（动物学专业论文）beagle母犬生殖器官发育及其erαmrna、prmrna表达规律的研究.pdf

中文摘要 犬属单次发情动物，间情期较长，犬科动物这一特殊的繁殖生理特点严重制 约着以犬为研究载体的科学研究的发展。犬的生殖特性的研究有助于从理论上对 其生殖生理的进一步认识，也为提高其繁殖力奠定理论基础。本文在研究b e a g l e 母犬一般生殖生理特点的基础上，以组织学方法和原位分子杂交方法对b e a g l e 母 犬生殖器官的发育及其激素受体的表达规律进行了研究，主要结果如下。 1 、b e a g l e 母犬的一般繁殖性能发情周期为2 3 0 2 5 0 天；全年均可发情，但 存在一定的季节差异；发情前期开始的第9 1 l 天交配受孕率高，产仔数多；b e a g l e 犬的妊娠期平均为6 2 1 9 天：每胎产仔数平均为5 3 0 头；仔犬雌雄比例为o 9 8 ：1 ： 离乳仔犬成活率为8 1 1 0 。 2 、初生至l s 月龄b e a g l e 母犬生殖器官的组织学变化初生时b e a 酉e 母犬卵 巢的皮质部含有大量的原始卵泡，颗粒细胞呈扁平排列在卵母细胞的周围，随着 月龄的增长，颗粒细胞层变多，卵泡体积变大。3 月龄出现初级卵泡，6 月龄出现 次级卵泡，9 月龄出现成熟卵泡和黄体。在不同月龄的卵巢均可见有多卵卵泡的存 在，且多卵卵泡数量呈下降趋势。初生时b e a g l e 母犬子宫腺体的体积小、数量 少、基质也少，随着月龄的增长子宫腺体不断发育增生，子宫腺体体积变大，数 量逐渐增多，腺体周围的基质也逐渐密集。初生至9 月龄b e a g l e 母犬输卵管黏 膜层形成初级皱襞，1 2 月龄后的输卵管开始出现较多次级皱襞，黏膜几乎充满整 个管腔，黏膜衬以柱状纤毛细胞和无纤毛的楔形细胞。 3 、血清中类圃醇激素的变化初生时，b e a g l e 母犬血清中e 2 浓度最低，出 生后不久e 2 水平迅速上升，在1 2 月龄时浓度最高，在1 2 月龄后呈下降趋势； 初生时，犬血清中p 4 的浓度为0 ，在1 2 月龄时p 4 浓度达到最高值。3 月龄起， 直至实验结束的1 8 月龄，其e 2 维持于2 0p g m l 左右，而p 一一直维持于较低的 水平( 0 8n g m 1 ) 。在发情周期，e 2 在总体上维持在较高水平；而p 在第9 天前呈上升趋势，在第9 天达到峰值，后浓度下降。 4 、脑垂体和生殖器官中雌激素受体m r n a 相对表达丰度的变化e r c t m r n a 阳性斑点主要出现在b e a g l e 母犬卵巢中各级卵泡的颗粒细胞，有腔卵泡与排卵前 卵泡的颗粒卵泡和内膜细胞，且大卵泡的阳性率明显高于小卵泡。初生母犬卵巢 e r c t m r n a 表达不明显，3 9 月龄之间的阳性率呈增长趋势，9 月龄后阳性率略有 下降却维持在较高的水平；卵巢中e r c t m r n a 在发情前期和发情期表达水平较高。 e r c t m r n a 阳性斑点主要出现于b e a g l e 母犬子宫腺体细胞，少见于基质中和平滑 肌细胞中。初生母犬子宫内e r c t m r n a 表达不明显，从初生至1 5 月龄过程中 e r c t m r n a 的阳性率随子宫内膜腺体细胞的数量和体积同步增加，阳性率和日龄 两者之间呈正相关( p 、五一二：。q ；、+ 产? ”“一l ；j 卜j，+ j 。鸯 ：。，。一5 j ”二。一。”j i 。 ，? ： 。 i 龇# 一。一燕+ 。t 。 口。t # m 蕊ih 。t ，* ? i 巍i a 036 91 21 51 8 b e a g l e 犬月龄( 月) 图2 1 0 - 1 8 月龄b e a g l e 母犬外周血清中雌- 二醇的含量变化 o 6 0 5 罂0 4 瑙0 3 蒸0 2 薰叭 0 # ” ；。“。 ；。 。 i 墓么二。飘破。一。赢：。毒 03691 21 51 8 b e a g l e 犬月龄( 月) 图2 2o - 1 8 月龄b e a g l e 母犬外周血清中孕激素的含量变化 由图可见，e 2 和p 4 总体上呈上升趋势。初生时，犬血清中e 2 的浓度最低， 出生后不久e 2 水平迅速上升，在1 2 月龄时浓度最高，为2 3 1 0 i l 7 6 p g n ：1 l ，在1 2 月龄后呈下降趋势；初生时，犬血清中p 4 的浓度为0 ，在1 2 月龄时p 4 浓度达到 最高值为o 5 2 士0 3 4 n g m l 。3 月龄起，直至实验结束的1 8 月龄，其e 2 维持于2 0p g m l 左右，而p 4 一直维持于较低的水平( 0 8n g m 1 ) 。 周天j i 牛：b e a g l e 母犬生珀器官发育及其e r a m r n a 、p r m r n a 表哒规律的研究 3 9 2 2 发情周期b e a g l e 母犬外周血清中生殖激素浓度的变化 发情周期犬血清中雌二醇和孕激素浓度的变化，见图2 3 ，图2 4 ：2 5 鼍2 0 遗1 5 藿l o 5 警o i 翼。：三墓兰三；乒；1 弋i ，：了聋二：7 厶f 麓瑚；。嘉，。融，二矗3 把# l 二# 一： 。，。，。 l3 4 5789 1 l 1 2 滴血后的天数 图2 - 3 发情周期b e a l e 母犬外周血清中雌激素的含量变化 = 2 0 鼍1 5 5 萎1 0 篓5 爵 o 要”一 ” ， 。“ ； ， ：、 ：+ 6 t 。 j i i ：- 荔- 。- 。 13 4 57 8 9l l1 2 滴血后的天数 图2 4 发情周期b e a g l e 母犬外周血清中孕激素的含量变化 从图可以看出：e 2 在总体上维持在较高水平；而p 在总体上也呈上升趋势， 在第九天达到峰值。 2 3b e a g l e 母犬卵巢、子宫和脑垂体中e r c t m r n a 和p r m r n a 表达 丰度的变化 b e a g l e 母犬卵巢、子宫和脑垂体中e r a m r n a 和p r m r n a 表达丰度变化见 表2 1 、表2 2 。 扬州人学硕卜学位论文 表2 10 - 1 8 月龄卵巢、子宫和垂体组织中e r n m 础q a 和p rm r n a 原位杂交相对表达丰度 注：原位杂交显色强度刚无( ) ，微弱( + ) ，中等( + + ) ，强( + + + ) 等符号表示：+ ，+ + 表 示介于两者之间。 表2 2发情周期卵巢和子宫组织e r a m r n a 和p rm r n a 原位杂交的相对表达丰度 注：原位杂交显色强度用无( ) ，微弱( + ) ，中等( + + ) ，强( + + + ) 等符号表示；+ + + 表 示介于两者之间。 周五胜：b e a g l e 母犬生殖器官发育及，( e r c 【m r n a 、p r m r n a 表达规律的研究4 2 3 1b e a g l e 母犬卵巢e r c t m r n a 和p r m r n a 表达丰度变化 b e a g l e 母犬卵巢e r c t m r n a 和p r m r n a 原位杂交信号见图2 5 ，图2 6 。 图2 5 犬组织e r 原位杂交图 a 原始卵泡e r 原位杂交图b 初级卵泡e r 原位杂交图c 次级卵泡e r 原位杂交图 d 成熟卵泡e r 原位杂交图e 成熟f f 泡e r 阴性对照图e 子宫腺体e r 原位杂交圈 g 子宫腺体e r 原位杂交图h 子宫腺体e r 原位杂交图i 子宫腺体e r 阴性对照图 扬州大学硕士学位论文 图2 6 犬组织p r 原位杂交图 a 初级卵泡p r 原位杂交图b 次级卵泡p r 原位杂交图c 次级卵泡p r 原位杂交图 d 黄体细胞p r 原位杂交图e 垂体细胞p r 阴性对照图e 垂体细胞p r 原位杂交图 b e a g l e 母犬卵巢内e r o 【_ m r n a 主要原位杂交阳性信号集中于各级卵泡的颗粒 细胞，有腔卵泡与排卵前卵泡的颗粒卵泡和内膜细胞，且大卵泡的阳性率明显 高于小卵泡；p r m r n a 主要原位杂交阳性信号集中于表面上皮细胞，各级卵泡 的颗粒细胞，有腔卵泡与排卵前卵泡的颗粒卵泡、外膜细胞、内膜细胞、黄体细 胞和间质细胞中。初生时卵巢e r c t m r n a 表达不明显，3 9 月龄之间的阳性率呈 增长趋势，9 月龄后阳性率略有降低却维持在较高的水平，随着卵泡的发育，颗 粒细胞的着色强度增强，且次级卵泡和成熟卵泡的着色强度明显强于原始卵泡和 初级卵泡；初生卵巢p r m r n a 不表达，3 1 8 月龄之间的阳性率呈增长趋势。 e r a m r n a 表达水平在发情前期和发情期较高；p r m r n a 表达水平在发情前期 前较高，后下降，在第九天又达到较高水平。 周天胜：b e a g l e 母犬生殖器官发育及其e r a m r n a 、p r m r n a 表选城律的研究4 3 2 3 2 b e a g l e 母犬子宫e r a m r n a 和p r n l r n a 表达丰度变化 b e a g l e 母犬子宫e r a m r n a 和p r m r n a 表达丰度变化见表2 1 ，表2 2 。 e r a m r n a 和p r m p n a 的阳性斑点主要出现于b e a g l e 母犬子宫腺体细胞， 少见于基质中和平滑目几细胞中。初生母犬子宫内e r o t m r n a 表达不明显，从初生 至1 5 月龄过程中e r a m r n a 的阳性率呈上升趋势，阳性率和同龄两者之间呈正 相关，并随子宫内膜腺体细胞的数量和体积同步增加；而从初生至1 2 月龄过程中 p r m r n a 几乎不表达。在发情周期，e r a m r n a 表达呈下降趋势，而p r m r n a 表达呈上升趋势。 2 3 3 b e a g l e 母犬垂体e r 旺m r n a 和p r m r n a 表达丰度变化 b e a g l e 母犬子宫e r a m r n a 和p r m r n a 表达丰度变化见表2 1 ，表2 2 。 e r a m r n a 和p r m r n a 的阳性斑点主要出现于b e a g l e 母犬垂体的腺体细胞。 初生时e r c t m r n a 和p r m r n a 几乎不表达，随着月龄的增加，e r a m r n a 一直 维持在较高的水平；p r m r n a 在3 月龄和6 月龄表达较高，后表达水平降低。在 发情周期，随着见阴道滴血后天数的增加，e r c t m r n a 表达下降，而p r m r n a 一直维持在较低的水平。 3 讨论 3 1 e r a 基因在b e a g l e 母犬生殖器官内定位与相对表达模式 本研究中，卵巢内e r a m r n a 主要原位杂交阳性信号各级卵泡的颗粒细胞， 有腔卵泡与排卵前卵泡的颗粒卵泡和内膜细胞，这一结果与对人，大鼠 1 ，小 鼠1 1 扪，恒河猴【1 9 1 ，猪【2 0 】的研究基本一致。我们没有在间质细胞发现e r a m r n a 的定位，或者未达到原位杂交可检测水平，这与国外学者在大鼠 1 7 1 、猪【加1 、犬的 研究相一致，在原始卵泡的扁平细胞、初级卵泡的颗粒细胞、大腔卵泡的颗粒卵 泡和内膜细胞发现e r u m r n a 的定位，说明e r a 直接介导了e 2 对颗粒细胞增殖、 分化的促进作用，e r a - e 2 形成复合体后导致颗粒细胞增殖，闭锁减少，也可通过 调节靶基因的转录，从而引发f s h 、l h 受体系统，以及其他的转录因子家族如 g a t a 家族g a t a 4 t 2 ”，还可维持颗粒细胞的问隙连接机制维持颗粒细胞生长、 扬州夫学硕七学位论文 分化拉2 j ，在原始卵泡扁平细胞以及初级卵泡颗粒细胞内发现e r a m r n a 阳性信 号，提示小卵泡能够对来自卵巢内大腔卵泡的雌二醇产生反应，即卵巢e 2 存在旁 分泌的调节方式，犬的有肺卵泡、排卵前卵泡的颗粒细胞内e r c t m r n a 表达明显 高于小卵泡内颗粒细咆，川见卵巢内e 2 存在自分泌调节方式，并且e r a 介导e 2 在卵巢的功能可能更主要是对卵泡成熟和维持的作用，同时增加f s h 刺激的颗粒 细胞内芳香化酶活性，在其它的一些物种如大鼠2 4 j ，猴1 2 5 1 ，人【2 6 i 也有类似的发现， 黄体细胞中e 2 以自分泌、胞内分泌的方式激活黄体内催乳素信号，刺激孕酮的分 泌。本研究中，我们在卵丘卵母细胞复合体中发现有e r c t m r n a 表达，说明卵 母细胞成熟存在一种旁分泌的影响【2 8 】1 2 9 1 ，同时，e 2 通过非基因组效应，即可通过 浆膜受体信号转导促进卵母细胞成熟【3 0 】【3 1 】1 3 2 1 。 运用原位杂交b e a g l e 母犬生殖器官中e r o t m r n a 的表达进行相对定量分析， 阳性细胞率及阳性灰度扫拙结果显示，在初生至9 月龄阶段，随着卵泡的发育和 颗粒细胞的增多，e r c t m r n a 的水平呈增长趋势，在9 月龄后e r c t m r n a 的表达 量有所下降，但仍然维持在较高的水平，这可能与犬进入卵泡发育周期有关，即 9 月龄后，卵巢己开始性周期活动。在发情前期和发情期，除了黄体细胞和大腔 卵泡的外膜细胞，e r c t m r n a 的表达量变化不大，同时我们发现与之相关的雌激 素和孕激素波动变化较大，提示与其他性器官相比，卵巢内e r a 可能由存在除激