（理论物理专业论文）原子力显微镜（afm）与生物膜相互作用实验理论分析.pdf

原子力显微镜与生物膜相互作用实验的理论分析 摘要 生物膜主要是由磷脂，类固醇和蛋白质组成，而磷脂双层膜作为生物膜的简 化模型，不仅为蛋白质提供了宿主媒介，还展现出许多电学性质和力学性质。本 文回顾了生物膜的液晶理论，并介绍了最近研究生物膜相关理论：细胞膜上的脂 筏结构、生物膜的单分子研究、原子力显微镜成像理论，然后介绍了我们在下_ 章讨论时将要用到的基础理论。但主要分析原子力显微镜与生物膜相互作用实 验，并解释其实验现象。讨论如下问题： l 、在盐溶液中，磷脂双层膜表面存在静电双层结构，随着离子 浓度的降低，原子力显微镜感受到里的距离之所以不断变长，是由德拜长度 t ：( 三! 些篓) 一；决定的，与实验结果符合的很好。 f 0 日 2 、盐溶液是如何影响带电磷脂双层膜的稳定性。 3 、拟合出力谱中的线性部分分别给出了线性和非线性部分的力的表达形式。 关键词：原子力显微镜，生物膜，磷脂双层膜，电双层结构，泊松一玻尔兹曼理论 相互作用原理，脂筏，流体镶嵌模型。 t h et h e o r e t i c a la n a l y s i so nt h ee x p e r i m e n t t h a tt h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p ei n t e r a c t s w i t hb il a y e rli p i dm e m b r a n e a b s t r a c t b i o l o g i c a lm e m b r a n e sm a i n l yc o n s i s to fl i p i d ss t e r o i d sa n dp r o t e i n s ， a st h es i m p l i f i e dm o d e lo fb i o l o g i c a lm e m b r a n e ，l i p i db i l a y e r sn o to n l y s e r v ea sah o s tm a t r i xf o rp r o t e i n sb u ta l s oe x h i b i tu n i q u ee l e c t r i c a l a n dm e c h a n i c a l p r o p e r t i e s t h i s p a p e rr e v i e w st h el i q u i dc r y s t a l b i o m e m b r a n em o d e la n di n t r o d u c e st h el a t e s tt h e o r ya b o u tb i o l o g i c a l m e m b r a n e ：t h em i c r o d o m a i ni nt h ec e l lm e m b r a n e 、t h es i n g l em o l e c u l e t e c h n o l o g yo ni n v e s t i g a t i n gm e m b r a n e 、t h et h e o r ya b o u ta t o m i cf o r c e i m a g i n g ，t h e ni n t r o d u c e st h eb a s i ct h e o r yt h a tw ew i l lu t i l i z ei nt h en e x t c h a p t e r b u tm a i n l ya n a l y z e st h ee x p e r i m e n tt h a tt h ea t o m i cf o r c e m i c r o s c o p ei n t e r a c t sw i t hl i p i db i l a y r e r ，i n t e r p r e t st h ee x p e r i m e n t a l p h e n o m e n a t h e nw ew i i id i s c u s st h ef o l l o w i n gp r o b l e m s t h ef i r s t 、i ns a l ts o l u t i o n ，d o u b l ee l e c t r i c l a y e r se x i s t o nt h e s u r f a c eo f b i l a y e r1 i p i dm e m b r a n e w i t ht h ed e c r e a s i n go ft h ei o n s t r e n g t h ，t h ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p ec a nf e e lt h ef o r ei , nal o n g e r d i s t a n c ef r o mt h es u r f a c e ，w h i c hi sd e t e r m i n e db yt h ed e b y el e n g t h 七一一( 而2 n e 2 2 2 ) 一 s e c o n d 、h o wt h es t r e n g t ho ft h eb u f f e rs o l u t i o na f f e c t st h es t a b i l i t y o fb il a y e r1i p i dm e m b r a n e ? t h i r d 、s i m u l a t et h eli n e a rp a r to ft h ef o r c es p e c t r u ma n dg i v et h e f o l = c ee x p r e s s i o no f1i n e a ra n dn o n li n e a rp a r ts e p a r a t e l y k e yw o r d s ：a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e4b i o m e m b r a n e 、b i l a y e rl i p i dm e m b r a n e ， d o u b l ee l e c t r i cl a y e r s 、p o i s s o n b o l z m a n nt h e o r y 、r e c i p r o c a lt h e o r e m ， 1 i p i dd o m a i n 、f l u i da n dm o s a i cm o d e l 第一章生物膜研究概述 1 1 生物膜的定义、模型及研究意义 细胞是生命的基本结构和功能单位。每一个细胞都有一层薄膜将其内含物和 周围环境分开，这层膜称为细胞膜。此外，细胞内还有许多内膜系统，组成特定 功能的亚细胞结构和细胞器，如细胞核，线粒体，内质网等。细胞膜和内膜系统 统称为生物膜( 本文的主要研究对象是细胞膜) 。 细胞膜主要有脂类，蛋白质和糖类组成的超分子体系( 图卜1 ) ，其中脂类 图卜1 细胞膜结构模型 和蛋白是主要成分，一种重要的脂类是磷脂( 图卜2 ) ，它是双亲分子，有一个 极性的亲水端和两条疏水的碳氢链尾巴。从物理学的观点来看，磷脂分子可以看 成一个双亲的棒，当一定量的磷脂分子分散在水中，由于疏水作用，它们能够自 组织地形成闭合的双层膜，亲水端暴露在外面，疏水端被屏蔽到里面。 细胞膜的模型很多，但被广泛接受的是s i n g e r 和n i c o l s o n 提出的流体镶嵌模 型( f l u i dm o s a i cm o d e l ) 1 ( s i n g e re ta l1 9 7 2 ) ，细胞膜被看作磷脂双分 子层，磷脂可以在层内流动，蛋白质分子镶嵌在双分子层内，形象地说，蛋白质 就像冰山一样在磷脂双层膜“海”上漂浮，其中一些蛋白贯穿磷脂层实现细胞内 外物质和信息的交流( 如离子通道) ，另一些蛋白部分嵌入双分子层内，实现其 它功能。 2 麓点未童：， 一 ! 蔓! ! ! ! ! 望；! ! ! ! 堡翌望! 鱼型! ；蔓q 旦坚盥塑墨! 型 、一u i z h o uu n i v e r s i t y 流动镶嵌模型是一个动态模型，它主要强调磷脂双分子层构成膜的连续体，而 蛋白质分散于其中，磷脂的流动性是生物膜结构的基本特征，细胞膜的形状主要 由磷脂双分子层决定。这种结构反映的生物性质可以归纳如下 2 ： 1 生物膜由多种磷脂及其他双亲分子复杂混合物构成，不同类型的膜具有 不同的成分，在膜表面可能形成不同的分相区。 2 除形成类脂双层的双亲分子如磷脂外，膜中还含有相当数量的影响膜性 质的其他分子。具体而言，约百分之二十五动物细胞膜中含有胆固醇。 胆固醇双亲性很弱，但它对可以显著改变膜的强度和通透性。 3 膜中含有一定数量的不同类的蛋白质，膜蛋白一些嵌入其中，另一些则 完全穿过膜的两侧，这些蛋白形成相应的物质输送的膜通道。有些情况 可以膜通道逆化学势方向抽吸分子。 4 膜是非对称性的，其内外两侧的化学组分不同。 5 膜外侧附有多糖短链，这些多糖或者成为特定双亲分子糖脂的亲水基 团，或者与膜蛋白共价结合。 6 膜的内侧可与诸如肌纤蛋白那样的可逆聚合蛋白网络形成的细胞骨架连 接。膜与细胞骨架连成一体，使得细胞能够控制膜的曲率和弹性且使细 胞具备了通过操纵膜形状而运动和分裂的功能。 p c h ， i c h i o d p i 一。 i o i h 2 7 - - “9 c h 2 i f _ 。f - o r 1r 2 图卜2 磷脂分子的化学式和示意图 4 ：熊照杰尊：。，。 ! 坚! ! ! g ! 望! ! ! ! 卫堕! 匝q ! 鱼婴；婪q 望! 塑坚婴! ! 型 vu i 五i o uu n i v e r s i t y 目前在实验室里开展生物膜功能和结构的研究，主要利用平面脂双层膜 ( b i l a y e rl i p i dm e m b r a n e ，b l m ) 3 ，特别在液体镶嵌模型被普遍接受以后， 人们发展了许多实验方法把生物活性分子，复合物整合到b l m 上，使之成为与细 胞膜成分接近的系统，做出了许多出色的工作 4 ( 现在已经能纯化 n a + 一k + a t p 酶，重建具有n a + 一k + 泵功能的人工膜) ，因此b l m 是研究生物膜 非常合适的简化模型。 红细胞形状提出的挑战 生物体内的许多过程都会引起生物膜的形状，结构的变化，红细胞就是一个 典型例子 5 。它会随着环境的变化不断改变形状，在正常状态，红细胞呈现双 凹圆盘形；通过狭窄的血管时，就会变成柱状的延伸体；当血液循环通过大血管 时，又会变成长轴方向与血流方向相同的椭球形，红细胞形状变化一直以来都是 难题。为了解决这个难题许多科学家做出了不懈的努力： 图一1 3 正常红细胞 1 1 9 6 5 年，m u r p h y 把红细胞双凹成因归结为膜内的胆固醇分部的不均匀 6 ，但 后来实验证明膜内胆固醇分布是均匀的 7 。 2 1 9 6 5 年，冯元桢和董平利用板壳力学弹性力学来解释红细胞形状，他们把红 细胞简化为两层薄壳夹一层液体的模型，在膜厚度不均匀的前体下得到了红细胞 的双凹圆盘形状 8 。但电子显微镜实验证明膜的厚度是均匀的，理论与实验不 符。 3 1 9 7 0 年，c a n h a m 从平衡形状的变分问题，并通过数值计算确实得到双凹圆盘 形状是能量的最低状态【9 】，但同时也得到了一个反例，旋转对称的哑铃形状和 双凹圆盘形状一样，也取能量最低，这样对应同一个能态，出现了两个解，无法 确定哪个最低。【1 0 】 4 直到1 9 7 3 年物理学家w h e l f r i c h 基于液晶特性提出自发曲率理论 1 1 才给这 问题带了曙光。 同时细胞在内吞，外排输运物质过程，细胞融合，分裂等等，这些都与生物 膜的性质有关，因此，研究生物膜对许多生命过程都有重要的意义。 1 2 生物膜形状的液晶模型理论 本节介绍在液晶模型基础上形成的生物膜形状理论。 1 2 1 液晶简介 5 ，1 2 液晶是介于各向同性液体和固态晶体之间的一种物质状态，它在位置上可以向 液体一样混乱，但在方向上具有长程有序性。位置无序，表明液晶像液体一样具 有流动性：但在方向上的有序性说明其物理性上呈现各向异性，说明液晶兼有部 分晶体和部分液体的性质。 液晶大致可以分为热致液晶和溶致液晶。热致液晶是指在一定温度范围内呈现 液晶态的物质，它又可以分为丝状相，层状相，螺旋相：溶致液晶是指某些化合 物溶解于适当的溶剂，随着浓度的改变呈现不同的液晶态。值得一提的是溶致液 晶于生物学关系密切，如磷脂分子在水溶液中形成双层膜，膜泡。 对于宏观体积的液晶可以用一个指向矢i 来表述分子的从优取向。液晶分子排 列的指向矢在外场的作用下会改变方向，除掉外场，它又恢复原有方向，把这种 形变成为弹性形变。液晶的弹性形变主要有三种：弯曲( b e n d ) ，扭曲( t w i s t ) ，展 曲( s p l a y ) 。 图卜4 液晶的三种形变类型：a 展曲，b 扭曲，c 弯曲 1 3 这里给出丝状液晶的自由能密度 ，一寻 女。( v d ) 2 + k , 2 d ( v d ) 2 】+ 女，【d ( 审d ) is ( 1 1 ) 其中，d 为液晶的指向矢，k n , k ：，k 。分别为展曲，扭曲，弯曲的弹性系数。下 面关于生物膜的 e l f r i c h 的自发曲率弹性自由能就是据此得到的。 i 2 2h e l f r i c h 的自发曲率弹性自由能 h e l f r i c h 是7 0 年代研究液晶的领军人物之一，但是红细胞形状的难题使 其从纯粹的液晶研究者转生物膜上来，他与别人不同，它正是抓住了生物膜处于 液晶态这个关键。 他注意到细胞膜是由双亲分子构成的双层膜。由于磷脂分子的双亲性，在只 有水溶液时，疏水端拒绝与水接触，两片单层膜的疏水面只结合在一起，形成分 子的双层膜。在一定溶剂浓度下，双层膜会自发的弯曲并闭合形成膜泡，这就是 细胞膜的基本模型。双层膜中的烃链，具有一定的排列有序性，在生理条件的温 度范围内，其从优取向与膜的法向一致。如果把磷脂分子的烃链看成指向矢，生 物膜就是一个垂面校列的“丝状液晶盒”，其厚度大约是两倍分子长度。 考虑到红血球的大小相当于生物膜泡的横向尺寸为8 t o n 左右，而类脂双层的厚 度只有两个磷脂分子长，在l o n m 以下，二者之比大于1 0 3 。在这种情况下， h e l f r i c h 把生物膜当作没有厚度的二维连续曲面来处理，从液晶的f r a n k 弹性 自由能式( 1 1 ) 出发，得到生物膜单位面积的弹性能 g = 兰t ( c i + c 2 一c o ) 2 + k c , c ： ( 1 2 ) c 。，c ：是曲面的两个主曲率，常数c 。是考虑膜表面的不对称性和两侧的环境不对 称而引入的，称为自发曲率。k 是膜的弯曲弹性系数，k 是对应于高斯曲率的弹 性模量。两者的数量级均为液晶曲率弹性常数与膜厚度乘机大小，1 0 1 9 ，。式( 1 2 ) 被称为生物膜h e l f r i c h 自发曲率自由能公式，是处理生物膜流体相力学行为的 基础。 处于溶液中的闭合双层膜泡有两个特性： 1 由于双层膜和溶剂分子之间的交换可以忽略，在一定温度下总面积保持不变。 2 透过双层膜的水交换必将引起膜两侧渗透压的变化。膜泡体积实际是常数。 7 就是平衡形状的曲率自由能变分的问题的两个约束条件。 考虑到以上条件的约束，则闭合膜泡的总自由能为 f 5 俨+ 廿f d v + y 严 ( 1 3 ) 卸，y 有一定的物理意义，即印= p 。一p ，是膜内外的渗透压差，7 为膜的表面 能。 值得一提的是，在处理膜泡问题时，微分几何中的g a u s s - b o n n e t 定理 1 4 f c l c 2 d 4 ；4 n ( 1 一n ) ( 1 4 ) 也发挥了作用。定理说明高斯曲率对面的积分是个与亏格数有关的常数。所谓 亏格n 是指任意封闭曲面上的洞的个数，例如，球面的亏格为0 ，环面的亏格为 l 等。n 是一个拓扑不变量。因此在对式( 1 3 ) 做变分时，不必考虑与i 有关的项。 但在处理生物膜融合( f u s i o n ) 和裂变( f i s s i o n ) 时，前后亏格数发生变化，因此 要考虑与k 有关的项，而且这一项有很重要的作用。这说明h e l f r i c h 流体膜模 型不仅可以讨论细胞形状，还可以说明细胞分裂和细胞融合。 1 2 3 闭合膜泡的形状方程及一些膜泡的解析解 闭合膜泡的形状方程 任何处在平衡状态的物理系统，它的能量必然处于最小值，也就是说系统平 衡时的能量比然小于该系统在微小变化下的能量，所以这里要求膜的能量式( 1 3 ) 的变分为零，这里对式( 1 3 ) 做一阶变分，结果为， 6 0 ) f = 币【卸- 2 y h + 女1 ( 2 h + c o ) ( 2 h 2 一c o h 一2 k ) + k l v 2 ( 2 h + c o ) 妇g c 缸d v ( 1 5 ) 因为“，1 2 ，妒都是任意的足够小的，非常平滑的函数，所以只有 a p - 2 7 h + k l ( 2 h + c j ) ( 2 日2 一c o h - 2 k ) + k a y 2 ( 2 h + c o ) = 0 ( 1 6 ) 这就是膜泡形状的普适方程，是由欧阳钟灿教授和其合作者与1 9 8 7 年的得到的 1 5 ，1 6 。若自发曲率在膜表面处处相等，则有 a p 一2 y h + 七l ( 2 h + c 0 ) ( 2 2 一c o h 一2 世) + 2 k v 2 h = 0 ( 1 7 ) g 蕴搽颤一一一 ! 蔓塑! 箜里! 堂型! 盟q ! 幽；望q 型业塑坠型 、一u i z h o uu n i v e r s i t y 这里日一去( c 。+ c 2 ) 为平均曲率，k = c ，c ：为高斯曲率。v 2 为拉普拉斯算子。 二 一些膜泡的解析解 对于生物膜形状的解析解，已经找到五类解析解，包括球形膜泡，柱形膜泡，正 常红细胞膜的双凹碟形 1 7 ，波纹形与竹节形膜泡 1 8 ，正环形膜泡解 1 9 ，2 0 ， 2 1 。这里只介绍球形膜泡解，柱形膜泡解，并且在附录中给出相应的方法。 1 球形膜泡解 其解为：y ；r ( s i n o c o s ，s i n o s i n ，c o s 0 ) ，r 为球形膜泡的半径，由形状方程可 得它的约束条件为 a 0 9 3 + 2 r r 2 一t 。c o r ( 2 一c o r ) = 0 ( 1 8 ) 2 柱形膜泡解 其解为：y = ( r c o s 0 ，r s i n 0 ，z ) ，( 0 s 0s 纫，0s zs f ) ，它的约束条件为 螂3 + 胆2 一去。( c 扭2 1 ) = 0 ( 1 9 ) 这里只对生物膜液晶模型理论的形成发展，普适的形状方程以及其解的情况作了 回顾，下面是与实验有关的研究生物膜的理论。 1 3 原子力显微镜和细胞膜相互作用理论 2 2 ，2 3 ，2 4 扩 细胞摸 基废 图卜5 原子力显微镜和细胞膜相互作用示意图 2 5 原子力显微镜提供了独特的研究细胞结构，形态，微力学性质，化学信号活 动的方法，它具有很高的时间，空间分辨率( n s ，l o n m ) 2 6 如图卜3 ，是原子力 显微镜和细胞膜作用过程，这里的电解质溶液为不可压缩的牛顿型流体( 说明溶 液的密度和粘滞系数是恒定的) ，细胞膜内( q ：) 外( q 。) 的流体满足包含电场的 准静态的n a v i e r ：- - s t o k e s 方程和连续性方程 2 7 。 一覃+ p v 2 “+ p 。e = 0 , x e9 2 1 ，q 2 ( 1 9 ) v “一0 , x q 1 ，q 2 ( 1 1 0 ) p ，“，分别为压力场，速度场，液体的粘滞系数，p 。为该点的体电荷密度，e 为 和该点电势相联系的电场矢量，e v 。同时在该点也满足p o i s s o n 方程， v 2 。一旦，z q ，q 2 ( 1 1 1 ) 而在绝缘的原子力显微镜尖端内部( q ) ，则有 v 2 妒= o , x q ，( 1 1 2 ) 由于离子达到电化学平衡的弛豫时间相对于原子力显微镜运动的时间很短，因 此认为溶液始终都处于点化学平衡。这种局部的化学平衡导致了非线性的 p o i s s 0 n b o l t z m a n n 方程，但在这里利用d e b y e - h u c k e l 条件( 嚣c c 1 ) 做线性 近似，则有 以等妒 代入上式，得到非各向同性s t o k e s 方程， 一勖+ 口v 2 “+ e o k2 v 妒= 0 ( 1 1 4 ) 和线性p o i s s o n - - b o l t z m a n n 方程 v 2 = k2 ( 1 ：1 5 ) 其中2 = 2 e 2 n 。e e o k 口t 。 下面讨论的是以细胞膜为边界的动力学边界条件，膜的变形是由膜的刚度和局部 各向同性的膜表面张力决定的，所以，在这种条件下，细胞膜的准静态的压力平 1 0 衡可表示为： ( t ： 一百l a ) + v 。y v f i ( v ；f i ) = 0 ( 1 1 6 ) 其中0 ：f i t 。a ) 为总的压力张量在剪切和法向的分量。审，y 为表面张力沿着切 向的分量，v f i ( v 。a ) 为表面张力沿着法向的分量。推广膜的形状方程式( 1 7 ) 则 有 t2 氛一t l a j _ 自一一2 y h 七k 2 h + c o ) 1 2 h2 一c ，h 一2 ：七2 k n 2h ) i q 1 7 ) ( t ：矗一百1 矗) f = v 。y ( 1 1 8 ) 同时要考虑局部膜面积不可压缩，即不随时间改变，则有 d d a ：0 f 1 1 9 ) m 幽细胞膜面积单元。由此可以确定表面能y 。 以上只是介绍了f a n 2 5 ，2 6 等提出的原子力显微镜和细胞膜相互作用所涉及到 的理论，由于生物膜独特的环境和柔软的力学性质，以上理论是研究细胞膜的有 效工具，可以解读大量的a f m 的实验数据。 1 4 生物膜的脂筏结构和流动镶嵌模型 自从i 9 7 2 午s i n g e r 和n i c o l s o n 提出生物膜的流动镶嵌模型，经搏3 0 多年， 它基本方面仍然是正确的，但它对生物膜的不均匀性并未给予足够的考虑，此后 的研究中人们逐渐认识到微区( m i c r o d o m a i n ) 的存在，即脂筏结构( 如图1 7 ) ，它 是由鞘磷脂和胆固醇相互作用形成的二维畴结构，如图中a 所示，g p i 是糖基磷脂 酰基醇锚定蛋白，h a 为定位于脂筏上的细胞跨膜蛋白，y e s 是结合于脂筏的细 胞内信号蛋白分子：b 显示的是脂筏内脂类结构，红色是鞘磷脂，白色的是胆固 醇，绿色的是磷酸甘油酯。 在生物学上它对细胞膜受体的跨膜信号转导，细胞内信号转导，介导细胞 吞噬作用都有极其重要的意义：从物理学角度，畴结构的形状引起人们的广泛关 注。对仅有脂类构成的固体畴已有较成功的偶极一偶极相互作用模型 2 9 ，欧阳 钟灿教授已经给出了固体畴的形状方程 3 0 。 鉴于此，膜上的脂筏的畴结构是非常有必要研究的方向，细胞膜的流动镶嵌 模型有必要进行修正 3 1 。 图卜7 细胞膜上脂筏的示意图 2 8 1 5 生物膜的单分子研究 生物膜的的单分子研究，提供了了丰富的实验数据，不仅能直观地解释生物 膜的相关性质，而且它的实验现象也为理论研究提供了检验依据，同时也会启发 时霞i ，王电凸昝盂2 方向砷位移) - 图1 6 原子力显微镜拉出紫膜中b r 的力谱示意1 虱 3 0 ，3 1 】 4 = 点曼点照一一一一 ! 幽旦壁二婴! 旦鲤垒婴型业! 塑婴曼墅型 vl n z l 4 0 uu n e r s r r y 理论研究。生物膜单分子技术主要有扫描探针技术和光学技术，这里介绍扫描探 针技术中的原子力显微镜( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p e ) 利用它直接观察和操纵单 个膜蛋白分子。 用原子力显微镜与膜蛋白接触并逐渐提起针尖，可以将整个单分子拉出膜 外，并在膜上留下一个空洞，由于b r 是七次跨膜的内在蛋白，整个拉的过程将 显示出力的变化过程，形成力谱( 图1 6 ) ，这时研究膜内在蛋白折叠的重要手 段。 本章小结： 本章系统地介绍了生物膜理论发展情况，从流体镶嵌模型到生物膜液晶理论 模型，并介绍了普适的形状方程以及一些膜泡的解析解；并介绍生物膜研究方 法的最新进展：原子力显微镜与细胞膜相互作用理论，生物膜单分子研究，生 物膜畴结构一脂筏研究情况。介绍了原有的流体镶嵌模型的不足之处，有待进 一步改进。 1 3 第二章实验介绍及要解决的问题 本文主要是对h a n s j u r g e nb u t t 实验组的原子力显微镜( a t o m i cf o r c e m i c r o s c o p ea f m ) 与生物膜相互作用实验结果 3 2 进行理论分析，下面介绍他们 的实验，并提出要解决的问题。 2 1 实验介绍 2 1 1 原子力显微镜在三种情况下与三种磷脂双层膜作用的力谱 在1 5 0 m m 的n a c i 和5 m m 的j ( h ：p 矾的缓冲液( 已用k o h 滴定，p h 值为7 4 ) 中，如图2 1 ，原子力显微镜分别以三种不同方式与磷脂双层膜作用：( 1 ) 只有 云母片上吸附磷脂双层膜；( 2 ) 原子力显微镜和与云母片上分别都吸附磷脂双层 膜：( 3 ) 仅在原子力显微镜尖端吸附磷脂双层膜。 d o p c 疆，一 ia p ：l 二 眨 = 二= = = = = = ：= ：= 1 口t n n v 图2 一l 原子力显微镜与生物膜作用的力谱及示意图 图2 1 所示的是原子力显微镜在三种情况下与三种磷脂分子构成的磷脂双 层膜( d o p c ，d o p s ，d o t a p ) 作用的力谱，它反映的是在原子力显微镜( a f m ) 向磷 脂双层膜接近，最后贯穿磷脂双层膜过程中受力情况，即力与距离的关系。 1 ) d ，e ，f 所示的是原子力显微镜和云母片上分别都吸附磷脂双层膜情形，力谱的 显著特征是出现了两次跳跃，是由于原子力显微镜分别两次贯穿吸附在原子力显 微镜和与云母片上的磷脂双层膜，而且第一次跳跃后的力谱是线性的。 2 ) 所有力谱的共同特征是在跳跃发生前，力谱都分别包含一段非线性部分和线性 部分。 2 1 2 随缓冲液浓度改变，双层膜一双层膜相互作用力谱的变化情况 呈星口 z c 2 o u d i s t a n c e ( n m ) 图2 2 力谱随缓冲液浓度的变化 为了确定缓冲液中盐的浓度对双层膜一双层膜相互作用力谱的变化情况，如 图2 2 所示，不断降低盐的浓度，发现贯穿力不断降低，当盐的浓度低于3 - 5 m m 时，外层的贯穿力将消失，同时长程的静电双层力开始出现，它的衰减长度随着 浓度的降低，不断增加，这说明盐对带电的磷脂双层膜具有稳定的作用。 2 1 3 磷脂双层膜的堆叠及其力谱 在云母片上首先吸附d o p s ( 或d o t a p ) ，然后用缓冲液冲洗，在其上吸附带相 反电荷的d o t a p ( 或d o p s ) ，同时在原子力显微镜尖端吸附d o t a p ( 或d o p s ) ， z c 2 o l l d i s t a n c e ( n m ) 图2 - 3 云母片上堆叠d o p s d o t a p 的力谱 z c 墨 o l l d i s t a n c e ( n r n ) 图2 4 云母片上堆叠多层磷脂双层膜的力谱 力谱发生了三次跳跃；在一些情况下可以形成更多层。图2 3 ，2 4 分别为云母 片上堆叠两层和多层的力谱。 2 2 要解决的问题 基于以上实验分析，提出本文要解决的问题： 1 ) 说明随着离子浓度降低，长程的静电双层力开始出现且衰减长度不断增加。 2 ) 说明盐对带电的磷脂双层膜具有稳定的作用。 3 ) 对力谱作全面的理论分析，拟合力谱曲线。 f ：童曼鑫崖一一一一。 ! 坠墅箜望! 幽! 旦q ! 垒望婴q 型塑塑坚墨i ! 翌 vu i 刭0 uu n e r s r r y 第三章a 踟与生物膜相互作用的理论基础 原子力显微镜与生物膜在电解质溶液相互作用过程主要静电相互作用以及 接触力学的相关理论，在这里给予详细地介绍： 3 1 双电层结构及泊松一玻尔兹曼( p o i s s o n - b o l t z m a n n ) 理论 磷脂双层膜在溶液中荷电后，由于静电引力会吸引溶液中带异号电荷的离子 向固体表面靠拢，集聚在距离固液二相界面一定距离的溶液一侧区域内，以补偿 其电荷平衡。若磷脂双层膜表面的电荷为q _ ，液相界面区的电荷为级，则有， q 。+ q 。= 0 ，由此构成了双电层结构，如图3 一l 所示。 厂团液二相界面 o o o o 。扩散层 图3 1 双电层结构示意图 3 3 基于双电层结构，介绍泊松一玻尔兹曼( p o i s s o n b o l t z m a n n ) 理论 3 4 ： 扩散层的电位可以用两个基本方程来表述，一个是p o i s o n 方程 砂一卫( 3 1 ) s 0 其中p 为扩散层中电势为妒处的体积电荷密度，为介电常数。 静电吸附使离子趋于有序化，而熵增加使离子分布于随机，正是由于两者的作用， 扩散层中的离子服从b o l t z m a n n 分布，则有： 驴e x p ( 等) ( 3 2 ) ”e x p 学 ( 3 3 ) 式中“+ ( - ) 是扩散层中离子的个数浓度，n + ( 一) 。是液体主体离子个数浓度，。+ ( - ) 是 离子的价数，e 是基本电荷，是b 。1 z m a n n 常数，r 是绝对温度，下标的+ ，一 表示阳离子和阴离子。对于对称电解质( n + 。，l 一：n ，z 。z 一；z ) p 。z e ( n + 一n ) ( 3 4 ) 将式( 3 2 ) ，( 3 3 ) 代入( 3 4 ) ，则有 一獗s j 血( 蛩 ( 3 s ) 由( 3 1 ) ，( 3 5 ) 可以得到p o j s s o n 一1 3 0 l z i i l a n n 方程 妒2 等幽h 罂i c b i ( 36 ) 0 若在8 哆磊c c l 的情况下，即满足d e b y e h n c k e l 近似，则有： 却：婺1 i j _ k 2 1 l ， ( 3 6 a ) kt 0b 。 对于平面双毛层则有 ， ， 窘= 等s ；曲嚣t 慨， c b c 、k 。 若在8 k t 1 的情况下，即满足d e b y e h n c k e l 近似，则有 舆：k ：1 i j ( 3 8 ) d x k 为d e b y e 长度的倒数。 一k ：堡竺 ( 3 9 ) 一= 一 r() o k b t ( 3 9 ) 式在理论分析中会用到。 关于p o i s s 。n b o l z m a n n 方程在d e b y e h u c k e l 近似下的解，以及非近似条件 下的解，附录中会给予具体结栗 # 介绍哉形# 形f | 蕈洵的p n j 。n r 。1 ，。 4 ：盔曼未照一一。一 ! 旦羔；! 竖里! 坠婴罂塑q ! 鱼婴翌业巡塑坠! 型 vu i 刭0 u u n i v e r s i t y 。一 方程【3 5 ，3 6 j 解的情况。 3 2 相互作用原理( r e c i p r o c a lt h e o r e m ) 3 7 一组力只( 七= 1 ，2 ，m ) 作用于一弹性体上，只在弹性体上的作用点沿着 只方向的位移为气，显然，气是整组力作用的结果，而不是只单一作用的结果。 力作用于弹性体的整个过程都是静态的，整个外力系统作的功矽完全转化为弹性 体的应变能u ，所以有： u w l ，m p 。, q (310)2 角 。 现在考虑有两组力，第一组为或( 七= l ，2 ，m ) ，第二组为 巧( j = l ，2 ，n ) ，若两组力分别作用于弹性体上，则有： u i = 丢扣： ( 31 1 ) u ：。三吝i t 埘 如果第一组力砭先作用于弹性体，然后第二组力也作用于其上，则所有的 应变能为： u = u l + u2 + u i 2 ( 3 1 3 ) 其中u ，：是第一组力通过作用在于弹性体上的第二组力引起的应变做的功，即 u 啦。著或e ： ( 3 1 4 ) p ：为第二组力在第一组力只作用点上引起的位移。 会有 同样，若第二组力只。先作用于弹性体，然后第一组力也作用于其上，同样 u = u 1 + u 2 + u2 1 ( 3 1 5 ) u ：，是第二组力通过作用在于弹性体上的第一组力引起的应变做的功，即 u ”。酽。i 。1 6 e j 为第一组力在第二组力巧作用点上引起的位移。 应变能与负载加载的顺序无关，所以有u 。：= u ：i ，即 蓍反e k 。；巧e j 3 1 7 以上的表述即为相互作用原理，在第四章，其会被用来作为理论分析的依据。 3 3 电偶极子( d i p o l e - d i p o l e ) 相互作用理论 3 8 ，3 9 这里主要是推导两个相距为r 的偶极子的相互作用能，距离偶极子中心d 为 r 的p 点的电势可以表示为： y = ( p c o s e ) 4 雎0 ，2 ( 3 i 8 ) 口为矢量历与偶极子的夹角。 则沿着偶极子方向和疗方向的电场分别为： e ：一当。2 p c o s 8 1 4 z e v ， ( 3 1 9 ) d r 岛。等= n 圳如吖3 ( 3 2 0 ) 所以有 。 e ( r ) ；( 2 p c o s & 2 ，+ p s i n o 8 ) 1 4 = e e o r 3 ( 3 2 t ) 在极坐标系中 p = p ( a ，c o s 8 一五日s i n 8 ) ( 3 2 2 ) 所以 2 ( o = ( 3 p c o s o 正，一p ) 4 j r e e 。r 3 ( 3 2 3 ) 如图3 - 2 ，考虑两个相距为，的偶极子i ，一p 2 ，其与轴一o z 的夹角分别为q ，口：，它 们在x o y 面上的投影与z 轴的夹角为九，妒：，则相互作用能 1 2 = 一p e 2 ( 3 2 4 ) 所以有 p 2 z 图3 - 2 偶极一偶极相互作用的几何参数及示意图 q ，2 = 一p 1 【3 ( p 2 露，) l ：，一p 2 4 z r e e o ，3 ( 3 2 5 ) 4 ：r e e o c o l 。2 = 【- 3 ( p l 五，) ( p 2 五，) + p 1 p 2 r 3 = 一3 ( p 1 r ) ( p 2 r ) r 5 + p l p 2 r 3 = 一3 p i p 2c o s o , c o s 0 2 r 3 + s i n 8 1s i n 8 2c o s a , c o s 8 2 + s i n 0 1s i n 0 2s i n 疵s i n # 2 + c o s 0 1 c o s 0 2 l p l p 2 r 3 = s i n 0 1s i n 0 2 ( c o s 朔c o s 2 + s i n # 1s i n # 2 ) 二2 c o s # jc o s 丸】p l p 2 r 3 。 = 【s i n 0s i n 0 2 c o s ( a 一如) 一2 c o s 0 1c o s 0 2 】用p 2 r 3 = k p t p 2 r 3 + ( 3 2 6 ) 其中k = s i n0 ls i n 0 2c o s ( 巾l 一巾2 ) 一2 c o s 0 1c o s 0 2 ( j ) l ，2 = k p t p 2 4 兀e e o r 3 ( 3 2 7 ) 可以看出当两个偶极子处在同一条直线上时，相互作用最强，为 一2 p ，p ：4 x g e 。r 3 。在讨论膜的稳定性时会用到以上推导结果。 3 3p i n k 模型简介 p i n k 模型主要是从磷脂分子之间的相互作用及其构象出发，研究磷脂双层 膜的稳定性。以下是p i n k 模型的基本假设： 4 0 ，4 l ，4 2 ，4 3 ，4 4 1 每个磷脂分子有两条碳氢链和一个可以看成偶极子的极性端构成。 2 在极性端，构成偶极予的正负电荷间的距离为5 1 0 一l o m 。 3 所有分子都可以绕垂直于表面的轴旋转1 8 0 0 4 膜内的所有分子都可以沿着膜法线方向移动相当于两个c c 键投影那样长的 距离。 5 磷脂分子的极性端呈现两种构象：偶极子方向与膜表面成7 8 0 和3 0 0 。 基于以上假设，磷脂双层膜的h a m i l t o n i a n 量包含三部分 4 l ，4 2 ，4 3 ，4 4 h = h 咖+ hc 呵+ h 埽 妈2 8 ) v a nd e rw a a l s 相互作用为 乩t “磊墨卜) s k k q 2 郇 ，r 代表的是在趱直干句象中相互平行的碳氢链的相互作用能，n ，m 代表碳氢链所 处的构象，其取值为1 到l o ；0 代表位置f ，之间的距离，它取决于这两个位置 的构象；l 。l 。，为状态算子，如果位置f 处的碳氢链为n 构象，则l m 等于l ，否 则为0 。s 为碳氢链处在构象n 时的序参数。 s = 打 ；吣 ( 3 3 0 ) 其中p 为每个碳氢链中碳原子个数，s p 代表第p 个c - c 键的序参数， s ，= 圭( 3 c o s 2 一1 ) ( 3 3 1 ) 为磷脂双层膜法线与c - c 键所在平面法线的夹角。 处在n 构象和优构象的碳氢链之间的相互作用对距离r 的依赖关系可以表示为 肌) 叫正) ； 。( 3 3 2 ) ， ， h 是弱化因子，当膜内的磷脂分子处于流动态，其值为0 4 ，处于其他构想时， 其值为1 。表示h 构象中，平均每个链占有空间的半径。 构像能为 4 ：湛办，鑫壤一一，一一 ! 丛羔! 堡旦! 坠婴堕鲤堡垒型! 型q 型型坚! 坚! ；! 型 vu l z h o uu n i v e r $ 1 t y e 。为碳氢链处在h 构象时的内能。 ( 3 3 3 ) 磷脂分子极性端的相互作用为 岭攒磊掣掣 c 。s 。， 其中k 为d e b y e 长度的倒数，k ； ，a ，卢= 1 分别表示正电荷和负电荷， 处在位置i ，的偶极子中的电荷口，之间的距离为锄，q 。是有效的极性头部电 荷。 随着电解质溶液离子浓度的增加，p i n k 模型给出的一些结果： 1 随着离子浓度的增加，磷脂分子极性头部的相互作用能逐渐减少。 一 一 世 叵 世 吼 窖 着 谍 掣 g 2 随着离子浓度的增加，链间的相互作用能逐渐增加。 0幺 v 鲁y 白 = 州 h 磊 f，二y 强。 一 ： 罐 匪 世 i q l 黑 霹 划 离子浓度im ”) 图3 - 4 3 随着离子浓度的增加，构象能改变不明显，说明起对离子浓度的依赖性不 离子浓度口 l 图3 - 5 本章小结： 本章主要介绍了在理论分析中将要用到的双电层结构及泊松一玻尔兹曼 ( p o i s s o n b o l t z m a n n ) 理论，相互作用原理( r e c i p r o c a lt h e o r e m ) ，电偶极子 ( d i p o l e d i p o l e ) 相互作用理论，p i n k 模型。 第四章理论分析 4 1 随着离子浓度降低，长程静电双层力开始出现且延伸长度不断增加 第三章介绍了电双层结构及泊松一玻尔兹曼理论，推导出的德拜( d e b y e ) 长度的倒数 k = 考虑实验条件( 2 3 c ，对称电解质n a c i 溶液，z = 1 ) ，代入相关常数，则有 一1 ：0 f 3 0 4( 4 1 ) k n 上式单位为面。利用软件m a t h e m a t i c a 得到延伸长度与电解质溶液浓度的关系曲线( 图4 - 1 ) 。 0 0 0 20 d 0 40 0 d 60 0 0 d0 0 10 0 1 2 0 0 1 4 电解质溶液浓度( m 0 1 ) 图4 静电双层力延伸长度与离子浓度的关系 表1由( 1 0 ) 式得到的离子浓度在0 o l m m