核酸的生产ppt课件.ppt

核酸的生产,1,什么是核酸？,welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience,由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内、生物体内核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸，简称RNA和脱氧核糖核酸，简称DNA。,2,一、核酸药物的分类,（一）具有天然结构的核酸类物质,如：DNA、RNA、肌苷、ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、肌苷酸等。获得：微生物发酵或从生物资源中提取生产。药理功能：有助于改善机体的物质代谢和能量代谢平衡，加速受损组织的修复，促使机体恢复正常生理功能。著名企业：珍奥集团、GENTA公司,3,（二）天然碱基、核苷、核苷酸的类似物或聚合物,如：三氟代胸苷、叠氮胸苷、拉米夫定（嘧啶类）、阿德福韦（嘌呤类）、恩替卡韦（第三代核苷类抗乙肝病毒药物）等。获得：由自然结构的核酸类物质通过半合成生产。药理功能：治疗病毒病如乙肝、肿瘤、爱滋病的重要药物，也是产生干扰素、免疫抑制剂的临床药物。,4,二、核酸类药物的生产方法,welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience,除病毒外，所有的动植物组织中都含有核酸类物质，包括大分子DNA和RNA、小分子的核苷酸、核苷、碱基等成分，但不同的组织中含量有所不同。动物胸腺中DNA含量较多，是提取DNA的原料；酵母细胞中RNA含量最多，是提取生产RNA的主要原料。,5,（二）DNA和RNA的生产方法,1、分离提取,核酸的生产一般采用提取法，即从粉碎、破裂的生物组织细胞中通过一定的方法获取总DNA或总RNA。如需进一步的纯化，常用纯化方法如柱层析、凝胶电泳和密度梯度超离心。,、人工合成,获取大分子核酸的另一方法是人工合成，即利用化学的方法按照设定的核苷酸顺序逐一加入形成核酸。现已有核酸合成仪，但合成长度还有一定限制，并且该仪器价格昂贵。因此这种方法一般用于研究，不适合生产。,6,（三）核苷酸、核苷及碱基类似物的生产方法,1、酶解法生产酵母，从酵母中提取RNA，RNA经青霉菌属或链霉菌属等微生物产生的酶进行酶解，制成各种核苷酸。,2、半合成法微生物发酵与化学合成并用。,3、直接发酵法采用营养缺陷型菌株或营养缺陷型兼结构类似物抗性菌株来发酵大量生产目的核苷或核苷酸。,7,二、核酸类药物的生产方法,1.直接提取法,2.水解法（酶水解、碱水解、酸水解）,3.化学合成法,4.酶合成法,8,二、核酸类药物的生产方法,5.微生物发酵法,9,（一）DNA的生产技术,1、提取原理,在细胞内的核酸通常是与蛋白质形成复合物核糖核蛋白（RNP）和脱氧核糖核蛋白（DNP），这两种复合物在不同电解质溶液中的溶解度有较大差异。RNApro.RNP（核糖核蛋白）DNApro.DNP（脱氧核糖核蛋白）00.14MNaCl溶液，DNP溶解度，RNP的溶解度；0.14M0.5MNaCl溶液，DNP溶解度，RNP的溶解度。在制备DNA时，可利用0.14MNaCl溶液使DNP与RNP分开。由于DNP在浓盐溶液中的溶解度比稀溶液大得多，所以，首先采用浓盐溶液（12M）尽量抽提DNP，然后再去除杂蛋白。,10,2、工艺路线,11,DNA的粗提取,1、准备材料将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24h。,2、取材称取30g菜花，去梗取花,切碎。,3、研磨将碎菜花放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨10min。,12,DNA的粗提取,4、过滤在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液倒入塑料离心管中进行离心,用1000r/min的旋转频率，离心25min，取上清液放入烧杯中，取上清液。,5、加冷酒精将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中，并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液，可见白色的DNA絮状物出现。,13,DNA的鉴定,1、配制二苯胺试剂取0.1mLB液，滴入到10mLA液中，混匀。,2、鉴定取4mLDNA提取液放入试管中，加入4mL二苯胺试剂，混匀后观察溶液颜色(不变蓝)。用沸水浴(100)加热10min。在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色)。,14,（二）RNA的生产,1、来源,微生物酵母通常在细菌中RNA占525，在啤酒酵母中占2.715，在霉菌中占0.728%，面包酵母含RNA4.17.2。酵母菌体提取优点：（1）收率高；（2）提取容易。,15,、RNA的提取等电沉淀法,16,3、工艺过程,welcometousethesePowerPointtemplates,NewContentdesign,10yearsexperience,（1）预处理：压榨、除水；（2）提取：0.13%NaOH，使细胞壁变性，使核酸从细胞内释放出来；（3）中和、除菌体；（4）分离：等电点法，调pH2.5，使RNA沉淀下来；（5）洗涤、干燥：95%乙醇,17,检测,2、RNA含量测定,（1）定磷法660nm；（2）定糖法地衣二酚（苔黑酚）法。盐酸