（茶学专业论文）茶树β13葡聚糖酶基因的克隆及原核表达分析.pdf

摘要 茶树是我国重要的经济作物之一，茶叶为我国主要出n g , j 汇农产品。长期以来， 真菌病害一直是危害茶树生长、影响茶叶产量的主要病害之一，给我国的茶叶带来巨 大的经济损失，因此防治真菌病害一直是人们非常关注的问题。自栽培茶树以来，人 类采取了多种措施防治真菌病害：通过传统育种方法，培育抗病新品种；施用化学杀 菌剂；采用综合防治等方法尽量减少农药的使用量和农药残留量。但由于作物本身的 遗传资源有限，真菌的高变异性以及化学杀菌剂的污染问题，使得利用基因工程的手 段培育抗病品种成为近年来农业生物技术的研究热点之一。 本论文中，首次从木本植物茶树中克隆出1 3 1 , 3 一葡聚糖酶基n ( g 1 u ) 的全长序列， 并在原核表达系统中表达，鉴定表达蛋白的活性，为开展茶树抗真菌病害的基因工程 研究及运用生物技术培养茶树良种打下基础。本实验研究结果表明： 1 根据已知茶树g l u3 - 端的部分序列设计特异引物，采用5 - r a c e 技术获得了5 一 端核酸序列片段1 0 0 5 b p ，经过测序，在g e n b a n k 数据库中搜索分析表明，克隆所 得碱基序列和所推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的c d n a 相应序列有很高 的一致性，推测该特异产物为茶树g l u 的片段。 2 ，根据已知g l u3 - 端部分序列和克隆得到的5 一端序列设计特异引物，通过采用高保 真酶体系做p c r 反应，得到全长序列2 0 0 2 b p ，开放阅读框为1 4 8 8 b p ，编码4 9 5 个氨基酸。在g e n b a n k 和s w i s s p o r t 数据库中搜索分析表明，该序列所推导的氨 基酸序列与已报道的其他植物g l u 的e d n a 相应序列有3 0 - - 7 0 的一致性，推测 该全长片段为茶树g l u 。 3 选用p e t 3 2 a 表达载体和b l 2 1 t r x b ( d e 3 ) 宿主菌的原核表达系统，对g l u 的开放阅 读框片段进行表达。经i p t g 诱导表达的融合蛋白的分子量约为7 3 k d a ，推算出 g l u 基因表达蛋白分子量为5 3 5 k d a ，与预计的分子量5 2 9 k d a 相符。表达的蛋白 经薄层层析分析，但没有酶活性。 关键词：茶树1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶 e d n a蛋白表达 1 1 1 a b s t r a c t t e ap l a n t 【c a m e l l i as i n e n s i s ( l ) ok u n t z e s 】i so n eo ft h ei m p o r t a n ti n d u s t r i a lc r o p sa n de x p o r t a g r i c u l t u r a lp r o d u c t si nc h i n a s i n c eal o n gt i m e ，f u n g a ld i s e a s e sh a v eb e e no n eo f t h ep r i n c i p a lc a u s e s o ft e ap l a n tg r o w t ha n dt e ay i e l d ，w h i c hr e s u l t st h en a t i o n a lt e ag r e a te c o n o m i cl o s s e s 。s oh o wt o c o n t r o lf u n g a ld i s e a s e sh a sb e e no d eo f t h ec o n c e r n e dq u e s t i o n sb yt h eb r e e d e r s s i n c eh u m a ns t a r t e dt o c u l t i v a t et e ap l a n t s ，al o to f m e a s u r e sh a v eb e e na p p l i e dt oc o n t r o lt h ef u n g a ld i s e a s e s ，s u c ha sb r e e d i n g t h ef u n g u s r e s i s t a n tc u l t i v a r sb yc o n v e n t i o n a lb r e e d i n gw a y s ，t h ea p p l i c a t i o no fp e s t i c i d e s ，a n d c o l l i g a t e dw a y st or e d u c ed o s a g eo f a g r o c h e m i c a l sa n dr u d i m e n t a la g r o c h e m i c a l s b u td u et ot h el i m i t e d i n h e r i t a n c er e s o u r c e s ，t h eh i 【g hv a r i a b i l i t yo f f u n g a la n dt h ep o l l u t i o no f t h ep e s t i c i d e se t c ，w h i c hl e a d s t oa p p l y i n gt h et e c h n o l o g yo f g e n ee n g i n e e r i n gt ob r e e dt h ea n t i p a t h o g e n sc u l t i v a r sb e c o m e so n eo f t h e r e c e n tr e s e a r c hf o c u s e so f a g r i c u l t u r a lb i o l o g i c a lt e c h n o l o g y i nt h i sp a p e r t h ef u l l - l e n g t he d n ao fb - 1 , 3 一g l u c a n a s eo f t e ap l a n th a db e e nc l o n e da n ds t u d i e da t t h ef i r s tt i m e t h i sg e n ew a se x p r e s s e di ne c o l ia n di t sp r o t e i na c t i v e n e s sw a sd e t e r m i n e d ，w h i c hw a s n o to n l yc o n t r i b u t et ot h eg e n ee n g i n e e r i n gr e s e a r c ho na n t i - f o n g a lp a t h o g e n so ft e ap l a n t ，b u tm a k ea b a s ef o ra p p l y i n gt h eb i o l o g i c a lt e c h n o l o g yt ob r e e dt h et e ac u l t i v a r s i nt h i sw o r k ，t h ee x p e r i m e n tr e s u l t s s h o w t h a t ： i a c c o r d i n g t o t h e p a r t i a lk n o w n3 - t e r m i n a ls e q u e n c e o f1 5 1 ，3 - g l u c a n a s eo f t e ap l a n t ，w e d e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dt h eg s pp r e m i e rf o r5 - r a c er e a c t i o n a1 0 0 5 b pf r a g m e n tw a sa m p l i f i e db y 5 - r a c ew h i c hw a ss u b s e q u e n t l ya n a l y z e di ng e n b a n kd a t e - b a s ea f t e rs e q u e n c i n g ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h es e q u e n c eo ft h en u c l e o d d ea n dd e d u c e da m i n oa c i d sh a dh i g li d e n t i t yw i t ht h e c o r r e s p o n d i n gp a r to fb - 1 , 3 - g l u c a n a s ec d n a s o f o t h e rp l a n t sp u b l i s h e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h i ss p e c i f i c p r o d u c t m a yb e t h e p a r t i a l f r a g m e n t o fb - 1 , 3 - g l u c a n a s e o f t e a p l a n t 2 a c c o r d i n gt ot h ep a r t i a lk n o w n3 - t e r m i n a ls e q u e n c ea n dc l o n e d5 - t e r m i n a ls e q u e n c e ，w ed e s i g n e d a n ds y n t h e s i z e dt w ot e r m i n a lg s pp r e m i e r s t h ef u l l l e n g t hf r a g m e n to f1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s ee d n a w a sa m p l i f i e dp c rb yu s i n gh i g h - f i d e l i t yd n a p o l y m e r a s e ，a n dt h es e q u e n c i n ga n a l y s i ss h o w e d t h a t t h e f u l l - l e n g t ho f1 3 - 1 ，3 - g l u c a n a s ec d n a w a sc o m p o s e d o f 2 0 0 2 b p ，a n d t h e o r ：w a s1 4 8 8 b p ， c o d i n gf o r4 9 5a m i n oa c i d s t h ef u l l l e n g t hf r a g m e n tw a ss u b s e q u e n t l ya n a l y z e di ng e n b a n ka n d s w i s s - p o r td a t e - b a s e s ，a n dt h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e d u c e da m i n oa c i d sh a d3 0 - - 7 0 i d e n t i t y w i t ht h ec o r r e s p o n d i n gp a r to fp 1 3 g l u c a n a s ec d n a so fo t h e rp l a n t sp u b l i s h e d t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h i ss p e c i f i cp r o d u c tm a yb et h ef u l l - l e n g t hf r a g m e n to fb - 1 3 - g l u c a n a s eo f t e ap l a n t 3 t h eo r fs e q u e n c eo fb 一1 , 3 一g l u c a n a s ew a sc l o n e di n t oe x p r e s s i o nv e c t o rp e t 3 2 aa n de x p r e s s e di n b l 2 i t r x b ( d e 3 ) t h em o l e c u l a rw e i g h to f t h ef u s i o na n dt a r g e tp r o t e i ni n d u c e db yi p t gw a sa b o u t l v 7 3 k d a a n d5 3 5 k d ar e s p e c t i v e l ya c c o r d e dw i t ht h ee s t i m a t e dm o l e c u l a rw e i g h t5 2 9 k d a e n z y m ea c t i v i t yw a sa n a l y z e db yt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y , b u tn oa c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d k e y w o r d s ：t e a p l a n t c a m e l l i a s i n e n s i s ( l ) 0 k u n t z e s ) ；b - 1 , 3 - g l u c a n a s e c d n a ；e x p r e s s i o np r o t e i n v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知除了文中特矧j j n 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名 鱼迄 时1 8 1 ：) o b y - 年6 月2 j f i 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保酎 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：亟邀时间：砂5 ，年f 月确 第一导师签名：时间： 时哞z 月 、 文献综述 植物抗病性及其机制一直是植物病理学和抗病育种中的热点问题。植物抵抗病原 菌的机制般有两种，一种是先天的结构性障碍和( 或) 诱导产生化学物质，另外一 种是系统性获得性抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t e n c e ，s a r ) 【1 1 前者的典型例子是过 敏性反应( h y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n ，h r ) 诱导1 2 1 ，h r 与植物的抗病性有直接的关系， 但h r 的原理还不十分清楚，一般认为植物受到病原苗感染后，细胞发生程序性死亡， 但同时植物也释放出胞液中储存的有害物质，如植保素和病程相关蛋白 ( p a t h o g e n s i s r e l a t e d p r o t i e n ，p r ) p j ，葡聚糖酶即是这样一种蛋白。 1 1 3 1 , 3 葡聚糖酶的基本生物学特性 b 一1 ，3 葡聚糖酶在高等植物内广泛分布，包括花粉管壁、精细胞壁、筛管端壁等 结构中均有存在，它们在植物正常的发育阶段中发挥重要作用。以往的研究表明d 1 ，3 一 葡聚糖酶涉及到许多生理过程，包括谷类发芽、胚轴和胚芽鞘发育、韧皮部运输和胼 胝质的运动、微管组织运输调节和细胞壁生物合成、花的发育、小孢子形成、花粉管 发育、果实成熟、植物衰老以及固定和愈色性葡聚糖的清除等方面。在植物抵抗外来 病原菌的过程中，b 一1 ，3 一葡聚糖酶是植物过敏性反应( h r ) 中合成的重要水解酶类。 植物抵抗病菌侵害的途径多种多样，包括加固细胞壁、产生抗菌物质，而其首要的方 式则是h r 。根据基因的进化关系、蛋白质特点和氨基酸序列相似程度等方面，b 1 ，3 一 葡聚糖酶可以分为不同的类型。综合以往的研究结果，b 1 ，3 葡聚糖酶可以归纳为三 种类型：定位于液泡的碱性类型、胞外定位的酸性类型、还有其它一些b 1 ，3 葡聚糖 酶在序列上与以上馕种类型相差甚远，可以单独作为一类【4 】。 2 p - 1 ，3 葡聚糖酶在植物抗病中的作用 d 1 ，3 葡聚糖酶是一类重要的病程相关蛋白( p r ) ，p r 类蛋白是由植物寄主基因 编码的，在病理或相关条件下诱导产生的蛋白质，p r 类蛋白与植物系统获得性抗性 ( s a r ) 和系统诱导性抗性( i n d u c e ds y s t e m i cr e s i s t a n c e ，i s r ) 有密切相关【5 】。根据 已经发现的p r 蛋白可分为十一类，d 1 ，3 葡聚糖酶属于p r 一2 类【6 】o p l ，3 - 葡聚糖酶在植物的抗病过程中扮演着重要角色。p 1 ，3 葡聚糖酶和几丁质是 真菌细胞壁的重要结构成分，许多真菌的菌丝尖端，b 1 ，3 葡聚糖和几丁质暴露在表 面，能够直接受到p 1 ，3 葡聚糖酶和几丁质酶的攻击，体外抑菌试验表明，b 1 ，3 葡聚 糖酶对菌丝生长具有抑制作用嘲。不过，只有液泡定位的碱性葡聚糖酶能够降解菌丝 壁，从而抑制生长，而胞间定位的类型则没有抑菌活性【7 1 ，b 1 ，3 葡聚糖酶与几丁质 酶共同作用时抑菌效果更明显。当然，真菌也合成一些葡聚糖酶抑制蛋白( g l u c a n a s e i n h i b i t o rp r o t e i n ，r i p ) ，r i p 特异性地抑制寄主内源葡聚糖酶的活性【8 】，这反映了植 物与微生物共进化的一种关系。更重要的是，在水解过程中有真菌细胞壁释放出来的 寡聚糖能够作为植物多种抗病反应的激发因子，诱导植物的全面抗病反应【引o l 。这方 面的报道集中在大豆与大豆疫病菌的互作研究中。在大豆中，已经发现葡聚糖酶激发 子结合蛋白( g l u c a n e l i c i t o r b i n g d i n g p r o t e i n ，g e b p ) ，定位于大豆根部细胞的质膜上， 能够特异性地结合口1 ，3 一葡聚糖酶降解过程中释放出来的寡糖激发子，诱导植物的防 卫反应j 。综上所述，8 】，3 一葡聚糖酶的作用方式是由病原或植物信号因子诱导，经 过一系列的反应，植物b 1 ，3 一葡聚糖酶( 包括胞内积累的碱性类型和胞问积累的酸性 类型) 大量合成。b 1 ，3 一葡聚糖酶直接攻击真菌丝上的葡聚糖，抑制真菌的生长，同 时，水解中产生的寡糖作为植物h r 中的激发子，诱导植物的防御反应。 3 p 1 ，3 。葡聚糖酶基因的研究 人们对包括烟草、水稻和大豆等重要农作物在内的十几种植物中的葡聚糖酶基洲 进行了研究( 见表1 ) 。植物中的d 1 ，3 葡聚糖酶有碱性和酸性同工型【1 2 】。在健康植株 的种子发芽、下胚轴和胚芽鞘的生长、韧皮部的传输调节和花器官的发育等过程中都 存在碱性b 1 ，3 葡聚糖酶i i ，其表达具有器官特异性。在幼嫩的茎叶中少量表达或小 表达，在衰老部位表达量较高【1 4 l ”。在植物的萼片中表达明显，花瓣居中，在雄蕊和 一d 皮中检测不到该酶的表达i l6 j 。碱性b 1 ，3 葡聚耱酶也可在烟草组培组织中积累l 6 j 。 对从不同植物中分离到的c d n a 克隆和基因组克隆的研究表明，d 1 ，3 葡聚糖酶的州 工酶在物理性质、酶活性和细胞内的位置各不相同。这些同工酶大体分为3 种1 2 “第 1 种为碱性同工酶，主要在植株的液泡中组成型表达并积累：第2 种是酸性同工酶 i f 常植株中不存在，但可由病原菌和化学物质诱导产生，主要在细胞间隙表达积祟。 这两种类型的酶由一个小的基因家族编码，同一类型基因之间的氨基酸序列同源性高 于不同类型的。第3 种主要以烟草中细胞外表达的酸性p r q 和番茄中细胞内表达的 碱性8 一l ，3 葡聚糖酶为代表。第1 种与第2 、3 种分别有5 5 的氨基酸序列同源性 第2 、3 种之间的氨基酸序列同源性约在5 4 5 9 之间i i ”。 4 1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶基因在植物抗真菌基n i 程中的应用 d 一1 ，3 葡聚糖酶的抑菌活性引起人们的重视。迄今，d 一1 ，3 一葡聚糖酶基因已经 转入到烟草、猕猴桃和玫瑰等植物中，获得了转基因植株，其抗性表现不尽一致，由 于几丁质酶和p 一1 ，3 一葡聚糖酶在体外的协同抑菌效果，更多的转化研究则是将p 一1 ，3 一 葡聚糖酶和几丁质酶共同导入受体植物基因组中( 见表2 ) 。j o n g e d i j k 等】将烟草的 c t a s s i 型b l ，3 - 葡聚糖酶基因和c l a s s i 型几丁质酶基因转化番茄肘发现，二者有明显 寰1 p - 1 3 - 葡聚一豆其基因在不圈擅中的研究状况 ! ! ! ! ! ：垒坚! ! ! 三苎! ! ! ! ! ! ! ! 璺z2 1 生! 圭g ! ! ! 1 2 1 兰! ! 垒! 垒g ! ! 壁也p ! ! 翌主苎 植物鉴定或分离的酶的性质诱导物与其他植物葡聚糖酶 参考文献 基因个数的同源性 的协同表达效果，番茄发病率降低3 6 5 8 ，但基因表达时抗病能力没有增强。同 样，s e l a - b u u r l a g e 等1 4 5 在烟草d 1 ，3 葡聚糖酶和几丁质酶转化烟草的研究中，发现胞 间汁液对立枯病具有很强的抑制效果，而单独转化其中的一个基因时，效果降低。对 于卵菌纲的真菌丽言，由于其菌丝壁不含几丁质，转化几丁质酶基因没有效果，导入 b 一1 ，3 一葡聚糖酶基因则更有意义。z h u 等【4 6 】在水稻碱性几丁质酶基因r c h i o 和苜蓿酸 性b l ，3 葡聚糖酶基因4 g z 们转化烟草的研究中发现，通过杂交的方式将二者协同 表达可以明显增强烟草对蛙眼病的抗性，而且其抗性与基因的拷贝相关，表现为 ( c h i t i n a s e 2 n + g l u c a n a s e 2 n ) ( c h i t i n a s e l n + g l u c a n a s e l n ) ，即二基因在纯合状态下的协 同表达效果更好，表现在发病期的延迟，病斑数和病斑面积的减小。转基因植株不仅 对于烟草的蛙眼病抗性提高，同时对于叶斑病及苗期猝倒病同样有抵抗效果。可见。 p r 类抗病基因协同表达可能是一种创建抗病新资源的有效方式。 寰21 3 - 1 8 - 囊i l l 一基园抚寞基园工曩研究 a d v a n c e 口nt h e5 t u d yo f 争1 ，3 哩i n c 瑚口eg e n e si nc o n t r o lo f f u n g a ld i s e a s e s 植物外源基因 抗病效果 参考文献 烟草烟草b 一1 3 - 葡聚糖酶抗性提高( p h y t o n p h t h o r n p a r a s i t i c a 和p e r o n o s p o r at a b a c i n a l 猕猴桃大豆b - 1 3 - 葡聚糖酶抗性提高( b o r n t i s c i n e r e a ) 攻瑰大麦b 一1 3 - 葡聚糖酶没有效果( d i p l o c a r p o n r o s a e ) 烟草烟草b 一1 3 - 葡聚糖酶和几丁质酶有抑制作用( f u s a r i u ms o a n i ) 烟草 苜蓿b 一1 3 - 葡聚糖酶和水稻几丁质酶症状减轻( c e r c o s p o r a n i c o t t a l l a e ) 番茄炳草b l ，3 一葡聚糖酶和几丁质症状减轻3 娟5 鼹 ( f u s a r i u mo x y s p o r u m f s p h ) v o p e r s i c i ) 烟草大麦b 一1 。3 - 葡聚糖酶和几丁质酶症状减轻( r h i z o c t o n i as o l a n i ) 旨蓿 苜蓿b 一1 3 - 葡黎藉酶和水稻凡丁质酶抗性提高( p h y t o p h t h o r a m e g a s g e r m a ) 没有效果( s t e m p h y l i u m 劬0 扣e ) 胡萝h 烟草b 1 3 一葡聚糖酶和几丁质酶 油菜烟草b 一1 。3 - 葡聚糖酶和几丁质酶 烟草烟草b l 。3 一葡聚糖酶和几丁质酶 抗性增强“l t e r n a r i ad a u c l ar a d i c i n a , c e r c o p o r ac a r o t a e , e r y s i p h eh e r a c l e o ( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r i u m ) 症状减轻( a l t e r n a r i a a l t e r n a t e ) 5 2 】 5 3 j f 5 4 3 p r 类的8 1 ，3 一葡聚糖酶或组成型、或诱导型表达，在不同组织中有不同的表达 反应，而且酶也被运输到细胞的不同部位，对于抵御真菌病原的攻击是具有积极意义 的。然而，迄今为止，没有证据表明该酶在“病原寄主”的相互作用为“基因对基因” 模式，而更为可能的是，该酶参与的是一种对病原攻击的广泛的，非特异性的反应。 由此可见，多种因素参与了植物对于病原攻击的防御反应，这些因素的协同表达 往往能增强寄主的抗病能力，不仅仅是葡聚糖酶和几丁质酶，而且还有几丁质酶和核 糖体失活蛋白等等，因而多因素的改造将成为植物抗病育种的一个发展方向。 5 b 一1 ，3 一葡聚糖酶与其它防卫蛋白的协同表达 1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶基因可以在植物抗病反应中独立地发挥作用，但在植物整个抗病 系统反应中，各种防卫反应往往表现出协同作用。 体外试验表明，6 1 ，3 葡聚糖酶与几丁质酶共同作用时能有效地抑制供试的1 8 种 真菌中的1 5 种。b o i l e rt 等( 1 9 8 3 ) 悼鄙报道，在几丁质酶与8 1 ，3 葡聚糖酶的协同作 用下对真菌细胞壁的降解作用增强。将c l a s si 几丁质酶和c l a s si1 3 - 1 ，3 葡聚糖酶的基 因修饰后再转入烟草，从转入修饰过的基因的烟草胞外检测出其产物，这两种酶在体 外仍具抑菌活性，两酶共存时有增效作用。这两种酶在体外对镰刀菌( f u s a r i u ms o l a n i ) 4 m 嗍 叫 等真菌也呈现了抑制活性。 b 1 ，3 葡聚糖酶或几丁质酶与核糖体失活蛋白也具有很强的协同作用。李明等 ( 1 9 9 9 ) 【56 j 将含有大麦核糖体失活蛋白( b r i p ) 编码序列的质粒p r c 2 4 b r i p 改造 后，依次与含有水稻碱性几丁质酶基因r c h l 0 和水稻酸性几丁质酶基因r a c 2 2 编码 序列的质粒p a b c 2 以及含有苜蓿b 一1 ，3 葡聚糖酶编码序列的质粒p a a g 8 9 连接，得 到了中间载体p r a s l 0 。p r a s l 0 再与根癌农杆菌双元载体p c a m b i a l 3 0 0 连接，得 到了合适水稻转化的双元载体p r a s l 3 0 0 ，并导入到根癌农杆菌l b a a 4 4 0 4 中。蔡应 繁等( 2 0 0 0 ) t 5 7 5 8 j 构建了来自大麦c d n a 克隆的b 1 ，3 葡聚糖酶基因等的植物表达载体， 通过基因枪法等导入棉花，已获得转基因棉株。 可见，8 1 ，3 葡聚糖酶是植物抗真菌病中重要的抗性物质之一，而且作为植物内 源蛋白的b 1 ，3 葡聚糖酶和几丁质酶，在转基因植物的安全性方面更有其利用价值。 有的学者( m e i n s ，fj l l 9 9 3 ) 甚至预测，由病原微生物侵染诱导植物产生的i 类b 1 ，3 葡聚糖酶和几丁质酶的结合可能是潜在的体外杀真菌剂【5 9 l 。将其应用于植物抗真菌 病基因工程中，外源b ! ，3 葡聚糖酶既可单独地被导入植物发挥作用，又可与其它防 卫蛋白一起转入植物协同表达。 6 p l ，3 。葡聚糖酶基因的表达调控 不同类型的b 1 ，3 葡聚糖酶具有不同的诱导调控形式，酸性1 3 - 1 ，3 一葡聚糖酶分泌 到细胞问隙，其表达受病原菌攻击、水杨酸和细胞分裂素的诱导，而对乙烯和伤害的 诱导不敏感。碱性类型则在健康的植株根部和下部叶片中组成性表达。碱性6 1 ，3 葡 聚糖酶定位于液泡，受到病原侵染、乙烯和紫外辐射以及伤害的诱导，但受细胞分裂 素和生长素的抑制i 矧，碱性b 1 ，3 ，葡聚糖酶一般对s a 的诱导不敏感【6 l 】。 从拟南芥中克隆的b g 4 和b g 5 则不受病原菌和水杨酸的诱导，植株营养生长期 间也不受阶段发育调控和激素的诱导，但对于b g 4 ，子房的花柱和隔膜中表达量高， 该基因的表达与生殖过程有关1 6 2 1 。 b 一1 ，3 一葡聚糖酶基因的表达中。一些顺式因子和反式因子在转录调控中发挥了重 要作用。在水杨酸应答元件( a s l i c y l i c a c i d r e s p o n s e e l e m e n t ，s a r e ) 的研究中，s h a l l 等【6 3 】发现在p 1 ，3 葡聚糖酶基因p r - 2 d 的启动子序列中，一个2 5 b p 的顺式元件对于 s a 的诱导具有重要作用，试验表明核内存在反式因子与其特异结合m 】。大量研究表 明，水杨酸是植物抗病反应中的重要信号分子，s a 调控转录可能涉及到基因启动子 的多个区域。 烟草b 1 ，3 葡聚糖酶基因g l n 2 启动子区中存在乙烯应答元4 锻 e t h y l e n er e s p o n s e e l e m n e t ，e r e ) ，其核心序列为a g c c g c c ，又称为a g c 盒【6 ”。e r e 结构在许多病 原反应基因的启动子中存在，与相应的乙烯应答元件结合蛋白( e t h y l e n er e s p o n s i v e e l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n ，e r e b p ) 作用1 ”1 。 v a n d e r h e e 等州对烟草的研究表明酸性葡聚糖酶基因上游1 7 5 0 b p 序列含有多个 调控元件，而碱性葡聚糖酶基因启动子1 4 7 6 到“6 的区段是其器官特异表达和阶段 发育调控以及侵染和其它胁迫处理诱导所必须的，启动子序列中含有若干个g c 元件 ( g g c g g c t c t t a ) n - - i 能与烟草碱性葡聚糖酶基因的诱导表达有关。 多项研究表明一个基因的上游序列中可以存在某种诱导因子的多个j ：陵式；：件，途 些顺式元件之间的关系是极为复杂的。另一方面，即使在一个很小的区段，如2 5 b p 区段中，也可能存在紧密毗邻的几个元件，这给顺式元件的鉴定带来困难。反式因子 与顺式因子之间的作用可能并不是真正专一性的，随着外界环境条件的改变，这种特 异性也可能发生改变，就s a 而言，在b 1 ，3 葡聚糖酶基因p r - 4 的5 上有序列中就存 在多个反应区段，而且调控s a 的过程中也可能远远不止一两种反式因子。 6 二、引言 一、j l 口 真菌病害一直是危害植物生长、影响作物产量的主要病害，病发流行时损失巨大 一般年份的损失及化学农药防治造成的污染亦相当严重。因此如何有效地防治真菌病 害一直是育种学家们努力攻克的难题。自栽培农业以来，人类采取了多种措施来防治 真菌病害，多数病害的防治主要依赖于化学农药的使用和抗病育种，但传统抗病育种 费事费力，而化学农药的使用易对环境造成污染，危害人类、牲畜的健康。防治该类 病害的根本措施是利用抗病品种，但由于病菌变异迅速，抗源缺乏及目前常规育种手 段繁杂，抗病品种远远满足不了生产上的需要。所以，人们考虑应用生物技术来防治 植物病害，解决上述难题。利用生物技术防治植物病害，主要涉及植物抗性基因和病 原菌无毒基因的分离和克隆、对病原菌代谢过程中产生的酶的抑制剂及抗菌蛋白的研 究。出于基因工程技术的迅速发展，利用动物、植物和微生物的基因相互转移，突破 了远缘杂交不亲和性的困难，开辟了作物抗病育种的新途径。 植物基因工程是在分子水平上定向重组d n a 并导入植物细胞改造其遗传特性 从而使作物的性状得到改良，或者作为重要经济价值的生产体系。基因克隆技术、 d n a 重组技术、分子杂交技术及基因表达调控等分子生物学操作技术的发展为植物 蛙因工程奠定了基础。 自1 9 8 3 年首次获得转基因烟草以来，迄今通过基因工程技术已可以把不同来源 ( 包括动物、植物和微生物) 的基因导入植物细胞并整合迸植物基因组中，获得转 基因植株。山于植物基因工程技术不仅不受物种之问的生理障碍的限制。可以充分利 j j 不f 司种质基因资源来改良农作物，而且克服了传统育种方法存在的培育新品种j 嚣要 的时间长，过程烦琐，需要耗费大量的人力和物力的局限性，因此基因工程技术已成 为改良植物性状，培育优良高产作物新品种的分子育种技术。 1 研究意义 茶树病害与其它作物相比，在病原菌方面有如下特点：到目前为止，我国茶树l 。 部和茎部几乎没有发现细菌病原物，也很少有病毒和类病原体引起的病害，以真菌病 害最多。大量的病虫害严重影响了茶叶的质量和产量，茶叶作为一种饮料，若以化学 方法防治茶树病虫害，直接关系到人们的身体健康，所以茶叶的农药残留量问题已经 越来越引起人们的普遍关注。长期以来，茶叶工作者采用综合防治等方法尽量减少农 药的使用量和农药残留量，同时通过各种方法选育抗病虫的品种，但进展不大，因此 利用转基因技术培育抗病虫品种已迫在眉睫【6 ”。到目前为止。已从许多不同植物分离 到6 1 ，3 一葡聚糖酶基因，而且毗烟草中p - l ，3 - 葡聚糖酶研究最透彻，但在木本植物中 关于b 一1 ，3 一葡聚糖酶的作用却知之甚少。本研究对茶树鲜时中具有广谱抗真菌病害的 b i ，3 葡聚糖酶基因c d n a 进行了克隆、序列的测定和酶活性检测，旨在为开展茶树 抗真菌病害的基因工程研究及运用生物技术培养茶树良种打f 基础。 2 技术路线和研究内容 2 1 技术路线 茶树叶片总r n a 的提取和c d n a 的第一链合成 上 b - i ，3 一葡聚糖酶c d n a 的5 - r a c e 扩增 土 1 3 - 1 ，3 - 葡聚糖酶c d n a 全序列的扩增 构建原核表达载体并转入e c o l i 中 、l 表达蛋白检测和酶活性鉴定 2 2 研究内容 2 21d l ，3 葡聚糖酶c d n a 的5 - r a c e 反应：根据已知3 一端的部分序列设计特异引 物，进行5 - r a c e 反应，扩增5 - 端的序列。 2 2 2b l ，3 一葡聚糖酶c d n a 全序列的扩增：根据已知3 端的部分序列和克隆得到的 5 - 端序列设计全长特异引物，扩增全长序列。 2 2 3 原核表达重组载体的构建：选用p e t 3 2 a 原核表达载体和b l 2lt r x b ( d e 3 ) 宿主菌， 将g l u 基因构建入p e t 3 2 a 载体，转化b l 2 1 t r x b ( d e 3 ) 菌株，经i p t g 诱导表达蛋白。 2 2 4 表达蛋白检测和酶活性鉴定：选用薄层层析法分析表达蛋白的酶活性。 ， 三、材料与方法 1 材料 鲜叶采自安徽农业大学茶业系教学茶园，品种为龙井4 3 4 c a m e h 胁s m e n s 担( l ) 0 k u n t z e s 一芽二叶初展。 2 仪器与试剂 2 1 主要仪器设备 p c r 仪：b i o t r m e t r a - t g r a d i e n t 凝胶成像系统：上海天能( t a n n o ng i s 凝胶图像处理系统) 电泳仪：北京六一仪器厂 超低温冰箱：r 本s a n y o 高速冷冻离心机：b e c k m a nc o u l t e r 台式离心机：上海安事科学仪器厂 制冰机：上海安亭科学仪器厂 恒温冷冻水循环仪：德国h u b e r 公司( p l o y s t a t ek 6 - 1 ) 电子天平：m e t i l e r1 o l e d o 公司 d h 计：m e t i l e rt o l e d o 公司 7 5 6 m c 紫外可见分光光度计：上海第三仪器厂 超净工作台：上海浦东物理光学仪器厂 立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂 电热恒温培养箱：南京仪器厂 真空干燥箱：m e d c e n t e re i n r i c h n 州g e ng m b hv a c u c e l l 微量移液器：吉尔森数字可调式移液器和e p p e n d o f f 电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏试验设备有限公司 2 。2 试剂 上海生工产品：d n am a r k e r 、t a qd n a 聚合酶，p c r 合成系统、g e le x t r a c t i o n k i t c l o n t e c h 公司产品：s m a r tr a c e e d n a a m p l i c a t i o nk i t ( 含t h ea d v a n t a g e2 p c r k i t 和n u c l e o t r a pg e le x t r a c t i o nk i t ) 、a d v a n t a g e g c2p c r k i t p h a m a c i a 公司产品：m r n a 提取纯化试剂盒 9 t a k a r a 公司产品：曲i 、b a m h l 、p m d 1 8 - t 载体、t a q t md n a 聚合酶 p y r o b e s t t md n a 聚合酶、x - e c o t t 4 id i g e s tm a r k e r p r o m e g a 公司产品：1 4d n a 连接酶和m m l v 逆转求酶 n o v a g e n 公司产品：菌株e c o l ib l 2 1 t r x b ( d e 3 ) i i 收达拔体p e t 一3 2 a ( + ) m b i 公司产品：d n am a r k e r 与蛋白质m a r k e r 实验中所用引物的合成及p c r 产物的n y ：- ：作皆山上海 j - ；l l 合作宠成。 3 方法 3 1 茶鲜叶中r n a 的提取、检测与e d n a 第一链的合成 3 1 1 总r n a 的抽提与检测：参考文献 e 7 6 8 的方法，稍有修改 i ) 茶鲜叶( 一芽二叶初展) 放在研钵中，加入液态氮和玎i 溶性聚乙烯毗略炕酮 ( p v p p ) 磨成粉术，p v p p 设5 和1 0 ( w w ) 2 个处理。准确称取i 司样重量的粉 末( 按粉术：鲜叶= l ：0 8 折算为4 5 0 m g 鲜叶) 分别放入冰上预冷的离心管中。 2 ) 每管加入o 9 m l 变性溶液( 含4 m o l l 异硫氰酸胍，2 5 m m o l l 柠檬酸钠p h 7 0 0 5 十二烷基肌氨酸钠，o 1 m o l l 2 - 巯基已醇) ，冰浴1 5 r a i n ，间歇缓慢搅动。 3 1 4 c ，1 4 0 0 0 9 ，离心2 0 m i n ，将上清液移至干净的预冷的离心管中。 4 1 加入1 1 0 体积2 m o l ln a a c ，p h 4 0 ，等体积饱和酚( p h 3 5 ) ，1 5 体积氯仿 异戊醇( 4 9 ：1 ) ，颠倒l o 次，充分混匀，冰浴1 5 r a i n ，让其静止分层。 5 14 ，1 4 0 0 0 9 ，离心2 0 m i n 。将上清液移至干净的离心管中，加入等体积的异 丙醇，混匀后簧7 0 冷冻一个小时或2 0 冷冻2 小时以上，沉淀r n a 。 6 14 c ，1 3 0 0 0 9 离心2 0 m i n ，弃1 1 清。川2 5 0 p l 变性溶澉彻底溶解沉淀加入 等体积的异丙醇，混匀后置。7 0 冷冻3 0 分钟或型长时m ，沉淀r n a 。 7 14 c ，1 3 0 0 0 9 ，离心2 0 m i n ，j f j1 m l7 5 乙醇淋沈( 即离心) r n a 沉淀2 次。 每次冰浴5 m i n ，4 c ，1 2 0 0 0 9 ，离心5 m i n 。 8 ) 除尽乙醇空气中干燥沉淀。刚3 5