄层修饰电极用于流动注射安培分析系统，实现了对大肠杆菌的快 速检测。本文研究方法检测大肠杆菌浓度范围从1 5 1 0 2 到1 0 1 0 6c f i l 细l ， 其检测限为1 0 0 c f l l m l ，总的分析时间为3h 。 4 铜和不锈钢材料抗菌生物效应的研究 采用电分析化学方法、光度分析方法研究了铜和不锈钢材料抗菌的生物效 应。以大肠杆菌和发光细菌为例，不锈钢材料对它们几乎没有抗菌生物效应，但 是铜材料对它们只需作用o 5h ，细菌死亡数量则可达到9 0 以上。该结果在医 药卫生消毒、罐装食品的封装及饮用水的管道输送等方面有着重要的意义。 关键词：大肠杆菌，纳米二氧化锡电极，酶修饰纳米氧化铟电极，纳米铋修饰玻 碳电极，快速检测，抗菌生物效应 3 a b s h a d p r e p a r a t i o no fn a n o - m e t e re l e c t r o d ea n di t sa p p l i c a t i o n f o rf a s td e t e c t i o no f e 譬c 矗p ，缸危蛔c o 魔i nw a t e r a b s t r a c t 西西盯f 幽缸c d 豇 但c o 豇) i st h em o s t t h o r o u g h l yc o m m o ni n t e s t i n a l m i c r o o 唱a n i s m s o m es t r a i n so fe c d 豇a r et h ed a n g e m u sp a t h o g e n s 锄dc a l lc a u s e h 啪a nd i s e a s e ss u c ha st r a v e l e r sd i a r r h e a i n f c c t i o n sd u et op a t h o g c i l i ce c 0 矗m a y a l s od i s s e m i n a t et h r o u g h o u tt h eb o d y ，a n dh a v eb e e i n l p l i c a t e di n u r i n a r yt r a c t i n f c c t i o n ，s 印s i s m e l l i n 百t i sa dg a s t m i n t e s t i n a l i n f e c t i o n s 1 1 la d d i t i o n ，p a t h o g e n i ce 打r e m a i n sam a j o rc a u s eo fi n f a n td i a h e ai ns o m er e g i o n sa dc o u n t r i e s ，w i t h r e c e n to u t b r e a k sr e p o r t i n gam o r t a 【i t yr a t eo f3 0 hm a n yc o u n t f i e s ，h e a l t h d e p a n m e n t sr o u t i n e l yd e t e c te c d 跖d e n s “yi nw a t e ro rf o o db e c a u s ee c d f c o n v e y s t h ep o t e m i a lp r e s e n c eo fp a t h o g c n s 田l er a p i da n ds c n s i t i v ed e t e c t i o no fe c d 豇i s e s s e n t i a lj nt h ef i e l do ff o o d i n d u s 仃y p u b l i ch e a l t h ，c l i n i c a ld i a g n o s i sa n d e n v i m n m e t a lm 砌t o r j g ( 、u r r e n tc o n v e n t i o n a lm e t h o d sf o r d e t e c t i i l ge c d 矗i n 、帕l v em u h i p l e t u b e f e 蛳e n t a t i o n ( m 1 日，m e m b r a n ef j l t e t ( m f ) ，p l a t ec o l m tm e m o d t h o u g ht h e s e m e t l l o d sh a v et h ea d v 肌t a g eo fh i g ha c c u r a 哆t l l e ya r et y p i c a l l yt j m e - c 衄s u m i n ga n d i a b o ri n t e n s i v e b o t hm r fa n dm ft e c h n i q u e sn c e dv e n i f i c a t i o n o ff i r s t _ s t 印 p r c s u m p t i v ep o s “i v c sa n dc o 对h m e dt e s t s ，a n dt h ec o m p l e t et e s t i n gp r o c e s sm a y r e q u i r ef r o m2t o4d a y s 耵l ec o u mo fm i c r o b i a lc o l o n yo nt h ep l a t em e d i u mi sa l s o w i d d yu s e dm e t h o d ，b u ti t su s u a li n c u b a t i o np e r i o di st o o1 0 n g ( 1 胁2 4t o4 8h ) 1 血e r e f o r c ，t h et i m e - c o n s u m i n gm a k e st h e s ec o n y e n t i o n a lm e t h o d su n s u i t a b l ef o ru s e i na ni n d u s t r y b a s e dl a b o r a t o r y a sar e s u l t ，an u m b e ro fm o r er a p j dm c t h o d sh a v e b e e nd w e l o p e df o rt l l ed e t e c t i o no f e 印矗，i n d u d i n go p t i c a ld e t e c t i o n ，i m m u n o a s s a y s a n de l e c t r o c h e m i c a lm e t l l o d s n o u g hn e wm e 也o d ss h o r t e n e d t h et i m ef o r 也ed e t e c t i o no fe c o ! ，t h c s e l e c t i v i t ya n dd e t e c t i o n1 i m “a r cp o o lf e x a m p l e ，s o m em e 也o d sc o u l dn o td e t e c t r e a le c o f fs 咖d l ew h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fe “i s1 e s sm a i l1 o 1 栌c f l l ，m l i m m u n o b j o s e n s o r s ，w h j c bh a v ea t t r a c t e dg r e a j n e f e s sb e c a u s eo ft 1 1 e i p 删i s i l l g 4 a b s l m c l a p p l i c a t i o nj nv a r i o u sa r e a s ，h a v eo b v i o u s l yi m p r o v e dm es e l e c t i v i t ya i i dd e t e c t i o n l i m i tf o rt h ed e t e d i o no fe c 。“b u ti m m u n o b i o s e n s o r sa r ee x p e n s i v ea n do p e r a t o c o m p l e x i t y t h e i e f o r e ，t h ef a s t ，s e 璐i t i v ea n ds 商p l ed e t e c t i o no fe c d f ld e n s i t y i e m a j i l sac h a l l e n g et om a ys c j 曲t i s t sa n de n 西n e e r s i nr e c e my e a r s ，锄。加a t c r i a l sh a v ep l a y e da ni l i l p o n a n tr o l ei n 出ef i e l do f e l e c 仃0 a i i a l y t j a c a lc h e m i s 仃yb e c a u s en a l l o - m a t e r i a l sh a v ea d v a i l t a g e so f b i gs u r f a c e a r e aa n de l e c 仃o c h e m i c a lc a t a l ”i ca c t i v i t y w ep r c p a r e dn a i l o - m a t e r i a l e l e c 仃o d e ， i n c l u d i n gt h en a n o s n 0 2e l e c t f o d e ，b i e n z y m e m o d i f i e d e l e c t r o d e ， b i s m u t h n a n o s t m c t u r cf i l i i lm o d i f i e 百a s s yc a r b o ne l e d r o d e ( b i n f e ) ，a i l da p p l i e dt h e mt o d e t e 咖抽et h ec o n c e n t r a t i o no fe 印疗w 色s u c c e e d e di n d e t e c t i ge c 0 疗，t h e d e t e c t i o nl i m i tr e a c h e dt o1 0 0c f u m lw i m i ns e v e r a lh o u r s i na d d i t i o n t h e e l e d i o a n a l y s i s ，s p e c t r o p h o t o m e t r yw c r e u s e dt os t u d ym ea m i b a c t e r i a i a b i l i t y o f c o p p e ra n ds t a i n l e s ss t e e l t h ed i s s e n a t i o ni n d u d e sf o u rs c c t i o s p a r t1 p r e p a r a t i o no fn a n o - s n 0 2e l e c t r o d ea n di t sa p p l i c a t i o nf o rf a s t d e t e c t 主o no fe c o 髓i nw a t e r a n o v e ln a n o s 0 2c l e c t r o d ew a sf a b r i c a t e da n da p p h e dt ot h ef a s tc o u n t i i l go f e 雎i w a t e lb yc l l f o n o a m p e r o m e t r y t l l en 卸o - s n 0 2e l e c t r o d ew a su s e da s b i o e l e c t r o c h e r n j c a ls e n rt oc o u n tf a s t l ye c d 如w i t h 血ec h a m d e ro fs i m p l eo p e r a t i o n a i l d h i 曲s e n s i t i v 蚵t h r o u 曲a s s a y i n g t l l em d ac o t e n to fe 脚hs o l u t i o ns u 鼢f r o m e l e c t r o c h e m i c a lo x i d a t i o nj nt b ee l e c t f o l y t e ，w ei i e s t g a t e dt l l eo x i d a t i o nm e c h a i d s m o f e no nn a n o s n 0 2e l e c 竹o d ea l l do b t a i n e ds a t i s f a c t o r yr e s l l l t s i a r t2 as e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e r l b a s e db i e n z y m eb i o s e n s o rf o r r a p i dd e t e c t i o no f 丑套c 矗p ，伽缸c d 矗d e n s i t y 1 1 1t h i s s t u d y ， as e l f - a s s e m b l e d m o n o l a y e r - b a s e db i e n z y m eb i o s e n s o rw a s 5 p r e p a r e df o rt l l ed e t e d i o no fe 距d e s i t y t h e1 a c c a s ea n dh r pw e r ei n 蚰o b i l i z e d o nt h ei t oe l e d r o d es u r f a c et h r o u 曲s e l f _ a s s e m b l e dm o n o l a y e ro f ( 3 - a m i n o p r o p y l ) t r i e t h o x y s i l a i l e n eb i e n z 胂eb i o s e n s o r i m p r o v e d m ed e t e c t i o nl i m i ti i l d e t e m i l l a t i o no fp o l y p h e n o l i c c o m p o u n d s ， 越dh a ss u f e i c i e n t s 锄s i t i v i t y a n d s p e d a l i t yt op o l y p h e n o l i cc o m p o u n d smt h en 柚。一m o lc o n c c n t r a t i o nr a i l g c b a s e do n as u b s t r a t e r e c y c l i n go fp o l y p h e o l i cc o m p o u n d sd r i v e nb yb i c n z y m e c a t a l y z e d o x i d a t i o na n dc h 哪i c a ir e d l l c t i o no fq u i n o n e s ， t b eb i e z y m eb i o s e n s o rc o u l d d e t e m i n a t em et r a c ep o l y p h e n 0 1 i cc o m p o u n d se f c c c t i v e l yi i l 豇s 0 1 u t i o n s i n c e t h c 嘲o u mo fp o l y p h c n o l i cc o m p o u n d s ，p r o d u c e d 劬ms ai nt h em i c r o b i a lm e t a b o l i c p a t h w a y ，i sd e p e n d e mu p o nt h eb a c t e r i ad c n s i t y ，t h eb i e n z y m eb i o s c n s o rc o u l db e a p p l i e dt od e t c e te c d f fd e n s i t ya f t e re c o ns o l u t i o nw a s 抽c u b a t e df o r2 _ 5h b y c h r o n o 锄p e 啪e t 彤 t h ea m p l i f i e df e s p o n s ec u r r e n to b t a i l l e da tm eb i e n z y m e b i o s e n s o rw a sl i i l e a rw i t ht h ev a r i a t i o no fe c 0 ，fd e n s i t yr a 芏l 百n gf m m1 6 1 0 jt 0 1 o 1 0 7c e l l s m ka n dt l l ed e t e c t i o nl i m i tw a s9 7 x 1 0 2c e l l s m l p a r t3 f l o wi n j e c t i o na a l y s i s a m p e r o m e t r i c d e t e c t i o no f e 譬c e 门c 忍妇c d 盯u s i gab i s i 叫t hn o s t n l c t u r ef i i mm o d i 6 e d g l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e h lt l l i s p a p e r ，t h e n o wi n j e 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e n y l 8 一d - g l u c u r o n i d e ( p n p g ) t op m d u c e4 - n i t r o p h e n 0 1 田l eq u a l l t i t yo f4 _ 矗r o p h e n o jw a s 6 a b s t r a d p r o p o r t i o n a lt oc o n c c n t r a t i o no fe c 0 2 f t h eb i s m u t hn a n o s t r i l c t u r ef i l mm o d i f i e d 9 1 a s s y c a r b o ne l e c t r o d e 圆i n f e ) w a sf a b r i c a t e d f o ru s ej nf l o wi n j e c t i o n a m p e r o m e t r i cd e t e c t i o n o f 4 - n i t r o p h e n 0 1 t h ea m p f i e d c a t h o d i cc u r r e n to f 4 一n i t m p h e n o lo b t a i n e da tt h eb i n f ei nf l o wi i l j e c t i o na l l a i y s i ss y s t e mw 髂l i n e a rw i t h m ec o n c c n 仃a t i o no fe c d 矗砌酉n g 丘o m1 5 1 0 2t o1 0 1 0 6c f i i m la n dt h e d e t e c t i o nl i m i tw a s1 0 0c f u m lt h e c o m p l e t ea 1 1 a l y s i sf o re c d 厅r e q u i r c d3h p a r t4 s t u d yo na n t i b a c t e a la b i l i t yc o m p a r i s o no fc o p p e ra n d s t a i n l e s ss t e e l i i lt h i sp a p e r t h ee l e c t r o a n a l y s i s ，s p e c t m p h o t o m e 扛yw e r eu s e dt 0 s t u d yt h e a n t i b a c t e r i a la b i l i t yo fc o p p e ra n ds t a i l l l e s ss t e e l t o o k 西吐盯f 曲如c d z fa n d l u m i n e s c e n tb a c t e r i af o re x a m p l e s ，t h e 柚t i b a c t c 【i a le f f e c t so fs t a i l l l e s ss t e e lo n b a c t e r i aw e r ev e r yw e a l 【，b u tt h ek m i i l gr a t eo fb a c t e r i ae x p o s e dt om e t a lc o p p e rf o r 3 0 】【1 1 i nw a so v e r9 0 t h ea n t i b a c t e r i a la b i l i t yo fc o p p e rm a yb ep o t e n t i a la p p l 妇t i o n t ot l l ef i e i do fs a m t a t i 叫d i s i n f e c t i o n ，f o o dp a c l d n ga n dm ec o n v e y a n c eo fd r i n 虹n g w a t e l k e y w o r d s ：盈如e r 耙i | l 妊c d 菇，a n o s n 0 2e l e d r o d e ，b i c n z y m eb j o s e n s o r ，b i s m u t h n a n o s t n l c t u r ef i l mm o d i f i e dg l a s s yc a r b o ne l e c 仰d e ，f a s tf c t e c t i o n ，a i l t i b a c t e r i a l a b i l i t y 7 第一章绪论 第一章绪论 水体中微生物的检测，特别是致病性细菌的检测在疾病预防、控制传染病以 及保障人民身体健康方面具有十分重要的意义。水体中致病性细菌严重威胁着人 类的健康，单就致病性大肠杆菌而言，根据报道，全球每年感染至少导致6 5 亿 人发病，并引起约8 0 万5 岁以下的儿童死亡，在我国不少地区大肠杆菌在腹泻 病人的病原谱中也占首位【1 。引。因此存在于溪流、河水、湖泊等与人类生活密切 相关的环境中的大肠杆菌数量己经成为反映水体或环境被污染的一个重要指标。 随着社会经济的发展和环境污染问题的突出，美国、欧洲、日本等一些国家和地 区先后制订了水体中细菌总数和大肠菌群指标条例，条例包括细菌的污染控制目 标及污染公共制度，细菌的检测，卫生调查、条例实施计划等内容，我国也在1 9 9 7 年5 月建立了大肠杆菌检测网络，这些措旋的实施对人体健康和社会经济发展的 作用日益受到人们的重视并成为关注的热点嘲。因此，建立水体中大肠杆菌的快 速检测方法，成为环境保护、饮水卫生、食品卫生和流行病学领域中最重要的研 究对象之一。 l 大肠杆菌的生物特性及其致病性 大肠杆菌是一种寄居在人和动物肠道上的革兰阴性菌，具有良性作用，能够 利用肠道内食物残渣合成维生素b 及k 供人体吸收利用【4 l 。但是部分大肠杆菌 能产生肠毒素，可导致人们肠胃炎等疾病。除此之外，当大肠杆菌侵入肠道外的 其他组织器官时，可引发尿道炎、膀胱炎、阑尾炎等，免疫能力下降的病人还可 引起败血症。 1 1 大肠杆菌的生物学特性 大肠杆菌是一种单细胞微生物，其基本结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质和 核质等。细胞壁是包裹于细胞膜外的坚韧而富有弹性的膜状结构，主要由肽聚糖 和外膜组成，肽聚糖形成疏松的二维平面网线络结构；外膜由脂蛋白、脂质双层 和脂多糖组成。细胞膜是位于细胞壁内侧，紧包在细胞质外的弹性膜状结构，主 第一章绪论 要是有磷脂及蛋白质组成。细胞质是细胞膜包裹的溶胶物质，含水、蛋白质、核 酸、脂类、少量糖和无机盐等，是细菌进行新陈代谢的重要场所。核质又称细菌 染色体，它具有细胞核的功能，控制细菌的各种遗传特性。1 。大肠杆菌在普通培 养基上生长良好，形成圆形、凸起的无色菌落，非常适合平板计数检测。另外， 大肠杆菌生化反应活泼，能够分解多种糖类，产酸产气，但不分解蔗糖；靛基质 和甲基红试验阳性；在鉴别培养基上能分解乳糖使菌落着色，可与其他肠道细菌 相区别。 大肠杆菌抗原较多，主要由o 抗原( 1 7 0 种) 、h 抗原( 6 0 种) 、k 抗原( 1 0 3 种) 三部分组成。新分离的大肠杆菌7 0 具有k 抗原，k 抗原又分为a 、b 、l 三 类，致病性大肠杆菌的k 抗原多数为b 类，少数为l 类。大肠杆菌的血清型别的 方式为o ：k ：h 排列，如0 1 1 1 ：k 5 8 ：h 2 ，0 6 ：k 1 5 ：h 1 6 等。 大肠杆菌的生命力较强，在3 7 情况下最适宜生长，5 5 、6 0 分钟仍有部 分大肠杆菌能够存活。自然界中大肠杆菌可存活数周至数月，温度较低时可以存 活更久。大肠杆菌对青霉素中毒敏感，对磺胺类、链霉素等敏感，但是大部分菌 株具有耐药性。 1 2 大肠杆菌的致病性 侵袭力：包括k 抗原和定居因子。k 抗原具有抗吞噬、抵抗抗体和补体的作 用。定居因子也称粘附素，它能使大肠杆菌粘附于宿主肠壁，以面被肠蠕动和肠 分泌液所清除。目前已证实可以导致人类腹泻的定居因子为c f a i 和f f a i i 。 内毒素：大肠杆菌细胞壁具有的内毒素活性，脂多糖层中的脂类a 是毒性部 位。 外毒素：某些产毒性大肠杆菌生长繁殖过程中释放出来的毒素，可分为耐热 和不耐热两种。不耐热外毒素对热不稳定，6 5 下3 0 分钟即失去活性。耐热外 毒素对热稳定，1 0 0 下2 0 分钟也不被破坏，分子量小，免疫原性弱。 1 3 大肠杆菌的内源性感染 大肠杆菌的内源性感染主要是由于某些血清型别的菌株的k 抗原、定居因 子、肠毒素引起的人类腹泻，主要有四类致腹泻大肠杆菌。肠产毒性大肠杆菌， 9 第一章绪论 临床症状表现为轻度腹泻，严重时表现为霍乱样症状。肠致病大肠杆菌，婴儿腹 泻的主要病原菌，表现为严重腹泻，导致婴儿死亡。肠侵袭性大肠杆菌，侵袭肠 粘膜上皮细胞，产生内毒素，破坏细胞形成炎症和溃疡，病人腹泻较为严重。肠 出血性大肠杆菌，产生类似于志贺痢疾杆菌样的细胞毒素，各个年龄段均可发病， 主要引起血性便 6 l o 内源性感染严重时常可导致尿道炎、膀胱炎、胆囊炎、阑尾 炎等，婴儿、老人或免疫功能下降的病人，大肠杆菌可引起败血症( 导致高达 3 0 的死亡率) 川。 1 4 大肠杆菌的外源性感染 大肠杆菌的外源性感染主要是通过人类饮食、呼吸及皮肤接触等侵入人体组 织器官引起的。 大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 自1 9 8 2 年被人们所发现以来，一直受到人们的广泛关 注，早已臭名远扬。如1 9 9 3 年，j a c kkt i l eb o x 快餐连锁店出售未煮熟的污染 汉堡引起7 0 0 多人( 以儿童为主) 食物中毒，并造成4 入死亡。2 0 0 1 年夏天， 因为碎牛肉被大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 感染，导致3 5 人食物中毒，这也使得c o n a 掣a f o o d s 找回了怀疑受到污染的1 9 0 0 万磅碎牛肉【8 一。美国疾病预防和控制中心估 计，美国每年因大肠杆菌0 1 5 7 ：h 7 致病总人数大约为7 3 0 0 0 人，尽管上报的病 例已有所下降【m1 ”。 1 5 大肠杆菌的卫生标准 细菌主要存在于水、土壤、腐败物质中，那么饮用水，蔬菜及其他食品都极 易受到细菌的污染。卫生学上常以大肠杆菌作为检查水源是否被粪便污染的指 标。我国卫生标准规定：每1 m l 饮用水中细菌总数不超过1 0 0 个，每1 0 0 0m l 饮用水中不得超过3 个肠道菌群。饮料如汽水、可乐、果汁等每1 m l 不得超过 1 0 0 个细菌，每1 0 0m l 中不得超过5 个肠道菌群i “。 2 大肠杆菌检测的研究动态 由于大肠杆菌样品的处理难度，以及受到灵敏度的困扰等问题。目前检测大 肠的主要方法仍然是传统的生物学方法，要求检测时间长。国内外一些专家和学 第一章绪论 者采用现代分析技术，结合微生物技术研究发展了一些快速检测大肠杆菌的新方 法。 2 1 检测大肠杆菌的传统生物学方法 目前，对大肠杆菌的检测常采用美国公共卫生协会、美国h ) a 或a o a c 规 定的传统方法，主要包括多管发酵法、滤膜法、平板计数法和显微直接计数法等 【1 3 ，“。多管发酵法适用于饮用水、水源水、特别是浑浊度高的水中的大肠菌群测 定。滤膜法则多用于测定饮用水和低浊度的水源水，污染较为严重的水样不篚采 用这一方法。平板计数法是目前使用较多的一种方法，测定结果较为准确，且检 测的具有活性的细菌。而显微直接计数法的检测速度较快，但往往是将具有活性 和没有活性的细菌一起检测。传统的生物学方法检测细菌准确度较高，但是大多 操作比较繁琐，需要时间长【1 5 l 埔l 。如多管发酵法是根据大肠杆菌能发酵乳糖产酸、 产c o ：的特性，乖j 用含乳糖培养基培养不同稀释度的大肠杆菌水样，经初发酵 试验、平板分离和复发酵试验三个检验步骤，操作过程复杂，耗时7 2h 以上。 平板计数法，要求对未知样品连续做3 4 次1 0 倍稀释，才能得到合适的平板菌 落数，每个样品需做6 8 个平板，需用4 8h 才能获得结果。 2 2 检测大肠杆菌的新方法 尽管传统的生物学方法可以较准确地测定细菌的含量，但随着现代生活节奏 的加快，其耗时长、操作繁琐、效率低的特点显然不能满足人们及时的临床医学 诊断、水体污染的快速检测、食品卫生的迅速检验的要求。世界各国的专家和学 者都在努力寻找一种新方法以达到快速分析的目的，而且已经发展了化学发光和 荧光法m “”、免疫分析法锄“”、电化学安培法以及生物和化学传感器方法。”1 ， 另外，电泳和毛细管方法也开始在此领域应用。3 “。 2 2 1 检测大肠杆菌的化学发光和荧光法 化学发光法、荧光法和酶分析方法经常结合在一起，而且大多数快速酶分析 法是以化学发光和荧光为基础的。化学发光法可以检测非常低的细菌浓度，只要 培养时间足够长，可以准确检测到样品中的几个肠道菌群。由于细菌的渗透可以 第一章绪论 减少胞内酶的扩散障碍，加速基底向酶的传递，科学工作者经常利用此来提高检 测信号。同样，荧光分析法也可以在充足的培养时间下检测到样品中几个肠道 菌群。”。 比利时科学家v a n 等人发展了膜过滤法快速检测细菌的荧光和化学发光“。 他们使用4 一m e t h y l u m b e l l i f e r y 卜一d 9 1 y c o s i d e s 酶基底物质，对水中指示细 菌的检测需要6 7 5h 。为了缩短分析时间，他们改善了膜过滤器表面的荧光标 志物