抗生素类药物分析.ppt

第十一章,抗生素类药物的分析,第一节概述,抗生素的定义,抗生素是细菌、放线菌和真菌等微生物的代谢产物，对各种病原微生物有强大的抑制或杀灭作用。,抗生素的来源,1.生物合成（发酵）,2.化学合成或半合成,抗生素质量的复杂性,产品稳定性差,分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用,发酵过程不易控制易受污染,生产工艺复杂,发酵液中杂质,无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、毒性物质,增加异常毒性、细菌内毒素、热原、降压物质、无菌,检查,含量测定方法,（一）生物学方法,测定抗生素抑菌或杀菌的能力,（二）化学及物理化学方法,以理化方法测定主药含量,分类（按结构与性质）：内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、大环内酯类、氯霉素类、多肽类、抗肿瘤类林可霉素类、其他抗生素类,第二节内酰胺类抗生素,青霉素类,头孢菌素类,青霉素,（青霉素G、苄青霉素）,氨苄西林（氨苄青霉素）,阿莫西林（羟氨苄青霉素）,普鲁卡因青霉素,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,酸性,结构与性质,一、,与碱金属(Na+、K+)成盐,（一）羧基,易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,（二）手性C,(5%头孢唑啉钠溶液1824),头孢菌素类C6C7,青霉素类C3C5C6,旋光性,（三）共轭体系,青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基,UV,青霉素钠UV7-20,（四）内酰胺环,水溶液不稳定,干燥纯净稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,例,青霉素的降解反应,二、,鉴别,（二）呈色反应,1.羟肟酸铁反应,-内酰胺类,NaOH,呈色,（红、棕、褐）,头孢菌素类,3.茚三酮反应,-氨基,-氨基、伯胺某些羟基胺类,酮式,烯醇式,茚三酮,茚三酮,缩合,蓝紫色,4.双缩脲反应,-内酰胺类,（开环分解）,似肽键,蓝紫色,5.与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素阿莫西林氨苄西林,（分解）,变色酸,显色,6.与重氮苯磺酸反应,（偶合）,酚羟基,头孢哌酮,7.与铜盐反应,橄榄绿色,NaOH,专属反应,（三）沉淀反应,1.遇酸,在过量HCl或有机溶剂中溶解,2.有机胺盐反应,（1）重氮化-偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,普鲁卡因,普鲁卡因青霉素,（2）与三硝基苯酚反应,二苄基乙二胺,mp,三硝基苯酚,样品、分解产物,Cu2+,头孢氨苄max=262nm,青霉素V钠A280nm/A264nm=1.301.50,-内酰胺环,酰胺,利用不同结构的原子核在D2O中有不同的NMR光谱进行鉴别,JP,以吸收峰频率对峰强度进行作图,主要研究原子核的磁化性质及其在外磁场中的运动规律,硫酸庆大霉素NMR谱7-08,硫酸庆大霉素NMR,对照品对照法,精密称取样品0.1009g，置250ml碘瓶中，加水10ml，振摇使溶解，精密加溴滴定液(0.1mol/L)25.0ml，再加盐酸5ml，立即密塞并振摇1分钟，在暗处静置15分钟后，注意微开瓶塞，加碘化钾试液10ml，立即密塞，摇匀后，用硫代硫酸钠滴定液（0.09863mol/L）滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至蓝色消失，消耗硫代硫酸钠滴定液(0.09863mol/L)13.80ml，并将滴定结果用空白试验校正，空白试验消耗硫代硫酸钠滴定液（0.09863mol/L）21.64ml。每1ml溴滴定液(0.1mol/L)相当于13.01mg的C12H17N2NaO3。,酸性,结构与性质,一、,与碱金属(Na+、K+)成盐,（一）羧基,易溶于水,与有机碱(普鲁卡因)成盐,难溶于水,普鲁卡因青霉素,（二）手性C,(5%头孢唑啉钠溶液1824),头孢菌素类C6C7,青霉素类C3C5C6,旋光性,（三）共轭体系,青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基,UV,青霉素钠UV7-20,（四）内酰胺环,水溶液不稳定,干燥纯净稳定,不稳定性因素,四元环张力大,酰胺键易水解,例,青霉素的降解反应,(头孢噻吩钠水溶液2524h失活8%),二、,鉴别,（二）呈色反应,1.羟肟酸铁反应,-内酰胺类,NaOH,呈色,（红、棕、褐）,例：ChP(2000)头孢哌酮鉴别取本品10mg，加水2ml与盐酸羟胺溶液取34.8%盐酸羟胺溶液1份，醋酸钠-氢氧化钠溶液1份，乙醇4份3ml，振摇溶解后，放置5min，加酸性硫酸铁铵试液1ml，摇匀，显红棕色。,头孢菌素类,3.茚三酮反应,-氨基、伯胺某些羟基胺类,酮式,烯醇式,茚三酮,茚三酮,缩合,蓝紫色,4.双缩脲反应,-内酰胺类,（开环分解）,似肽键,蓝紫色,5.与变色酸-硫酸反应,活泼“-CH2-”,青霉素阿莫西林氨苄西林,（分解）,变色酸,显色,150,（缩合）,6.与重氮苯磺酸反应,（偶合）,酚羟基,头孢哌酮,7.与铜盐反应,橄榄绿色,NaOH,专属反应,（三）沉淀反应,1.遇酸,在过量HCl或有机溶剂中溶解,2.有机胺盐反应,（1）重氮化-偶合反应,重氮化-偶合反应,芳伯氨基,普鲁卡因,普鲁卡因青霉素,（2）与三硝基苯酚反应,二苄基乙二胺,mp,三硝基苯酚,样品、分解产物,头孢氨苄max=262nm,青霉素V钠A280nm/A264nm=1.301.50,Cu2+,氯唑青霉素3410.682,双氯青霉素3420.653,苯唑青霉素3391.328,(nm),-内酰胺环,酰胺,利用不同结构的原子核在D2O中有不同的NMR光谱进行鉴别,JP,主要研究原子核的磁化性质及其在外磁场中的运动规律,对照品对照法,（水解）,水解产物,定量过量,剩余,-内酰胺类,ChP,反应分两步进行：1.水解反应(按化学计算量进行)2.氧化-还原反应(无固定的量关系，受温度、PH值和时间等因素影响，应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),第一步,第二步,例,注射用普鲁卡因青霉素含量测定,取装量差异项下的内容物，精密称取约0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟，再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.5)5ml，精密加入碘滴定液(0.01mol/L)15ml，密塞，摇匀，在2025暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，,至近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同时用青霉素钠对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。,V样空,V样,V对空,V对,空白试验,A、消除样品已降解产物的干扰B、消除样品中其他消耗碘的杂质的干扰C、消除碘挥发造成的误差,以未经水解的样品作空白测定,空白,样品,Na2S2O3,采用标准品平行对照测定,A、可消除温度、pH、操作、环境等条件的影响B、使本法测定结果与微生物检定法一致,（1）弱酸性pH4.5,碱I2IO3-+I-,酸普鲁卡因与碘在酸性条件下会产生复盐沉淀,（2）温度2426,温度38未水解的供试品亦消耗碘,（3）水解时间,以水解20分钟后的耗碘量最大,（4）反应时间,反应20分钟后，耗碘量随时间的变化较小，可减小含量测定的误差。,（1）灵敏度高,样品:碘=1:8,（2）反应条件、实验操作要求高,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,4I28I-,原料,（水解）,青霉素族,ChP,样品,以未经水解的样品作空白测定,例,青霉素钠含量测定,取本品约50mg，精密称定，加水5ml溶解后，加1mol/L氢氧化钠溶液5ml，摇匀，放置15分钟，加1mol/L硝酸溶液5ml，醋酸盐缓冲液(pH4.6)20ml及水20ml，摇匀，照电位滴定法(附录A),用铂电极为指示电极，汞-硫酸亚汞电极为参比电极，在3540，用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)缓慢滴定，,（控制滴定过程约为15分钟），不计第一个等当点，计算第二个等当点时消耗滴定液的量。每1ml硝酸汞滴定液(0.02mol/L)相当于7.128mg的总青霉素(按C16H17N2NaO4S计算)。另取本品约0.5g，精密称定，加水与上述醋酸盐缓冲液各25ml，振摇使完全溶解，在室温下，立即用硝酸汞滴定液(0.02mol/L)滴定，终点判断方法同上.,每1ml硝酸汞滴定液（0.02mol/L）相当于7.128mg的降解物（按C16H17N2NaO4S计算）。总青霉素的百分含量与降解物的百分含量之差值即为青霉素的含量。,（1）以第二次滴定突跃为终点电位法指示终点,（2）反应摩尔比1:1,（3）空白试验消除已降解产物干扰,（4）优点不需标准品,精密称取含水量为0.5%的青霉素钠0.0502g，按药典方法测定总青霉素含量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)6.97ml。另精密称取上述样品0.5013g，按药典方法测定降解物含量时，用去硝酸汞滴定液(0.02009mol/L)1.33ml。以干燥品计算，求样品中青霉素的含量。,例,青霉素钠含量测定,（钠盐）,-内酰胺类,ChP,中和,中和,例,苯唑西林钠含量测定,取本品约0.5g，精密称定，加新沸过的并用0.01mol/L氢氧化钠溶液中和至酚酞指示液刚显红色的水20ml，使溶解,再用0.01mol/L氢氧化钠溶液中和后，精密加氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)25ml，摇匀，置水浴中加热20分钟，注意避免吸收空气中的二氧化碳，冷却后，加酚酞指示液12滴，用盐酸滴定液,（0.1mol/L）滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液(0.1mol/L)相当于40.14mgC19H19N3O5S。,（1）水解前先中和溶剂和样品,（2）加热时避免吸收CO2,不能使酚酞变红,（3）空白试验校正(消除Na2CO3干扰),（水解）,可见-紫外分光光度法,（四）,（1）原理,稳定剂,JP,青霉素族,（2）方法,（3）特点,实验条件随各药物稳定性不同而定,标准品对照法,（4）计算,（1）原理,（咪唑）,青霉素族,ChP,（2）方法,对照品法,计算,pH9,例,氨苄西林钠含量测定,取本品约60mg置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置另一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再精密量取5ml，置25ml量瓶中，加硼酸缓冲液2.5ml与醋酐的乙腈溶液（150）0.25ml，放置5min后，加咪唑溶液至刻度，摇匀，置60水浴,中，加热30min，取出冷却，照分光光度法（附录A），在325nm的波长处测定吸收度；另取氨苄西林三水合物标准品，按同法测定，计算，即得。,（3）讨论,a.咪唑催化的水解产率高，硫醇汞盐稳定（3h）,b.侧链有-NH2时，需加醋酐先将其乙酰化后才能发生上述反应,（4）特点,A、简便快速B、用标准品对照，重现性良好，RSD1%,USPJP,红色,-内酰胺类,NaOH,ChP头孢菌素类,特点快速、高效、灵敏专属性强、重现性好一法多用（鉴别、检查、含测）,哌拉西宁原料药含量测定色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇0.2mol/L磷酸二氢钠溶液10氢氧化四乙基铵溶液水（400503547）用磷酸调节pH值至5.5为流动相。检测波长为254nm。,第三节氨基糖苷类抗生素,链霉素双氢链霉素新霉素卡那霉素庆大霉素巴龙霉素,链霉胍+链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,链霉胍,链霉糖,N-甲基-L-葡萄糖胺,绛红糖胺+脱氧链霉胺+加洛糖胺,绛红糖胺,紫素胺,2-脱氧链霉胺,加洛糖胺,N-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺,庆大霉素C复合物庆大霉素C1R=HR1、R2=CH3庆大霉素C2R=R2=HR1=CH3庆大霉素C1aR、R1、R2=H庆大霉素C2aR=CH3R1=R2=H庆大霉素C2bR=R1=HR2=CH3,多与硫酸成盐,碱性,（一）,链霉素pH57.5庆大霉素pH212,羟基胺结构,吡咯衍生物,红色,（Elson-Morgan反应）,红色,链霉糖特有反应,紫红,麦芽酚,链霉胍特有反应,8-羟基喹啉,-萘酚,H+,庆大霉素无UV吸收,链霉素B（甘露糖链霉素）,方法TLC中的对照品法（BP）,1.来源反应中间体,发酵菌种不同工艺差别,规定控制各组分的相对百分含量,ChPUSPBPJP,max=330nm,衍生化原理,1.,1-烷基硫代-2-烷基异吲哚衍生物,RPHPLC,规定C12550%C1a1540%C2a+C22050%,峰面积归一化法,链霉素、庆大霉素,微生物检定法本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。,四、血清中庆大霉素的HPLC法,血浆样品的预处理离子对色谱法的目的：除去氨基酸、肽、胺的干扰选用OPA为荧光衍生化试剂采用柱后衍生化法,第四节四环素类抗生素,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,四环素（TC）tetracycline,金霉素(CTC)chlortetracycline,氯四环素,土霉素(OTC)oxytetracycline,氧四环素,多西环素(DOTC)doxycycline,脱氧土霉素,美他环素（METC）metacycline,多含结晶水,pH37.5荧光,1.,差向异构化,淡黄黑,蓝色荧光,差向四环素,（土霉素、多西环素不易差向异构化）,（1）酸性下降解,max=445nm,max=435nm,橙黄色,脱水四环素,TC,ETC,ATC,EATC,（2）碱性下降解,（荧光）,1mol/L盐酸-甲醇（1100）0.01mg/ml,UV,正相分配薄层色谱,EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象,4-差向四环素（ETC）脱水四环素（ATC）差向脱水四环素（EATC）盐酸金霉素（CTC）,TLC法（2019版）,HPLC法（2000版）,标准品对照法,盐酸四环素,四环素有关物质TLC图,4,0.5,0.5,2,杂质吸收度,ChP、USP,HPLC法（外标法）,系统适用性试验1.防护柱2.预试溶液4-差向脱水四环素四环素3.RSD2.0%,JP比色法（标准曲线法）,原理,1.熟悉抗生素类药物分析的特点及其常规检验项目。了解抗生素类药物的分析现状，熟悉生物学法与物理化学法测定效价的原理及优缺点。2.掌握内酰胺类抗生素的结构、性质、鉴别及含量测定。,第十一章复习内容,3.掌握氨基糖苷类抗生素的结构、性质及鉴别，了解其检查及含量测定4.掌握四环素类抗生素的结构及性质，了解其鉴别、检查及含量测定5.了解抗生素类药物的质量考察方法,99：89下列哪个药物会发生羟肟酸铁反应A.青霉素B.庆大霉素C.红霉素D