（微生物学专业论文）新鲜软质干酪发酵剂及发酵工艺研究.pdf

摘要 干酪以其极高的营养价值，成为我国乳品行业的发展方向，积极研究并大力开 发高效浓缩型新鲜软质干酪发酵剂，对于推动我国乳酸菌发酵剂产业化进程，促进 我国乳制品工业的发展，具有重要意义。本文对新鲜软质干酪菌种进行了优化搭配； 探讨了影响新鲜软质干酪工艺的主要因素指标；研究了新鲜软质干酪发酵剂菌株适 宜生长的廉价增殖培养基，优化筛选出适合工业化生产的冻干复合保护剂；研究了 乳脂链球菌增殖培养、细胞浓缩分离、真空冷冻干燥的工艺技术；制备出高效浓缩 型乳脂链球菌冻干发酵剂，并对冻干发酵剂在乳中的发酵活力进行了检测；对新鲜 软质干酪的产品质量进行了初步分析和评价。 研究了接种量、培养时间对乳脂链球菌在牛乳中发酵的影响，分别比较了4 株 乳脂链球菌和5 株嗜热链球菌在乳中的生长与发酵特性，获得特性优良的一株乳脂 链球菌l c l 和一株嗜热链球菌s t - s y 。 以干酪产率、乳清p h 、乳清o d 为指标，研究了菌种配比、凝乳酶添加量及加 热终温度对新鲜软质干酪的影响。结果表明：原料乳灭菌后接种5 的发酵剂( 乳 脂链球菌：嗜热链球菌- 8 ：1 ) ，添加凝乳酶量为o i m l 1 0 0 lm i l l 【，加热终温度为 5 5 时，干酪产率3 3 3 2 ，制得的干酪柔软，有奶香味，无苦味，有颗粒感。 选择原料易得、易于分离细胞的胡萝卜汁培养基、番茄汁培养基、麦芽汁培养 基、菊芋汁培养基作为基础培养基，通过细胞生长试验，确定番茄汁基础培养不仅 是乳脂链球菌l c i 的最适基础培养基：研究了在番茄汁基础培养中添加1 2 种营养 因子对乳脂链球菌l c l 细胞生长量的影响，结果表明，大豆蛋白胨、酵母膏、葡萄 糖、玉米浆、磷酸氢二钾可显著促进乳脂链球菌l c l 的细胞生长，磷酸氢二钾不仅 可以促进菌体增殖，而且还可缓冲基质p h 值的变化，避免了低p h 值对乳酸菌的 伤害；利用b ( 3 4 ) 正交试验优化筛选出乳脂链球菌l c i 最佳增殖培养基，其配比 为：在o 2 k 2 h p 0 4 的番茄汁基础培养基中添加，1 大豆蛋白胨、0 5 酵母膏、 0 7 玉米浆、0 5 葡萄糖。 在番茄汁增菌培养基中，乳脂链球菌l c l 活菌数达1 4 2 x 1 0 1 0 c f h ，m l ，较对照 番茄汁基础培养基( 1 5 0 1 0 s c f u m l ) 提高了9 5 倍，与m r s 培养基数量级相当。 通过研究离心力、离心时间对乳酸菌离心损失率、离心存活率及离心收得率的 影响，确定了乳脂链球菌l c l 细胞浓缩分离的最适离心条件为5 7 3 8 9 ( 7 5 0 0 r ) 5 m i n ， 活菌收得率高达9 8 0 7 。 筛选出抗冻干、耐贮藏的复合冻干保护剂1 种，利用此保护剂制得的乳脂链球 菌l c l 和嗜热链球菌s t - s y 冻干发酵剂活菌含量均在1 0 c f u g 以上加工制得的 干酪校正产率为3 1 5 6 、乳清o d 值( 扣5 0 0 r i m ) 为0 5 1 5 ，乳清p h 为4 6 ，而且 感官风味俱佳，与传统液态发酵剂相比，各参数无明显差异性。 对实验室自制干酪产品进行了初步分析和评价，结果表明：该产品感官指标、 卫生指标均符合中华人民共和国国家标准软质干酪n y 4 7 8 2 0 0 2 ，呈均匀一致的白 色，具有乳特有的气味和滋味，无苦味，质地均匀细腻、柔软有颗粒感 关键词乳酸菌；干酪；增殖培养基；真空冷冻干燥；浓缩型发酵剂；保护剂 t h es t u d yo nt h es t a r t e rc u l t u r eo ff r e s ha c i d - c u r dc h e e s e a n df e r m e n t a f i o nt e c h n o l o g y a u t h e r ：z h a js h u o l i s u p e r v i s o r ：p r o f h o n g t a on 衄 m a j o r ：m i c r o b i o l o g y b e c a u s eo fi ti sh i g hv a l u a b l e c h e e s ew i l lb e c o m ed e v e l o p i n gd i r e c t i o no f f e r m e n t e dd a v yp r o d l l c ti n d u s a y i t sv e r yi m p o r t a n tt or e s e a r c ha n dd e v e l o ph i g h a c t i v i t yc o n c e n l r a t e dy o g h o m ts t a r t e rc u l t m ef o rp r o m o t i n gt h ei n d u s t r i a lp r o c e s so f l a c t i ca c i db a c t e r i as t a r t e ra n dd e v e l o p m e n to ff e r m e n t e dd a v yi n d u s t r y i nt h i sp a p e r , i t h a si s o l a t e ds t r a i n sa n do p t i m i z a t i o nc o l l o c a t i o nf o rf i n el a c t i ca c i db a c t e r i a ，s t u d i e dt h e p r i m a r yf a c t o r sw h i c ha f f e c tm a n u f a c t u r i n gt e c h n o l o g yo ff r e s ha c i d - c u r dc h e e s e 1 1 圮 c h e a pe n r i c h m e n tm e d i u ms u i t e df o ri n d u s t r i a lp r o c e s s i n ga n d 白蠲司r y i n gp r o t e c t a n t w o r es c r e e n e d t h et e c h n o l o g yo fe n r i c h m e n tc u l t u r ef o rs t r e p t o c o c c u sc r e m o r i s ，c e l l c o n c e n t r a t i o n , l y o p h i l i z a f i o nw e i es t u d i e d 1 1 f e r m e n t a t i v ea c t i v i t yo f t h ef r e e z e - d r y i n g s t a r t e ri nm i l l 【w e r ee x a m i n e d i n o c u l a t i o n , f e r m e n t e dt e m p e r a t u r ew e i es t u d i e do nt h ee f f e c to ff e r m e n t a t i o n 1 1 他 g r o w t ha n df e r m e n t a t i o no ff o u rs t r e p t o c o c c u sc r e m o r da n df i v e 踟p p t o c o c c u $ t h e r m o p h i l g ss t r a i n sw u w es t u d i e d t w os p c c i a ls a a i n so f l c la n ds t - s y w e r eo b t a i n e d i nt h i sp a p e r , y i e l d , w h e yp ha n dw h e yo dw e r es t u d i e dt os c r e e ns u i t a b l es t a r t e r sa g e n t c o m b i n a t i o n , a d d i t i o na m o u n to fr e n n e ta n dt h ef i n a lh e a t i n gt e m p e r a t u r e 1 1 r e s u l t s h o wt h a tt h eo p t i m u mm i x e ds t a r t e r sw a s8 ：1 a d d i t i o na m o u n to fr e n n e tw a sl o f a c t i v i t y u n i t a n d t h e o 州m a l f i n a l h e a t i n g t e m p e r a t u r e w a s5 5 ( 2 i j e r u s a l e ma r t i c h o k ej u i c em e d i u m ，t o m a t oj u i c em e d i u m ，c a r r o tj u i c em e d i u ma n d w o r tm e d i u mw h i c ha r ca p tt og a i na n ds c p a r a t em o b t a i n e db yc e l lg r o e t he x p e r i m e n t e d mr e s u l ts h o w e dt h a tt o m a t oj m c ew a st h eb e s tb a s em e c f i u mf o rs t r e p t o c o c c u s c r e m o h s 1 1 ”e f f e c to fa d d m g1 2k i n d so fd i f f e r e n tn u t r i e n tf a c t o r si nt o m a t oi u i c e m e d i u m t h er e s u l ts h o w e dt h a ts o y ap o p t o n e , y e a s te x t r a c t , g l u c o s e , c o r nl i q u o ra n d k 2 h p 0 4c o u l dp r o m o t et h eg r o w t ho fs t r e p t o c o c c u sc r e m o r i s k 2 h p 0 4c o u l dn o to n l y p r o m o t ec e l lg r o w t h , b u ta l s op r o t e c tl a c t o b a c i l l u sf r o mb e i n gd a m a g e db yl o wp ho f m e d i u m 1 1 1 eo p t i m u me n r i c h m e n tm e d i u mo b t a i n e db yo r t h o g o n a l i t yt e s tl “3 4 ) c o n s i s t o fa d d i n g1 s o y ap e p t o n e ，o 5 y e a s te x t r a c t , o 7 c o r l lf i q u o ra n d0 2 k 2 i - i p 0 4i n t o m a t o j u i c em e d i u m i nt h eo p t i m u me n r i c h m e n tm e d i u m , t h er i v i n g - c e l ln u m b e ro fs t r e p t o c o c c u s c r e m o r i sw c r e1 4 2 x 1 0 1 0 c f u m lc u l t i v a t e df o r1 4 ha t3 0 c ，w h i c hw c i ei n c r e a s e db y9 5 t i m e sc o m p a r e dw i t ht o m a t oj u i c eb a s em e d i u ma n dt h es a m ew i 也t h el i v i n gn u m b e ri n t h e m r s u s e d i n l a b t h ee f f e c t so f c e n u i f u g i n gf o r c e ，t i m eo nt h el o s sr a t e ，s u r v i v a lr a t ea n dh a r v e s tr a t e o fl a c t o b a c i u u sw a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o r c e n t r i f u g a t i o no fs t r e p t o c o c c u sc r e m o r i sw a s5 7 3 8 9 ( 7 5 0 0 r ) f o r5 m i na n dt h eh i g h e s t h a r v e s t i n g r a t eo f l i v i n gc e l l sw a s9 8 0 7 a c o m p l e xp r o t e c t a n tw a ss c r e e n e d , w h i c hc o u l dp r o t e c tc e l lf r o md a m a g 她d u r i n g f 僦z e - d r y a t l e rf r e e z e - d r y i n g , t h el i v i n g - c e l ln u m b e ro f 或a r t e r w h e t h e rs i n g l es t r a i n0 1 m i x e ds t r a i n sw 粥o v e r1 0 c f u g t h ec h e e s ef e r m e n t e db yp r o t e c t a n t t h er e s u l tw e r o n od i f f e r e n t a ls i g n i f i c a n c ec o m p a r e d 、i t ht r a d i t i o n a lc u l t u r ew h i c hs h o wc h e e s ey i e l d w 猫3 1 5 6 w h e yo d w a so 5 1 5a n d w h e yp hw a s 4 6 t h eq u a l i t yo fp r o d u c t sw a sa n a l y z e da n de v a l u a t e di n i t i a l l y t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a t s e n s o r ya n d h e a l t hi t e m sw e r e u p t ot h en a t i o n a l q u a l i t y s t a n d a r do f n y 4 7 8 - 2 0 0 2 t h ep r o d u c t f a so faw e l l - d i s t r i b u t e dw h i t ec o l o r , d a v yf l a v o r , 1 1 0b i t t e r , t e x t u r ee x q u i s i t e ，s o f ta n dg r a i n y k e y w o r d s l a c t i ca c i db a c t e r i a ； c o n c e n t r a t e ds t a r t e r ；p r o t e c t a n t 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑些壅些盘鲎或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：署墅硬莉签字日期：、加7 年f 月，| 7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑韭盔些盘茎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑些盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：翟砍韵 签字日期：神7 年月一日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 司凄咖 签字日期：跏7 年月，日 电话： 邮编： 新鲜软质干酪发酵剂及发酵工艺研究 1 1 干酪概述 1 1 1 干酪的定义 l 引言 千酪( c h e e s e ) ，俗称奶酪，是指在乳中( 也可以用脱脂乳或稀奶油等) 加入适量乳酸苗发 酵剂和凝乳酶，使乳蛋白( 主要是酪蛋白) 凝固后，捧除乳清，将凝块压成所需形状而制成的产 品制成后未经发酵成熟的产品称为新鲜干酪，经长时问发酵成熟制成的产品称为成熟干酪。国 际上将这两种干酪统称为天然干酪( n a t u r a lc h e e s e ) i l j 联合国粮农组织和世界卫生组织0 7 a o w h o ) 在a 6 号文件中制定了国际上通用的干酪定义： 干酪是以乳、稀奶油、脱脂乳或部分脱脂乳、酪乳或这些原料的混合物为原料经凝乳酶或其它凝 乳剂，并捧出部分乳清而制成的新鲜或经发酵成熟的产品m t 3 1 1 1 2 千酪的起源及发展 ( 1 ) 干酪的起源 关于干酪起源的说法很多，据推测，干酪的产生缘于古代人宰杀了一只刚喝过母乳的小动 物，发现其胃中有凝乳块，这些凝乳块在适合的条件下经凝乳酶、乳酸菌共同作用，形成了类似 干酪的食品 4 1 研究表明，干酪食品于公元前6 0 0 0 年一7 0 0 0 年起源于伊拉克的幼发拉底河和底格里斯河区 域，以牛羊乳作为干酪的生产原料早期的游牧民族以动物皮装牛羊乳，由于天气炎热，乳糖发 酵，使乳变酸产生凝乳，人们捧出乳清或加盐以延长这类产品的保质期，故许多学者认为干酪起 源于发酵乳制品【“1 ( 2 ) 干酪的发展 干酪产生后发展迅速，到罗马帝国时期干酪的制造已经非常普遍 6 1 。1 9 世纪，干酪制作从农 场手工作坊进入了工业化时期。干酪加工手艺直至1 9 世纪末才进行研究。最早一部系统介绍干 酪加工技术的论著发表于1 8 9 9 年( 由e j u o g d 著) 。论著系统介绍了地理、降雨量、牧场、管理、 于酪加工缺陷和已有的加工体系i ，j ，技术的进步使干酪生产发展成为一门科学 从1 8 5 1 年美国第一家干酪加工厂至今，干酪的产量逐年上升，同时也受到世界各国人民的 喜爱，而且其发展势头将超过其它乳制品( 奶粉、炼乳、奶油等) 。现在干酪生产主要分布在欧 洲、北美洲、大洋洲和亚洲的中东地区h 调查显示，二十世纪8 0 年代以来干酪是全世界产量 唯一保持连续上升的乳翻品受消费需求的驱动，世界主要地区的干酪产量继续增长尤其包括 那些干酪消费水平已相当高的地区，2 0 0 4 年美国l ，3 奶用于干酪生产，干酪年产量8 6 亿磅，占 世界总产量的3 0 1 7 1 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 1 3 千酪的分类 世界干酪种类达8 0 0 种以上，依生产工艺、原料来源、组成成分、风味、外观等多种因素的 改变而各不相同。干酪的分类十分复杂，国际上通常把干酪划分成三个大类：天然干酪( n a t u r a l c h 哟，再制干酪( p 】俄翳s e dc i 豫黯) 和干酪食品( c h e e f o o d ) 。按照质地可将干酪分为：软质千 酪、半硬质干酪、硬质干酪按照制造工艺可将千酪分为：新鲜干酪、未压榨型成熟干酪、压榨 型成熟干酪、经过煮制和压榨的成熟干酪和纺丝型干酪旧世界上主要干酪分类如表i 1 悯 襄1 干醋的品种分类 t a b l el 州c i y 卯j o f d m ” 1 1 4 干酪的营养价值及在我国发展趋势 ( 1 ) 干酪的营养价值 i , 1 0 - i l 干酪是被浓缩的乳制品，营养高、易消化、生物学价值高蛋白质和脂肪含量相当于原料乳 的l o 倍，含有丰富的糖类、有机酸，矿物元素钙、磷、钠、钾、镁、铁、锌及维生素a 、b l 、 2 新鲜软质干酪发酵剂及发酵工艺研究 b 2 、b 6 、b 1 2 、烟酸、泛酸、叶酸、生物素和胡萝h 素等多种营养成分及生物活性物质 千酪在制造和成熟过程中，在微生物和酶的作用下发生复杂的生物化学和微生物变化，使 不溶性的蛋白质混合物分解为胨、肚、氨基酸以及无机或有机化合物等小分子物质。脂肪被分解 为脂肪酸，其中4 0 为不饱和脂肪酸后者不仅是构成细胞的成分，还可降低血清胆固醇，并具 有预防心血管病、高血压、高血糖等功效干酪制作过程中乳糖分解为乳酸与其他混合物，这些 变化使干酪具有特有的风味，并促进人的消化吸收率提高。乳在凝乳剂和发酵剂的共同作用下形 成了凝块，随着乳清的捧出，溶解在其中的乳糖也被捧走了人们消化干酪就不存在“乳糖不耐 症”的麻烦了 近年来功能性干酪产品已经开始生产并正在进一步开发之中，如：钙强化型、低脂肪型、 低盐型，还有向干酪中添加膳食纤维、低聚糖等具有保健功能的成分，促进肠道内优良菌群的生 长繁殖，增强对钙磷等矿物质的吸收并且具有降低血液内胆固醇及防癌抗癌等效果这些功能 性成分的添加，给高营养价值的干酪制品增添了新的魅力 ( 2 ) 干酪在我国的发展前景 一个成熟的乳品消费结构表现在，液态乳作为传统乳制品的消费量越来越低，而高附加值产 品，如酸奶、干酪、奶油等的消费量逐渐增加目前西方主要发达国家的牛奶消费已经处于第三 个阶段即干酪，奶油阶段。发达国家大约有1 3 1 2 左右的鲜乳用于干酪的生产，干酪号称“乳 制品之王”是世界乳制品贸易最大的乳制品之一1 1 5 , 1 6 然而，目前我国的乳制品主要是液态奶和酸奶干酪仅占乳制品的0 2 ，主要原因是我们对 干酪的抗拒很大程度上来自嗅觉的障碍，大多数干酪的风味浓烈而刺激，不易为国人接受 1 4 , 1 7 ， 再者，干酪价格相对较高l 但这并不意味着中国没有干酪生存的市场。每年需求量约为5 , 0 0 0 多吨，但产量仅1 , 8 0 0 吨左右，缺口很大，据海关统计数据显示【1 8 j 。干酪的进1 ：3 量正在急剧增长， 2 0 0 2 年增长2 5 2 0 0 3 年增长8 2 ，2 0 0 4 年增长4 3 ， 因此引进和开发适合中国人口味的干酪势在必行我国的各大中型乳品企业及科研机构正在 研究符合我田人民口味的干酪，崔旭海1 1 9 1 ，陈伟增将大豆与牛奶混合研制豆奶干酪；黑龙江完 达山乳业和龙丹乳业科技股份有限公司对再制干酪进行了一些研究；中国农业大学食品学院与多 家研究e e , c , 、乳品企业和设备制造公司共同完成m o z z a r e l l a 干酪加工关键技术与设备研究及产业 化开发：石家庄三鹿集团对涂抹型干酪的制造过程也进行摸索，特别是对新鲜干酪的凝乳条件等 进行了试验；上海光明乳业技术中心的研究人员研制出表面霉菌干酪。但是，由于这些试验均处 于实验阶段，采用的是实验室的设备和工艺，因此其研究结果的可行性还需经过工厂试验后最终 确定l ” 随着西式快餐的发展，一些年轻人愿意接受用干酪做成的食品，这是我国干酪发展的动力 2 0 0 8 年的臭运会，2 0 1 0 年的世博会干酪生产和供应问题已近在眼前，也是我国发展干酪生产 的好时机【2 1 1 研制生产适应中国人口味的干酪，将会推动干酪产业及整个乳业在中国的发展，伴 随着近几年来我国乳制品行业的快速发展及人民消费水平的提高，干酪将成为未来我国乳业的发 展趋势 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 1 2 干酪发酵剂 制作千酪过程中，用于千酪发酵与成熟的特定微生物培养物称为干酪发酵剂发酵剂在干酪 制作方面起着举足轻重的作用是干酪生产及成熟中的主要参与者，用于生产干酪的发酵剂，随 干酪种类而不同【1 1 干酪是西方国家传统的加工乳制品，各方面分析研究较多，国内干酪制作和 研究刚刚起步。且主要集中在工艺的探讨和优化上，有关发酵剂研究还处于探索阶段。 1 2 1 发酵剂分类 发酵剂的选择在一定程度上决定了凝乳的风味和质构特征及在干酪制造所用的温度下产生 正确的酸度干酪发酵剂可分为细菌发酵剂和霉菌发酵剂两大类。大部分干酪发酵剂为细菌发酵 剂。以乳酸菌为主。霉菌发酵剂用于特殊品种的干酪，如c a m e m b e r t 干酪。某些酵母，如解脂 假丝酵母也在一些品种的干酪中得到应用l i j 表2 中列出了用于干酪生产的发酵剂【9 】。 寰2 干醴发酵剂种类及使用范圈、作用 t a b l e2s p e c i e s 、s e r v i c e a b l er a i s ea n de f f e c to f c h e e s e 绝大多数干酪生产都需要乳酸菌发酵剂，一般可分成两类瞄】，嗜热型发酵剂( 最适温度为 4 0 - - 4 5 c ) 和嗜型性发酵齐j ( 最适温度为3 0 - 3 3 c ) 嗜热型发酵剂用于特定类型的干酪，如： e m m e n t h a l 、p a 咖e s m ，主要包括嗜热链球苗、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌和乳酸乳杆菌；嗜温 新鲜软质干酪发酵剂及发酵工艺研究 型发酵剂应用于大多数干酪生产，包括乳球菌属和明串珠菌属，这种应用划分并不严格，实际上 有许多嗜热型发酵剂也用作嗜温工艺中发酵剂由它们的一种或几种混合组成。乳酸乳球菌是应 用于发酵食品和干酪中的主要菌株之一许多乳酸链球菌和乳脂链球菌含特有的质粒，具有乳糖 水解作用，可利用柠榱酸盐、含有蛋白酶、产细菌素、具有免疫性、抗噬菌体、产胞外多糖、抗 生素，这些特性赋予产品良好的质地和风味| 2 3 j a a h a y a l o g l u r u 等人研究t l 咄i s hw h i t e - b r i n e d 干酪，发现乳球菌发酵剂对干酪的物理化学、生化及感官特性有影响a g n i e s z k al ( i 凹呻c 巧i 【i 硎 等人研究表明，在g o u d a 、c h e d d a r 类型的干酪中氨基酸转化成芳香物质是芳香物质形成的主要途 径，而氨基酸的转化能力取决于乳酸菌 干酪发酵剂可以分为单菌株发酵剂：混合菌株发酵剂；多菌株发酵剂或复合菌株发酵剂。复 合发酵剂是指由已知的。相容的，无嗜菌体相关的，经精心选育的菌株混合物。现代干酪生产中 应用单菌株的已很少。主要应用多菌株发酵剂1 2 6 1 1 2 2 千酪发酵剂的主要作用 发酵剂是决定干酪成品质地和风味的一个重要因素【l 珂乳酸菌发酵剂将牛乳中的乳糖转化成 乳酸，形成酸性环境，同时也赋予干酪不同的质构和风味。主要作用有以下几点1 1 2 2 1 ： ( 1 ) 干酪加工过程中，乳酸可促进凝块的收缩，产生良好的弹性有利于乳清的渗出，这 样产生的凝乳水分含量低。通过加热凝乳和乳清，并经挤压使脱水作用进一步增强，赋予制品良 好的组织状态。在不加或少加凝乳酶的干酪中，凝乳是由于p h 的降低，通过达到酪蛋白的等电 点使其不稳定而引起蛋白质聚沉的，一些产物被捧出，改善了产品的质构 ( 2 ) 发酵乳糖产生乳酸，促进凝乳酶的凝乳作用由于原料乳中添加一定量的发酵剂，产 生乳酸，使乳中可溶性钙的浓度升高为凝乳酶创造一个良好的酸性环境，从而促进凝乳酶的凝 乳作用 ( 3 ) 在加工和成熟过程中产生一定浓度的乳酸，有的菌种还可以产生相应的抗生素，可以 较好地抑制产品中致病菌和食品腐败菌的繁殖，保证成品的品质。 ( 4 ) 发酵剂中的某些微生物可以产生相应的酶分解蛋白质、脂肪等物质如脂肪酶和蛋白 酶仍将在干酪成熟的过程中起到一些作用。从而提高制品的营养价值、消化吸收率并且还可形 成制品特有的芳香风味 ( 5 ) 由于丙酸菌的丙酸发酵，使乳酸菌所产生的乳酸还原，产生丙酸和二氧化碳气体，在 某些硬质干酪产生特殊的孔眼特征 1 2 3 发酵剂的制备 干酪的发酵过程依赖于发酵剂的纯度和活力。选择适宜的方式对发酵剂进行保存是非常重要 的按保存方式说，发酵剂一般可分为液态发酵剂、冷冻发酵剂和干燥发酵剂p 刀捌 ( 1 ) 液态发酵剂 发酵剂以少量形式保存，在正式生产时再逐级放大，直到达到工作发酵剂的状态，作为扩大 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 培养过程中的起始菌种。其制作过程为：纯培养菌种一母发酵剂一中间发酵剂一生产发酵剂液 态发酵剂新鲜、活力强、便宣。但贮存时间短。不宜运输，在多次传代过程中易受污染 ( 2 ) 冷冻发酵剂 通过冷冻浓缩或超浓缩液态发酵剂制成的，包装后存于1 9 6 液氮中，冷冻发酵剂活力极强， 俣藏期长，可用于制备工作发酵剂或直接用于生产，接种量较传统人工型发酵剂降低1 0 0 倍左右； 一次性使用方便、简单、准确，减少了菌种车间的投资和空间，大大降低了杂菌或病毒在培养时 的污染，产品质量稳定，运输需低温环境，成本较高。 ( 3 ) 干燥发酵剂 干燥发酵剂系乳酸菌经液体增殖培养，浓缩分离，与保护介质混溶，再经一定方式干燥而成 的发酵剂干剂制各一般采用两种方法例，喷雾干燥法和真空冷冻干燥法。此类发酵剂一方面可 减少液态发酵剂制备的许多工作，另一方面可延长发酵剂的保存期，使其保存和分发更容易一 些研究者认为真空冷冻干燥法比喷雾干燥法更实用p o 丑1 喷雾干爆发酵剂的干燥工艺成本较低，但菌体存活率仍然偏低，对大多数的嗜温菌而言，存 活率仅1 0 ，尽管科学家通过研究找到了许多办法来保护菌体细胞，保持其活性，但这种方法最 终没有得到广泛应用 浓缩冷冻干燥发酵剂( c 叩咖仃a 删舨枷e dc u l t w 晦c f d c ) 又称直投式发酵剂，是现今商 业化发酵剂的主要形式，这是一种菌体细胞高度浓缩后经冷冻干燥的发酵剂形式，具有高活力、 高菌数( 菌活菌数可达到1 0 1 2 c f u g ) ，所以可直接接种用于生产，这就是真正意义上的直投发酵 剂 直投式乳酸菌发酵剂的应用能够有效地解决继代发酵剂的问蹶，除了具有纯种接种发酵工艺 的优点外，还具有其自身的优势i s 2 ：保存和管理简单；易于进行工艺管理和质量控制；接 种方便，可直接用于生产，减少了污染环节：适合于不同规模的工厂使用以及家庭、餐饮行业 直投式乳酸菌发酵剂起源于乳品行业，1 9 世纪末2 0 世纪初，西方乳业科学家开始研制浓缩 发酵剂。1 9 6 3 年浓缩发酵剂进入商品化生产阶段最初是冷冻浓缩发酵剂，由于其保存需要特 殊的制冷系统，成本高、运输不方便随着冷冻干燥技术的发展，将离心分离后的高浓度乳酸菌 悬浮液添加抗冻保护剂后冻结再在真空条件下升化干燥，制成干燥粉末状的固体发酵剂1 9 8 8 年丹麦汉森中心实验室研制成功了超浓缩乳酸菌发酵剂系列产品，并于1 9 9 4 年将其系列产品推 向中国市场嘲直投式发酵剂以其巨大的优势在欧美等发达国家得到了广泛应用岬1 国内对于 直投式发酵剂的研究多见于保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌p t - 4 t l ，也有部分学者研究泡菜中的直投 式发酵剂h 纠3 i ，但对于乳脂链球菌未见报道 1 3 新鲜软质干酪 新鲜软质干酪指的是销售前不贮藏或没有成熟，加工后立即准备销售的干酪，主要靠乳酸作 用凝乳，这类干酪一般在乳清或液体部分从凝乳中分离后不久就包装，且添加物已包含在发酵基 质中瞄】，如：农家干酪、夸克干酪农家干酪是新鲜软质干酪中典型的一种，以脱脂乳或浓缩脱 6 新鲜软质干酪发酵剂及发酵工艺研究 脂乳为原料，采用乳酸菌发酵。添加或不 器加少量凝乳酶 4 4 4 q 。生产方式分为三种【1 2 2 4 6 4 7 1 长时 凝乳法( 1 4 - - 1 6 h ) 、半时凝乳法( 8 h ) 和短时凝乳法( 5 h ) ，由于长时和半时发酵法需要的生产时 间长，不适合工业化生产，本试验以农家干酪生产工艺为例，采用短时凝乳法生产干酪 新鲜软质干酪的制作经过发酵、凝乳、捧乳清、加盐四个过程。其中凝乳过程既是一种微生 物发酵过程，又是一种人为控制的生化过程，凝乳可以采用三种方法h 7 删：酶凝乳、发酵剂培养 物产酸凝乳和直接酸化凝乳，新鲜软质干酪凝乳采用后两种方法而凝乳效果直接影响干酪得率 和品质通常选取两种以上的乳酸菌配成混合发酵剂，发酵剂对干酪的风味和质构的形成起着主 导作用，风味来自于发酵剂产生的酸和易挥发的芳香族化合物农家干酪加工过程中有时也加入 少量凝乳酶，此时凝乳酶的作用不是凝结牛奶，而是稳定干酪颗粒，使颗粒在以后的处理中能保 持持良好的形态，适当的加酶量可使组织状态紧实细腻0 9 , 2 0 l 。 1 4 高效浓缩型发酵剂制备关键技术 1 4 1 增殖培养基 乳酸菌发酵剂的活菌数要求在1 0 ”1 0 ”c 眦之间，因此在液体培养过程中必须使乳酸菌在 短时间内得到大量增殖。以便获取较高的菌体生物量，同时液体培养基的确定还必须考虑乳酸菌 便于分离和收集，并且成本低康1 4 9 , e 目前，实验室常用的乳酸菌培养基，如脱脂乳，m r s ，m 1 7 中营养成分丰富，可满足乳酸菌 生长繁殖的需要，是乳酸菌增殖培养的主要原料，但是其成分复杂价格昂贵，制作繁琐。适合 工业化生产浓缩型直投式发酵剂的乳酸菌培养基必须是原料易得、价格低廉、菌体产量高、容易 浓缩分离细胞1 5 1 5 2 因此，根据我国国情和资源优势，积极寻求来源广泛，经济易得的廉价原料， 优化筛选适合乳酸菌大量生长的增殖培养基，对实现我国大规模工业化生产高效浓缩型乳酸菌发 酵剂具有重要意义 对于收集乳酸菌菌体来说，发酵液粘度和蛋白质沉淀将严重影响乳酸菌的收集，所以通常在 确定培养基时多采用麦芽汁、番茄汁、菊芋汁、胡萝h 汁等易于与菌体分离的培养基1 4 9 j 2 5 3 1 1 4 2 菌体细胞浓缩分离技术 乳酸菌经发酵，菌体细胞量达到最大值，即在细胞具有较强抗冻能力的稳定期时，便可以收 集浓缩培养液中的乳酸菌菌体。分离技术是制备乳酸菌冻干制剂的重要中间工艺环节，分离方法 有膜渗透法和离心法。膜渗透法具有对菌体影响小，获得的菌体浓度高，培养液可重复利用等优 点，但膜装置成本高，滤膜的污染、清洗、杀菌、老化等一系列问题使商业化生产受到一定程度 的限制。离心法是借助离心机的离心力作用使菌体沉积以提高悬浮液的含菌量，此类方法操作 简捷、便于设备清洗、不易污染、处理量大，适合商业化生产，被大多数研究及生产者所采用 但是离心过程中，一方面，离心力机械作用以及酸或氧的伤害，可能造成部分菌体死亡：另一方 面。部分菌体必然残留在上清液中而损失如果离心工艺掌握不当，菌体死亡率和损失率随之增 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 高，使活菌收得率大大降低，直接导致冻干制剂活菌含量低而影响产品质量 离心损失率、存活率、收得率计算公式及其相关性： ( 1 ) 离心损失率( ) = 上清液活菌数( c f u m l ) 初始活菌数( c f i i m l ) 1 0 0 ( 2 ) 离心存活率( ) = 沉降细胞活菌数( c f i 恤l ) ( 初始活菌数( c f u m l ) 一上清液活菌数( c m m l ) ) x 1 0 0 ( 3 ) 离心收得宰( 嘞= 沉降细胞活菌数( c f u m l ) 初始活菌数( c m m l ) x 1 0 0 由( 1 ) 、( 2 ) 、( 3 ) 式得出 离心收得率( ) = 离心存活率( ) x ( 1 一离心损失率( ) ) 1 4 3 真空冷冻干燥技术 真空冷冻干燥设备的基本原理是在真空状态下利用升华原理，使预先冻结的物料中的水分不 经过冰的融化直接以冰态升华为水蒸汽被除去从而使物科干燥乳酸菌经增殖培养、浓缩分离 后，菌体与保护介质混溶，在共溶点以下预冻，然后，在低于三相点压力的高度真空状态下使 菌品中的冰晶升华，除去菌品中的多余水分，获得一定古水量的干燥发酵剂删由此可见，影 响冻干发酵剂细胞存活率的因素主要有：冻结温度、冻结时间和冷冻保护介质。微生物在冷冻过 程中不可避免地会造成部分细胞的死亡或损伤 5 7 + ，f j ，尤其是乳酸菌，生理条件要求苛刻，细胞 死亡率明显升高i 蛐l 。这主要归因于细胞膜成分、物理条件或敏感蛋白结构在冻干后发生变化1 6 1 “j 目前，微生物一般采用3 5 c 预冻l h 的工艺。万红兵1 等人研究表明冻结方式和冻结时间对保加 利亚乳杆菌冷冻存活率没有影响 冻干保护介质的选择是最为关键的因泵。保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学 环境，减轻或防止冷冻干燥或复水对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特征和生物活 性 6 s - + 7 1 。保护介质由不同种类的保护剂组成，不同的保护剂对不同菌种的保护效果是不同的，甚 至同种保护剂对同种不同株保护作用也不同i “”，单一保护剂并不能满足冷冻干燥的要求，所以 抗冻保护剂一般都是按一定配方混合使用 保护剂可分为小分子化合物( 如低聚糖类。醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类) 和大分子化 合物( 如蛋白质和多肽类、多糖类) 小分子保护剂应具有很强的亲水性。其结构应具备3 个以上 氢键，对糖、醇而言，应具有5 个以上的羟基1 5 9 , 7 1 7 2 j 。大分子保护剂的物理化学特性目前还不清 楚。但它主要是保护细胞的表面免受伤害，冻干过程中对细胞有一定的保护作用但大分子保护 剂单独使用时在保存期间对细胞的保护效果却不明显。如果合适的大分子和小分子保护剂配合 使用，将会加速干燥且能在干燥和保存期间维持较高的细胞存活率以一定比例复配保护剂效果 较好 由于乳酸菌一般应用于食品、药品领域，所以保护剂应该满足m 7 1 ；无免疫原性，无毒性； 冷冻升华时不起泡：冻干后易溶解；在冻干和保存过程中有保护作用；有利于生物活性 保持； 不影响冻干制品的检测。关于保护剂对细菌存活率影响的研究国外已有许多报道。脱脂 乳| 7 0 , 7 7 1 1 是应用比较广泛的保护剂。这是因为脱脂乳本身具有以下几个特征i 明：稳定细胞膜结 构，避免细胞受到伤害；增加冻干产品的多孔结构，利于细胞复水作用：本身包含蛋白为细 胞提供一种保护外壳1 ( i a r a v 6 1 研究发现，麦芽提取液、脱脂乳、乳清、胨化乳都有较好的保护 8 新鲜软质千酪发酵剂及发酵工艺研究 作用，田洪涛嗍等人研究表明海藻糖可显著提高长双歧杆菌的冻干存活率及冻干菌粉在贮藏期间 的细胞稳定性，张英华唧】等人研究保加利亚乳杆菌时指出海藻糖使菌体的存活率较高，刘丹p 1 1 等人考察了多种保护剂对瑞士乳杆菌的冻干保护效果，发现海藻糖、脱脂乳、谷氨酸钠、大豆蛋 白胨效果较好。大量国内外研究表明脱脂乳、蔗糖、甘油、麦芽糊精、海藻糖、谷氨酸钠、酵母 膏、蛋白胨等都可用于提高乳酸菌的冻干存活率。 1 5 本课题研究的目的意义、研究内容及技术关键 1 5 i 研究目的 随着全球经济的发展，干酪在全世界的发展非常迅速，已成为2 1 世纪乳品行业中最具潜力 的乳制品之一，干酪产量增幅速度有高于液态牛乳增幅速度的趋势，而在亚洲干酪产量的增长速 度更快1 1 j 目前在我国进口干酪占据主要市场，各大中型乳品企业及科研机构正在致力于符合中 田人口味干酪的研制。 针对目前我国干酪产业刚刚起步，直投式干酪发酵剂生产技术还是空白，并结合我国的资源 优势利用现代发酵工程技术选育优良干酪发酵剂菌种，探讨影响新鲜软质干酪的主要因素，寻 求获得并优化筛选适合工业化生产的廉价增殖培养基和高效冻干保护剂，研究乳脂链球菌增殖培 养、细胞浓缩分离、真空冷冻干燥等工艺技术，探索乳脂链球菌在冻干过程中适宜的存活条件， 提高细胞冻干存活率，为高效浓缩型干酪发酵剂在我国的推广应用提供科学依据。 1 5 2 研究意义 随着我国乳制品工业的发展和人们健康意识的增强。对干酪研究的逐步深入积极研制具有 自主知识产权的高效浓缩型直投式干酪发酵剂，对于推动我国高效浓缩型直投式益生菌发酵剂产 业化的科技进步，促进我国发酵乳制品工业的发展，具有重要意义通过对乳酸菌菌种选育、菌 体的高密度细胞培养、细胞离心浓缩分离等关键技术甸题的深入研究和探讨，直投式乳酸菌发酵 剂一定会在我国有较大的应用发展前景 1 5 3 研究内容 ( 1 ) 乳酸菌优良菌株的选育 从本实验室现有乳酸菌资源着手研究不同菌株在乳中的发酵特性，包括：凝乳时问，产酸 话力、双乙酰含量、可溶性氮含量，从而选育优良菌株，确定干酪制作的发酵剂菌种 ( 2 ) 干酪制作的影响因素 制约我国干酪产业发展的原因有两个t 一是干酪价格较高。二是大部分干酪口味不适宣本 试验选取口味适宜的新鲜软质干酪，针对影响干酪品质的三个主要因素：发酵剂，凝乳酶、加热