（生物化学与分子生物学专业论文）大薯种质资源遗传多样性分析.pdf

r 一 海南大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品或成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 论文作者签名： 平支欠 日期：如。年月乡日 学位论文版权使用授权说明 本人完全了解海南大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海南大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。本人在导师指导下完成的论文成果，知识产权归属海 南大学。 保密论文在解密后遵守此规定。 论文作者签名： 日期：加卜年 日 日 本人已经认真阅读“c a l l s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的学位论 文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库”中全文发布，并可按“章程”中规定享受相关 论文作者签名： 日期：7 口年 积支杰 肖3 日 导师签；芳喀、豇 日期：砂年月多日 r 摘要 大薯( d i o s c o r e aa i a t al ) ，又名参薯，为薯蓣科薯蓣属藤本植物；生育期短， 产量潜力高，且具有一定的药用价值。本研究以产白海南、云南、广西、广东、 福建5 省的1 3 3 份大薯种质为材料，对其农艺性状进行观察记录分析；用改良 c t a b 法提取叶片材料基因组d n a ，采用r a p d 分子标记和i s s r 分子标记对其 种质资源进行分类评价；实验结果表明： 1 农艺性状分类研究。对1 3 3 份大薯材料的1 2 个农艺性状进行统计。s a s 数据分析表明，在欧式距离为1 2 时，可以将材料分为六个大类。第1 类群对应 叶片对生，右旋缠绕方向。第1 i 类群对应左旋缠绕方向。第、类群对应叶片 较为瘦长。第v 类群对应嫩叶绿色。第类群对应叶片互生。 2 c t a b 提取基因组d n a 。采用改良c t a b 法( 1 0 0 m m o l l t r i s h c lp h 8 0 ， 1 4 m o l ln a c l ，2 0 m m o l le d t ap h 8 0 ，2 c t a b ，3 p v p ，单独加入终浓度为 2 的b 一巯基乙醇，l u g m l 的r n a s e a 酶) ，采用苯酚氯仿异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 抽 提。用该法提取的d n a 能满足r a p d ( 随机扩增多态性d n a ) 和i s s r ( 简单重复 间序列区间) 分析的要求。 3 大薯r a p d 分子标记体系的构建与结果分析。2 0 t l 大薯r a p d p c r 反应 体系中包括：4 0 n g 模板d n a ，1 0 p m o l l 的引物，1 0 此的2 x m i x 混合液，加 水至2 0 “l 。反应程序为9 4 预变性5 m i n ；前6 个循环为循环9 4 c 变性3 0 s ，3 2 。c 下退火9 0 s ：后3 5 个循环为9 4 变性3 0 s ，4 0 c 一4 2 c 退火温度下4 5 s ，7 2 延 伸9 0 s ；7 2 延伸1 0 m i r a 扩增后p c r 产物在4 c 保存。经过筛选，在1 0 0 条引 物中筛选出8 条多态性良好的引物，得到4 4 个位点，多态位点4 2 个，多态位点 百分率为9 5 。u p g m a 聚类结果表明：1 3 3 份材料间的遗传相似系数范围为 o 4 8 4 - - 0 8 9 2 ，平均遗传相似系数为0 6 8 7 ，在相似系数为0 6 6 5 时将所有材 料分为6 个大类。 4 大薯i s s r 分子标记体系的构建与结果分析。2 0ul 大薯i s s r p c r 反应体 系中包括：6 0 n g 模板d n a ，1 0 “m o l l 的引物，1 u 的t a q 酶，1 8 7 5 m m o l l 的 m 9 2 + ，o 5 0 0 m m o l l 的d n t p s ，2 此的10 b u f f e r ，加水至2 0 “l 。反应程序为 9 4 。c 预变性5 m i n 每个循环9 4 。c 变性4 5 s ，4 8 。c 5 2 。c 退火4 5 s ，7 2 c 延伸9 0 s ， 4 5 个循环；7 2 。c 延伸1 0 m i n 。扩增后p c r 产物在4 。c 保存。经过筛选，在1 0 0 条引物中筛选出l o 条多态性良好的引物，得到9 1 个位点，多态位点8 5 个，多 态位点百分率为9 3 。通过n t s y s 软件分析材料间的相似系数和聚类图，遗传 相似系数在0 6 2 2 3 - 0 。9 3 1 5 之间，平均遗传相似系数为0 6 7 4 。在相似系数0 6 6 5 时，对1 3 3 份大薯材料可以分为七个大类。 关键词：大薯遗传多样性r a p di s s r a b s t r a c t d i o s c o r e aa l a t al ，a l s ok n o w na sc h i n e s ey a mo rw a t e ry a m ；w i t has h o r t l i f e c y c l ea n dh i g hy i e l dp o t e n t i a l ，h a v i n gc e r t a i nm e d i c i n a la n dn u t r i t i o n a lv a l u e ；i n t h i ss t u d y , t h ea g r o n o m i ct r a i t so f13 3g e r m p l a s mo fd i o s c o r e aa l a t alc o l l e c t e df r o m h a i n a ny u n n a ng u a n g d o n gg u a n g x ia n df ji a ni nc h i n aw a sr e g i s t e r e da n da n a l y s e d ； m e t h o do fm o d i f i e dc t a bf o rd n ae x t r a c t i o nf r o md i o s c o r e aa l a t al r a p da n d i s s rm o l e c u l a rm a r k e r sm e t h o d sw e r ea p p l i e dt od e t e c tt h eg e n e t i cd i v e r s i t ya n d p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s r e l a t i o n s h i po f13 3g e r m p l a s m s t h em a i nr e s u l t sa r e a s f o l l o w s ： 1 r r e s e a r c ho nc l a s s i f i c a t i o no fa g r o n o m i ct r a i t s 12a g r o n o m i ct r a i t so f133 g e r r n p l a s m sh a sb e e na n a l y s e d s a sc l u s t e r i n gr e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h e s ey a mc o u l d b ec l u s t e r e di n t o6g r o u p sa t1 2i nc e d s t h ei g r o u ph a v eo p p o s i t ep h y l l o t a x i sa n d r i g h t h a n dt w i s t t h ei ig r o u ph a v el e f t - h a n dt w i s t t h ei i i 、i vg r o u p sh a v en a r r o wl e a t h evg r o u ph a v eg r e e nb u r g e o n t h ev ig r o u ph a v ea l t e r n a t ep h y l l o t a x i s 2 e x t r a c t i o no fd n a ：t h ei m p r o v e dm e t h o do fc t a b ( 10 0 m m o l l t r i s - h c l p h 8 0 ，1 4 m o l l n a c i ，2 0 m m o l le d t ap h 8 0 ，2 c t a b ，3 p v p ，a d d2 1 3 m e ， l u g m l 的r n a s ea i n s i n g l ew a y ) w a su s e dt oe x t r a c tt h ed n ao fs p e c i e si n d i o s c o r e aa l a t a l ，a n d e x t r a c t e dw i t h p h e n o l c h l o r o f o r m i s o a m y l a l c o h o l ( 2 5 ：2 4 ：1 ) b e c a u s et h ed n ab yt h em e t h o dw a ss u i t a b l ef o rr a p da n di s s ra n a l y s i s 3 o p t i m i z a t i o no fr a p d p c rr e a c t i o ns y s t e mf o rd i o s c o r e aa l a t al a n dr e s u l t a n a l y s e r a p d - p c rw a sp e r f o r m e di na2 0 1 t lr e a c t i o nm i x t u r e 谢m4 0 n g 2 0 1 ad n a ， 1 0 9 m o l lr a n d o mp r i m e r ，10 i t l 2x t a qp c rm a s t e r m i x t h et e m p e r a t u r ep r o f i l e u s e df o rr a p d - p c rw a s9 4 cf o r5m i n ；f o l l o w e d b y6c y c l e so f9 4 cf o r 3 0 s ，3 2 * c f o r9 0 sa n d7 2 cf o r9 0 s ；a n df o l l o w e db y6c y c l e so f9 4 cf o r 3 0 s ，4 0 - 4 2 f o r9 0 sa n d7 2 f o r9 0 s ；a n dw a st e r m i n a t e dw i t ha10m i nd n a e x t e n s i o ns t e pa t7 2 。c ；s t o r e da t4 c at o t a lo f8r a p d p r i m e r sw e r es e l e c t e df r o m 10 0p r i m e r s ，a n d4 4 a m p l i f i e ds i t e sw e r ed e t e c t e d ，o fw h i c h4 2 ( 9 5 ) w e r e p o l y m o r p h i c u p g m ac l u s t e r i n g r e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a t g e n e t i cs i m i l a r i t y c o e f f i c i e n to f13 3m a t e r i a l sw a sr a n g e df r o m0 5 612t o0 9 7 6 2 ，晰t l lt h ea v e r a g eo f 0 6 87 w ec a ng e ts i xg e n u sf r o ma l lt h em a t e r i a l sw h e nt h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n ti s 0 6 6 5 4 o p t i m i z a t i o no fi s s r - p c rr e a c t i o ns y s t e mf o rd i o s c o r e aa l a t al a n dr e s u l t a n a l y s e i s s r - p c rw a sp e r f o r m e di na2 0 止r e a c t i o nm i x t u r e 晰t h6 0 n g 2 0 p ld n a ， 1 0 9 m o l lp r i m e r ，1 ut a qp o l y m e r a s e ，1 8 7 5 m m o l lm 9 2 + ，0 5 0 0 m m o l l d n t p ，2 p , l10 xb u f f e r t h et e m p e r a t u r ep r o f i l eu s e df o ri s s r p c rw a s9 4 cf o r5 m i n ；f o l l o w e db y4 5c y c l e so f9 4 f o r4 5 s ，4 8 - - 5 2 cf o r4 5 sa n d7 2 cf o r9 0 s ；a n d w a st e r m i n a t e dw i ma10m i nd n ae x t e n s i o ns t e pa t7 2 c ；s t o r e da t4 c at o t a lo f 1 0i s s rp r i m e r sw e r es e l e c t e df r o m1 0 0p r i m e r s ，a n d9 1a m p l i f i e ds i t e sw e r e d e t e c t e d ，o fw h i c h8 5 ( 9 3 ) w e r ep o l y m o r p h i c u p g m a c l u s t e r i n g r e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a t g e n e t i cs i m i l a r i t yc o e f f i c i e n to f13 3m a t e r i a l sw a sr a n g e d f r o m 0 6 2 2 3t o o 9 31 5 ，w i mt h ea v e r a g eo f0 6 7 4 w ec a ng e ts e v e ng e n u sf r o ma l l t h em a t e r i a l sw h e nt h es i m i l a r i t yc o e f f i c i e n ti s0 6 6 5 k e yw o r d ：d i o s c o r e aa l a t al g e n e t i cd i v e r s i t yr a p d i s s r i v 目录 摘要工 a b s t r a c t ii 工 1 文献综述1 1 1 大薯种质资源概述1 1 2 大薯形态学研究进展1 1 3 大薯分子标记研究进展2 1 4 有关大薯的其他研究进展2 1 4 1 大薯种质理化特性研究2 1 4 2 大薯种质抗病、抗逆性研究3 1 4 3 大薯组织培养和无性繁殖的研究3 1 4 4 大薯品种选育研究4 1 5 当前分子标记种类及特点一4 1 5 1 限制性长度片段多态性r f l p 5 1 5 2d n a 随机扩增多态性r a p d 6 1 - 5 3 扩增片段长度多态性a f l p 。6 1 5 4 简单重复序列s s r 8 1 5 5 简单重复序列区间i s s r 9 1 5 6 序列相关扩增多态性s r a p 1 0 1 6 本研究的目的意义1 0 1 7 本研究的技术路线1 1 2 材料与方法1 2 2 1 实验材料与试剂1 2 2 1 1 实验材料1 2 2 1 2 实验设备与试剂1 3 2 1 2 1 实验设备与试剂1 4 v 2 1 2 2 实验试剂配置1 5 2 2 试验方法1 6 2 2 1 田间形态学记录1 6 2 2 1 1 大薯种质资源的保存1 6 2 2 1 2 生物学性状观察记录1 6 2 2 1 3 统计分析方法1 6 2 2 2 大薯基因组d n a 提取1 6 2 2 2 1 材料选择1 6 2 2 2 2 提取及纯化步骤1 6 2 2 3r a p d 分子标记1 7 2 2 3 1r a p d - - p c r 体系的建立1 7 2 2 3 2 引物的筛选1 9 2 2 3 3 数据统计分析方法1 9 2 2 4i s s r 分子标记1 9 2 2 4 1i s s r p c r 体系的建立1 9 2 2 4 2 引物的筛选2 1 2 2 4 3 数据统计分析2 1 结果与分析2 2 3 1 适合提取大薯基因组d n a 方法2 2 3 1 1 大薯基因组d n a 的初步提取2 2 3 1 2 大薯基因组d n a 的纯化2 2 3 1 3 基因组d n a 的o d z o d z 值检测2 3 3 1 4 总结2 3 3 2 大薯形态学统计分析2 3 3 2 1 统计数据记录情况2 3 3 2 2 对数据处理和聚类分析2 8 3 3 大薯r a p d p c r 体系的建立及r a p d 结果分析3 1 3 3 1 大薯r a p d - p c r 体系的建立优化3 1 3 3 1 1 引物退火温度的确定3 l v i 3 3 i 2r a p d - p c r 体系反应循环数的确定3 1 3 3 i 3 模板d n a 浓度的确定3 2 3 3 1 4 引物浓度的确定3 2 3 3 1 5r a p d p c r 反应体系的验证3 3 3 3 2 大薯r a p d - p c r 结果的分析3 3 3 3 2 1 筛选出引物的扩增情况3 3 3 3 2 2 多态性比例统计j 3 5 3 3 2 3 r a p d 结果分析及聚类分析3 5 3 4 大薯i s s r - p c r 体系的建立及i s s r 结果分析3 8 3 4 1 大薯i s s r p c r 体系的建立优化3 8 3 4 i 1 引物退火温度的确定3 8 3 4 1 2i s s r - p c r 反应中循环数目的确定3 8 3 4 1 3 模板d n a 浓度的确定3 9 3 4 1 4 引物浓度的确定4 0 3 4 1 5m 9 2 + 浓度的确定4 1 3 4 1 6t a q 酶浓度的确定4 1 3 4 1 7d n t p s 浓度的确定4 2 3 4 1 8i s s r p c r 反应体系的验证4 3 3 4 2 大薯i s s r p c r 结果的分析4 3 3 4 2 1 筛选出引物的扩增情况4 3 3 4 2 2 引物退火温度及多态性比例统计4 5 3 4 2 。3 i s s r 结果分析及聚类分析4 6 3 5 大薯r a p d 与i s s r 结果相关性分析4 7 4 讨论4 9 4 1 大薯形态学统计分析4 9 4 2 基因组d n a 的提取4 9 4 3 大薯r a p d 分子标记体系的建立4 9 4 5 大薯i s s r 分子标记体系的建立5 0 4 6 大薯分子标记特点分析5 0 v l l v i i i 2 3 9仁u 工u 只u hk 一 献 一 论 文 一 结考谢 鼠 参致 1 文献综述 一一 ， 1 1 大薯种质资源概述 大薯( d i o s c o r e aa l a t al 1 ，又名参薯，为薯蓣科薯蓣属藤本植物。大薯营养 丰富，色泽鲜艳，口感俱佳，是人们喜爱的一种副食；大薯产量潜力高，单株块 茎产量一般可达1 0 公斤，高产的甚至可达到5 0 公斤以上；大薯种植分布范围广， 在我国湖北及其以南的省份均有种植；生育期短，4 - 6 个月就可收获( 海南地区) ： 大薯淀粉含量较高，达2 8 ，与马铃薯和甘薯的淀粉含量相当。另外大薯还可用 作饲料、中医药等。 本研究收集了主要来自云南、广西、广东、福建、海南五省的1 3 3 份大薯材 料，并对这些材料进行种植保存，观察记录每一份材料的基本农艺性状进行数据 分析，综合r a p d 和i s s r 分子标记结果进行数据分析。 国内外有关种质资源的研究报道较少。王天云等( 1 9 9 1 ) 对海南岛的大薯、 毛薯等资源进行了初步考察，其中收集到4 9 份大薯材料。 1 2 大薯形态学研究进展 从形态学和表型性状来检测遗传变异是最直接简便易行的研究方法。它是根 据研究材料的外部特征特性，如株高、叶片大小、叶色、花色等可以观察到的性 状来研究生物遗传多样性的方法。形态学研究具有简便、易行和快速的特点，所 以很久以来，物种的遗传多样性研究都是以形态学研究作为主要方法，特别是在 农作物研究方面，应用尤其广泛。但是表型性状易受环境影响而发生变化，在特 定情况下一些表型性状的变化并不能真实地反映物种的遗传变异，因此，只依赖 表型性状还不能全面准确地了解物种的遗传变异状况，还需要与其它检测方法结 合起来进行更深层次的研究，并加以比较和验证( 李月仙，2 0 0 9 ) 。 国外学者对大薯形态学研究较多。日本的s h i w a c h ih ( 1 9 9 5 ) 对收集的3 6 份大薯种质进行了生态学、形态学评价，以及综合评价。n a g a s h i m at ( 2 0 0 3 ) 等研究了从巴布亚新几内亚收集到的1 5 个大薯地方品种的特性和种内差异，并 且与怀山药n a g a i m o ( d o p p o s i t a ) 进行了对比。s e e s a h a ia ( 1 9 9 9 ) 评估了拉美洲 7 个大薯品种在本地的基因维持和农艺价值。对其形态特征和产量数据进行考 测。a m i n a ha 等( 2 0 0 5 ) 评估了马来西亚两种不同类型土壤环境下大薯的产量 表现和形态学特征。k h a n d e k a rrg 等( 2 0 0 0 ) 对几个大薯品种的产量、块茎外 形、风味、肉色花色素甙含量等性状进行了评估。方玉霖等( 2 0 0 2 ) 对参薯 ( d i o s c o r e aa l a t al ) 等薯蓣属植物的叶脉序特征及其分类学意义进行了研究。 1 3 大薯分子标记研究进展 分子标记是以植物遗传物质d n a 分子的多态性为基础的遗传标记，其测定 结果也不受环境条件和发育情况的影响，与形态性状综合分析可以更加科学的反 映出被研究材料的遗传特性。 大薯分子标记的研究国内报道较少，国外学者研究较多。m a l a p ar ( 2 0 0 5 ) 等用a f l p ( 分子标记法) 对大薯的遗传多样性和大薯与薯蓣科植物d n u m m u l a r i al a m 和d t r a n s v e r s ab r 的相关性进行了研究。m i g n o u n ahd ( 2 0 0 2 ) 等人报道了基于a f l p 标记和q t l 分析的大薯分子遗传连锁图谱构建研究。 l e b o tv 等( 1 9 9 8 ) 通过对源自南太平洋、亚洲、非洲和加勒比海地区的2 6 9 个 大薯品种同工酶变异分析，探讨了各个品种之间的遗传关系。e g e s ic n 等( 2 0 0 6 ) 从亚洲中西部不同地理环境收集到5 3 份大薯种质材料，基于a f l p 标记的种内 遗传多样性分析表明，5 3 份种质材料中存在着丰富的遗传多样样性。d a n s i a 等 ( 2 0 0 5 ) 采用常规染色体计数和流式细胞测量对收集于贝宁的4 3 份大薯种质的 了 的 口 日口 了 ) p 含 量，以及植酸、草酸盐等抗营养因子，并进行了品种间比较。h s uc h i n l i n 等( 2 0 0 4 ) 测定了几个品种大薯块茎冷冻干粉的淀粉和直链淀粉含量，并用差示扫描量热法 研究了其鲜粉浆和干粉的凝胶化温度和热函变化。r i l e yck 等( 2 0 0 6 ) 对8 个 种植于牙买加的大薯品种分离得到的淀粉进行了特征特性研究。台湾的w a n gjy 等( 1 9 9 2 ) 研究了三种基因型大薯块茎的贮藏性能。王勇等( 2 0 0 5 ) 采用f o l i n d e n i s ( f d ) 法和普鲁士蓝( p b ) 法测定山药及其同属植物参薯中多酚含量。姜芳婷 等( 2 0 0 4 ) 采用硫酸苯酚显色，分光光度法测定了山药及其同属植物参薯中的 一 多糖含量，结果显示，不同产地山药多糖含量差别不大，而山药和参薯的多糖含 量差别较大。孟祥艳等( 2 0 0 8 ) 介绍了山药( d i o s c o r e a aa l a t al ) 淀粉的制备与组 成，并对其物理化学特性和加工特性，包括淀粉的颗粒形态、溶解度和膨胀度、凝 胶特性等进行了综述。 1 4 2 大薯种质抗病、抗逆性研究 o n y e k a tj 等( 2 0 0 6 ) 采用3 种供试的炭疽病原分离物，通过组培再生苗全 株评价的方法，对6 0 个大薯品种进行抗性评价，将之归为高抗、中抗、中感和 易感4 个类。e g e s icn 等( 2 0 0 7 ) 对源自贝宁、加纳、尼日利亚和波多黎各的4 0 份大薯种质进行了炭疽病抗性和病毒病抗性评价。巴西的a r a n aroc 等( 1 9 9 9 ) 对1 0 份大薯种质进行了炭疽病室内接种抗性评价试验。e g e s icn 等( 2 0 0 7 ) 研究 了大薯6 个基因型之间的炭疽病抗性差异和病毒病抗性差异。a r a n a 等( 1 9 9 8 ) 对 两个大薯品种d i a m a n t e2 2 和c o n c h ad ec o c o 进行炭疽病抗性评价，d i a m a n t e2 2 表现抗性，后者表现易感性。m i g n o u n a ，h d ( 2 0 0 2 ) 报道了大薯品种炭疽病抗性 鉴定和r a p d 标记的应用。o d ub o 等( 2 0 0 6 ) 以4 0 个大薯基因型为研究对象，布 置了田间和室内试验，分别测试了各个基因型对y m v 、d a v 、c m v 、d a b v 4 种薯类易感病毒的抗性。印度m o h a n d a sc 等( 1 9 9 6 ) 进行了3 3 份大薯种质对根结 线虫( m e l o i d o g y n ei n c o g n i t a ) 的抗性评价试验，选出3 份免疫种质，1 份高抗和 9 份抗性种质。b l a c kid ( 1 9 8 3 ) 进行了大薯品种v u r a ib a l a v u 对除草剂的耐受性评 价。 1 4 3 大薯组织培养和无性繁殖的研究 1 9 8 7 年，l a c o i n t ea ( 1 9 8 7 ) 成功构建了大薯组培再生苗，并能在大田正常生 长和块茎发育。g o n z a l e zp a n e q u eo ( 1 9 9 5 ) 等人研究了大薯愈伤组织的诱导。 m e d e r ov 等( 1 9 9 7 ) 报道利用大薯离体再生植株节间切片诱导微鳞芽，继续培养获 得完整的再生苗。m e n e s e ss 等( 1 9 9 7 ) 进行了7 个大薯品种的组培快繁试验，其 中4 个获得成功，再生苗在大田的生长发育表现正常。b o r g e sm 等( 2 0 0 4 ) 研究 了离体保存大薯种质的再生苗构建和扩繁技术。此外，各种因素对大薯组织培养 再生苗的研究报道也较多。j o h njl ( 1 9 9 3 ) 开展植物生长调节剂和光对大薯试管微 薯诱导和形成的影响，以及大薯试管苗的光控发育研究。e s t r a d as i l v e i r a ( 2 0 0 1 ) 、 c m zl i c e agd el a 等( 1 9 9 5 ) 研究了碳源对大薯组培繁殖和再生苗生长的影响。 s a b o r i tv e r d e c i agf 等( 2 0 0 1 ) 研究了氮源对组培繁殖的影响。l a b r a d am 等( 1 9 9 7 ) 研究了类固醇对大薯试管微薯形成的影响等。b a z a b a k a n ar ( 2 0 0 3 ) 、o n j om 等 ( 2 0 0 1 ) 研究茉莉酸、茉莉酸衍生物和赤霉素等物质对大薯试管微薯形成和膨大发 育，以及对试管苗生长的影响。m y o u d at ( 2 0 0 1 ) 等人研究了蔗糖和葡萄糖浓度对 大薯组培再生苗生长发育的影响。s a b o r i tv e r d e c i a , g a s t o nf 等( 2 0 0 1 ) 研究了培养 基剂量和容器接种密度对大薯组培再生苗生长的影响。n o r o s ocb ( 2 0 0 3 ) 研究 了不同配方的预处理对外植体诱导愈伤组织的影响，以及大棚内不同基质配方对 再生苗生长和成活率的影响。m h o u s s o un 等( 1 9 7 9 ) 进行了大薯块茎、叶腋鳞芽和 多数d n a 分子标记以电泳谱带的形式表现个体之间的d n a 差异，是生物分类 学、育种学、遗传学和物种起源与进化、基因定位与功能等研究的重要技术指标 之一。总的说来d n a 分子标记有以下优点：1 具有较强的多态性；2 直接以d n a 为表现形式。不受环境、季节限制，不受个体发育阶段的影响，不存在基因表达 与否的问题，没有组织及器官特异性；3 许多分子标记表现为共显性；4 数量的 丰富性；5 表现为“中性 ；6 经济方便和易于观察记录( 关强等，2 0 0 8 ) 。 目前，比较常见、应用较多的分子标记标术主要有：限制性长度片段多态性 r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ) 、d n a 随机扩增多态性r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 、扩增片段长度多态性a f l p ( a m p l i f i e d f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s ) 、简单重复序列s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 、 简单重复序列区间i s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 序列相关扩增多态性 s r a p ( s e q u e n c e - r e l a t e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ) 、靶位区域扩增多态性 t r a p ( t a r g e tr e g i o na m p l i f i e dp o l y m o r p h i s m ) 等，下面对这几类分子标记的原理 特点及应用做简单介绍。 1 5 1 限制性长度片段多态性r f l p 限制性长度片段多态性r f l p 的基本原理：用限制性内切酶降解从生物中提 取的总d n a ，经凝胶电泳分离这些降解的小片段，再通过s o u t h e r n 印迹法转移 到滤膜上，然后用放射性标记的探针与滤膜上的d n a 杂交，洗去多余的杂交探 针，永久性滤膜经放射性自显影就可发现与探针杂交的d n a 限制性片段。不同 的限制性内切酶，不同来源的d n a 及标记的探针就会有不同的结果组合，利用 这些不同的组合就可以构建r f l p 分子标记图谱( 汤复跃等，2 0 0 6 ) 。 r f l p 技术的优点在于它高效、可靠、可在一个反应内检测大量的限制性片 段，但是它需用同位素或非同位素标记引物，较费时、耗材而且单个探针位点少， 鉴别效率不高；r f l p 标记在遗传上是共显性的，按孟德尔规律传递，这一特点使 得它可以在没有任何形态，生化等标记的情况下，通过直接识别d n a 上的变异 构建遗传图谱，并可有此对一些农艺上较为重要性状的基因进行定位。r f l p 不 受环境影响，同一个体内不同组织的d n a 得到的r f l p 结果是一致的，这就保 证了结果的可靠性。 r f l p 技术是比较早期的分子标记技术，该技术显著的特点就是没有p c r 过 程，进而对d n a 要求较高，且还需要探针，这些都是r f l p 的局限性。目前r f l p 已经很少应用。 1 5 2d n a 随机扩增多态性r a p d 1 9 9 0 年美国的w i l l i a n m s 和w e l s h 分别提出了一种建立在p c r 基础上的 d n a 分子标记技术d n a 随机扩增多态性( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a ，r a p d ) ，利用该技术可在对物种没有任何分子生物学基础信息的情况下 对其进行d n a 多态性分析。其原理是利用一系列人工合成、碱基随机排列的寡 核苷酸单链为引物( 常用1 0 b p 核苷酸) ，通过p c r 技术对所研究的基因组片段进 行扩增，便可得到1 条扩增产物。一般植物基因组每个引物可扩增出2 1 0 个d n a 片段，每个扩增片段代表了基因组上的1 个位点。扩增产物经琼脂糖电泳分离、 e b 染色后即可检测；也可对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用银染法显 示 1 1 】；另外，为提高检测灵敏度，也可对扩增产物进行同位素标记，再用p a g e 分离，用放射自显影检测，扩增产物的多态性基本反映了基因组d n a 的多态性 ( 汤复跃等，2 0 0 6 ) 。 r a p d 基于p c r 技术，相对于r f l p 来言对模板d n a 要求降低，而且技术 简单。该技术不需要d n a 探针，不需专门设计已知序列的引物，且引物的t m 值相对较低，可保证寡聚核苷酸引物与模板稳定结合，也允许引物与模板适当误 配，因而增大了引物在基因组d n a 中配对的随机性，提高了对d n a 的分析效 率。但r a p d 为显性分子标记，不能提供完整的遗传信息，同时，扩增结果易 受外界因素的影响。r a p d 的数量从理论上讲是无限的，因此可以用于构建高密 度的遗传图谱。但r a p d 为显性分子标记，不能提供完整的遗传信息，同时， 扩增结果易受外界因素的影响，对实验条件比较敏感，对操作人员的技术要求比 较高。r a p d 技术适合用于对大薯遗传多样性的研究。( 郑学项等，2 0 0 9 ) 目前r a p d 已在橄榄、桑树、长叶榧、青牛胆属植物、人参等植物研究中 广泛应用( 汪伟等，2 0 0 6 ) ，r a p d 分子标记技术还可用于检测外界环境对生物体 基因组结构的影响。e n a n m r ( 2 0 0 6 ) 利用r a p d 分子标记检测菜豆中重金属的 遗传毒性。 1 5 3 扩增片段长度多态性a f l p a f l p 的基本原理( 李成涛等，2 0 0 8 ) ：对基因组总d n a 或者e d n a 酶切后 6 经p c r 进行选择性扩增，随后将特定的接头连接在这些d n a 片段的两端。接头 序列加上邻近的限制性酶切位点序列用作引物结合位点，然后用与接头序列相对 应的特定引物进行p c r 扩增，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增片段。利 用一套特定的引物在未知d n a 序列的情况下，可在1 次单个反应中检测大量片 段。a f l p 扩增可获得在某一品种出现而在另一品种不出现的特异d n a 谱带。 因此，通过限制性酶切及相应的p c r 扩增后得到的d n a 多态性可作为一种分子 标记。a f l p 分析可分为单酶切和双酶切。双酶切是为了保证酶切片段大小分布 均匀，该方法应用较多，采用切割位点多的识别4 个碱基序列的内切酶( m e si ) ， 和一种是切割位点少的识别6 个碱基序列的内切酶( 如e c o rd 。因而a f l p 反应 过程中产生的主要是两个酶共同酶切的片段，其长度一般小于5 0 0 b p ，在a f l p 反应中可被优先扩增，产物可被很好的分离。a f l p 接头和引物都是由人工合成 的双链核酸碱基序列。a f l p 引物包括3 部分：5 端的与人工接头序列互补的核 心序列( c o r e ) 、限制性内切酶特定序列( e n z ) 和3 端的带有选择性碱基的粘 性末端( e x t ) 。其中a f l p 接头的设计( 包括核心序列和酶特定序列) 是关键 之处。a f l p 接头一般是长度为1 4 _ 1 8 个核苷酸的双链d n a ，接头序列与试验 中所采用的酶切位点序列相对应，常用的多为e e o ri 和m e si 接头，接头和与 接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点。 a f l p 的流程及特点( 王青山等，2 0 0 5 ) 。a f l p 的基本流程一般包括：模板 d n a 的制备、预扩增、选择性扩增、扩增产物电泳的检测、结果分析几个步骤。 a f l p 的显著特点：1 d n a 需要量少，检测效率高。a f l p 分析仅需要少量的d n a ， 且部分降解的样品也可用来分析，但样品必须没有扩增的抑制物存在。2 可靠 性好，重复性高。a f l p 分析基于电泳条带的有或无，高质量的d n a 和过量的 酶可以克服因d n a 酶切不完全而产生的失真，同时由于它采用的是特定的引物， 且退火温度高，使假阳性降低，因而其分析具有很强的重复性和可靠性。3 多 态性高a f l p 分析可以通过改变限制性内切酶和选择性的碱基种类与数目调节 扩增的条带数，具有较强的多