（动物学专业论文）原始蛋白酶结构功能的生物信息学分析及化学基础.pdf

山东师范大学博上论文 中文摘要 2 0 世纪5 0 年代初，m i l l e r 成功模拟了原始地球环境下氨基酸的产生，从而揭开 了现代生命起源研究的新篇章。半个多世纪以来，科学家们在生命起源方面进行了大 量研究，对氨基酸、密码子等的起源初步形成了统一的认识，但是对于原始蛋白酶的 研究，进展却相对缓慢。这是由于研究原始蛋白酶的结构与功能是很困难的：一方面， 没有原始蛋白的化石遗迹可供参考；另外一方面，蛋白质前生物合成需要很长的周期， 很难在实验室进行模拟。近几年来，基因组学、结构基因组学等各种“组学( o 面c s ) 的快速发展为蛋白质结构进化历史提供了新的研究途径。这些新兴学科为我们提供了 大量关于蛋白质结构与功能的信息，由此，我们可以初步推断原始蛋白酶的结构与功 能特征。 蛋白质的某些性质( 或元素) ，包括折叠类型( f o l d ) 、酶的催化位点( c s a ) 、辅 因子( c o f a c t o r ) 以及部分短肽片段等，在进化过程中是非常保守的。它们可以作为 “分子化石( m o i e c l l l a rf o s s i l s ) 推测原始蛋白酶的结构与功能。对于原始蛋白酶的 结构与功能特征我们很难用实验去证实，但是，我们用不同的方法、标准以及其他相 关研究的实验数据，对其进行假设与验证却是可能的。本论文旨在通过生物信息学和 化学信息学方法探究原始蛋白酶的结构、功能及化学基础。 研究目的：分析原始蛋白酶的结构和功能，并对原始蛋白酶的化学基础进行初步 研究。 研究方法与步骤：首先，以酵母原始蛋白酶和m a i l e t 原始蛋白酶为研究数据集， 综合运用现有的生物信息数据库( 如s g d 、s c o p 、p d b 、b i 汪n d a 等) 对原始蛋白 酶的结构进行统计分析，发现了原始蛋白酶折叠方式( f o l d ) 在蛋白结构域空间 山东帅范大学博十论文 ( d o m a i l l ) 和蛋白家族空间( 伽血1 y ) 的分布特征，以及大部分原始蛋白酶发挥功能 时都需要辅因子的参与；接下来，对酵母蛋白酶结构的拓扑复杂性进行了计算，发现 了在进化过程中，酵母蛋白酶结构的变化趋势；而后，主要以氧化还原酶为研究对象， 探讨原始蛋白酶的功能，分析了辅因子的使用偏好并对这种偏好性进行解释；最后， 将化学信息学方法运用到生物学领域，计算了参与原始蛋白酶反应小分子的分子描述 符，从小分子的角度加深对原始蛋白酶的认识。 研究结论：对原始蛋白酶结构的统计结果显示，原始蛋白酶偏好使用p - l o o p c o n t a i n i n g 肌c l e o s i d e 仃i p h o s p h a t eh y d r o l a s e s ( c 37 ) 、t i mb e 伽，a l p h a - b a n e l ( c 1 ) 、 n a d ( p ) - b i n d i n gr o s s m a n n - f o l dd o m a i n s ( c 2 ) 等折叠类型；计算了处于不同进化阶段的 酵母蛋白酶结构拓扑参数，结果显示，随着酵母的进化，蛋白酶的结构拓扑复杂性在 增加；对原始氧化还原蛋白酶辅因子的使用偏好分析结果显示，原始蛋白酶在在发挥 功能时偏好使用起源较早的氨基酸与有机辅因子结合；计算了参与原始蛋白酶反应的 小分子的分子描述符，包括表征分子大小、组成成分和疏水性质等的定量指标，发现 了这些分子描述符在化学空间的分布特点，为进一步研究提供了理论依据和基础。 研究意义：本论文创新性地将生物信息学与化学信息学相结合，将小分子( 如辅 因子等) 研究与原始蛋白酶研究相结合，对原始蛋白酶的结构和功能进行了研究，既 拓宽了小分子的研究空间，又为生命起源研究提供了新的思路。 关键词：生命起源；原始蛋白酶；生物信息学；化学信息学 2 山东师范大学博上论文 a bs t r a c t s i i l c em i l l e r se x p 缸m e n t sd e p e n d e do nr e d u c i i l gg 雒e st 1 1 a tm a yb ep r e s e n to nm e p r i m o r d i a le a 他i 1 11 9 5 3 ，m er e s e a r c ho f t h el i f eo r i 咖i m de n t e r e d an e we r a t h eo r i g i l lo f a i l l i n oa c i da i l dg e n e t i cc o d eh 嬲s t u d i e db e t t e ri i lt l l ep a s td e c a d e s ，b u tw eh o w l i m ea b o m l ep r i i i l i t i v ep r o t e me n z y m e s ，b e c a u s ei ti sv e 巧d i 衔c u l tt 0e x p l o r em es 仃u c t i i r e sa n d 血n c t i o n so ft h ev e r ya i l c i e n tp r o t e i i le 掣e s 1 1 1 er e a s o l l sa r ea sf o l l o w s ：f i r s t ，t l l e r ea r en 0 f o s s i l so fp f i i n i t i v ep f o t e i i le i l z y m e st 0c o n s u h ；s e c o n d ，n l eb i o s y n 也e s i so fp r e 。p r o t i e n e 1 1 z y m e sn e e dt o ol o n gt h t l et 0s i i l l u l a t ei i lt h el a b o t a t o r ) h o w e v e r 懿td e v e l o p m e n to f m e g e n o 觚c sa n ds t m c t g e n o 血c sa 1 1 ds o0 nh a v es u i ) p l i e d1 l sm u c hi i l f o 衄a t i o i l s0 np r o t e i l l s t f u c t u r e sa i l d 胁c t i o i l s ，w l l i c hc a nb et a k e nt 0s t u d ym ee v 0 1 u t i o no f 1 ep r o t e 证e n z y m e s s 臼m c t i l r e s a si sw e l lk n o w n ，s o m ee l e m e n t so fp r o t e i ne n z y m e s ，s u c h 嬲a r c l l i t e c t u r e s ( f o l d s ) ， c a t a l 如cs i t eo fe n z y m e s ，c o f a c t o r s ，a 1 1 ds h 嘶s e q u e n c e sa i l ds oo n ，i sv e d rc o i l s e r v e d d 耐n ge v o l u t i o nt h a tc a l ls e ea sm o l e c u l a rf o s s i l st 0h e l pi n f e rt h ec 妇t e r so f 删t i v e p r o t e i ne n z y m e s0 ns 仃u c t l l r e sa n dm n c t i o i l s 1 1 l ep r e l i i l l i n a 巧s u c c e s so f t l l i ss t i 吼e g ) ，h a s b e e nw i 协e s s e di i lt l l ep 嬲tf e wy e a r s h o w e v e r ，i ti sv e 巧d i 疵r e n tf o ru st 0 印p r 0 v em e s t m c 饥鹏sa 1 1 d 缸l c t i o n so fp r i r n j t i v ep r o t e i i le i 目，i n e sb ye x p e 血n e n t s w 色n e e dd i 腩r e n t m e t l l o d s 、s t a n d a m 、e x p 嘶m e n td a t at 0v a l i d a t em ep r e v i o u sr e s u l t s o b j e c t i v e s ：m a k eat h e o r e t i c sa 1 1 a l y s i so ns t m c t u 】r e sa n d 血n c t i o 邶o fp r i 血t i v e p r o t e i ne n z y m e s i i lo r d e rt 0 c x p l o r et h ec t e ro fp r 砌t i v ep r o t e i ne n z y m e s f u r t h e m l o r e ，w em a d eap r e l i m i n a d rr e s e a r c hf o rt h ec h e n 畦c a lb a i s i so fp 血m t i v ee n z y m e s 3 山东师范大学博士论文 m e t h o d s ：f i r s t l y ， w ea i l a l y s e du s et 1 1 eo l d e s ta g e 争o u po fy e a s te n z y m e sa 1 1 dm a l l e t p u t 小i v ep 血试t i v ee n z y m e sb ys e a r c m n gf o rr e l a t 证gb i o i i l f o m l a 矗c sd a 组b 雒e s ，s u c h 豳 s a c c h a r o m y c e s g e n o m es t m c t 嗽lc l a s s i 6 c a t i o no f p r o t e i n s _ s c o p 、p r o t e i nd a _ t ab a n l ( _ _ p d b 锄ds o0 n w e 向咖dt l l ed i s t r i b u t i o n c h a r a c t e ro fm ef o l d ；ac e 确np a r to fv e 搿a n c i e n te n z y m e sn e e dc o f a c t o r st 0w o r k n o m a l l y s e c o n d l y ，w ec a l c u l a t e dm et o p o l o 百c a li n d i c a t o r so fy e a l s te n z y m e sm a tl o c a t e d a td i f r e r e n te v o l u l t i o ns t a g e s w em a d et 1 1 ee l u c i d a l t i o no fr e d o xc o f k t o rp r e f e r e n c ei i l p r i m i t i v ee m ：y m e sb ya n a l y z i n gc o f a c t 0 卜b i i l m n gr e s i d u e si i lp d 【1 1 i t i v ee m ：y m e s t l i r d l y ， w ee x p l o r e dt h ec o f a c t o r su s a g eb i a so fp r i m i 廿v ee n z y m e si no r d e rt 0r e s e a r c hm e 劬c t i o n o fp 血n i t i v ee m ：y m e sb yb i o i n f o m a t i c sm e t l l o d f o u r t l l l y ，w ec a l c u l a t e dt h ec h e i i l i c a l c h a r a c t e r so fs m a l li n 0 1 e c u l e sp a n i c i p a t i i l gi 1 1m ep r i l l l i t i v ee n z y m e sr e a c t i o i l si i lo r d e rt 0 e x p l o r et l l ep 枷t i v ee n z y m e sb 2 l s e do nt h es m a l lm o l e c u l e s r e s u l t s ：f i r s t l y ， t 1 1 ed i s t r i b u t i o no ff o l d s 仕l a tp r i i i l i t i v ee n z y m e su s e df o l l o w s p o w e r 1 a w1 1 l l e t h e r e f o r e ，w ei 1 1 f e rt h a tt h ea r c l l i t e c t u r e so fv e d ra i l c i e n tp r o t e 洫sb e l o n gt 0 n l ef o l l o w i n gf o l d s ：p l o o pc o n t a j n i n g 肌c l e o s i d et r i p h o s p h a t eh y d r o l a s e s ( c 3 7 ) ，t i m b e t a ，钮p h a - b a u n r e l ( c 1 ) ，n a d ( p ) - b i n d i n gr o s s m 锄- f o l dd o m a i 芏l s ( c 2 ) s e c o n d l y t h e s t n l c t u r e c o m p l e x i t ) ro fy e a s tp r i m i t i v ee n y m e si si n c r e a s i i l g w i t ht h ee v o l u t i o nb y c a l c u l a t i n gt 1 1 et o p o l o 百c a li n d i c a t o r so fy e a s te n z y m e sm a t1 0 c a t e da td i f r e r e n tc v o l u l t i o n s t a g e s t m f d l y t h ep 而【n i t i v ee m 【y m e sa r ec o n v e m e n tt 0 u s ey o l l i 培孤1 1 i n oa c i dt 0b i i l d c o f k t o r sb ya i l a l ) ，z i l l gc o f a c t o r b i n d i n gr e s i d u e si np r i l l l i t i v ee n z y m e s f o 删y w ef o m l d l ed i s t r i b u t i o nz o n eo ft l l es m a l lm o l e c u l ed e s c r i p t o rb yc a l c u l a t i i l gt l l ec h e i i l i c a l c h a r a c t e r so fs m a um o l e c u l e sp a n i c i p a 曲gi nm ep r 证d t i v ee n z y m e sr e a c t i o n s t m sw i u o 虢rt l l em e o d ra s s i s t 趾c e 孤d em ef o u i l d a t i o nf o rm e 缸恤e rr e s e a r c h 4 山东师范大学博l 论文 s i g n i 矗c a n c e ： r 1 1 i sp a p e rl n a d ear e s e a r c ho nm ef i u n c t i o na n ds 仃u c t t l r eo fp r i i l l i t i v e e n z y m e sb yc o m b i r 血gm eb i o m f o m l a t i cm e t l l e o d 锄dc h 锄o i n f 0 彻a t i cm e t h o d ，m es m a u m o l e c u l e ( s u c h 勰c o f k t o r s ) r e s e a r c h 孤l dt h eb i gm o l e c u l e ( s u c h 硒e l 亿y m e s ) r e s e a r c h t 1 1 i so 虢r san e wn o t i o nf o rt l l ef m h e rl i 诧r e s e a r c h k e yw o r d s ：o 晤no fl i f e ；p r i i i l i t i v ee 啕l ，i n e s ；b i o i n f 0 衄a t i c s ；c h e m o i n f 0 锄a t i c s 5 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其他需要 特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 陈蔼 导师签字：另沈、勿f 勾 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 邋可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权 书) 学位论文作者签名： 胀喜 导师签字： 砒、钆肉 签字日期：2 0 0 1 年月加日 签字日期：2 0 07 年月肜日 山东师范大学博士论文 第一章引言 原始蛋白酶( 脚i t i v ee n z y n l e s ) 在生命起源早期扮演了重要的角色，研究 原始蛋白酶的结构和功能，不仅有助于更深入地认识原始蛋白酶的性质，还可以 为生命起源研究提供借鉴。一方面，生命起源研究离不开对原始蛋白酶的研究， 另一方面，生命起源的研究成果又可促进原始蛋白酶的研究。本章就对目前生命 起源的研究进展进行综述，这既是本论文的研究依据也是本论文的研究背景。 目前，被广大学者普遍接受并认同的生命起源学说是“化学进化学说 【。 “化学进化学说 认为：在地球形成的早期，地球属于强还原性的大气环境， 即原始大气层主要是由含量丰富的甲烷( c h 4 ) 、氨( n h 3 ) 、氢( h 2 ) 等气体组 成；而太阳紫外线的强烈辐射、雷鸣闪电、宇宙射线等则为生命的出现提供了各 种形式的能量。首先，以上气体在这些条件下，合成了大量的氨基酸、嘌呤、嘧 啶等低分子的有机物质。其次，这些低分子有机物质降落到池塘、湖泊和海水里， 经过水分的蒸发、浓缩、冰冻冷缩，各种氨基酸就聚合成了蛋白质、嘌呤、嘧啶 等碱基。再次，上述合成的碱基与脱氧核糖、磷酸结合形成了脱氧核糖核酸。最 后，蛋白质与脱氧核糖核酸或核糖核酸结合形成了有生命活力的单细胞，单细胞 分裂成多细胞，于是地球上出现了生命。 一般认为，化学进化可分为4 个阶段： 1 无机分子( 例如：c h 4 、n h 3 、水- h 2 0 、一氧化碳叫o 、二氧化碳 0 2 、一氧化氮- n o ) 的生成； 2 生物小分子( 例如：氨基酸、嘌呤、嘧啶、糖、单核苷酸、腺嘌呤核苷三 磷酸a t p 等高能化合物、脂类等) 的合成； 3 生物大分子( 例如：多聚核苷酸、蛋白质) 的合成； 4 原始细胞的出现。 1 1 氨基酸的起源 1 9 5 3 年，美国学者尤里( u r e y ) 和他的学生米勒( m i l l e r ) 用著名的尤里一 米勒模拟实验验证【刁了化学进化学说。实验装置如图卜1 所示，首先，将水注入 7 左下方的5 0 0 毫升烧瓶内，同时将玻璃仪器中的空气抽去并打开左方的活塞， 泵入c 出、n h 3 和h 2 等混合气体( 用以模拟原始地球的还原性大气) 。然后，煮 沸烧瓶内的水，使水蒸汽( h 2 0 ) 和混合气体在密闭的玻璃管道内循环，并在另 一容量为5 升的大烧瓶中，进行火花放电一周( 用以模拟原始地球的雷鸣闪电) 最后，生成的有机物经过冷却后，积聚在仪器最底部的溶液内( 用以模拟原始地 球大气中生成的有机物被雨水冲淋到原始海洋中的过程) 。此实验共生成2 0 种有 机物( 如表卜1 所示) ，其中包括了1 1 种氨基酸，这1 1 种氨基酸中有4 种氨基 酸( 即甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸) 是生物天然蛋白质所含有的。 r 1 ； o 这一参数既包含每个接触间的序列距离，又包含所有接触的数目，它与的差 别仅在于分母不同，但不同的分母代表不同的物理意义：c d 表示平均到每个残 基上的平均接触距离( 从序列上看) ，而彻则表示残基间所有接触的距离总 和( 再对接触数的平方进行归一化) 。当c d 和朋d 所选的，相同时，戏1 d 可 简单地表示成二者乘积的形式，彻= 朋d 。 随着蛋白质研究的不断深入，逐渐总结出以下规律，一般来说，a 螺旋蛋白 要比p 、叶p 蛋白折叠得快，用c o 的理论解释，是因为仅螺旋蛋白中含有大量的局 部接触，所以有较低的c o 值，较高的折叠速率，而d 、a + p 蛋白含有大量的远程 接触，所以有较高的c o 值，较低的折叠速率。若反问这样一个问题：对于c o 和 蛋白质折叠速率之间的相关性，是否仅由螺旋含量就可以决定呢? 换言之，螺旋 结构之外的其他的结构特征对这一相关性的贡献是否显著呢? 为了回答这一问 题，m i m y 和s h a k i 】n o v i c h 【1 1 2 】在对c o 作了详细研究后，提出了一个新的参数 一局部接触比率( 胍t i o no fl o c a l c o n t a c t s ，f l o c a l ) ，既回答了这一问题，又能 很好地预测出蛋白质的折叠速率，公式如下： 3 9 。， 烈f ，) = 等2 螨 4 ， 其中，n 1 0 c a l 为局部接触数，n 为全部接触数，当残基i 和j 相互接触时，! ( i j ) 为1 ， 否则为o 。 随着研究的不断深入，各种不同的参数被相继提出来，这些参数各自与折叠 速率之间有着很好的相关性。在这种情况下，把不同的参数进行组合，共同预测 蛋白质的折叠速率也不失为种不错的方法。 3 2 研究对象 以有明确进化历程的酵母蛋白酶，在李文雄等人的分组基础上进行重新分 组，将第1 组中的蛋白酶称为酵母原始蛋白酶，将剩余四组中的蛋白酶统称为酵 母次老蛋白酶。 3 3 数据的获取 由于第二章已对酵母蛋白酶的e c 号进行了汇总，因此，我们只需将e c 号 输入p d b 数据库，下载相应的蛋白酶的蛋白序列即可。 3 4 数据的筛选 由于同一个蛋白酶的结构可能会有不同的人测定，故p d b 数据库中的数据 存在冗余，会出现同一个酶号有多个蛋白序列的现象，为了排除冗余，我们对所 下载的蛋白酶进行了以下规定： a 蛋白酶结构都是通过x 射线衍射法的实验方法得到的。 b 测结构时的分辨率要小低于2 a 。 c 同一个酶号所包含的所有蛋白序列的相似度要低于3 0 。 3 5 拓扑参数的计算 在本研究中的蛋白质拓扑参数的计算程序由b i n - g u a l l gm a 提供的p y t h o n 程 序进行的。 山东师范人学博士论文 3 6 结果与分析 表5 1 酵母新老蛋白酶结构域拓扑复杂性计算结果比对 1 h b l e5 - 1t h ea v e r a g e so fa i r i e t yo ft o p o l o 昏c a li i l d i c a t o r so v e rm ey e 嬲to l d 唑! ! 塑鱼羔! 箜! 娑婴曼! 些坚箜 l n d i c a t o r 矗y e a s to l d 既固衄ey e a s ty o u n ge i 呸归尸v a l u e b 拓扑参数酵母原始蛋白酶酵母次老蛋白酶尸检验值 a t h e 娜o l o 西c a li n m c a t o r s 盯ec a l c u l a t e da c c o r d i n gt 0m er e f ( j m b ) b u 也s tf o re q u a l 时o f m c 姐v a l u e sb ys p s s 由图我们可以很直观地看出两组蛋白酶在a b sc o 、c t p 、u 之o 、f l o c a l 、 c c 、a b sc c 指标上差异极显著。 c o 没有显著差异，而a b sc o 有显著差异，说明两组酶的序列长度有差 异，因为，c o 和a b sc o 的区别仅在是否对蛋白序列的长度进行归一化；c t p 和c o 的区别仅在于把c o 中两个相接触氨基酸( c o n t a c t i n gp a i r ) 之间的序列长 度( l o o p 长度) 做了平方，c o 没有显著差异而c t p 有显著差异，也正好可以 归因于蛋白长度平方后增大了差异，l r o 的定义中也因为对蛋白长度进行了归 一化，所以，酵母次老蛋白酶序列长导致其l r o 的取值小，所以，上述三个显 著差异的参数都可以归因于序列长度的差异。 而f l o c a l 的显著差异表明，短l 0 0 p ( 小于4 个残基的) 在酵母次老蛋白酶 酶中比例更高一些，而这可能暗示二级结构含量的差别，比如，可能酵母次老蛋 白酶的螺旋含量更高。 4 l 山东师范大学博士论文 c c 的定义中c o n t a c t i n g 的空间距离阈值是4 5 a ，而c c 高，表明这种短距 离的模块( c o n 拓圮血gc l u s t e r s ) 化程度高，此外，c o n t a c t i i l gc l u s t e r s 并不仅限于 某l o o p 以内( 或某l o o p 之上) ，还可以是各l o 叩之间。 u l c o 是我们定义的参数，它和c o 是一个公式形式，只是在定义c 0 n t a c t i n g p a i r 时，用了8a 的空间距离阈值，c o ( 空间距离阈值为6a ) 差异不显著，而 l rc o 差异却显著，表明，当放宽c o n t a c t i i l g 的定义，即考虑( 在3 d 空间中) 远程的相互作用时，有氧酶的h o p ，平均来说，更长一些，即便已经对序列的 整体长度进行了归一化( 因为u tc o 采用和c o 相同的公式，是对序列的长度 进行了归一化的) 。 综上所述，酵母次老蛋白酶比酵母原始蛋白酶的拓扑结构更复杂( 根据 l rc o ) ，而且模块化程度更高( 根据c c ) ，但这个复杂并不是指无规卷曲就 多( 其实，如果都是无规卷曲，反倒不能算复杂) ，而是指蛋白结构中既有大的 回旋，而在一个回旋内部，又有比例较高的相互接触。 3 7 结论 本章计算了处于不同进化阶段的酵母蛋白酶结构拓扑参数，结果显示，随着 酵母的进化，蛋白酶空间结构的拓扑复杂性在增加。 山东师范大学博士论文 第四章原始蛋白酶功能的生物信息学研究 摘要：氧化还原辅因子包括有机辅因子和金属辅因子，为了探究原始氧化还原酶 辅因子的使用偏好，使用生物信息学的方法对酵母原始氧化还原酶和m 砧咂t 数据库中的原始氧化还原酶辅因子的使用情况进行了统计，结果显示，原始氧化 还原酶偏好使用有机辅因子。为了迸一步解释这一偏好性，又对蛋白酶与辅因子 的结合位点的信息进行了分析，发现原始蛋白酶与有机辅因子结合时偏好使用早 起源的氨基酸，而与金属辅因子结合时偏好使用晚起源的氨基酸，由此我们推断， 原始蛋白酶辅因子的使用偏好与原始世界中氨基酸的丰度有密切关系。 关键词：氧化还原；辅因子：生物信息学 作为一类重要的化学反应，氧化还原反应在工农业生产、科学技术以及日常 生活中有着广泛的应用。无论是疾病防治、基因遗传、药物体内释放，还是能量 转换、神经传导、光合作用、呼吸过程，都伴随着氧化还原反应的发生。氧化还 原反应的本质是电子的偏移和转移，由于氨基酸是弱的氧化还原介体( r e d 0 x m e d i a t o r s ) ，本身并不具备较好的得失电子能力，而辅因子( 即与酶结合且酶促 反应所必需的非蛋白质化合物) 【1 1 3 】能够帮助氧化还原酶偏移和转移电子。因此， 绝大多数的氧化还原反应需要辅因子的参与。众所周知，辅因子主要包括两大类： 有机辅因子，如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( n a d ) 、烟酰胺腺嘌呤二核昔酸磷酸 ( n a d p ) 、黄素腺嘌呤二核苷酸( f m n ) 、黄素腺嘌呤二核苷酸( 山) 等；金属辅 因子，如铜( c u ) 、铁( f e ) 、锰( m n ) 、镍( n i ) 、钴( c o ) 等【1 1 年1 1 16 】。既然两类辅因 子在生物体内都是普遍存在的，又都是多数氧化还原反应所必需的，那么对这两 类辅因子的特征比较将会是一件很有意思的事情。遗憾的是，我们并未从前人的 研究结果中得到满意的答案，这也激发了我们找寻答案的热情。本文借鉴生物信 息学的方法，对氧化还原反应涉及的辅因子进行分析。 4 3 山东师范大学博j ：论文 4 1 研究对象 本章的数据集主要包括以下三个： ( 1 ) 酵母蛋白组中的氧化还原蛋白酶。 ( 2 ) m a l l e t 数据库中前1 2 类代谢中进化值在0 加0 5 的原始氧化还原蛋白。 ( 3 ) 处于进化树根部的嗜热蛋白忉p 砌绷印办妇毋m c d c c 搬乃础淞( 最 适生长温度为l o oo c ) 的蛋白信息。 4 2 相关的生物信息数据库 分子进化网络数据库( m o l e c u l a ra n c e s 缸yn e t 、釉r k _ m a n e t ) 【7 3 】 详细 介绍见2 1 。 酵母基因数据库( s a c c h a r o m y c e sg e n o m ed a t a b a s e s g d ) 【7 4 】 蛋白质序列数据库( s w i s s p o r t t r e m b l ) 【7 7 】 基于蛋白质结构数据的药物结合位点注释数据库a n n o 诅t e dd a 讪a s eo f d 1 1 l g g a b l eb i n d i i l gs i t e s 矗的mt h ep d b ( s c p d b ) 【1 1 刁 4 3 研究方法及步骤 4 3 1 原始氧化还原酶的筛选 筛选酵母原始蛋白酶中酶编号为1 的酶。 在m a n e t 数据库中提取生命早期使用的前1 2 类代谢途径中中进化值在 o 0 0 5 的古老氧化还原酶( e c1 ) 。 从p d b 数据库中下载处于进化树根部的嗜热蛋白切甜编删印力泷 马物淞触淞( 最适生长温度为1 0 0o c ) 的氧化还原酶( e c l ) 和相对 应的p d b 号。 4 3 2 原始氧化还原酶辅因子的查询 根据s w i s s p r o t 数据库和b r e n d a 数据库中蛋白酶参与的反应方程式以 及辅因子( c o f a c t o r ) 的使用情况确定原始氧化还原酶使用的辅因子的类型。 山东师范大学博上论文 4 3 3 辅因子与原始氧化还原酶结合位点氨基酸信息的查询 主要在s c p d b 数据库中进行。 4 4 结果与分析 4 4 1d ，d c c 淞扣枷口氧化还原酶辅因子的统计结果与分析 嗜热菌砂m c d 淞乃砌淞体内氧化还原酶发挥作用时所需要的辅因子情况 如表4 1 所示。 表4 - l 嗜热菌毋m c 伽触搬体内氧化还原酶使用辅因子的情况 t a b i e4 - lr e d o xp r o t e i i l sc o n t a i n e di nh ) ，p e n l l e 加o p e 毋阳c d 雌 砌s 埘 p y r dp y r f l ， 4 5 山东师范大学博士论文 续表4 1 。d a c a 厅o ms w l s s p r o t 厂i h ；m bl 7 7 i “a c c o r d i n gt ot t i e t a l 蛳cr e a c t i o 啮p r e s 如t e di nt 量l e n 蚰锄t so fs w l s s p r o f r 厂r r e m b l 7 7 1 。a c c o r d i n gt ot l l ec o f j | c t o ri n f i o m 培l i p r e s t e dj nt 量l e 咖m 协o fs 、s s p r o t 厂i r e m b l 1 7 7 1 4 妇c t o rm 如姗撕o ni sa b s e n ti nt h ec c m 如q e n t so f s 、1 s s p r o t 眦m b l 7 7 1 d 砌e l 【1 18 】等人认为生命起源于高温环境下( 9 5 0 c ) ，而氧化还原蛋白酶的 有机辅酶在这个温度下是无法稳定存在的，因此他们推断在生命起源早期金属辅 酶要比有机辅酶更易在氧化还原过程中发挥作用。对此，我们有不同的看法，因 为一方面，生命到底起源于热的环境还是冷的环境，现在在科学界还没有一个比 较公认的看法【1 1 9 啦! 1 ；另一方面，我们分析了处于进化树根部的嗜热蛋白 h y p e r t h e n i l o p l l i l eb 即c d 螂向，良坫螂( 最适生长温度为1o oo c ) 中氧化还原酶中 的辅因子使用情况，结果如表4 1 所示，从表中我们可以看出，8 2 4 的辅因子使 用的是有机小分子，这与d 撕e l 等人的推断相反。由此我们认为，d a n i e l 等人的 研究结果并不一定全面，究竟是哪类辅因子在生命起源早期氧化还原反应中占主 导地位还有待于迸一步的研究。由于这个问题涉及到生命初始的原始状态，而且 也不可能有化石作为参考，因此研究起来有一定的难度。但这一问题在近几年有 了很大改观，因为随着各种“组学( - 0 m i c s ) 和生物信息学的快速发展，科研 山东师范大学博十论文 人员假定了一些原始蛋白，我们又对对这些蛋白的信息进行了深入的挖掘，结果 如表4 2 和4 3 所示。 4 4 2m a n e t 原始蛋白酶辅因子的统计结果与分析 1 6 3 个m 锄e t 原始蛋白酶中共包含3 9 个氧化还原酶，通过对3 9 个氧化还原 酶使用辅因子的统计分析，我们发现3 4 个( 8 7 ) 氧化还原酶在发挥正常生理 功能时需要有辅因子( c o f a c t o r ) 的参与，而在这3 4 个辅因子中有3 2 个( 9 4 ) 属于有机小分子，有机小分子中3 1 个( 9 6 9 ) 是n a d p ( h ) 辅因子。由此，我 们推断，绝大多数m a l l e t 原始氧化还原酶在发挥生理功能时需要有机辅因子 n a d p ( h ) 的参与。此外，通过分析表4 2 ，我们又得到了一个有意思的结论：在 使用n a d p ( h ) 作为辅因子的原始蛋白酶中6 4 3 的蛋白使用n a d ( p ) - b i n d i n g r o s s m a j l n f o l dd o m a i l lf o l d ( c 2 ) 的折叠类型。这与第二章的推断结果相一致。 表4 2i n 觚e t 数据库中原始氧化还原蛋白使用辅因子 t a b l e4 2p u 硼v e 姐c i c n tr e d o xp r o t e i i l sd e v e d 舶m 蝌e td a t a b a s e p u t a t i v ea n c i e n tr e d o xp r o t e i n s ( e cn u m b e r ) 。 m 觚e t 原始氧化还原酶名称( 酶编号)参黯笋， 蛋白折叠类型：= 二二一 编号 ”一。 u d p - g l u c o s e6 d e h y d r o g e n a s e ( 1 1 1 2 2 ) c 2 1 6 n a d + ，n a d h a l c o h o ld e h y d r o g e n 舔e ( n a d p + ) ( 1 1 1 2 ) c 1 7 1 c 1 7 1 n a d ( p ) + ，n a d ( p ) h n a d p + ，n a d p h a s p a 删e - s e i i l i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ( 1 2 1 1 1 ) c 2 1 3 n a d p + ，n a d p h h 伽s e 血ed e h y d r o g e n 弱( 1 1 1 3 ) d t d p - 4 司e h y d r o i h a i i l n o s er e d u c t a s e ( 1 1 1 1 3 3 ) b i l i v e 砌血r e d u c t a s e ( 1 3 1 2 4 ) 3 - h y d r o x y a c y l c o ad e 吣g e n a s e ( 1 1 。1 3 5 ) 1 ，6 划h y d r o x y c y c l o h c x a - 2 ，4 面e n e - l - c a r b o x y l a t e c 2 1 3 c 2 1 2 c 2 1 3 c 1 5 1 c 2 1 6 n a d p + n a d p h n a d p + ，n a d p h n a d ( p ) + ，n a d ( p ) h n a d + ，n a d h n a d + ，n a d h c 2 1 n a d + ，n a d h c 2 1 1 n a d + ，n a d h 4 7 续表4 2 山东师范大学博士论文 山东师范大学博士论文 续表4 2 c i 皿锄o y l c o ar e d u c t a s e ( 1 2 1 4 4 ) c 2 1 _ e 。d a _ t a6 o mm o l e c u l 盯a 丑s 廿yn e t w o r k ( ma n e t ) ( h t t p ：w 叭m 锄e t u i i l c e d u ) ” 。 f 0 1 di n f 0 1 朋a t i 伽伽n o tb ed e t e r i l l i n e d b ym o l 咖l 盯a n s 仃y n e t w o r k ( ma n e d ( h 郇：伽憎阿f m e l u i l l c e d i l ) f 7 3 d c 蝴r d i n gt ot l l ec a l a l 蜘c 脱c t i sp r e s t e di nt h e 咖印t so f s w i s s p r o t m 吲佃l 7 7 1 da c r d i n gt 0t i l e f i 蛾o ri n 向皿a t i o np 懈t e d i i lt 1 1 ec 0 姗即t so fs 、s s p r o t 厂r 慢m bl 7 7 l 。f - a c 的ri n f o m a t i o ni sa b s 即ti nn l e m m 印t so fs 、1 s s p r o t 恤m 【bl 7 7 】 4 4 3 酵母原始蛋白酶辅因子的统计结果与分析 9 2 7 个酵母原始蛋白酶中共包含1 6 8 个氧化还原酶，通过对1 6 8 个氧还还原酶 辅因子的使用情况分析，我们发现1 2 1 个( 一7 2 ) 氧化还原酶在发挥正常生理功 能时需要有辅因子( c o f a c t o r ) 的参与而1 2 1 个辅因子中有1 0 5 个( 8 6 ) 属于有 机小分子，有机小分子中又有8 7 个( 8 2 ) 是n a d p ( h ) 辅因子。由此，我们可以 看出，绝大多数酵母原始氧化还原酶在发挥生理功能时需要有机辅因子n a d