（发育生物学专业论文）文昌鱼可能的发育相关基因profilin与brp的研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：丞盛搭， 日期：2 鲤王竺阳 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阕；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：驹冬盘盛晦师签名：崔丝日期：2 塑2 ，缘矽 山东大学硕士学位论空 文昌鱼可能的发育相关基因p r o f i i n 与b r p 的研究 摘要 文昌鱼( a m p h i o x u s ) 属头索动物( c e p h a l o c h o r d a t a ) ，主要包括三个物种： 分布于西大西洋的佛罗里达文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a ，7 0 r i d a e ) 、分布于东大西 洋和地中海地区的矛形文昌鱼( b r 口 曲f d s f 。川口l a n c e o l a t u m ) 和分布于太平 洋地区的白氏文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 。我国所见的文昌鱼属白氏 文昌鱼，主要分布于青岛、厦门等地。文昌鱼在生物进化中具有特殊的地位， 被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物，它形体结构较脊椎动物简 单，在胚胎发生和发育机制方面都与脊椎动物相似，未曾经历脊椎动物中大 范围的基因倍增，因此是研究动物发育机制，研究脊椎动物起源和进化的理 想材料。目前对文昌鱼的研究已深入到分子水平，已经报道的文昌鱼基因包 括脊椎动物转录因子、生长因子、信号分子、结构基因和酶的同源基因。随 着分子水平研究的深入，我们对文昌鱼的发育机制与调控也有了进一步的认 识。但是，由于文昌鱼取材困难，因而对其研究依然很少，有待于继续积累 数据，从而开展广泛、系统、深入的研究。本论文报道了青岛文倡鱼( q i n g d a o a m p h i o x u s ) 中两个可能的发育相关重要基因p ，妒，m 与b r p 的完整读框，分 别与其它物种中其相应基因进行了同源性比较，分别研究了这两个基因在文 昌鱼胚胎发育过程中的表达图式，借此为阐明文昌鱼发育的分子机制和基因 家族进化的机制积累资料。 p r o f i l i n 是一种在各种生物中广泛存在的小分子量蛋白，在不同生物中 其一级结构存在较大的差异性，但在高级结构与功能上高度保守。p r o f i l i n 具有与g - a c t i n 、4 ，5 一二磷酸磷脂酰肌醇( p i p 2 ) 、p o l y l p r o 、富含脯氨酸的 蛋白质、含有f o r m i n 同源区的蛋白质( f h ) 、a r p 2 3 复合物及a n n e x i n s 等结 合的活性。目前的研究表明p r o f i l i n 是控制细胞中肌动蛋白聚合信号通路中 的重要分子，从而参与了细胞形态的维持、肌肉收缩、变形运动、细胞分裂、 山东大学硕士学位论文 花粉管的生长与受精、细胞迁移以及信号传递等活动。这些功能对于细胞的 正常生长、分裂以至于生物体的发育都具有十分重要的意义。本研究首次获 得了青岛文昌鱼p r o f i l i n 基因的完整读框，并由此推测了其蛋白序列，对演 绎的文昌鱼p r o f i l i n 蛋白的一级结构进行了分析，对其二级结构进行了预测， 同时与多种真核生物中的p r o f i l i n 蛋白进行了同源性比较，并首次对文昌鱼 胚胎发育过程中p r d _ ，i ，m 基因的表达图式进行了研究，同时通过n o r t h e r n b l o t 与s o u t h e r nb l o t 对青岛文昌鱼芦，o ， z 加基因可能存在的同源体及拷贝数进行 了研究。研究结果证实本研究得到了文昌鱼p ，妒砌基因的完整读框；显示 该基因产物可能在文昌鱼的体节形成中起着重要的作用，并可能参与肌肉的 发育；同时揭示了文昌鱼中可能仅含有一个与肌肉型肌动蛋白结合的p r o f i l i n 基因，并且该基因可能也不存在多种剪接形式。 在对青岛文昌鱼神经胚c d n a 文库测序，并进行e s t ( e x p r e s s e ds e q u e n c e t a g 、e s t ) 同源性分析，从中获得了青岛文昌鱼的一个新基因( 我们称之为 b r p ) 的e s t ，发现该基因与人脑中的脑蛋白2 3 9 具有一定同源性。本研究 对b r p 基因的研究展开了探索性的工作。首先，首次对b r p 的表达图式进行 了研究，研究结果表明b r p 基因产物可能在文昌鱼卵裂过程中，在表皮分化 过程中，在早期脊索中胚层的发育过程中，在内胚层、消化道及咽腮区的形 成过程中，特别是在早期神经板细胞的旋育过程和中枢神经系统发育启动中 起到一定作用：同时通过s o u t h e r nb o t 对b r p 基因可能存在的同源体迸行了 研究，结果揭示文昌鱼中可能存在多个拷贝的b r p 同源基因。 关键词：文昌鱼，j 口r 妒f 抽基因，b r p 基因，同源性分析，表达图式 生墨奎兰堡主兰垡堡皇 t h er e s e a r c ho fp r o f i na n d6 厂口一t h et w op o s s lb l e d e v e l o p m e n t r e l a t e dg e n e s a b s t r a c t a m p h i o x u s ，w h i c hb e l o n g s t o c e p h a l o c h o r d a t a ，i n c l u d e s t h r e e s p e c i e s ： b r a n c h i o s t o m af l o r i d a e ( w e s ta t l a n t i c o c e a n ) ，b r a n c h i o s t o m a l a n c e o l a t u m ( e a s ta t l a n t i ca n dm e d i t e r r a n e a n ) ，a n db r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ( p a c i f i co c e a n ) t h e a m p h i o x u si nc h i n ab e l o n g st ob r d n c h i o s t o m a b e l c h e r i w h i c hm a i n l yl i v e s i nq i n g d a oa n dx i a m e n a m p h i o x u sh a ss p e c i a lp o s i t i o ni nt h ee v o l u t i o no ft h e v e r t e b r a t e sa n di sc o n s i d e r e dt h ec l o s e s t l i v i n g i n v e r t e b r a t e r e l a t i v e o f v e r t e b r a t e s a m p h i o x u s ，w h o s eb o d y s t r u c t u r ei s s i m p l et h a nt h a to fv e r t e b r a t e s ， i ss i m i l a rt ov e r t e b r a t e si nt h e i re m b r y o g e n e s i sa n dd e v e l o p m e n t a lm e c h a n i s m f u r t h e r m o r e ，i th a sb e e ns u g g e s t e dt h a te x t e n s i v eg e n ed u p l i c a t i o n so c c u r r e db y g e n o m et e t r a p l o i d i z a t i o na f t e rt h ec e p h a l o c h o r d a t e v e r t e b r a t es p l i ta n dt h a tt h i s p r o v i d e dt h ef l e x i b i l i t y t ob u i l dt h em o r ec o m p l e xv e r t e b r a t eb o d yp l a n s o a m p h i o x u s i sa ni d e a l o r g a n i s m f o rt h er e s e a r c ho fa n i m a l d e v e l o p m e n t a l m e c h a n i s ma sw e l la s o r i g i n a n de v o l u t i o no fv e r t e b r a t e s t h er e s e a r c ho f a m p h i o x u so nm o l e c u l a rl e v e lh a sp r o g r e s s e dg r e a t l yi nr e c e n ty e a r s al o to f g e n e sh a v eb e e nc l o n e df r o mf l o r i d aa m p h i o x u s ，w h i c hi n c l u d e st r a n s c r i p t o r s ， g r o w t hf a c t o r s ，s i g n a lm o l e c u l e s ，a n ds oo n n o ww eh a v em o r ek n o w l e d g eo f t h ed e v e l o p m e n t a lm e c h a n i s mi na m p h i o x u s b e c a u s eo ft h ed i f f i c u l t yi nt h e a c q u i r e m e n to f t h i sk i n do f m a t e r i a l ，w h i c hi sc a u s e db ya m p h i o x u s se x t r e m e l y l i m i t e d d i s t r i b u t i o n ，t h er e s e a r c ho fa m p h i n x u ss t i l ll a g sb e h i n d 。h e r e ，t h i s r e s e a r c hf o c u s e s m a i n l y o nt h et w op o s s i b l e d e v e l o p m e n t - r e l a t e dg e n e s i n a m p h i o x u s - - p r o f i l i n a n db r p p r o f i l i n sa r es m a l lp r o t e i n s ，w h i c ha r e u b i q u i t o u s l yf o u n di nm a m m a l s ， 3 山东大学硕士学位论文 a n i m a l c e l l s ，p l a n t s ，a n d v i r u s e s t h es e q u e n c e so fp r o f i l i n sf r o md i f f e r e n t s p e c i e sa r en o tw e l lc o n s e r v e d ，b u tt h es t r u c t u r ea n dt h eb i o c h e m i c a lf u n c t i o no f d i f f e r e n t p r o f i l i n s a r eh i g h l yc o n s e r v e d p r o f i l i n sc a nb i n dt o g - a c t i n ，p i p 2 ， p o l y l p r o ，p r o l i n e - r i c hp r o t e i n s ，f o r m i n r e l a t e dp r o t e i n s ，a r p 2 3c o m p l e x ，a n d a n n e x i n s p r o f i l i n sa r ea c t i nm o n o m e rs e q u e s t e r i n gp r o t e i n si n v o l v e di nt h e r e g u l a t i o no f t h ea c t i np o l y m e r i z a t i o n ，a n di n v o l v e di nt h ec o n t r o lo fc e l ls h a p e ， p o l a r i t ya n dm o t i l i t yi nr e s p o n s et oe x t r a a n di n t r a c e l l u l a rs i g n a l s p r o f i l i n sa r e a l s or e p o r t e dt op l a yar o l ei nt h ed e v e l o p m e n to f m a n yo r g a n i s m s i nt h i ss t u d y ， t h ec o m p l e t eo r fo fa m p h i o x u s p r 斫l i ni sr e p o r t e d ，t h ed e d u c e da m i n oa c i d s e q u e n c ew a sa n a l y z e da n dc o m p a r e dw i t ho t h e ra n i m a la n dp l a n tp r o f i l i n s a m i n oa c i d s e q u e n c e s ，t h es e c o n d a r ys t r u c t u r e o fa m p h i o x u sp r o f i l i n w a s p r e d i c t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ep r o f i l i ni sc o n s e r v e di ne v o l u t i o n t h e r e s u l to fi ns i t u h y b r i d i z a t i o ns h o w st h a tp r o f i l i n i s p o s s i b l yi n v o l v e di n t h e f o r m a t i o no fs o m i t ea n da l s oi n v o l v e di nt h ed e v e l o p m e n to fm u s c l et i s s u ei n a m p h i o x u se m b r y o g e n e s i s t h e r e s u l to fs o u t h e r nb l o ta n dn o r t h e r nb l o t s u g g e s t st h a tt h e r ei so n l yo n ec o p yo ft h i sg e n ei na m p h i o x u sg e n o m ea n dn o a l t e r n a t i v es p l i c i n go ft h i sg e n ei na m p h i o x u s b ys e q u e n c i n gt h eq i n g d a oa m p h i o x u sn e u r u l ae d n a l i b r a r y ，w eo b t a i n e d o n e e x p r e s s e ds e q u e n c e t a g o f b r p ( n o m i n a t e db yo u r s e l v e s ) ，w h i c h i s h o m o l o g o u st o an e w l yd i s c o v e r e dp r o t e i n h u m a nb r a i np r o t e i n2 3 9a ts o m e e x t e n t i nt h i ss t u d y ，t h ee x p r e s s i o np a t t e r no f b r ps u g g e s t st h a tb r pi si n v o l v e d i n c l e a v a g e ，i nd e v e l o p m e n to fe p i d e r m ，c h o r d a m e s o d e r m ，e n d o d e r m ，g u t ，a n d n e u r a lp l a t e ，a n d e s p e c i a l l yi nt h ei n i t i a lo f c e n t r a ln e r v o u ss y s t e md e v e l o p m e n t a n dt h er e s u l to fs o u t h e r nb l o t s u g g e s t st h eb r ph a sm o r et h a no n ec o p yi n a m p h i o x u sg e n o m e k e yw o r d s ：a m p h i o x u s ，p r 斫l i n ，b r p ，h o m o l o g ya n a l y z e ，e x p r e s s i o np a t t e r n 4 坐垄查兰堡主兰垒堡! l 一 英文缩写 a p b c i p b s a d e p c d i g d m f e d t a e g t a h m i n m o p s n b t p b s p c r p v p r p m s s d s s s c u 符号说明 英文全名 a l k a l i n ep h o s p h a t a s e 5 - b r o m o 4 一e h l o r o 一3 一i n d o l y p h o s p h a t e b o v i n es e r u ma l b u m d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d i g o x i g e n i n d i m e t h y l f o r m a m i d e t h y l e n ed i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e e t h y l e n eg l y c o l b i s ( 2 - a m i n o e t h y l e t h e r ) t e t r a a c e t i ca c i d h o u r m i n u t e 3 n m o r p h o l i n o 】p r o p a n e - s u l f o n i c a c i d n i t r ob l u et e t r a z o l i u m p h o s p h a t a t e b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n p o l y v i n y l p y n o l i d o n r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e s e c o n d s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e 1j n i t 5 中文 碱性磷酸酶 5 溴4 氯3 一吲哚磷酸盐 牛血清白蛋白 焦碳酸二乙酯 地高辛 二甲基甲酰胺 乙二胺四乙酸 乙二醇一双一( 2 - 氨基乙基) 四乙酸 小时 分钟 3 ( n 吗啡啉) 丙磺酸 硝基四氮唑盐 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 聚乙烯吡咯烷酮 每分钟转数 秒 十二烷基苯磺酸钠 标准柠檬盐溶液 酶活单位 山东大学硕士学位论文 第一部分 文昌鱼胚胎发生及其发育机制的研究进展 文昌鱼( a m p h i o x u s ) 属头索动物( c e p h a l o c h o r d a t a ) 川，主要包括三个物 种：分布于西大西洋的佛罗里达文昌鱼( b r a n c h i o s t o m a f l o r i d a e ) 、分布于东 大西洋和地中海地区的矛形文昌鱼( b r a n c h i o s t o m al a n c e o l a t u m ) 和分布于 太平洋地区的白氏文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r i ) 。三个物种约在一亿一 千万年至一亿九千万年前发生歧化【2 r 3 1 。经过c o n k l i n 、童第周先生等所做 的一系列实验研究，又使我们对文昌鱼胚胎发育的规律有了明确的认识【4 4 l 。 目前对文昌鱼的研究己深入到分子水平，已经报道的文昌鱼基因已有1 0 0 多 个，包括脊椎动物转录因子、生长因子、信号分子、结构基因和酶的同源基 因。随着分子水平研究的深入，我们对文昌鱼的发育机制与调控也有了进一 步的认识。 一、文昌鱼的形态、生活习性及胚胎发育 文昌鱼的体形略似小鱼，无明显的头部，左右侧扁，半透明，可隐约见 到皮下的肌节( m y o t o m e ) 和腹侧块状的生殖腺，身体两端尖出，故有双尖 鱼( a m p h i o x u s ) 之称，又因其尾形很像矛头而名海矛。文昌鱼常栖息于浅 海水质清澈的沙滩上，平时很少活动，常把身体半埋于沙中，前端露出沙外， 或者左侧贴卧沙面，借水流携带矽藻等浮游生物进入口内。夜间较为活跃， 凭藉体侧肌节的交错收缩在海水中作短暂的游泳。寿命约2 年8 个月左右。 5 7 月为生殖季节，一生中可繁殖3 次，其中以最后一次产卵最多 7 1 。 文昌鱼为雌雄异体，雌雄同体十分罕见。成体文昌鱼的生殖腺位于肌节 腹面紧贴围腮腔内壁的两侧，成熟的卵巢呈黄色，成熟的精巢呈乳白色。性 成熟时精卵冲破围腮腔内壁，通过围腮腔经腹孔排出，文昌鱼卵只有以自然 方式排出才可受精【8 9 1 。 我国所见的文昌鱼属白氏文昌鱼，主要分布于青岛、厦门等地。青岛文 昌鱼卵子在室温条件下自然受精后5 0 6 0 r a i n 开始第一次卵裂，1 2 h 左右孵化 6 山东大学硕士学位论文 出膜，至2 4 h 时期已具有1 3 1 4 体节，进入幼体阶段 l 。2 4 h 文昌鱼幼体神 经管、脊索、肌节的分化己很明确，但此时脊索、神经管分化程度还不高， 脊索鞘还不发达，神经管的闭合似乎是由前至后逐渐进行的，其后部神经管 尚未完全形成，神经管腹部两侧未观察到神经纤维束。3 6 h 文昌鱼已开口， 第一鳃裂尚未完全形成，神经管由明显的结缔组织鞘包围着，细胞围绕着神 经管腔排列。4 8 h 文昌鱼已具有2 个鳃裂，脊索由发达的脊索鞘包围，脊索 高度空泡化，肌节中已具有发达的肌纤维，神经管细胞可见到大而明显的核 仁1 。 文昌鱼被认为是现存的与脊椎动物最接近的无脊椎动物，文昌鱼在形体 模式( b o d yp l a n ) 、发育程序和基因组组织等方面都类似于脊椎动物。文昌 鱼的成体结构与胚胎发生过程与无脊椎动物( 如棘皮动物) 有相似之处：如 表皮为单层上皮，外有角质层，结缔组织不发达，胚胎有纤毛能在水中游泳， 许多器官有分节等。但它与脊椎动物有更多共同点：具有脊索、背神经管。 成体与胚胎都有肌节、鳃裂，胚胎发生时期有神经肠管等 1 2 1 。 二、文昌鱼发育机制的研究及其与脊椎动物发育机制比较的研究 目前对文昌鱼的研究已深入到分子水平，如同与脊椎动物在胚胎发生过 程中外部形态具有相似之处一样，文昌鱼中许多发育相关基因也与脊椎动物 中的同源基因在表达模式上有相似之处。 在脊椎动物中n o d a l 基因编码t g f b 超家族的分泌蛋白，在胚胎发生的 早期n o d a l 在背侧的高浓度表达与s p e m a n n 组织者的建立有关。14 1 。n o d a l 对 于组织者特异基因g o o s e c o i d 的表达是必需的【l5 】；在组织者形成时n o d a l 对于 中胚层诱导及图式形成具有重要作用【1 6 ；在胚胎发生的后期，n o d a l 的表达 出现左右不对称性，仅在左侧表达【1 7 9 1 。在文昌鱼中，n o d a l 最初在原肠胚 表达于胚孔的背唇；在晚原肠胚及早神经胚时期两侧对称的表达于近轴中胚 层及神经板上方：在神经胚晚期，所有神经表达和右侧的中胚层表达消失， 沿着神经胚左侧，中胚层表达延伸到肠内胚层左侧：之后前端与后端的表达 开始下调，头端左侧外胚层开始表达。这些证据表明，n o d a l 基因在文昌鱼 及脊椎动物中对于组织者的建立、中胚层图式形成和躯体左右轴的建立具有 保守功能f 20 1 。 h e d g e h o g 基因是文昌鱼中发现的又一个与发育相关的基因。h e d g e h o g 山东大学硕士学位论文 ( h h ) 基因家族编码一类细胞间信号分子，1 9 9 2 年在果蝇中首先被克隆，并 被发现在果蝇成虫盘的图式形成中起重要作用2 “2 2 】。随后，在不同无脊椎 动物如海胆、水蛭和甲虫，脊椎动物如斑马鱼、爪蟾、鸡、小鼠和人中均发 现并克隆了h h 同源基因，在无脊椎动物中仅发现一个h h 基因，而在脊椎 动物的基因组中则发现多个h h 同源基因，可分为s o n i ch e d g e h o g ( s h h ) 、 d e s e r th e d g e h o g ( d h h ) 、i n d i a nh e d g e h o g u h h ) 等类型。其中d h h 、肪j f z 分别参 加精巢和软骨的发育，而s h h 在脊椎动物神经管、体节和肢的发育中起关键 作用，是参与脊索诱导作用的重要信号分子1 2 2 - 2 5 。文昌鱼h h 基因的表达图 式与脊椎动物的s h h 相似，所以可能由s h h 保持着h h 基因的原始功能，而 d h h 和l h h 则在不同的区域承担了全新的功能，分别参与了精巢和软骨等的 发育【2 6 27 1 。 b r a c h y u r y 首先在鼠中被发现，其同源物已在一些脊椎动物中发现。 b r a c h y u r y 参与中胚层的形成与脊索的分化。文昌鱼发育过程中b r a c h y u r y 转录产物的时空分布类似于脊椎动物b r a c 咖u r y 转录产物，表达于预定的中 胚层和脊索中。这一结果预示文昌鱼与脊椎动物在中胚层形成中有着共同的 机制。 2 8 1 e n g r a i l e d 是果蝇及其他原肢类动物胚胎中体节建立与维持的关键因素。 文昌鱼的e n g r a i l e d 基因a m p h i e n 在神经胚早期沿胚胎前后轴形成体节性分 布的条纹，在每一新形成的体节后部表达，在神经胚后期在外胚层和神经管 少数细胞中短暂表达，在神经管中的表达区域相当于脊椎动物的间脑处，但 相对于脊椎动物中e n g r a i l e 硅中脑与后脑分界处的表达要稍晚些【2 9 1 。 i s l e t l 是一个具有l i m 同源区域的转录因子，i s l e t l 表达于脊椎动物发育 中的运动神经元中，这些在后脑与中脑后部的运动神经元中表现出的i s l e t l 分节表达区域将表达菱脑节特异表达的k r o x 2 0 年 i h o x b i 。文昌鱼的i s l e t l 同 源基因分节的表达于中脑腹侧的细胞簇中，揭示文昌鱼的祖先与脊椎动物祖 先在脑发育中的相同机制。1 3 0 。l i m 超家族还有多个成员在文昌鱼中被发现。 d r a l 是l i m 超家族中的一个亚族，曾认为只有脊椎动物中才存在d r a l 一引】。 文昌鱼的d r i l l s 同源基因a m p h i d r a l 在发育中的表达局限于表皮中。最初在 杯状的原肠胚时期表达于除背侧外的整个外胚层，文昌鱼的背侧外胚层将发 育为神经板，并进一步发育为中枢神经系统，而余下的外胚层将发育为表皮。 山东大学硕士学位论文 a m p h i d r a l 在早神经胚时期表达于表皮中，而在神经板中未见表达：在3 0 h 的胚胎中仍广泛的表达于表皮中，但在口和鳃裂的预定区域无表达：在早期 的幼体中除了前端与后端，表皮中的表达开始消退；在晚期的幼体中不再有 表达1 32 1 。 g a l a s 和n o r t h c u t t 提出脊椎动物共同的特征在于其特别的头部结构，包括 精细的脑、外部感觉器官的累积以及具有骨骼支持的分节的肌肉化的咽；并 提出这些特别的头部结构源于非常局限的胚胎组织主要是神经嵴与表皮基 板f 3 引。脊椎动物中o t x 基因集中表达于神经索前部，覆盖了预定的前脑和中 脑前部【3 4 】；h o x 基因表达靠后，表达于后脑脊髓上方区域3 5 1 。p a x 一2 、p a x 5 和p a x 8 表达部位位于o t x 与h o x 的表达区域之间，包括中脑前部、i s t h m u s 平1 后脑前部【3 “。文昌鱼o t x 基因表达于神经管前端，而h o x 基因表达靠后；并 且o t x 与h o x 的表达区域不相邻，这一结果揭示了文昌鱼中也存在与脊椎动物 类似的脑分区机制。但是文昌鱼形态上最终未出现脊椎动物中前脑、中脑、 后脑等分区，这也许与a m p h i p a x 2 5 8 的表达有关。在多种动物中，p a x 基因 家族编码控制关键发育决定的转录因子。j d 戤2 俗馏亚家族通过直接调节e n 2 等基因的表达而在脊椎动物中脑与后脑边界的特化与维持中其重要作用。在 许多地方，文昌鱼中a m p h i p a x 2 5 8 的表达模式与脊椎动物胚胎中的同源基 因p a x 一2 、p a x 5 或p a x 一8 的表达相似，如在幼虫的肾管、内柱、神经索和前端 光感受器的色素细胞中的表达【3 7 1 。但文昌鱼中与脊椎动物中脑与后脑边界同 源的结构中却未见至：1 a m p h i p a x 2 5 8 、e n g r a i l e d 和w n t 的表达2 9 _ 3 8 1 。研究表 明，a m p h i p a x 2 5 8 在这区域表达的缺失是由于相关基因启动子或增强子 区域缺少适当的调控元件【3 9 l 。 神经嵴是脊椎动物区别于文昌鱼等其他脊索动物的主要特征之一。神经 嵴是胚胎的外皮层间充质成分，最初特化于神经板的边缘和表皮，在神经胚 形成后，神经嵴从神经上皮中分层，迁移穿过内部组织，分化成广泛的内部 组织 4 ”。神经嵴细胞衍生出了头部的骨骼、肌肉组织、面部、咽和许多外周 神经系统。尽管在文昌鱼中缺少神经嵴，但在其神经板的边缘细胞中含有与 神经嵴细胞同源的细胞簇，同时参与神经嵴形成的遗传机制( b m p 4 ，s n a i l , p a x 3 ，w n t 7 b , d i s t a l l e s s 和m s x ) 在文昌鱼中已存在】。 a m p h i d l l 是文昌鱼中单一的的d i s t a l 1 e s s 同源基因，该基因在外胚层的 9 山东大学硕士学位论文 分化、背腹轴的建立、神经胚早期迁移中的上皮细胞的特化和前脑的特化中 具有重要作用。在脊椎动物中该基因家族包括六个成员，完成多种功能；而 在文昌鱼中仅有一个d i s t a l 1 e s s 同源基因a m p h i d l l 。a m p h i d l l 在原肠胚时期 表达于整个动物半球( 假定的外胚层) ，但不久其在背侧( 假定的神经板) 的表达下调；在早神经胚时期，a m p h i d l l 表达于神经板侧的表皮细胞中：在 神经胚中期，神经板前端的细胞开始表达a m p h i d l h 神经胚结束时，这些细 胞进入神经管背部形成神经板卷缩，并与后来在神经管更前端表达a m p h i d l l 的细胞组成了脑泡的前四分之三区域。文昌鱼神经管的这一区域与脊椎动物 的前脑同源，这些表达a m p h i d l l 的迁移的细胞与脊椎动物中的神经嵴细胞 类似，这也为脊椎动物与文昌鱼起源于同一祖先提供了证据 4 2 1 。 a p 2 是脊椎动物神经嵴的分子标记，是头部神经嵴发育所必须的。脊椎 动物a p 2 家族包括四个基因尸2 口，口， ga n d 万) ，脊椎动物a p 一2 家族在 小鼠胚胎形成过程中有动态的并且大量重叠的表达模式。原肠时期，4 p 一2 转录产物在非神经的外胚层中的表达消失，在神经折叠中的表达上调，标记 了迁移前、迁移中和迁移后的神经嵴细胞；并且a p 2 对于神经嵴细胞中 h o x a 2 的表达是必需的。在受精8 9 h 后，文昌鱼胚胎中背侧外胚层衍生出神 经板。在9 h 的文昌鱼神经胚中，彳p 2 车专录产物在整个非神经的外胚层中都能 检测到，在开放的神经板与中胚层中无表达。在9 5 一1 0 h 体节开始形成时，非 神经的外胚层在神经板上方开始闭合。在1 1 5 h 的神经胚中表达4 j p 一2 的外 胚层细胞在闭合的神经板上方开始迁移。在1 2 h ，神经胚外覆盖着有纤毛的 表达爿尸2 的上皮。1 8 h 神经化完成，在这时一尸2 在外胚层的表达由前向后逐 渐消失。2 0 h 前肠出现表达。2 4 h 在口前窝内胚层表达，同时脑泡的腹侧开始 表达，表皮中的表达消退。3 6 h 体长长为18 h 的两倍，口与第一腮裂开始形成， 此时脑泡与1 ：3 前窝中的表达开始消退【4 引。 s n a i l 基因最初在果蝇中发现【44 1 ，随后在斑马鱼【4 5 1 、蛙【4 6 1 、鸡【4 7 1 和鼠【4 8 】 中也发现了s n a i l 基因同源物。s n a i l 基因编码锌指型的d n a 结合蛋白，是组 织特异的转录因子。果蝇的s n a i l 基因表达于原肠胚的腹沟中，是中胚层形成 所必需的。脊椎动物的s n a i l 基因是一个脊椎动物中神经嵴特化起始的标记 物，表达最初出现于原肠胚，而后局限于体节出现前的中胚层中，此外还会 表达于迁移前的神经嵴细胞和咽弓衍生物中。文昌鱼中s n a i l 基因最初表达于 1 0 山东大学硕士学位论文 近轴中胚层和前体节中胚层中，之后在整个神经胚时期表达于神经板侧，同 时体节中的表达消失，证明了神经板侧是脊椎动物神经嵴同源物1 4 ”。 脊索动物中的f o r k h e a d 基因( 简称f o x ) 编码一种在发育、代谢和衰老 中发挥多种作用的转录因子【50 1 。f o x 基因家族在哺乳动物中有4 1 个成员，而 在昆虫中有1 4 个成员。这些基因被分为七类，以字母a ，q 标识”，文昌鱼中 f o x a ( 曾被称为h n f - 3 疗) 与f o x g ( 曾被称为b f l ) 的表达揭示了文昌鱼中枢 神经系统含有与脊椎动物中底板和端脑前体同源的区域5 2 。3 1 。哺乳动物中 f o x e l 与p a x 8 对于甲状腺的发育是必需的。甲状腺是脊椎动物中一种重要的 内分泌器官，甲状腺分泌的三碘甲状腺素( t 3 ) 和甲状腺素对于骨骼和中枢 神经系统发育、蛋白与脂代谢都起重要作用。文昌鱼神经胚形成时期， a m p h i f o x e 4 表达于腹侧咽内胚层右侧；在文昌鱼幼体中，表达局限于内柱 附近的棒状腺处，揭示了棒状腺与脊椎动物的甲状腺进化有关。a m p h i f o x d 与脊椎动物中的而z d ，f o x d 2 ，f o x d 3 ，f o x d 4 ，f o x d 5 同源，脊椎动物中 f o x d 3 表达与迁移前后的神经崤中，而a m p h i f o x d 在胚胎发育初期表达于神 经扳前部、轴中胚层和近轴中胚层中，在胚胎发育后期表达于体节、脊索、 脑泡和后肠内胚层中5 4 】。这些不同或许是引起脊椎动物中特有神经嵴分化特 征的分子机制之一。 三、文昌鱼基因的组织与进化研究 文昌鱼的整个基因组测序还未开展，但已有不少学者对一些文昌鱼基因 的组织与进化展开了研究。 生物体中通常含有许多肌动蛋白( a c t i n ) 基因并且a c t i n 基因的序列 高度保守。根据a c t i n 生理功能可将其分为肌肉型与胞质型两类【55 1 ，这两种 肌动蛋白由不同的基因编码，脊椎动物中这两种肌动蛋白相差2 2 个氨基酸 “ 】。而在非脊索动物中只有一种相似于脊椎动物胞质型肌动蛋白的肌动 蛋白【58 1 。文昌鱼的肌肉型a c t i n 强烈的表达于分节的肌肉中，在腮裂的平滑 肌中也有表达，而胞质型a c t i n 无特定表达模示。对, 4 c t i n 基因家族的系统 进化研究表明脊索动物中的肌肉型a c t i n 在外显子序列上彼此相似，脊索 动物中的胞质型a c t i n 在外显子序列上彼此相似，佛罗里达文昌鱼和白氏文 昌鱼的a c t i n 序列高度保守。在所有的脊索动物中，六个内含子的位置是保 守的，但脊椎动物中保守的3 2 8 1 3 2 9 位的内含子在文昌鱼、棘皮动物和尾索 山东大学硕士学位论文 动物中却不存在。由此看出，d c t i n 基因家族在脊索动物中出现了肌肉型和 胞质型的分化，在脊椎动物中出现了3 2 8 3 2 9 位的内含子，揭示了a c t i n 基 因家族的进化史( 卵】。 脊椎动物在进化中经历了两次大规模的基因倍增或基因组四倍化，其中 第一次大约发生在脊椎动物起源时，与文昌鱼分支之后，另一次大约发生在 颌1 3 类动物起源时1 6 0 。文昌鱼基因组的大小约为o 6p g ( 5 8 0 m b ) ，大于尾 索动物( 如海鞘c i o n a 基因组大小约为0 2p g ) ，而脊椎动物基因组大小主 要分布在1 4 - 2 8p g 。o h n o 认为在进化过程中。基因倍增( g e n e d u p l i c a t i o n ) 对新的更复杂的发育机制的出现具有重要作用。基因倍增或整个基因组的倍 增( 多倍化) ，产生出了多余的基因，它们承受的自然选择压力较低，可以 积累大量的突变，直至具有新的功能，导致新的结构和发育机制的出现【6 ”。 除了大范围的基因组倍增外，串联扩增也是基因扩增的一种重要方式。 h o x 基因是揭示脊椎动物进化中两次基因倍增的典例。h o x 基因是参与 动物前后轴图式形成的重要基因，它在基因组中通常成簇分布。在同一簇内， h o x 基因按其表达区域与功能成线性排列，参与前部图式形成的位于簇的3 端，而参与后部图式形成的位于簇的5 端，而参与中部图式形成的则位于簇 中部。这种分布方式从果蝇到人类都如此f 6 2 “引。哺乳动物中有4 个h o x 基 因簇，斑马鱼中有7 个h o x 基因簇，共包含有1 3 中不同类型的h o x 基因。 文昌鱼中仅有一个h o x 基因簇，其簇内的基因组织特点与脊椎动物相似，但 是文昌鱼h o x 基因簇中比脊椎动物h o x 基因簇中多一个h o x 基因( h o x l 4 ) ， 这一结果表明文昌鱼与脊椎动物的歧化发生在脊椎动物进化中广泛的基因 倍增之前，并且在这之后文昌鱼h o x 基因簇可能发生过串联的基因扩增【“】。 e v x 同源框基因从刺皮动物到脊椎动物中都有发现。在所有两侧对称的 动物中，该基因在原肠作用开始时，表达于胚胎后部，并且在中枢神经系统 中发挥作用，在不同物种中e v x 也有特异的功能，在脊椎动物中e v x 在尾芽 与肢芽的形成中起作用，同时也表达于中脑与后脑分界处( 6 5 t 。e v x 基因与 h o x 基因连锁，位于h o x 基因后部，脊椎动物有两个e v x 基因( e v x l 与e v x 2 ) ， 位于不同的染色体上【66 1 。文昌鱼有两个连锁的e v x 基因( a m p h i e v x a 和 a m p h i e v x b ) ，a m p h i e v x a 的同源域更接近脊椎动物的e v x l 与e v x 2 ，原肠胚 中a m p h i e v x a 表达于后部腹侧的外胚层，神经胚和幼体早期时a m p h i e v x a 山东大学硕士学位论文 在身体后部三个胚