（生物化学与分子生物学专业论文）rna干扰技术在klf10研究中的应用.pdf

钟茜硕士论文r n a 干扰技术在k l f i o 研究中的应用 r n a 干扰技术在k l f i o 研究中的应用 专业：生物化学及分子生物学 2 0 0 2 级硕士研究生：钟茜 导师：朱振宇教授 摘要 k l u p p l e 样因子( k l u p p l e - l i k ef a c t o r s ，k l f s ) 是一组高度同源的锌指蛋白。 通过调节富含g c 碱基的启动子的基因的表达，k l f s 样因子参与了细胞功能的 各个方面，包括细胞增殖，凋亡和分化。尽管这个蛋白家族调控基因的分子机制 已经被广泛的研究，但它们在体内生长发育的确切作用机制尚不清楚。k l f 6 是 前列腺癌的候选抑制基因，位于染色体l o p l 5 ，这个区域大约在5 5 的零散发病 的前列腺癌中缺失；k l f 7 位于染色体2 q 3 2 ，在神经发育和细胞分化中起着重要 的作用，它的过度表达，可导致细胞生长的停滞；k l f i o 位于染色体8 q 2 2 。转 化生长因子b l 能够诱导k l f l 0 的基因表达，k l f l 0 与细胞分化有关，具有抗 增殖活性，通过氧化反应和线粒体功能失调引起细胞凋亡。运用r n a 干扰技术 特异性下调k l f 6 ，k l f 7 ，k l f i o 的表达，并进一步分析靶基因表达下调后的 生物学特性上的改变。发现k l f 6 ，k l f 7 表达下调后，对y g l o b h l 无显著影响： 只有在k l f l 0 表达下调后，可以引起v g l o b i n 转录水平的显著抑制。 研究目的 建立以慢病毒( l e n t i v i r u s ) 为载体的r n a 干扰技术，对k l f s 进行表达下 调，从而分析k r u p p e l 样因子的生物功能学特性，探讨它们在生物发育和分化等 方面的意义。 实验方法 根据k l f s 基因的e d n a 序列设计3 到4 组短片段发夹r n a ( s h r n a ) 序列，在 将合成的序列克隆进入含u 6 启动子的d n a 质粒载体，通过荧光素酶分析方法， i 钟茜硕士论文r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应用 选择最有效和其次有效的短片段发夹r n a ，与u 6 启动子一起，克隆进入 l e n t i v i r u s 转移载体。制作含短片段发夹r n a 的l e n t i v i r u s ，感染细胞，筛 选阳性表达的细胞，检测阳性克隆细胞内靶基因的表达下调水平，进而分析其表 达下调后的生物功能学改变。 实验结果 i 与空对照载体相比，共三组短发夹干扰r n a 对k l f 6 的基因表达下调效果中， 以第二组下调效果最佳，达9 0 7 5 ( 8 4 9 ) ；其次为第三组短发夹干扰r n a ， 下调k l f 6 的基因表达5 3 5 9 ( 4 2 4 ) ： 2 与空对照载体相比，共三组短发夹干扰r n a 对k l f 7 的基因表达下调效果中， 以第三组下调效果晟佳，达8 5 5 6 ( 1 2 7 2 ) ；其次为第一组短发夹干扰r n a ， 下调k l f 7 的基因表达3 1 6 0 ( 5 6 5 ) ： 3 与空对照载体相比，共四组短发夹干扰r n a 对k l f i o 的基因表达下调效果中， 以第三组下调效果最佳，达8 5 1 0 ( 儿3 2 ) ；其次为第二组短发夹干扰r n a ， 下调k l f i o 的基因表达5 9 4 1 ( 5 6 9 ) ： 4 在第二和第三组k l f i o 短发夹结构干扰r n a 感染阳性克隆细胞中，以含 l u c i f e r a s e 靶基因的短序列干扰r n a 的感染阳性克隆细胞为对照，提取m r n a ，进 行r t p c r 扩增k l f l 0 片断基因和y g l o b i n 基因，实验证明第三组短发夹结构干 扰r n a 在k l f l 0 基因的转录水平上基因下调效果最佳，其y g l o b i n 在转录水平 上下降也最为明显。第二组k l f i o 短发夹结构干扰r n a 效果介于对照和第三组短 发夹结构干扰r n a 之间。 5 以含l u c i f e r a s e 靶基因的短序列干扰r n a 的感染阳性克隆细胞为对照，含异 染色质蛋白ia l p h a ( h p la l p h a ) 的短发夹结构干扰r n a 的l e n t i v i r u s 第二次 感染人乳腺癌细胞2 3 1 一i o a 细胞后，h p ia l p h a 表达量下降的程度与对照相比， 比含这个干扰r n a 的l e n t i v i r u s 第一次感染乳腺癌细胞2 3 1 一i o a 细胞h p la l p h a 表达量下降的程度，更为显著。 6 将分别含l u c i f e r a s e 的短序列干扰r n a 的l e n t i v i r u s ，含k l f l 0 靶基因的第 二组短序列干扰r n a 的l e n t i v i m s 和含k l f l 0 靶基因的第三组短序列干扰r n a 的l e n t i v i r u s 感染后的k 5 6 2 细胞在2 4 小时，4 8 小时和7 2 小时后通过t r y p a n 蓝 钟茜硕士论文 r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应用 染色鉴定存活细胞，并行细胞计数。结果显示三组k 5 6 2 细胞的生长曲线间差别 无统计学意义。 结论 1 建立了r n a 干扰的l e n t i v i r u s 病毒载体系统，该系统操作方便，结果稳定， 特异性高且重复性好。 2 首次对k l f l 0 与y - g l o b i n 基因的表达之间的关系进行研究，发现k l f l 0 基因的表达下调，引起t - g l o b i n 在转录水平上的下降。这意昧着k l f l 0 在y g l o b i n 基因表达过程中起着重要的作用。 3 k l f l 0 基因表达下调后，对人红白血病细胞生长无显著影响。 4 经含干扰r n a 病毒二次感染的细胞中，表达水平下调比一次感染更为有效。 关键词：短发夹结构干扰r n a ， k l u p p e l 样因子( k l f s ) ，k l f 6 ，k l f 7 ，k l f l 0 ， 7 - g l o b i n i i i 钟茜硕士论文r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应用 a p p l y a n c ew i t hr n a ii nf u n c t i o n a la n a l y s i so fk l f10 m a j o r ：b i o c h e m i s t r y & m o l e c u l a rb i o l o g y 2 0 0 2g r a d em a s t e rc a n d i d a t e ：q i a nz h o n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h e n y uz h u d e p a r t m e n to f b i o c h e m i s t r y & m o l e c u l a rb i o l o g y z h o n g s h a nm e d i c a l c o l l e g e ，s u ny a t s e nu n i v e r s i t y ，g u a n g z h o u510 0 8 0p r c h i n a a b s t r a c t b yr e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fal a r g en u m b e ro fg e n e st h a th a v eg c r i c hp r o m o t e r s ， k l ft r a n s c r i p t i o nr e g u l a t o r sm a yt a k ep a r ti nv i r t u a l l ya l lf a c e t so fc e l l u l a rf u n c t i o n i n c l u d i n gc e l lp r o l i f e r a t i o n ，a p o p t o s i sa n dd i f f e r e n t i a t i o n a t h o u g ht h em o l e c u l a r m e c h a n i s mo fg e n er e g u l a t i o nb yt h i sf a m n yo fp r o t e i n sh a sb e e nw e l ls t u d i e d ，t h e i r e x a c tr o l ei ng r o w t ha n dd e v e l o p m e n ti nv i v or e m a i n sl a 娼e l yu n k n o w n t h ek l f 6 g e n e ，ac a n d i d a t et u m o rs u p p r e s s o rg e n e ，m a p st oh u m a nc h r o m o s o m el o p l 5 ，a r e g i o nd e l e t e di n 5 5 o fs p o r a d i cp r o s t a t ea d e n o c a r e i n o m a t h ek l f 7g e n e ，l o c a t e d o l lh u m a nc l l r o m o s o m e2 q 3 2 ，p l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nn e u r o g e n e s i sa n dc e l lc y c l e p r o g r e s s i o n k l f 7o v e r - e x p r e s s i o nl e a d st og r o w t ha r r e s t t h ek l f l 0g e n ei sl o c a t e d a t8 q 2 2 t g f 一6 lc a ni n d u c ek l f i og e n ee x p r e s s i o n k l f l 0i si n v o l v e di nc e l l d i f f e r e n t i a t i o na n da b i l i t i e st o a n t i - p r o l i f e r a t i o n k l f l 0 一i n d u c e d c e l ld e a t hi s a c c o m p a n i e db ya ni n c r e a s ei nt h eg e n e r a t i o no fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e sa n dal o s so f m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a lp r e c e d i n gt h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e so f a p o p t o s i s w ea p p l yar n ai n t e r f e r e n c es y s t e mt ok n o c kd o w nk l f 6 ，k l f 7a n dk l f l 0f a m i l y f o rf l l r t h e rf u n c t i o n a la n a l y s i s a f t e rk n o c k i n g d o w nk l f 6a n dk l f 7 ，t h e r ei sn o ta n y s i g n i f i c a n te f f e c to ny - g m b i ng e n ee x p r e s s i o n h o w e v e r , w ef o t m dt h a tt h e 1 v 钟茜硕士论文 r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应州 k n o c k d o w no fe n d o g e n o u sk l f l og e n ee x p r e s s i o ni nl e u k e m i ac e l l sr e s u l t si n s i g n i f i c a n ti t t h i b i t i o no f t r a n s c r i p t i o n a ll e v e lo f v g l o b i n o b j e c t f i r s t ，w ee s t a b l i s har n a i n t e r f e r e n c es y s t e mm e d i a t e db yl e n t i v i r u st ok n o c k d o w n t h ee x p r e s s i o no fk l f s ，a n dt h e na p p l yt h i sm e t h o dt oa n a l y z et h ef u n c t i o no ft h e s e f a c t o r s t h e r e f o r ew ec a r le x p l o r et h e i rr o l e sd u r i n gd i f f e r e n t i a t i o na n dd e v e l o p m e n t m a t e r i a la n dm e t h o d s a c c o r d i n gt ot h ee d n as e q u e n c i n go fk l f s ，w ed e s i g n3t o4k i n d so fd n ao l i g o e s f o rs h o r t - h a i r p i nr n a ，t h e nc l o n et h e s es y n t h e t i cd n ao l i g o e si n t op u 6 bp t a s m i d w h i c hc o n t a i n sah u m a nu 6p r o m o t e r a f t e rt 1 1 a t w ec h o o s et h em o s te f f i c i e n ta n dt h e s e c o n dm o s te f f i c i e n ts h o r t - h a i r p i nr n ab yl u c i f e r a s ea s s a y t h e nw ec l o n et h e d n ao l i g o e sa n du 6p r o m o t e ri n t ol e n t i v i r u st r a n s f e rv e c t o r , s ot h a tw ec a np r o d u c e l e n t i v i m sw h i c hc o n t a i n st h ed n ao l i g o e sf o rs h o r th a i r p i nr n aa n di n f c c tc e l l s p i c ku pt h ep o s i t i v ei n f e c t e dc e l l sa f t e ra d d i n ga m p i c i l l i n a f t e rt h a t ，w ed e t e c tt h e t r a n s c r i p t i o nl e v e lo rp r o t e i nl e v e lo ft h et a r g e tg e n ea f t e rk n o c k d o w n ，a n da n a l y z e t h ef u n c t i o no f t h e s eg e n e s r e s u l t s 1 c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lv e c t o r , a m o n gt h et h r e es h o r th a i m i nr n a ( s h r n a ) ，n o 2s h r n ai st h em o s te f f i c i e n to n et ok n o c kd o w nt h ek l f 6g e n ee x p r e s s i o nw h o s e e f f i c i e n c yi s9 0 7 5 ( 8 4 9 ) ：n o 3s h r n a i st h es e c o n dm o s te f f i c i e n tw h o s e e f f i c i e n c yi s5 3 5 9 ( 4 2 4 ) 2 c o m p a r e d t ot h ec o n t r o lv e c t o r , a m o n gt h et h r e es h o r th a i 巾i nr n a ( s h r n a ) ， n o 3s h r n ai st h em o s te f f i c i e n to n et ok n o c kd o w nt h ek l f 7g e n ee x p r e s s i o n w h o s ee f f i c i e n c yi s8 5 5 6 ( 12 7 2 ) ：n o 1s l 堋小队i st h es e c o n dm o s te f f i c i e n t w h o s ee f f i c i e n c yi s3 1 6 0 ( 5 6 5 ) v 钟茜硕士论文r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应用 3 c o m p a r e dt ot h ec o n t r o lv e c t o r , a m o n gt h et h r e es h o r th a i r p i nr n a ( s h r n a ) ， n o 3s h r n ai st h em o s te f f i c i e n to n et ok n o c kd o w nt h ek l f l 0g e n ee x p r e s s i o n w h o s ee f f i c i e n c yi s8 5 1 0 ( 1 1 3 2 ) ：n o 2s h r n ai st h es e c o n dm o s te f f i c i e n t w h o s ee f f i c i e n c y i s5 9 4 1 ( 5 6 9 ) 4 a t i e rr n ae x t r a c t i o nf r o mt h ep o s i t i v ei n f e c t e dc e l l sw h i c hc a ns t a b l ye x p r e s s e i t h e rn o 2o rn o 3s h o r th a i 坤i nr n a ，w ea m p l i f i e dt h ek l f l0a n d7 - g l o b i nb y r t - p c ra n df o u n dt h a tn o 3s h o r th a i r p i nr n ac a nm o s te f f i c i e n t l yk n o c k d o w n k l f l 0g e n ee x p r e s s i o na n d7 - g l o b i na tt r a n s c r i p t i o nl e v e lc o m p a r e dt ot h ec o n t r o l c e l lw h i c hw a si n f e c t e dw i t hl e n t i v i r u sc o n t a i n i n gt h es h r n af o rl u c i f e r a s e t h e e f f i c i e n c yo f n o 2s h o r th a i r p i nr n a f o rk l f l 0a n dy - g l o b i ni sb e t w e e nn o 3a n d t h ec o n t r 0 1 5 t h ed e c r e a s ee x t e n to f t h ep r o t e i nl e v e lo fh p la l p h ai nt h ec e l l si n f e c t e dt w i c e w i t hl e n t i v i r u sc o n t a i n i n gt h es h o r th a i r p i nr n af o rh p la l p h ac o m p a r e dt ot h e c o n t r o lc e l l sw h i c hw e r ei n f e c t e dw i t l ll e n t i v i r u sc o n t a i n i n gt h es h r n af o rl u c i f e r a s e m o r et h a nt h a ti nt h ec e l l si n f e c t e do n l yo n c ec o m p a r e dt ot h ec o n 仃o lc e l l s 6 t h ec e l l si n f e c t e dw i t hl e n t i v i m sc o n t a i n i n gt h es h r n af o rl u c i f e r a s eo rt h e n o 2o rn o 3s h r n af o rk l f l 0a r ec o u n t e da f t e r2 4h o u r s ，4 8h o u r sa n d7 2h o u r s a n dt h ev i a b i l i t yi sd e t e r m i n e db yt r y p a nb l u es t a i n t h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h e c o n t r o lc e l l sa n dt h ec e l l sc o n t a i n i n gn o 2o rn o 3s h r n af o rk l f l 0h a sn o s t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e c o n c l u s i o n 1 w ed e v e l o par n ai n t e r f e r e n c es y s t e mm e d i a t e db yl e n t i v i r u s t h es y s t e mh a s s t a n d a r do p e r a t i o n ，s t a b l eo u t p u t ，h i g hs e n s i t i v i t ya n dg o o dr e p e a t a b i l i t y 2 w ee x p l o r et h er e l a t i o nb e t w e e nk l f l 0a n d7 - g l o b i n ，a n df i n dt h a tt h et r a n s c r i p t i o n l e v e lo f ) , - g l o b i nc a nb ed e c r e a s e da f t e rk n o c k d o w no fk l f l 0g e n ee x p r e s s i o n ， w h i c hm e a n st h a tk l f l 0u p r e g u l a t e7 - g l o b i ne x p r e s s i o na n dp l a ya ni m p o r t a n tr o l e i n7 - g l o b i n 3 a f t e ri n f e c t i o nt w i c ew i t hl e n t i v i r u sc o n t a i n i n gt h es h o r th a i r p i nr n af o rt a r g e t 钟茜硕士论文r n a 干扰技术在k l f i o 研究中的应用 g e n e ，t h ek n o c k - d o w ne f f i c i e n c yf o re x p r e s s i o no ft a r g e tg e n ei sm o r ee f f i e c i e n tt h a n t h a ti nt h ec e l l sw h i c hi n f e c t e db ys a m ev i r u so n l yo n c e 4 t h ed e c r e a s eo f g e n ee x p r e s s i o no f k l f i oh a sn oe f f e c to nl e u k e m i ac e l lg r o w t h k e y w o r d ：s h o r t h a i r p i nr n a ，k l u p p e l l i k ef a c t o r ( k l f ) ，k l f 6 ，k l f 7 ，k l f i o ， ) , - g l o b i n v 钟茜硕士论文 r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应用 p c r b p r n a m r n a m 峒摩s d n a c d n a l b r n a i s h r n a k l f 英文单词缩写表 a b b r e v i a t i o n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n b a s ep a i r r i b o n u c l u n ca c i d m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d c o m p l e m e n t a r yd n a l u r i a b e r t a n im e d i m n r n ai n t e r f e r e n c e s h o r th a i r p i nr n a k l u p p e l - l i k ef a c t o r 5 3 聚合酶链反应 碱基对 核糖核苷酸 信使核糖核酸 四种脱氧核糖核苷三磷酸 脱氧核糖核酸 互 b d n a l b 培养基 r n a 干扰 短发夹结构r n a k l u p p e l l i k e 因子 钟茜硕士论文r n a 干扰技术在k l f i o 研究中的应_ j 第一章前言 k l u p p e l 样因子是一组高度相关的锌指蛋白。这类蛋白是真核细胞的转录机 制的重要成员( 1 ) 。这个家族蛋白通过高度保留的三个锌指域，可以正性和负性 地调控转录。这个k l f s 家族中的每一个独立成员，依靠它们结合的启动子和 相互作用的共调控因子，起着激活和抑制的作用。 k l f s 属于一个包含大约二十个成员的转录因子家族。这个家族包括 p r o m o t o r - s p e c i f i ct r a n s c r i p t i o nf a c t o r ( s p ) 蛋白，s p l ，s p 2 ，s p 3 ，s p 4 ，和k l f s 。从 线虫到人类，s p l 1 i k e k l f s 蛋白在多种生物中都有表达( 2 ) 。例如，果蝇拥有 三个s p l 一l i k e 蛋白( 3 ) ，然而人类却含有所有的二十一个s p l l i k e k l f s 基因。 s p l 一l i k e k l f s 家族的因子可以与很多富含g c 的d n a 片断结合从而调控转 录。而且，在哺乳动物和无脊椎动物中的很多s p l 1 i k e 转录因子参与了调节细胞 生长和控制多态性遗传途径的过程( 4 ) 。不像其它的重要的发育调节因子，比如 说h o x 或是那些包含k r u p p e l 相关盒( k r a b ) 的因子( 5 ) 。它们编码在基因族 中，而那些编码k l f s 蛋白的基因却随机分布在整个基因组，并且它们的基因 产物被认为是有独立的功能的。唯一的例外是有两个基因被包含在同一个位点， 它们分别编码k l f i ( e k l f ) 和k l f 2 ( l k l f ) 。 1 ik l f 经典的结构特征 作为位点特异的转录因子，这些蛋白都要求有至少三个结构域：一个是d n a 结合域，个是核定位信号域，另一个是转录调节域。s p l 1 i k e k l f s 的特征是 在其含有三个重复的c y s 2 h i s 2 锌指域的羧基端有一个高度保守的d n a 结合域 ( 在家族成员中超过6 5 的相同序列) 。除了d n a 结合功能，锌指域还能通过 蛋白与蛋白相互作用以调节d n a 结合的特异性中起功能作用( 6 ) 。而且 s p l l i k e k l f 蛋白的核定位序列在锌指域中或直接与其毗邻( 7 ) 。 钟茜硕士论文 r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应用 1 2k l f 的锌指域 每一个s p l 1 i k e 锌指域遵循c y s 2 h i s 2 的锌指相同序列 c x 2 _ 5 c x 3 ( f y ) x 5 甲x 2 - h - x 3 _ 5 - h ( 单个字母的氨基酸代码) ，其中x 代表任意 一个氨基酸，而甲是一个疏水性氨基酸基团( 8 ) 。在s p l 和s p l - l i k e k l f 的其 它成员的锌指域中，整个的氨基酸相似性至少大6 6 7 ，而且每个域的长度是不 变的：前两个锌指域是2 3 个氨基酸，而后一个锌指域是2 1 个氨基酸。在锌指域 之间起连接的是7 个氨基酸，同样是高度保守序列一t g r ( r k ) ( p k r ) ( f y ) x 。 有关d n a 结合的生化研究显示：大部分的s p l 1 i k e k l f s 蛋白有着对不同 富含g c 位点相似的亲和性( 9 ) 。在几个成员中被设想可以和d n a 作用的氨基酸 是一样的，而且与d n a 的竞争性结合也表现在这些成员中。例如s p l 和 k l f 9 ( b t e b l ) ，s p l 和k l f l 3 ( b t e b 3 ) ，s p l 和k l f 4 ( g k l f ) ，以及k l f l 和 k l f 3 ( b k l f ) ( 1 0 ，1 1 ，1 2 ) 值得注意的是，一些因子有与其它家族成员不同的关 键氨基酸残基，而这些因子的d n a 结合特异性也被改变。譬如， s p 2 在它的 第一个锌指域有一个亮氨酸残基，这个残基替代了在s p l 相应区域的组氨酸残 基，这个亮氨酸残基被发现在不同的启动子中优先识别g t 盒 ( 5 - g g t g t g g g g 3 ) 而不是g c 盒( 1 3 ) 另外，s p l 1 i k e k l f 亚群，除了 k l f 6 ( c p b p ) ，在第三个锌指域中包含一个亮氨酸而不是赖氨酸，并且优先与 5 - c a c c c 3 序列结合，比如在b g l o b i n 启动子中( 1 4 ) 。 1 3 转录调节域 尽管不同的s p l 1 i k e k l f s 蛋白在d n a 结合方面有着高度的相似性，但它 们调节转录的能力却有着很大的区别。例如，s p l 是至今报道的最强的转录激活 因子之- - ( 1 0 ) ；然而k l f l l ( t i e g 2 ) 却起着转录抑制因子的作用0 5 ) 。另外， 几个s p l 1 i k e k l f 蛋白能根据它们结合的启动子和细胞情况起转录激活因子或 抑制因子的作用( 9 ，1 2 ，1 5 ) 。s p l l i k e k l f s 蛋白的氮基端高度可变，近来的研 究显示这个家族中的几位成员，通过特定的氨基端激活和抑制域，与共激活因子 或共抑制因子一起调节转录。在s p l 和s p 3 氨基端富有谷氨酰胺的区域，与转录 2 钟茜硕士论文r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应用 因子t a f i l l 3 0 作用从而激活转录( 1 6 ) 。然而在k l f 3 ( b k l f ) ，k l f 8 ( b k l f 3 ) 和 k l f l 2 ( a p 2 r e p ) 蛋白的氨基端的p v a l s t 结构与其它的属于羧基端结合蛋白 ( c t b p ) 的共抑制转录因子一起抑制转录( 1 7 ) 。 s p l l i k e k l f s 家族中所有的第三类蛋白如：t i e g 蛋白( t i e g io rk l f l 0a n d t i e g 2o r k l f l l ) 和b t e b 蛋白( b t e b lo r k l f 9 ；b t e b 3o r k l f l 3 ：b t e b 4o r k l f l 6 ) 共有一个保守的抑制域。它是与转录抑制因子m a d l 中s i n 3 互作用域 ( s i d ) 紧密相关的a 螺旋域( 1 8 ) 。 1 4 生物性质 基因表达和敲除的研究显示大部分的s p l 1 i k e k l f s 蛋白都与大部分组织的 生长调控或发育过程有关( 1 9 ) ，比如，s p l 是广泛表达在m u r i n e 细胞中，它的 基因敲除导致在发育早期的广泛性形态缺陷( 2 0 ) 。相反，其它的成员例如，k l f l 和k l f 2 分别在红细胞和t 淋巴细胞中特异性表达，这意味着这些因子有细胞 种类特异性的功能。的确，k l f l 的基因敲除导致了红细胞形成的选择性缺陷 ( 2 1 ) ，然而k l f 2 却特异性地与t 细胞的沉默和存活有关( 2 2 ) 。 很多s p l 1 i k e k l f s 蛋白在各种各样的细胞种类中调节细胞生长，其中部分 成员还与肿瘤的发生相关。与良性肿瘤相比，在上皮细胞癌中s p l 的表达和其 活性有增加，比如乳头状瘤。由此可见，s p l 与肿瘤形成有关( 2 3 ) 。类似的，k l f 4 在一些肿瘤中促进细胞生长，例如在乳腺癌中，并且在些肿瘤中能被肿瘤抑制 基因下调其表达( 2 4 ) 。这就意味着这个基因根据不同的环境在肿瘤形成中起着不 同的角色。本文主要着重于对k l f 6 ，k l f 7 及k l f l 0 的研究。 1 4 1k l f 6 k l f 6 ( z f 9 c p b p ) 是一个广泛表达的转录因子，其在体内的角色并未完全阐 述。人k l f 6 包含2 8 3 个氨基酸，而且在很多个组织中表达，包括胎盘，心脏， 肺和胰腺( 2 5 ) 。k l f 6 包含一个富含脯氨酸和丝氨酸的氨基端激活区，和其它的 3 钟茜硕士论文r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应用 k l u p p e l l i k e 因子一样，三个羧基端c 2 h 2 锌指域。k l f 6 与包含t a t a l e s s 或 t a t a 盒的启动子中的中心启动区相互作用( 2 6 ) 。它的靶基因有：胎盘糖蛋白， 胶原d l ，转化生长因子b l ( t g f p 1 ) ，转化生长因子p l i 型和i i 型受体( 2 7 ) ，尿 激酶血浆酶原( u p a ) ( 2 8 ) 以及人免疫缺陷病毒长末端重复序列( h i v - 1l t r ) 。而 且，k l f 6 还能与g k l f 相互作用，共激活人角质蛋白4 启动子( 2 9 ) 。 试验表明在c c l 4 引起的肝损伤3 小时后，k l f 6 蛋白表达水平在肝卫星细 胞中明显增高，从而进一步导致纤维组织增生和细胞外基质形成。肝卫星细胞的 激活是肝损伤的生理反应，激活的卫星细胞在导致肝纤维化的细胞外基质形成中 起重要的作用( 3 0 1 。在卫星细胞激活过程中，k l f 6 的表达迅速被诱导，并进 一步诱导一些基因，包括胶原，血小板诱导生长因子( p d g f ) 受体和转化生长 因子b l 及它的受体。k l f 6 的诱导发生在体内和体外典型的肝损伤，这意味着 k l f 6 的表达上调是卫星细胞激活的特点。其重要性是k l f 6 激活胶原l ，转化 生长因子d l ( t g f 3 1 ) ，转化生长因子p 1 i 型和i i 型受体的启动子( 3 1 ) ，再由 这些下游基因的表达引起了肝纤维化的发生。k l f 6 介导的尿激酶血浆酶原 ( u p a ) 转录激活，可以导致生物活性的t g f 的增加( 2 7 ) 。这些研究显示在不 同组织中k l f 6 对介导纤维原或纤维溶酶原对损伤的反应有着广泛的功能。 作为转录的激活因子，k l f 6 基因位于染色体l o p l 5 ，这个区域大约在5 5 的零散发病的前列腺癌中缺失( 3 2 1 。g o u t h a mn a r l ae 1 鉴定出k l f 6 是前列腺 癌的一个候选肿瘤抑制基因( 3 3 ) 。从k l f 6 的广泛表达和它抑制生长的能力来 看，k l f 6 可能在肿瘤发生及进展中起着一个广泛的作用，尤其是那些与染色体 1 0 p 1 5 有关的肿瘤。 新的研究显示k l f 6 在非小型细胞癌中常常被表达下调；它通过诱导抑制非 小型细胞癌的凋亡从而抑制肿瘤的生长( 3 4 ) ；k l f 6 作为细胞增殖的抑制因子， 通过促进c j u n 原癌蛋白的降解来减弱c j u n 的功能( 3 5 1o 这进一步证实了k l f 6 是一个肿瘤抑制基因的观点。 4 钟茜硕士论文r n a 干扰技术在k l f l 0 研究中的应用 1 4 2k l f 7 ( u b i q u i t o u sk r u p p e l - l i k ef a c t o r ) k l f 7 是最初运用设计为扩增e k l f 相关序列的p c r 技术，在内皮细胞中查 找新的k l u p p e t 1 i k e 蛋白时被发现的( 3 6 ) 。k l f 7 在多个组织中均有表达。像 其它的k l u p p e l 1 i k e 因子一样，k l f 7 能够与c a c c c 序列紧密结合，但与s p l 盒 的结合却非常微弱。k l f 7 的激活区位于其蛋白宫含酸性基因氨基端侧的7 2 个 氨基酸( 3 6 ) 。在所有k l u p p e l l i k e 因子中，尽管k l f 6 位于人染色体1 0 p 1 5 和 k l f 7 位于人染色体2 q 3 2 ，但这两个基因功能最为相似。它们享有一个在氨基端 4 7 个残基的共同序列，这个序列起着转录激活的作用( 3 1 ，3 6 ) 。ed eg r a e v e re ta 1 发现在果蝇中l u n a 基因是k l f 6 k l f 7 在无脊椎动物中进化的祖先，它也同样 具有三个锌指域。曾有报道k l f 7 可以在体外结合8 g l o b i n 启动子的c a c c c 序 列，而l u n a 也类似地与果蝇基因组中c a c c c 序列结合，并且k l f 7 在核内的 定位与这个昆虫蛋白一样( 3 7 ) 。 另有研究间接证明，k l f 7 在细胞分化中起着重要的作用。首先，k l f 7 在 纤维母细胞和神经母细胞瘤的细胞中过度表达可以导致c d k 的抑制物p 2 1 蛋白 的聚集以及细胞生长的停滞；其二，鼠k l f 7 的表达局限在分裂晚期胚胎神经母 细胞及新生儿神经系统：最后，在家鼠中，k l f 7 活性的丢失与神经异常表型及 产后死亡有关。事实上与几种非神经的组织相比，在中枢及周围神经系统的一些 神经元亚型细胞中k l f 7 保持较高的活性( 3 8 ) 。 1 4 3k l f l 0 ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r 3 - i n d u c i b l ee a r l yg e n e1 ) 人