（物理化学专业论文）核酸探针的制备及初步应用.pdf

! 沟 帅 范 大学 理 学 r. 论 义摘 要 摘要 核酸是生命遗传信息的携带者和传递者， 它不仅对生物的延续、 生物物种遗 传特性的保持、生长发育、细胞分化等起着重要的作用。 而且与生物变异，如肿 瘤、 遗传病等也密切相关，因此研究核酸，尤其是核酸的结构和功能，将有助于 人们从分子水平上了解生命现象的本质。 核酸探针技术是研究核酸结构与功能的 重要手段。 核酸探针的制备和标记是核酸探针技术发展的关键， 因此研究建立新 的制备探针技术具有重要的理论意义和应用价值。 本论文针对核酸分子“ 光开关 ， 和磁性纳米粒子一 s s d n a这两种核酸 探针的制备和应用进行了 较为系统的研究， 取得了以下几个有意义的结果: ( 1 ) 制 备 了 一 种 具 有 核 酸分 子“ 光 开 关” 性 质的 荧 光试 剂一 r u ( b ip y ) z (d p p 劝 2 ， 并 选 用r u ( b ip y )2 ( d p p z ) z + 和 苯 胺红t 分 别作 为 探 针 ， 研 究p n a -d n a , d s d n a 之i b 1 的差异性。 通过相同条件下同一荧光探针与p n a - d n a, d s d na两者之间的不同 作用， 来说明p n a - d n a, d s d n a结构具有一定的差异，并对引起差异性的原因 进行了初步的探讨。 ( 2 ) 建 立了 一种基于磁性纳米粒子的不对 称 p c r技术 用于制备磁性纳米粒子 - s s d n a探针。将一对引物中的一条引物共价键合到磁性纳米粒子表面，限制另 一条引物的量，一定条件下能够进行 p c r扩增，并且可以获得大量连有纳米粒 子的目标 s s d n a.磁性纳米粒子的存在可以方便扩增产物的分离，在外磁场中 即可实现产物的分离和纯化。所得的磁性纳米粒子一 s s d n可以作为探针， 应用于 生物芯片、基因测 序、基因导弹 等方 面的研究。 ( 3 )由于纳米粒子对结合在表面的 d n a有保护作用，可以有效防止核酸酶的降 解，因此将核酸探针结合到纳米粒子表面后可以很好地用于细胞或活体内的分 析、 检测，同时，纳米粒子的存在还可以实现探针大量、定向地导入其中。本文 设计了针对端粒酶r n a的反义脱氧核昔酸，将其键合到核壳型磁性纳米粒子表 面后，导入 h l - 6 0细胞中。原子力学显微镜观察的结果表明:通过细胞吞噬作 用， 磁性纳米粒子一 s s d n a可以大量地导入 h l - 6 0 细胞中， 并能有效地诱导h l - 6 0 细胞凋亡。 关键词:荧光探针:p n a; s s d n a;磁性纳米粒子:反义核酸;荧光光谱:t e m; af m hh 师范大学理学硕 卜 论文 摘 要 ab s t r a c t n u c l e i c a c i d c a r r i e s a n d t r a n s m i t s t h e h e r e d i t a r y i n f o r m a t i o n o f t h e l i f e . i t n o t o n l y p l a y s a n i mp o r t a n t r o l e i n c o n t i n u i n g t h e l i v i n g b e i n g s , k e e p i n g t h e h e r e d i t a r y c h a r a c t e r i s t i c o f t h e b i o l o g i c a l s p e c i e s , m o r e o v e r it a l s o h a s a c l o s e r e l a t i o n w i t h t h e b i o mu t a t i o n . t h e s t u d y o n t h e n u c l e i c a c i d , e s p e c i a l l y o n t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e n u c l e i c a c i d , w i l l e n a b l e u s t o r e a l i z e t h e e s s e n c e o f t h e b i o l o g i c a l p h e n o m e n a a t t h e m o l e c u l e l e v e l . t h e t e c h n o l o g y o f n u c l e i c a c i d p r o b e i s t h e i m p o rt a n t m e a n s t o s t u d y t h e n u c l e i c a c i d s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n , a n d t h e p r e p a r a t i o n a n d ma r k o f t h e n u c l e i c a c i d p r o b e a r e c r i t i c a l t o t h e d e v e l o p m e n t o f t h e n u c l e i c a c i d p r o b e t e c h n o l o g y . t h u s t h e s t u d y a n d d e v e l o p m e n t o f n e w t e c h n o l o g y f o r p r e p a r i n g s u c h p r o b e s h a v e i m p o r t a n t l y t h e o r e t i c a l m e a n i n g a n d p r a c t i c a l v a l u e . h e r e i n th e p r e p a r a t i o n a n d p r e l i mi n a r y a p p l i c a t i o n o f t h e n u c l e i c a c i d m o l e c u l a r l i g h t s w i t c h a n d mn p - s s d n a p r o b e h a v e b e e n s y s t e m a t i c a l l y s t u d i e d a n d s o m e i n t e r e s t in g r e s u l t s w e r e o b t a i n e d a s f o l l o ws . ( 1 ) r u ( b ip y )z ( d p p z ) z a n d s a fra n in e t a r e u s e d a s th e fl u o re s c e n c e p ro b e . t h e in te r a c t io n s o f tw o fl u o r e s c e n t m o le c u le s , r u ( b ip y ) z (d p p z ) z+ a n d s a f ra n in e t , o n p na - d n a a n d d s d na a r e s t u d i e d r e s p e c t i v e l y . wh e n t h e s a m e fl u o r e s c e n t m o l e c u l a r r e a c t s w i t h t h e s e t w o d i f f e r e n t t a r g e t s , t h e d i s t i n c t fl u o r e s c e n c e i s o b s e r v e d u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s . t h i s e x p e r i m e n t a l r e s u l t d e mo n s t r a t e s t h a t t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e p r o b e a n d p n a - d na i s d i f f e r e n t f r o m t h a t b e t w e e n t h e p r o b e a n d d s d n a . we t h i n k t h a t t h e r e a r e mu s t b e s o me d i f f e r e n c e b e t we e n p na- d na a n d d s dna i n s t r u c t u r e . l i v s p e c t r a w a s a l s o u s e d t o c o n f i r m o u r c o n c l u s i o n s ( 2 ) a n a s y m m e t r i c p c r t e c h n i q u e b a s e d o n m a g n e t i c n a n o p a rt i c l e s ( m n p s ) h a s b e e n d e v e l o p e d i n t h i s w o r k t o g e n e r a t e t h e m np - s s d na p r o b e . o n e o f t h e t w o a m p l i f i c a t i o n p r i m e r s w a s b o u n d t o t h e mn p s s u r f a c e b y m o d i f y i n g i t s 5 - e n d a n d l e a v i n g t h e 3 - e n d a v a i l a b le f o r d n a p o l y me r a s e a c t iv i t y , w h i l e t h e o t h e r w a s u n b o u n d . t h e r e s u lt s o b t a i n e d s h o w e d t h a t p c r c o u l d p r o c e e d s u c c e s s f u l l y a n d p le n t y o f t a r g e t s s d n a c o n n e c t e d w i t h mn p s ( mn p - s s d n a c o m p l e x e s ) a l o n g w i t h s o m e d s d n a w i t h o n e s t r a n d c o n n e c t e d t o mn p s c o u l d b e g e n e r a t e d . i n v i r t u e o f 几 海 帅 范 人 学 理 学 硕 卜 论 文摘 要 t h e i r i m m o b i l i z a t i o n o n t h e mn p s s u r f a c e , a s y m m e t r i c p c r p r o d u c t s c o u l d b e e a s i l y i s o l a t e d b y t h e e x t e r n a l ma g n e t i c f i e l d . t h i s n e w s u r f a c e a s y m m e t r i c a m p l i f i c a t io n p r o c e s s c a n n o t o n l y b e u s e d t o p r o d u c e mn p - s s d n a c o mp l e x e s , b u t a l s o p r o v i d e a n a lt e r n a t i v e r o u t e t o i s o l a t e p r o d u c t s o f a s y mm e t ry p c r . ( 3 ) a s t h e n u c l e i c a c i d a t t a c h e d t o t h e s u r f a c e o f n a n o p a rt i c l e s r e s i s t t o t h e d i g e s t i n g o f n u c l e a s e , t h e c o v a l e n t i mm o b i l i z a t i o n o f n u c l e i c a c i d p r o b e o n t o t h e n a n o p a rt i c l e s s u r f a c e w i l l m a k e i t p o s s i b l e f o r g e n e a n a l y s i s a n d g e n e d e t e c t i o n i n c e l l o r i n v i v o a d d i t i o n a l l y , t h e n p s w i l t e n a b l e t h e p r o b e t o e n t e r t h e c e l l i n g r e a t a m o u n t a n d t a r g e t - o r i e n t e d . i n t h i s t h e s i s , a n t i s e n s e d i g o n u c l e o t i d e s c o mp l e m e n t a ry t o t h e t e l o m e r e e n z y m e r n a i s d e s i g n e d a n d i m m o b i l i z e d o n t o t h e s u r f a c e o f mn p s . t h e n t h e o b t a i n e d c o r e - s h e l l mn p - s s d n a c o mp l e x e s w e r e i n t r o d u c e d i n t o t h e h l - 6 0 c e l l . t h e r e s u l t o f a f m s h o w s t h a t t h e mn p s - s s d n a c o m p l e x e s , w h i c h h a v e b e e n p h a g o c y t o s e d b y t h e h l - 6 0 c e l l , h a v e e ffic i e n t l y i n d u c e d t h e a p o p t o s i s o f t h e h l - 6 0 c e l l . k e y wo r d s : f l u o r e s c e n t p r o b e ; p n a; s s d n a; m a g n e t i c n a n o p a r t i c l e s ; a n t i s e n s e d i g o n u c l e o t i d e s ; fl u o r e s c e n c e s p e c t r u m; e l e c t r o p h o r e s i s ; t r a n s m i t i o n e l e c t r o n mi c r o s c o p y ; a t o mi c f o r c e m i c r o s c o p y 卜 海 师 范 人学 理 学 硕 ! 论 文第 一章 第一章文献综述 一、 研究意义 从 1 8 6 9 年瑞士科学家 f r i e d r i c h mi e s c h e r 发现核酸， 到1 9 5 3 年wa t s o n 和c r i c k 阐明d n a双螺旋结构，到今天的分子生物学、分子遗传学和基因治疗学的迅速 发展， 无不标志着核酸研究工作的活跃。核酸是遗传信息的携带者， 是基因表达 的基础。 它在个体的生长、 发育以及繁殖等正常生命活动中具有十分重要的作用。 此外， 核酸碱基序列的突变还会导致生命的异常， 如肿瘤或遗传疾病的发生，因 此分析核酸序列， 探测核酸结构与功能具有非常重大的意义。目前， 核酸探针技 术是分析核酸序列、 研究核酸结构与功能的重要手段。 核酸探针是指标记有报告 分子或具有特殊序列的 r n a或 d n a片段以及能与核酸发生特殊作用的小分子 化合物。 核酸探针一般分为放射性核酸探针和非放射性核酸探针两大类。 放射性 同位素探针因其检测灵敏度高， 己被应用于分子生物学研究和临床诊断。 但由于 放 射性核酸探针存在环境污染以 及放射性废物处理等问 题， 使其进一步的 应用受 到了限制， 因此开发高灵敏度非放射性核酸探针来替代放射性探针成为了热门的 研究课题。荧光核酸探针以其快速、 方便、 所用仪器简单和无放射性污染等优点 而受到极大的关注。 目 前所研制出 核酸分子“ 光开关” 和分子信标等高灵 敏度荧 光 探 针 ， 有 望代 替 放 射 性 核 酸 探针 成 为 常 规的 检 测 工具 。 r u ( b i p y )2 ( d p p z )2 1 是 一 种典型的具有 “ 光开关” 性质的新型高灵敏度荧光核酸探针， 它对核酸的不同构 型 和 不 同 碱基 的 含 量 具 有很 强 的识 别 能 力。 本 论 文 选 用r u ( b ip y ) 2 (d p p z )2 十 和 苯 胺 红t作为探针，研究 p n a - d n a , d s d n a之间的结构差异性，目的是为p n a的 进 一 步 应 用 提 供一 些 有 意 义 的 信 息， 同 时 也 进 一 步 开 拓了r u ( b ip y )2 ( d p p z )2 十 和s t 作为核酸探针的用途。 核酸探针根据其来源与性质又可以分为 d n a探针、 c d n a探针、 r n a探针， 寡核昔酸探针，其中寡核着酸探针因其独特的优点而备受关注，如 ( 1 )可识别 靶序列内单碱基的变化; ( 2 ) 可一次大量合成， 探针价格低廉等。目前寡核营酸 探针主要靠 d n a合成仪合成，但合成仪只能有效合成碱基数 目较少的探针，对 于碱基数目较多的探针主要依靠 p c r扩增得到，其中单链探针主要通过不对称 p c r获得。 本文建立的基于磁性纳米粒子的不对称 p c r技术， 将均相体系的p c r 卜 海 师 范 人学 理 学 硕 ! 论 文第 一章 第一章文献综述 一、 研究意义 从 1 8 6 9 年瑞士科学家 f r i e d r i c h mi e s c h e r 发现核酸， 到1 9 5 3 年wa t s o n 和c r i c k 阐明d n a双螺旋结构，到今天的分子生物学、分子遗传学和基因治疗学的迅速 发展， 无不标志着核酸研究工作的活跃。核酸是遗传信息的携带者， 是基因表达 的基础。 它在个体的生长、 发育以及繁殖等正常生命活动中具有十分重要的作用。 此外， 核酸碱基序列的突变还会导致生命的异常， 如肿瘤或遗传疾病的发生，因 此分析核酸序列， 探测核酸结构与功能具有非常重大的意义。目前， 核酸探针技 术是分析核酸序列、 研究核酸结构与功能的重要手段。 核酸探针是指标记有报告 分子或具有特殊序列的 r n a或 d n a片段以及能与核酸发生特殊作用的小分子 化合物。 核酸探针一般分为放射性核酸探针和非放射性核酸探针两大类。 放射性 同位素探针因其检测灵敏度高， 己被应用于分子生物学研究和临床诊断。 但由于 放 射性核酸探针存在环境污染以 及放射性废物处理等问 题， 使其进一步的 应用受 到了限制， 因此开发高灵敏度非放射性核酸探针来替代放射性探针成为了热门的 研究课题。荧光核酸探针以其快速、 方便、 所用仪器简单和无放射性污染等优点 而受到极大的关注。 目 前所研制出 核酸分子“ 光开关” 和分子信标等高灵 敏度荧 光 探 针 ， 有 望代 替 放 射 性 核 酸 探针 成 为 常 规的 检 测 工具 。 r u ( b i p y )2 ( d p p z )2 1 是 一 种典型的具有 “ 光开关” 性质的新型高灵敏度荧光核酸探针， 它对核酸的不同构 型 和 不 同 碱基 的 含 量 具 有很 强 的识 别 能 力。 本 论 文 选 用r u ( b ip y ) 2 (d p p z )2 十 和 苯 胺 红t作为探针，研究 p n a - d n a , d s d n a之间的结构差异性，目的是为p n a的 进 一 步 应 用 提 供一 些 有 意 义 的 信 息， 同 时 也 进 一 步 开 拓了r u ( b ip y )2 ( d p p z )2 十 和s t 作为核酸探针的用途。 核酸探针根据其来源与性质又可以分为 d n a探针、 c d n a探针、 r n a探针， 寡核昔酸探针，其中寡核着酸探针因其独特的优点而备受关注，如 ( 1 )可识别 靶序列内单碱基的变化; ( 2 ) 可一次大量合成， 探针价格低廉等。目前寡核营酸 探针主要靠 d n a合成仪合成，但合成仪只能有效合成碱基数 目较少的探针，对 于碱基数目较多的探针主要依靠 p c r扩增得到，其中单链探针主要通过不对称 p c r获得。 本文建立的基于磁性纳米粒子的不对称 p c r技术， 将均相体系的p c r _ 海师范大学理学硕士论文 第 一 章 拓展到了在磁性纳米粒子 ( mn p )表面进行，不但为制备 mn p - s s d n a 探针提 供新的方法， 也为单链探针的分离提供了 捷径。 在外磁场作用下即可实现对不对 称 p c r产物的分离， 所得的磁性纳米粒子一 s s d n a可以制备成探针， 在生物芯片、 基因测序、基因导弹等方面有着广泛的应用前景。此外， 将探针键合到纳米粒子 表面后可以进一步开拓探针的应用领域。 一方面纳米粒子对结合在表面的核着酸 具有保护作用，能有效防止核酸酶的降解， 这样连接纳米粒子的探针可以应用于 细胞内以及活体内的分析和检测; 另一方面探针连接在纳米粒子上后还可以实现 探针大量、定向地导入。为此，本文将一段具有生物功能的 s s d n a共价键合到 磁性纳米粒子表面， 初步探讨了其与肿瘤细胞的作用。 结果表明通过细胞吞噬作 用， 磁性纳米粒 子一 s s d n a可以 大量地导入 肿瘤 细胞中，并能有效地诱导 肿瘤细 胞凋亡。在此同时，首次应用 a f m来检测被细胞吞噬的磁性粒子，为磁性纳米 粒子进入细胞后的观察和检测提供新的手段，进一步开拓了a f m在细胞生物学 中的应用。 二、研究进展 核酸探针是指标记有报告分子或具有特殊序列的 d n a或 r n a片段以及能 与核酸发生特殊作用的小分子化合物。 其中发展最早、 应用最多的是基于核酸分 子杂交原理的核酸探针，即为标记有报告分子的已知序列的 d n a或 r na片段 1 - 3 1 。 随着探针技术的不断发展人们发现 利用核酸对小分子探针的荧光增强或减 弱作用也可以 进行核酸研究和分析， 而且操 作更方便! a a l 1 . 已知序列的d n a或 r n a片段作为核酸探针 将不同来源的核酸分子混合后， 经过热变性再冷却复性的过程， 具有相同序 列的异源核酸分子间会形成杂交核酸分子。 d n a或 r n a探针就是利用核酸分子 之间的这种杂交特性，将杂交链中的一条作为探针并标记上某种可检测的物质， 用来识别和检测另一条具有互补核酸序列的杂交链。由于 d n a或 r n a探针与 互补链之间的识别作用是通过大量结合位点间的氢键作用力和碱基专一配对作 用实现的，因此具有极高的特异性。 1 . 1 探针的制备 核酸探针根 据其来源和性质主要 分为d n a探针、 r n a探针、 c d n a 探针和 寡核昔酸探针等。前 3 种核酸探针一般是通过分子克隆获得的，称为克隆探针。 _ 海师范大学理学硕士论文 第 一 章 拓展到了在磁性纳米粒子 ( mn p )表面进行，不但为制备 mn p - s s d n a 探针提 供新的方法， 也为单链探针的分离提供了 捷径。 在外磁场作用下即可实现对不对 称 p c r产物的分离， 所得的磁性纳米粒子一 s s d n a可以制备成探针， 在生物芯片、 基因测序、基因导弹等方面有着广泛的应用前景。此外， 将探针键合到纳米粒子 表面后可以进一步开拓探针的应用领域。 一方面纳米粒子对结合在表面的核着酸 具有保护作用，能有效防止核酸酶的降解， 这样连接纳米粒子的探针可以应用于 细胞内以及活体内的分析和检测; 另一方面探针连接在纳米粒子上后还可以实现 探针大量、定向地导入。为此，本文将一段具有生物功能的 s s d n a共价键合到 磁性纳米粒子表面， 初步探讨了其与肿瘤细胞的作用。 结果表明通过细胞吞噬作 用， 磁性纳米粒 子一 s s d n a可以 大量地导入 肿瘤 细胞中，并能有效地诱导 肿瘤细 胞凋亡。在此同时，首次应用 a f m来检测被细胞吞噬的磁性粒子，为磁性纳米 粒子进入细胞后的观察和检测提供新的手段，进一步开拓了a f m在细胞生物学 中的应用。 二、研究进展 核酸探针是指标记有报告分子或具有特殊序列的 d n a或 r n a片段以及能 与核酸发生特殊作用的小分子化合物。 其中发展最早、 应用最多的是基于核酸分 子杂交原理的核酸探针，即为标记有报告分子的已知序列的 d n a或 r na片段 1 - 3 1 。 随着探针技术的不断发展人们发现 利用核酸对小分子探针的荧光增强或减 弱作用也可以 进行核酸研究和分析， 而且操 作更方便! a a l 1 . 已知序列的d n a或 r n a片段作为核酸探针 将不同来源的核酸分子混合后， 经过热变性再冷却复性的过程， 具有相同序 列的异源核酸分子间会形成杂交核酸分子。 d n a或 r n a探针就是利用核酸分子 之间的这种杂交特性，将杂交链中的一条作为探针并标记上某种可检测的物质， 用来识别和检测另一条具有互补核酸序列的杂交链。由于 d n a或 r n a探针与 互补链之间的识别作用是通过大量结合位点间的氢键作用力和碱基专一配对作 用实现的，因此具有极高的特异性。 1 . 1 探针的制备 核酸探针根 据其来源和性质主要 分为d n a探针、 r n a探针、 c d n a 探针和 寡核昔酸探针等。前 3 种核酸探针一般是通过分子克隆获得的，称为克隆探针。 _ 海师范大学理学硕士论文 第 一 章 拓展到了在磁性纳米粒子 ( mn p )表面进行，不但为制备 mn p - s s d n a 探针提 供新的方法， 也为单链探针的分离提供了 捷径。 在外磁场作用下即可实现对不对 称 p c r产物的分离， 所得的磁性纳米粒子一 s s d n a可以制备成探针， 在生物芯片、 基因测序、基因导弹等方面有着广泛的应用前景。此外， 将探针键合到纳米粒子 表面后可以进一步开拓探针的应用领域。 一方面纳米粒子对结合在表面的核着酸 具有保护作用，能有效防止核酸酶的降解， 这样连接纳米粒子的探针可以应用于 细胞内以及活体内的分析和检测; 另一方面探针连接在纳米粒子上后还可以实现 探针大量、定向地导入。为此，本文将一段具有生物功能的 s s d n a共价键合到 磁性纳米粒子表面， 初步探讨了其与肿瘤细胞的作用。 结果表明通过细胞吞噬作 用， 磁性纳米粒 子一 s s d n a可以 大量地导入 肿瘤 细胞中，并能有效地诱导 肿瘤细 胞凋亡。在此同时，首次应用 a f m来检测被细胞吞噬的磁性粒子，为磁性纳米 粒子进入细胞后的观察和检测提供新的手段，进一步开拓了a f m在细胞生物学 中的应用。 二、研究进展 核酸探针是指标记有报告分子或具有特殊序列的 d n a或 r n a片段以及能 与核酸发生特殊作用的小分子化合物。 其中发展最早、 应用最多的是基于核酸分 子杂交原理的核酸探针，即为标记有报告分子的已知序列的 d n a或 r na片段 1 - 3 1 。 随着探针技术的不断发展人们发现 利用核酸对小分子探针的荧光增强或减 弱作用也可以 进行核酸研究和分析， 而且操 作更方便! a a l 1 . 已知序列的d n a或 r n a片段作为核酸探针 将不同来源的核酸分子混合后， 经过热变性再冷却复性的过程， 具有相同序 列的异源核酸分子间会形成杂交核酸分子。 d n a或 r n a探针就是利用核酸分子 之间的这种杂交特性，将杂交链中的一条作为探针并标记上某种可检测的物质， 用来识别和检测另一条具有互补核酸序列的杂交链。由于 d n a或 r n a探针与 互补链之间的识别作用是通过大量结合位点间的氢键作用力和碱基专一配对作 用实现的，因此具有极高的特异性。 1 . 1 探针的制备 核酸探针根 据其来源和性质主要 分为d n a探针、 r n a探针、 c d n a 探针和 寡核昔酸探针等。前 3 种核酸探针一般是通过分子克隆获得的，称为克隆探针。 卜 海 师 范 人学 理 学 硕 论 文第 一章 寡核若酸探针是指人工合成的短链 d n a探针。寡核营酸探针的优点是对靶序列 变异的识别能力较强， 因为短探针中碱基错配会导致杂交体系的融链温度显著下 降， 而克隆探针对于单个或少数碱基不配的两个序列杂交信号差别很小， 难以区 分。此外，寡核昔酸探针还具有杂交时间短，可一次性大量合成， 成本低廉等优 点。但是，由于寡核昔酸探针序列较短，随机遇到互补序列的可能性大，所以特 异性不高。另外由于序列较短，可标记的位点较少，可获得的杂交信号较弱，灵 敏度较低。 因此适当增加探针的长度可以提高寡聚核普酸的探针的特异性和灵敏 度。目前 d n a合成仪只能有效合成碱基数目较少的探针，对于碱基数目 较多的 探针主要通过 p c r扩增得到，其中不对称 p c r常用来制备单链探针。 1 . 2 探针的标记 最早采用的标记方法是放射性同位素标记法。 虽然放射性同位素标记的探针 灵敏度较高， 但由于半衰期限制， 标记后存放的时间有限， 另外对操作者和环境 有放射性危害， 因而近年来越来越多 地被非放射性 标记所取代。 非放射性标记的 探针种类丰富，包括金属配合物、荧光染料、地高辛半抗原、生物素和酶等，可 以通过酶促反应、 光促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。目前大多是先 制成标记的脱氧核昔三磷酸 d n t p ，然后采用缺口平移法、末端标记法、随机引 物法或聚合酶链反应法 ( p c r )等技术标记到核酸分子上。 1 .3 探针的杂交检测技术 核酸分子杂交有均相杂交和异相杂交 之分。 均相杂交中参加反应的两条核酸 链都游离在溶液中;异相杂交则是一条反应核酸链固定在固体支持物上，另一条 反应核酸链游离在溶液中，因而也叫固相杂交。 作为固体支持物的有尼龙膜、乳 胶颗粒、 磁珠和微孔板等。目前，固相杂交是核酸探针杂交的主要模式。常用的 固相杂交类型有:菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、s o u t h e r n印迹杂交、 n o r t h e r n 印迹杂交、 组织原位杂交和夹心杂交等。 近几年来， 均相杂交检测技术 取得了重要突破，以核酸分子 “ 光开关” 和分子信标为代表的一系列新型探针的 出现使杂交检测操作更加简便，分析速度大大提高。 2 . p n a探针 肤核酸 ( p e p t i d e n u c l e i c a c i d s ，简 称p n a )是以 中性酞胺键为骨架的 一类新 的 d n a类似物，它以 ( 2 - 氨乙基)甘氨酸结构单元为骨架，碱基部分通过亚甲 卜 海 师 范 人学 理 学 硕 论 文第 一章 寡核若酸探针是指人工合成的短链 d n a探针。寡核营酸探针的优点是对靶序列 变异的识别能力较强， 因为短探针中碱基错配会导致杂交体系的融链温度显著下 降， 而克隆探针对于单个或少数碱基不配的两个序列杂交信号差别很小， 难以区 分。此外，寡核昔酸探针还具有杂交时间短，可一次性大量合成， 成本低廉等优 点。但是，由于寡核昔酸探针序列较短，随机遇到互补序列的可能性大，所以特 异性不高。另外由于序列较短，可标记的位点较少，可获得的杂交信号较弱，灵 敏度较低。 因此适当增加探针的长度可以提高寡聚核普酸的探针的特异性和灵敏 度。目前 d n a合成仪只能有效合成碱基数目较少的探针，对于碱基数目 较多的 探针主要通过 p c r扩增得到，其中不对称 p c r常用来制备单链探针。 1 . 2 探针的标记 最早采用的标记方法是放射性同位素标记法。 虽然放射性同位素标记的探针 灵敏度较高， 但由于半衰期限制， 标记后存放的时间有限， 另外对操作者和环境 有放射性危害， 因而近年来越来越多 地被非放射性 标记所取代。 非放射性标记的 探针种类丰富，包括金属配合物、荧光染料、地高辛半抗原、生物素和酶等，可 以通过酶促反应、 光促反应或化学修饰等方法标记到核酸分子上。目前大多是先 制成标记的脱氧核昔三磷酸 d n t p ，然后采用缺口平移法、末端标记法、随机引 物法或聚合酶链反应法 ( p c r )等技术标记到核酸分子上。 1 .3 探针的杂交检测技术 核酸分子杂交有均相杂交和异相杂交 之分。 均相杂交中参加反应的两条核酸 链都游离在溶液中;异相杂交则是一条反应核酸链固定在固体支持物上，另一条 反应核酸链游离在溶液中，因而也叫固相杂交。 作为固体支持物的有尼龙膜、乳 胶颗粒、 磁珠和微孔板等。目前，固相杂交是核酸探针杂交的主要模式。常用的 固相杂交类型有:菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、s o u t h e r n印迹杂交、 n o r t h e r n 印迹杂交、 组织原位杂交和夹心杂交等。 近几年来， 均相杂交检测技术 取得了重要突破，以核酸分子 “ 光开关” 和分子信标为代表的一系列新型探针的 出现使杂交检测操作更加简便，分析速度大大提高。 2 . p n a探针 肤核酸 ( p e p t i d e n u c l e i c a c i d s ，简 称p n a )是以 中性酞胺键为骨架的 一类新 的 d n a类似物，它以 ( 2 - 氨乙基)甘氨酸结构单元为骨架，碱基部分通过亚甲 _ 淘帅范大学理学硕一 l 论文第 一 章 基拨基连接于主骨架上， 碱基与骨架间隔3个键， 相邻碱基间隔6个键其结构上 与天然核酸具 有相似性，使 p n a对核酸分子具 有独特的序列识别功能( a l 。 它可 以 通过w a t s o n - c r i c k 碱基配对形式识别互补的d n a和r n a 9 1 。由 于p n a的骨 架为中性， p n a - d n a或 p n a - r n a双链之间就不存在电荷排斥作用，因此与 d n a双链相比p n a - d n a具有更高的热稳定性。而且 p n a - d n a碱基对错配杂 交分子的不稳定性 比 d n a - d n a 碱 基对错配杂交分子 的不稳定性更高。 p n a - d n a间出现一个碱基错配， 其结合效率就会明显下降， 出现两个碱基错配， 则完全不能杂交。 不同于 d n a与 d n a或 r n a间的杂交， p n a与 d n a或r na 的杂交 几乎不受杂交体系盐浓度的 影响。 因此与d n a探针相比， p n a探针具有 更快的杂交速度，更高的杂交稳定性、 优良的特异序列识别能力。杂交速率和亲 和性的增加，使 p n a能够通过链侵入在 d n a双链里达到与序列的识别功能， 同时还可以在双链 d n a 的内部有效地识别二级结构。鉴于 p n a 具有的上述特 点，用p n a作为诊断或检测用的探针是当前富有前景的应用领域， 2 . 1 p n a探针用于原 位杂交 由于p n a比d n a具有更高的亲合性，同时 具备较高 的特异性， 使得p n a 能成为理想得杂交探针。当采用较短的序列时， 系统具有较高的特异性， 对于原 位杂交p n a可以采用生物素、荧光 素、 地高辛营元等进行标记 。 2 .2 p n a用于点突变分析 采用p n a的p c r发夹方法可以对一 个给定的d n a片断是否存在己 知位点 的突变 进行直 接的p c r分析，而无需进 行测序(lull 。其方法是先合 成一个与 野 生型序列互补的p n a寡聚物， p c r反应时加入这种p n a寡聚物和一对引物( 其 中一个与突变型基因配对，另一个是正常的引物) 。当扩增进行时，野生型序列 的p n a和突变型 d n a引物共同 竞争目 标物质的 起始 序列位置而形成杂交体。 由于只有当目 标中存在突变等位基因时，突变型 d n a引物才能竞争过 p n a引 物而结合到起始位点，从而得以扩增延长。因此这样 p c r扩增具有精确的匹配 设计。 2 .3 p n a用于改善酶切位点 当全喷咙的p n a寡聚物连接在一起时能形成p n a发夹， 链侵入的过程使它 可以有效地识别双链 d n a中短至 7个碱基的全嘿吟序列。当 p n a发夹与双链 海师范大学理学硕 j论文第 一章 d n a结合 后即可封闭 酶的功能1 2 1 。 采用p n a发夹 可以重叠于特异性的全嘿吟目 标序列上。 从而达到封闭特殊的甲基化位点的 目 的。 当甲基化完成以后除去 p n a 发夹，加入相应的限制性酶切割 d n a 。只有那些被p n a封闭了甲基化作用的位 点刁能作为限制性酶作用的 底物， 采用 这种方 法 f r a n k - k a m e n e t a k i i 等 2 0 证实了 可以在非常特异性的位点上对酵母菌基因进行切割。 2 . 4 p n a用于预凝胶杂交 p n a 预凝胶杂交是一种具有单碱基对区分功能的快速印迹方法。首先双链 d n a 与过 量的 p n a 标记探针在低盐浓度 下一起加热 ，形成单链 d na 和 p n a / d n a杂交体，通过电泳可以将两者分离。标记的p n a / d n a杂交体可以采 用传统的方法检测。 此方法对于 1 5 m e r 的探针特异性很强， 对单个碱基对的区分 不用严格的冲洗条件即可实现。p n a 预凝胶杂交可以极大地简化印迹的操作过 程，避免大量的时间与劳力的投入，包括可以省略印迹后的杂交。 目前，p n a正处于应用迅速扩展的时期，随着对 p n a性质和用途的深入了 解。将促使其在核酸识别功能方面的普及性迅速提高。 3 荧光探针 利用核酸对小分子探针的荧光增强或减弱作用进行核酸研究和分析， 操作方 便、 快速，在众多核酸分析方法中，发展之快， 涉及范围之广是其它方法无可比 拟的。 3 . 1染料探针 漠 化乙锭是一种经典的核酸探针， 可用于核酸的定性、 定量分析 h 1 。由 于溟 化乙锭具有强制癌性， 使其进一步应用受到很大的限制， 因而发展其它安全灵敏 的核酸荧光染料一探针成为必然。 花蓄染料是一类性质优良的近红外探针， 大多数 花着染料在水溶液中摩尔吸光系数大，有合适的光稳定性。单聚体曝啤橙 ( t o) 和德吟黄 ( y o) 及其二聚体 t o t o和 y o y o在水溶液中不发荧光， 但是与d n a 结合后，荧光量子产率显著提高。 许金钩 1 4 1 等合成了 一种近红外花警染料，可 以用于痕量核酸测定。 h o e c h e s t 3 3 2 5 8是一种非常灵敏应用广泛的荧光染料探针， r i le y 11 以 之为 探 针 ， 采 用荧 光 微 滴 定 技术 建 立了 精 确 测 定d n a 的 方 法。 许 金 钩 等利用染v 一 与 d n a之间的 相互作 用，建 立了福 斯芬 3 r i s 、亚甲 基蓝 n 1 、耐尔 蓝 1 8 1 、 灿烂甲酚蓝 【 1 9 1麦格达拉红以 及利凡诺为 探针测定d n a的荧光碎灭法: 海师范大学理学硕 j论文第 一章 d n a结合 后即可封闭 酶的功能1 2 1 。 采用p n a发夹 可以重叠于特异性的全嘿吟目 标序列上。 从而达到封闭特殊的甲基化位点的 目 的。 当甲基化完成以后除去 p n a 发夹，加入相应的限制性酶切割 d n a 。只有那些被p n a封闭了甲基化作用的位 点刁能作为限制性酶作用的 底物， 采用 这种方 法 f r a n k - k a m e n e t a k i i 等 2 0 证实了 可以在非常特异性的位点上对酵母菌基因进行切割。 2 . 4 p n a用于预凝胶杂交 p n a 预凝胶杂交是一种具有单碱基对区分功能的快速印迹方法。首先双链 d n a 与过 量的 p n a 标记探针在低盐浓度 下一起加热 ，形成单链 d na 和 p n a / d n a杂交体，通过电泳可以将两者分离。标记的p n a / d n a杂交体可以采 用传统的方法检测。 此方法对于 1 5 m e r 的探针特异性很强， 对单个碱基对的区分 不用严格的冲洗条件即可实现。p n a 预凝胶杂交可以极大地简化印迹的操作过 程，避免大量的时间与劳力的投入，包括可以省略印迹后的杂交。 目前，p n a正处于应用迅速扩展的时期，随着对 p n a性质和用途的深入了 解。将促使其在核酸识别功能方面的普及性迅速提高。 3 荧光探针 利用核酸对小分子探针的荧光增强或减弱作用进行核酸研究和分析， 操作方 便、 快速，在众多核酸分析方法中，发展之快， 涉及范围之广是其它方法无可比 拟的。 3 . 1染料探