（植物学专业论文）拟南芥活性氧应答基因的转录调控分子机制研究.pdf

河南大掌2 0 1 0 屠研究生博士掌位论文 摘要 在高等植物中，活性氧作为重要的信号分子介导了防御反应、程序性死亡、气孔关闭、细 胞生长和植物发育调控等许多重要的生理过程。活性氧能够广泛地调控许多基因的表达，暗示 了在植物细胞中存在复杂的活性氧应答的转录调控网络，但目前对于这一复杂调控网络中的许 多细节仍不清楚。 本研究通过基因芯片技术在基冈组水平上系统研究检测了a b a 以及h 2 0 2 对拟南芥幼苗 基因表达的调控。发现外源h 2 0 2 处理使4 5 9 个基因的转录水平明显增加，同时使2 2 1 个基因 的表达显著减少，显示h 2 0 2 也是一种重要的转录调节物质，广泛地调控了许多基因的表达。 而且a b a 和h 2 0 2 对基因表达的调控存在相当大的重叠，它们可能通过一种协同模式调控下 游基因的表达。通过生物信息学检索，本研究从活性氧特异应答基因的启动子序列中发现8 个潜在的氧化胁迫应答的顺式作用元件。通过基因枪介导的瞬时表达系统检测发现4 个保守序 列元件在h 2 0 2 、m v 等不同种类的活性氧处理下能够诱导下游萤光素酶基冈的表达，它们可 能作为氧化胁迫应答的元件( r o sr e s p o n s i v ee l e m e n t ) 参与活性氧应答的转录调控。 在上述研究的基础上，发现a p 2 e r e b p 家族转录冈子e r f 6 能够特异地与r o e 8 结合， 共转化e r f 6 能够显著增强r o e 8 的转录活性，而且h 2 0 2 处理能够促进e r f 6 对r o e 8 的激 活效应。进一步的研究发现e r f 6 能够与m p k 3 6 发生直接的相互作用，m p k 6 能够磷酸化 e r f 6 蛋白的s e r 2 6 6 和s e r 2 6 9 残基。e r f 6 磷酸化位点的突变会引起e r f 6 亚细胞定位的改变， e r f 6 d o 定位于细胞核中，而非活化状态的e r f 6 a a 主要存在于细胞质中。3 5 s - e r f 6 w r 、 3 5 s - e r f 6 d o 超表达转基因植物在萌发和生长早期对h 2 0 2 更加敏感，些活性氧应答基因的表 达也明显增加。免疫共沉淀结果还显示h 2 0 2 和磷酸化能增加e r f 6 和m p k 6 复合体的积累。 上述结果显示e r f 6 作为活性氧应答的转录因子，接受活性氧激活的m p k 6 的调控，介导了活 性氧对于基因表达和幼苗生长发育的调控过程。 本研究工作系统比较分析了h 2 0 2 对基因表达的调控作用，通过生物信息学和遗传学分析 检测了在活性氧应答基因启动子中存在的氧化胁迫应答元件，并鉴定了其中一个顺式作用元件 r o e 8 的结合蛋白e r f 6 的功能，发现r o s m p k 6 e r f 6 途径部分地介导了活性氧对于基因表 达的调控过程。这一研究为阐明活性氧应答的转录调控机制提供了重要的基因组学和遗传学线 索。 论文主题词：活性氧、基因表达、顺式作用元件、m p k 6 、e r f 6 菊臼霄芥活性窜立答基因的转景谩控分子机制研究 a b s t r a c t r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) h a sb e e nc h a r a c t e r i z e da sa l li m p o r t a n ts i g n a lm o l e c u l et h a t m e d i a t e sm a n yd e v e l o p m e n t a la n dp h y s i o l o g i c a lp r o c e s s e si np l a n t s ，w h i c hi n c l u d eb i o t i ca n d a b i o t i cs t r e s sr e s p o n s e s ，s t o m o t a lm o v e m e m ，p r o g r a m m e dc e l ld e a t h ，g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t r o s a l s op l a y sag l o b a lr o l ei ng e n et r a n s c r i p t i o n s of a r , d e t a i l so ft h er o sr e s p o n s i v et r a n s c r i p t i o n a l n e t w o r ka r es t i l ll a r g e l yu n k n o w n t og a i ni n s i g h ti n t ot h ec o o r d i n a t i o no f g e n ee x p r e s s i o np r o f i l e su n d e ra b s c i s i ca c i d ( a b a ) a n d h 2 0 2a p p l i c a t i o n s ，g l o b a lc h a n g e si ng e n ee x p r e s s i o ni nr e s p o n s et oa b aa n dh 2 0 2i na r a b i d o p s i s s e e d l i n g sw e r ei n v e s t i g a t e db ym i c r o a r r a ya n a l y s i s 4 5 9t r a n s c r i p t sw e r ef o u n dt ob es i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d ，w h e r e a sa n o t h e r2 21d e c r e a s e df o l l o w i n gh 2 0 2t r e a t m e n tc o m p a r e dw i t hc o n t r 0 1 t h e s e r e s u l t ss u g g e s tt h eg l o b a lr o l eo fh 2 0 2i ng e n et r a n s c r i p t i o n t h et r a n s c r i p t i o n a lr e s p o n s e si n d u c e d b yt h ea p p l i c a t i o no fe x o g e n o u sa b aa n dh 2 0 2o v e r l a p p e ds u b s t a n t i a l l y p r o m o t e r so fr o s u p - r e g u l a t e dg e n e sw e r es e l e c t e df o rab i o i n f o r m a t i c ss e a r c ht oi d e n t i f yt h ep o t e n t i a lt r a n s c r i p t i o n f a c t o rb i n d i n gs i t e sr e s p o n s i b l ef o rr o si n d u c e dg e n ee x p r e s s i o n ，a n df o u ro fe i g h tp o t e n t i a lr o s r e s p o n s i v ec i s - e l e m e n t s ( r o e s ) a r es u f f i c i e n tt oc o n f e rar a p i di n c r e a s eo fl u c i f e r a s eu n d e rh 2 0 2a n d m vt r e a t m e n ti n d i c a t e dt h e i rr o l e si nr o sr e s p o n s i v eg e n e t r a n s c r i p t i o n w ea l s of o u n dt h a ta na p 2 e r e b pt r a n s c r i p t i o nf a c t o re r f 6c o u l db i n dt ot h er o e 8 s p e c i a l l y c o - e x p r e s s i o no fe r f 6e f f e c t o re n h a n c e dt h ee x p r e s s i o no fr o e 8d r i v e rl u c i f e r a s eg e n e ，w ea l s o f o u n dt h a te r f 6i n t e r a c t e dp h y s i c a l l yw i t hm p k 6i nv i t r oa n di nv i v o ，a n da l s os e r v e da sas u b s t r a t e o fm p k 6 t w os e rr e s i d u e s , s e r2 6 6a n ds e r2 6 9w e r et h ep u t a t i v ep h o s p h o r y l a t i o ns i t eo fe r f 6 a f t e ra p p l i c a t i o no fh 2 0 2 ，p h o s p h o r y l a t i o nb ym p k 6 ，e r f 6r e l o c a l i z e sf r o mc y t o p l a s mt ot h e n u c l e u s e x p r e s s i o no fr o sr e s p o n s i v eg e n e si ss t r o n g l yu p - r e g u l a t e di n3 5 s - e r f 6 盱a n d 3 5 s - e r f 6 wt r a n s g e n i cp l a n t s f u r t h e r m o r e ，g r o w t h so f3 5 s e r f 6 w ta n d3 5 s e r f 6 d ds e e d l i n g s a r em o r es e n s i t i v et o h 2 0 2t r e a t m e n tt h a nw to r3 5 s - e r f 6 州t r a n s g e n i cp l a n t s i m m u n o p r e c i p i t a t i o nr e s u l t si n d i c a t e dt h a th 2 0 2t r e a t m e n ta n ds st od dm u t a t i o na l s oi n c r e a s e dt h e s t a b i l i t yo fe r f 6 - m p k 6c o m p l e x b a s e do nt h o s er e s u l t s ，t h em p k 6 - e r f 6p a t h w a yh a se s t a b l i s h e d t h a ti tm e d i a t e dt h er o s r e s p o n s i v et r a n s c r i p t i o na n ds e e d l i n gg r o w t hr e g u l a t i o n i nt h i sw o r k , h 2 0 2r e s p o n s i v eg e n et r a n s c r i p t i o nw a sc o m p a r e da tg e n o m i cr a n g e sa n dp o t e n t i a l r o sr e s p o n s i v ec i s - e l e m e n t sw e r ei d e n t i f i e d t h ef u n c t i o no fr o e 8b i n d i n gp r o t e i ne r f 6i n c o n t r o l l i n gt h er o sr e s p o n s i v eg e n ee x p r e s s i o nw a sa l s oc h a r a c t e r i z e d w ef o u n dt h a th 2 0 2 r e s p o n s i v eg e n ee x p r e s s i o np a r t l yd e p e n d e n to nr o s m p k 6 - e r f 6p a t h w a y t h e s ed a t am a y p r o v i d en e wi n s i g h ti n t or o sr e s p o n s i v eg e n er e g u l a t i o nm e c h a n i s m k e yw o r d s ：r o s ，g e n ee x p r e s s i o n , e i s e l e m e n t , m p k 6 ，e r f 6 河南大掌2 0 1 0 届研究生博士掌位论文 缩略词表 越南芥活性审j 筻答基因的转录调控分子机制研究 d r t l l 2 d s m l d s t d t t d w f 4 e d t a e r n 3 e m s a e r f e t r l g f p g p a l g p x g r g s h g s t 6 h h i f o m h s f m i a a 4 i p j a z 8 l e a m a k l m 魄p k m d a r m e j a m e s m i p s m v n a d k n d p k 2 n e s n f 心 n l s n o n o a l d n a - d a m a g e r e p a i r t o l e r a t i o n1 1 2 d r o u g h th y p e r - s e n s i t i v em u t a n t1 d r o u g h ta n ds a l tt o l e r a n c e d i t h i o t h r e i t o l d w a r f 4 e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d e t h y l e n e - i n s e n s i t i v e 3 e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i f ta s s a y e t h y l e n er e s p o n s ef a c t o r e t h y l e n er e s p o n s el g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n gp r o t e i na l p h as u b u n i tl g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e g l u t a t h i o n er e d u c t a s e g l u t a t h i o n e g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s e6 h y d r o g e np e r o x i d eh i g h l yi n d u c e dg e n e f l u l ，0 3a n dm vi n d u c e dg e n e h e a ts h o c kf a c t o r i n d o l e 3 a c e t i ca c i d a u x i n - r e s p o n s i v ep r o t e i n4 i m m u n o p r e c i p i t a t i o n j a s m o n a t e - z i m - d o m a i np r o t e i n8 l a t ee r a b r y o g e n e s i sa b u n d a n tp r o t e i n m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s el m i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m o n o - d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e m e t h y lj a s m o n a t e 2 - ( 4 - m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ca c i d m u n i c hi n f o r m a t i o nc e n t e rf o rp r o t e i ns e q u e n c e m e t h y lv i o l o g e n n a d hk i n a s e n u c l e o s i d ed i p h o s p h a t ek i n a s e2 n u c l e a re x p o r ts i g n a l n u c l e a rf a c t o rk a p p a - l i g h t - c h a i n - e n h a n c e ro fa c t i v a t e dbc e l l s n u c l e a rl o c a l i z a t i o ns i g n a l n i u i co x i d e n i t r i co x i d ea s s o c i a t e dl d n a 伤害修复耐受( 相关蛋白) 1 1 2 干旱超敏感突变体l 干旱和盐耐受突变体 二硫苏糖醇 矮化突变体4 乙二胺四乙酸 乙烯不敏感突变体3 凝胶阻滞电泳分析 乙烯应答因子 乙烯应答( 突变体) l 绿色荧光蛋白 g 蛋白a 亚基l 谷胱甘肽过氧化物酶 谷胱甘肽还原酶 还原型谷胱甘肽 谷胱甘肽巯基转移酶6 h 2 0 2 强烈诱导表达基因 f l u 、臭氧和m v 诱导基因 热休克因子 吲哚乙酸 生长素应答蛋白4 免疫沉淀反应 荣莉酸z i m 结构域蛋白8 胚胎晚期丰余蛋白 促有丝分裂素激活的蛋白激酶l 促有丝分裂素激活的蛋白激酶 单脱氢抗坏血酸还原酶 荣莉酸甲酯 2 吗啉乙磺酸 慕尼黑蛋白序列信息中心 甲基紫精 n a d h 激酶 二磷酸核苷激酶2 细胞核转出信号 核定位序列 一氧化氮 氧化氮相关蛋白l 2 河南大掌2 0 1 0 屠研究生博士掌位论文 n p r l n r 0 b p o c s o s t l 0 x i l p a l l p a o p c d p c h l i d e p 1 3 k p 1 3 p p i n 3 p k p m r s p m s f p p 2 c p r 1 p l 己e s p m p y l s p y r l r b o h r c a r l r o e p o p r o p g a p r o s s a s a r s i p k s l a c l s n r k 2 s o d t g a l t p x y a p n o ne x p r e s s i o no f p rg e n e s n i t r a t er c d u c t a s c o c se l e m e n tb i n d i n gp r o t e i n o e t o p i n es y n t h a s e o p e ns t o m a t a1 o x i d a t i v es i g n a l i n d u c i b l el p h e n y l a l a n i n ea m m o n i al y a s el p o l y a m i n eo x i d a s e p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p r o t o c h l o r o p h y i l i d e p h o s p h a t i d y l i n o s i t o i3 - k i n a s e p h o s p h a t i d ) 7 l i n o s i t o l3 - p h o s p h a t e p i n - f o r m e d3 p h y t o c h r o m ek i n a s e p l a s m am e m b r a n er e d o xs y s t e m p h e n y i m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e p r o t e i np b o s p h a t a s e2 c p a t h o g e n e s i sr e l a t e d1 p h e r o m o n er e s p o n s ee l e m e n t s p h e r o m o n er e s p o n s ef a c t o ri p y r i - l i k e p y r a b a c t i nr e s i s t a n c ei r e s p i r a t o r yb u r s to x i d a s eh o m o l o g r e g u l a t o r yc o m p o n e n t so f a b ar e c e p t o r r o sr e s p o n s i v ed e m e n t r h o - l i k es m a l lgp r o t e i n p o pg t p a s ea c t i v a t i n gp r o t e i n r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s s a l i c y l i ca c i d s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e s a l i c y l i ca c i d - i n d u c e dp r o t e i nk i n a s e s l o wa n i o nc h a n n e l - a s s o c i a t e dl s n f1r e l a t e dp r o t e i nk i n a s e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t g a c gb i n d i n gf a c t o r1 t h i o lp e r o x i d a s e s y e a s ta c t i v a t o rp r o t e i n - l - 1 p r 基因不表达突变体l 硝酸还原酶 o c s 元件结合蛋白 章鱼碱合成酶( 元件) 气孔开放突变体l 氧化信号诱导基因l 苯丙氨酸解氨酶i 多胺氧化酶 细胞程序性死亡 原叶绿素酸脂 磷脂酰肌醇3 激酶 磷脂酰肌醇3 磷酸 生长素转运调节蛋白 光敏色素激酶 质膜氧化还原酶系统 苯甲基磺酰氟 蛋白磷脂酶2 c 病程相关( 基因) l 信息素应答元件 信息素应答因子1 p y r l 类似 p y r a b a e t i n 抗性突变体1 呼吸猝发氧化酶同源物 a b a 受体调节组分 活性氧应答元件 r h o 类似的小g 蛋白 r o p 类g 蛋白活化蛋白 活性氧 水杨酸 系统获得性抗性 水杨酸诱导的蛋白激酶 慢速阴离子通道l s n f l 相关的蛋白激酶 超氧化物歧化酶 t g a c g 结合因子1 硫醇过氧化物酶 酵母激活子蛋白1 类似蛋白 3 关于学位论文独立完成和内容创新的声明 本人向河南大学提出硕士学位中请。本人郑重声明：所呈交的学位论文是 本人在导师的指导下独立完成的，对所研究的课题有新的见解。据我所知，除 文中特别加以说明、标注和致谢的地方外，。论文中不包括其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包括其他人为获得任何教育、科研机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作酌同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示了谢意。 臼l 学位申请人( 学位论文作者) 签名： 堑塑与盈芝 2 0 ，o 年占月，彳日 关于学位论文著作权使用授权书 本人经河南大学审核批准授予硕士学位。作为学位论文的作者，本人完全 了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文番勺要求，即河南大学有权向国家 图书馆、科研信，叁机构、数据收集机构和本校图书馆等提供学位论文( 纸质文 本和电子文本) 以供公众检索、奎阅。本人授权河南大学出于宣扬、展览学校 学术发展和进行学术交流等目的，可以采取影印、缩印、扫描乖拷贝等复制手 段保存、汇编学位论文( 纸质文本和电子文本) 。 ( 涉及保密内容的学住论文在解密后适用本授权书) i 学位获得者( 学位论文作者) 签名：乏筮自翌羔 2 0 ，口年月，名日 学住论文指导教师签名： 披南芥活性牵j 应答基因的转景调控分子审博f 研究 文献综述 1 植物活性氧信号转导研究进展 氧的代谢过程是植物生命活动的重要组成部分，环境刺激和体内代谢的失衡都能够引发体 内电子传递和氧化还原动态平衡的破坏，引起h 2 0 2 、超氧阴离子、氧自由基等活性氧( r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 的产生。细胞内活性氧的产生和积累不仅可以造成细胞坏死、细胞膜 渗漏、染色质凝结等细胞伤害，而且越来越多的研究也证实活性氧还可以作为信号分子，介导 植物对于病原菌的防御反应、程序性死亡、气孔关闭、细胞生长和植物发育调控等许多重要的 生理过程( l a l o ie ta 1 ，2 0 0 4 ；n e i l le ta 1 ，2 0 0 2 ；w a n ga n ds o n g ，2 0 0 8 ) 。目前活性氧相关的信号转 导研究已经成为植物学研究领域的热点之一。 1 1 植物活性氧的产生和清除 植物体内具有复杂的活性氧产生和清除机制，维持细胞内氧化还原状态的微妙平衡，在避 免过量活性氧造成的细胞伤害的同时，还能及时准确地应答上游的胁迫和发育信号，并介导下 游的复杂的生理过程。 已经知道在植物细胞内，叶绿体、线粒体和过氧化物酶体是r o s 产生的主要细胞器。叶 绿体光合电子传递系统是植物细胞r o s 的一个重要来源。叶绿素分子吸收量子后由基态上升 到一个不稳定的、高能状态的激发态，在从激发态向较低能量状态的转变过程中，可以与植物 体内的基态氧分子形成单线态氧( 1 0 2 ) ，或通过电子转移形成0 2 一、h 2 0 2 和o h 等活性氧自由 基。高光强刺激下当吸收的光能超过c 0 2 同化作用的能力时，叶绿体也能产生1 0 2 。光系统i i 中激发的三线态叶绿素分子与0 2 相互作用也产生1 0 2 ( f r y e re ta 1 ，2 0 0 2 ；h i d e ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。u v 辐射或强光胁迫引起的光抑制作用也会导致叶绿体内1 0 2 和0 2 的产生( h i d e ge ta 1 ，2 0 0 2 ； h i d e ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 。在叶绿体光合电子传递链p si 的受体端有大量的自动氧化酶类存在，能够 通过米勒反应将氧还原成超氧化物，0 2 。可通过酶促反应歧化成h 2 0 2 和( c h e n ga n ds o n g , 2 0 0 6 ) 。 过氧化物酶体也是h 2 0 2 产生的主要细胞器，叶绿体光呼吸形成的乙醇酸转移到过氧化物 酶体后，在乙醇酸氧化酶作用下，生成乙醛酸和h 2 0 2 ，另外过氧化物酶体中脂肪酸p - 氧化过 程中也有h 2 0 2 作为代谢副产物产生，嘌呤分解代谢途径也产生多种r o s ( d e lr i oe ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 植物细胞内在空间分布上与叶绿体和过氧化物酶体紧密相邻的线粒体，是另一个产生r o s 的 细胞器，线粒体呼吸链末端氧化酶把底物的电子传递到氧分子形成水或h 2 0 2 ，哺乳动物细胞 4 河南大掌2 0 1 0 角；研究生博士掌位论文 中，线粒体是r o s 的主要来源，植物由于a o x ( a l t e r n a t i v eo x i d a s e ，交替氧化酶) 的存在， 线粒体中产生的r o s 相对很低( p u r v i s 。1 9 9 7 ) 。a o x 与呼吸链中的复合体i l l ( c y t b c l 复合体) 竞争电子，阻止泛醌库电位过度产生，限制线粒体中r o s 的产生( m a x w e l le ta 1 ，1 9 9 9 ) 。拟南 芥a o x 被证实参与了强光、冷和盐胁迫的应答过程( g i r a u de ta 1 ，2 0 0 8 ；s u g i ee ta 1 ，2 0 0 6 ； y o s h i d ae ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 细胞质膜上的氧化还原酶系统( p l a s m am e m b r a n er e d o xs y s t e m ，p m r s ) 是产生h 2 0 2 的 重要部位( r u b i n s t e i na n dl u s t e r , 1 9 9 3 ) 。在哺乳动物中，n a d p h 氧化酶亚基g p 9 1 p o x 是催化r o s 的产生的关键酶( s e g a la n da b o ，1 9 9 3 ) 。植物中质膜n a d p h 氧化酶也是h 2 0 2 产生的主要来源， 但与哺乳动物不同，植物质膜n a d p h 氧化酶的活性直接受c a + 结合激活( k e l l e re ta 1 ，1 9 9 8 ； l a m ba n dd i x o n , 1 9 9 7 ) 。拟南芥中g p 9 1 p h 0 1 亚基同源物被称为呼吸猝发氧化酶同源物 ( r e s p i r a t o r yb u r s to x i d a s eh o m o l o g ，r b o h ) ( t o r r e se ta 1 ，1 9 9 8 ) ，拟南芥基因组存在l o 个 n a d p h 氧化酶的同源基因。其中r b o h d 和r b o h f 对病原菌侵染应答过程中h 2 0 2 的产生是必 需的( t o r r e se ta 1 ，2 0 0 2 ) ，c d + 和磷酸化协同调控了r b o h d 的活性( o g a s a w a r ae ta 1 ，2 0 0 8 ) 。另 一个n a d p h 氧化酶r b o h c ( r h d 2 ) 受r o p 蛋白的激活，通过增加细胞r o s 产生，导致质 膜c a + 通道去极化，引起c a + 内流，调节根毛和根细胞生长( f o r e m a ne ta 1 ，2 0 0 3 ) ，也有证据 表明c d + 能够调控r b o h c 的活性，影响r o s 的积累和胞内p h 的变化，调控根系的发育过 程( m o n s h a u s e ne ta 1 ，2 0 0 9 ) 。除了质膜n a d p h 氧化酶外，在质外体还存在一些产生r o s 的酶 类。在植物病原菌互作过程中，质外体的草酸氧化酶能催化草酸产生h 2 0 2 ( w o j t a s z e k , 1 9 9 7 ) 。 另外，多胺氧化酶( p o l y a m i n eo x i d a s e ，p a o ) 也是一种产生h 2 0 2 的重要酶类，在细胞质外 体接受光、生长素、损伤等多种刺激调控，参与细胞壁的分化和防御应答过程( a n g e l i n ie ta 1 ， 2 0 0 8 ；c o n ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 植物体内h 2 0 2 可以自由扩散，过量产生的h 2 0 2 会造成细胞伤害，因此细胞内h 2 0 2 的积 累受到精密的控制，h 2 0 2 的代谢主要通过酶促和非酶促两种机制：酶促清除机制包括超氧化 物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、抗坏血酸过氧化物酶( a s c o r b a t ep e r o x i d a s e ，a p x ) 、 谷胱甘肽过氧化物酶( g l t r t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g p x ) 和过氧化氢酶( c a t a l a s e ，c a t ) ；非酶 促清除机制主要依赖于抗坏血酸、谷胱甘肽、类黄酮、生物碱、生育酚等还原性物质。植物体 通过抗氧化物与清除酶类相互作用，维持细胞的氧化还原平衡( a p e ! a n dh i r t , 2 0 0 4 ) 。 s o d 直接将超氧阴离子歧化为h 2 0 2 。c a t 直接催化h 2 0 2 产生h 2 0 和0 2 ，c a t 是唯一不 需要能量的活性氧清除酶，但可能不是清除活性氧的最主要酶类，拟南芥基因组中有三个基因 编码了c a t ，其中c a t 2 缺失导致突变体植物对强光敏感( v a n d e n a b e e l ee ta 1 ，2 0 0 4 ) ，但c a t l 和c a t 3 突变体并不表现明显的表型，尽管c a t l 和c a l 3 的表达和活性也受冷、干旱等多种胁 迫刺激的诱导( d ue ta 1 ，2 0 0 8 ) 。a p x 通过a p x g s h 再生系统( 抗坏血酸谷胱甘肽循环) ，利 用抗坏血酸、n a d p h 和还原型谷胱甘肽( g l u t a t h i o n e ，g s h ) 抗氧化物，在单脱氢抗坏血酸 还原酶( m o n o - d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e ，m d a r ) 、脱氢抗坏血酸还原酶( d e h y d r o a s c o r b a t e 5 拟南莽活性缸应善蒜目的# 量僵控分子机制研究 r e d u e t a s e ，d h a r ) 和谷胱甘肽还原酶( g l u t a t h i o n er e d u c t a s e ，g r ) 的辅助f ，将h 3 q 还原 为h 2 0 ，这一清除系统可能是植物细胞内活性氧的主要清除方式( a p e la n dh i m2 0 0 4 ) 。g p x 通 过谷胱甘肽过氧化物酶循环，直接利h g s h 将h 2 晚还原为h 2 0 。生成的氧化态g s s g 在g r 和n a d ( p ) h 的共同作用f 重新转变为g s h ( a p e la n dh i r t ，2 0 0 4 ) 。 1 2 活性氧调控的生理过程 1 2 1 活性氧与气孔运动 环境胁迫以及a b a 等激素信号能够诱导保卫细胞内h 2 0 2 的积累，进而促进气孔关闭， 许多研究者认为h 2 q 是a b a 诱导气孔运动中的关键信号组分( c h e n ga n ds o n g , 2 0 0 6 ； s c h r o e d e r e ta 1 2 0 0 1 ：w a n ga n ds o n g 2 0 0 8 ) 。m c a i n s h 等( 1 9 9 6 ) 观察到h 2 0 2 处理可增加保卫 细胞中游离c a 2 + 的浓度( m c a i n s he ta l ，1 9 9 6 ) ，h 2 0 2 可能通过激活c a ”通道，导致细胞内c a 2 + 的增加，调节气孔的运动( p e ie ta l ，2 0 0 0 ) 。在a b a 诱导气孔芙c j j 的过程中保卫细胞质膜内 向k + 通道被抑制k + 的流山和溶质丧火引起膨压降低，促进气孔天f j j ( z h a n g c t a l ，2 0 0 1 b ；z h a n g e t a l ，2 0 0 1 c ) 同时，胞质p h 的变化也被证实参与了k + 诱导的气孔关| ! j j 过程( z h a n gc ta l ，2 0 0 t a ) 。 在s a 、m c j a ，重碳酸盐等其它刺激引发的气7 l 运动过程中，h 2 0 2 也有着重要信号作用( k o l l a d “2 0 0 7 ) 。 一黟蠹 一冬鬟 耋遗二塑竺鲨 图1 - l 保卫细胞r o s 介导的a b a 信号转导模式简图( w a n g 龃ds o n g2 0 0 8 ) 母近，关于a b a 受体及其偶联的信号转导途径的解析初步揭示了a b a 调节气孔运动的 分子机制。通过种子选择的a b a 拮抗剂p y r a b a c t i n ，研究者分离和鉴定了a b a 的结合蛋白 p y r l 刚l s ( p y r a b a c t i nr e s i s t a n c e l ，p y r i l i k e ) ，这个蛋白家族成员的多突变体在种子萌发、 根伸长等生理过程中表现出对a b a 的不敏感( p a r ke ta l ，2 0 0 9 ) 。在a b a 存在的条件r ， 河南大学2 0 1 0 启研究生博士学位论文 p y r l p y l i r c a r i 等能够特异地抑制a b l l 、a b l 2 等p p 2 c 家族蛋白磷酸酶的活性( m ae ta 1 ， 2 0 0 9 ；p a r ke ta 1 2 0 0 9 ) ，而后者被认为是a b a 信号转导途径的关键负调控因子，可以抑制a b a 激活的蛋白激酶s n r k 2 ( s n f lr e l a t e dp r o t e i nk i n a s e2 ) 家族( u m e z a w ae ta 1 ，2 0 0 9 ) 。随后结 构生物学研究进一步提供了p y r l 结合a b a 的空间结构，并解析出p y r l 与a b i i 相互作用 的结构模型( m i y a z o n oe ta 1 ，2 0 0 9 ；y i ne ta 1 ，2 0 0 9 ) 。同时，a b a 受体偶联的蛋白激酶磷酸酶途 径也得到了解析( f u j i ie ta 1 ，2 0 0 9 ) ：在a b a 存在的情况下，p y l 狎y l s 能够与p p 2 c 家族蛋白 磷脂酶发生相互作用，解除其对于s n r k 2 激酶活性的抑制，后者通过磷酸化转录因子a b f 2 、 离子通道蛋白s l a c l 以及n a d p h 氧化酶r b o h f 等底物蛋f 兰t ( f u j i ie ta 1 ，2 0 0 9 ；g e i g e re ta 1 ， 2 0 0 9 ；s i r i c h a n d r ae ta 1 ，2 0 0 9 ；v a h i s a l ue ta 1 ，2 0 1 0 ) ，调控a b a 应答基因的表达以及气孔运动等 生理过程。在这一信号转导途径中，r o s 也具有重要的作用，在r b o h d f 中，h 2 0 2 的产生受 到抑制，a b a 诱导的气孔关闭过程也被部分地抑制( k w a ke ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在a b i l 中a b a 不能诱 导h 2 0 2 的产生( m u m t ae ta 1 ，2 0 0 1 ) ，同样s n r k2 6 ( o s t l ，o p e ns t o m a t aj ) 突变体对a b a 不 敏感，a b a 可以激活野生型保卫细胞原生质体o s t ! 激酶活性，但是o s t l 突变体中a b a 不 能诱导h 2 0 2 产生，虽然h 2 0 2 仍能诱导气孔的关闭( m u s t i l l ie ta 1 ，2 0 0 2 ) ，最近的研究结果表明 r b o h f 是o s t i 的底物，o s t l 能够磷酸化r b o h f 蛋白第l3 和17 4 位丝氨酸( s i d c h a n d r ae ta 1 ， 2 0 0 9 ) ，o s t i 可能直接调控n a d p h 氧化酶活性，调控h 2 0 2 的产生。 除a b a 受体偶联途径外，h 2 0 2 调节气孔运动过程中的其它信号组分也被鉴定。锌指蛋白 家族转录因子d s t ( d r o u g h ta n ds a l tt o l e r a n c e ) 能够调控h 2 0 2 产生，并调控水稻对于干旱和 盐胁迫的适应过程0 a u a n ge ta 1 ，2 0 0 9 b ) 。磷脂酰肌醇3 - 磷酸( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - p h o s p h a t e ， p 1 3 p ) 和异三聚体g 蛋白等其它信号组分也调节了h 2 0 2 的产生( c h e ne ta 1 ，2 0 0 4 ；l ie ta 1 ，2 0 0 9 ； p a r ke ta