（微生物学专业论文）丙酮丁醇梭菌生产丁醇及代谢调控的初步研究.pdf

摘要 摘要 产物丁醇对细胞的毒性限制了丙酮丁醇发酵总溶剂终浓度，导致后续成本较高，难 以和化学合成法相竞争。因此菌种改良的目标就是选育丁醇产量高、丁醇耐受性强的菌 株，以期大大降低生产成本。 本论文以实验室保藏的丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) e 3 1 作为出发菌 株，紫外线诱变后，经2 - d o g 淀粉平板筛选，得到一株丁醇产量提高的菌株w 1 ，丁 醇产量为9 8 8 9 l ，比出发菌株提高了1 0 0 2 。然后以u v 1 为出发菌株，进行亚硝酸 诱变，得到一株丁醇产量提高的菌株n a 3 4 ，丁醇产量为1 1 5 8 9 l ，比出发菌株e 3 1 的丁醇产量提高了2 2 4 5 。对所得菌株n a 3 4 进行丁醇浓度梯度富集筛选，得到一株 丁醇耐受性提高的菌株b r 8 - 1 ，丁醇产量达1 2 8 1 9 t , ，经过多次传代，表现出较好的遗 传稳定性。 由于筛选平板根据q 淀粉酶活所设计，因此比较了出发菌株c 船p 幻6 锄，胁“聊e 3 1 和诱变菌株c a c e t o b u t y l i c u mb r 8 1 的a 淀粉酶活。b r 8 1 的a 淀粉酶活有很大提高， 从5 9 8 4 i7 m i ，提高到了9 4 6 7 u n 儿，提高了5 8 2 0 。分解代谢产物葡萄糖、麦芽糖和 糊精对c a c e t o b u t y l i c u me 3 。1 和c a c e t o b u t y l i c u mb r 8 1 的a 淀粉酶活均有抑制作用， 但对c a c e t o b u t y l i c u m e 3 1 的抑制强度要比c a c e t o b u t y l i c u mb r 8 1 的大。其中葡萄糖的 抑制作用最强，且随着葡萄糖浓度的增大，对a 淀粉酶活的抑制作用也不断增强，当葡 萄糖浓度增加到4 0 0 时，8 8 0 0 以上的a 淀粉酶活被抑制。通过在不同时间添加4 0 0 的葡萄糖，研究葡萄糖对c a c e t o b u t y l i c u m b r 8 1 a 淀粉酶活的调控，发现葡萄糖主要 在对数期影响b r 8 1 的q 淀粉酶活。这些研究表明c a c e t o b u t y l i c u mb r 8 1 是抗代谢阻 遏株，但并没有完全解除阻遏。 以总溶剂产量为指标，确定木薯的预处理条件为粉碎度为6 0 目，蒸煮温度为9 0 ， 蒸煮时间为6 0 m i n ；初始p h 5 2 0 、培养温度3 7 、接种量7 0 0 、种龄2 6 h 。以总溶剂 产量和残糖量为指标，确定最佳的营养组合为：碳源为7 0 0 木薯粉，氮源为1 0 0 的 麸皮加o 2 5 酵母膏，2 5 0 0 的废液。 考察了中性红和乙酸钠对代谢的调控。中性红对丙酮丁醇代谢的调控表现为：使代 谢流流向丁醇和乙醇的方向，当添加o 1 0 的中性红时，丁醇的比例从6 0 3 5 提高到6 6 4 3 ，乙醇比例从1 0 1 9 提高到1 5 8 4 ，而丙酮的比例从2 9 4 6 下降为1 7 7 3 。乙 酸钠对丙酮丁醇的调控表现为：使代谢流向了丙酮和丁醇，当添加0 6 0 的乙酸钠时， 丙酮的比例从2 9 o o 提高到了3 3 4 4 ，丁醇的比例从6 0 9 7 提高到6 4 7 8 。 关键词：丙酮丁醇发酵；诱变：a 淀粉酶；调控 a b s t r a c t a b s t r a c t b u t a n o la st h ee n dp r o d u c ti st o x i ct ot h ec e l l ，w h i c hr e s t r i c tt h e t h et o t a l 丘n a l c o n c e n t r a t i o no fs o l v e n t a sar e s u l t , t h ef o l l o w i n gc o s t sa r er e l a t i v e l yh i g ha n di ti sd i 伍c u l tt o c o m p e t ew i t hc h e m i c a ls y n t h e s i s s t r a i ni m p r o v e m e n t s ，t h e r e f o r e ，f o c u so nt h ei s o l a t i o no f s t r a i n sw i t hh i g hb u t a n o lp r o d u c t i o na n dt o l e r a n c es oa st or e d u c et h ep r o d u c t i o nc o s t s i nt h i sp a p e r , as t r a i nn a m e dc o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u mu v - 1 t r e a t e dw i t hu vw a s s e l e c t e da n dt h eb u t a n o ly c i d sw e r e9 s 8 9 l ，1 0 0 2 h i g h e rt h a nt h eo r i g i n a ls t r a i n t h e n c a c e t o b u t y l i c u mu v - 1w a st r e a t e dw i 也n i t r o u sa c i d , w h i c hr e s u l t e do fas t r a i nn a m e d c a c e t o b u t y l i c u mn a 3 4 a tl a s t , c a c e t o b u t y l i c u mn a 3 4w a st r e a t e db yas e r i a le n r i c h m e n t p r o c e d u r ew i 也b u t a n 0 1 n 地b u t a n o ly e i d sr e a c h e d1 2 81 9 l t h em u t a n tw a sg e n e t i c a l l y s t a b l e c o m p a r e dw i t hca c e t o b u t y l i c u me 3 - 1 t h ea a m y l a s ea c t i v i t yo fca c e t o b u t y l i c u m b r 8 1e l e v a t e db v58 2 0 a st h em e t a b o l i t e sg l u c o s e ，m a l t o s ea n dd e x t r i na l lc a ni n h i b i tt h e a a m y l a s ea c t i v i t yo fc a c e t o b u t y l i c u me 3 - 1m o r et h a nc a c e t o b u r ) 7 l i c u mb r 8 1 a m o n g t h e m , g l b c o s e h a dt h e s t r o n g e s ti n h i b i t o r y e f f e c t 。鼢t h ei n c r e a s eo ft h e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n , t h ee f f e c to fi n h i b i t o r ye l e v a t e d w h e nt h eg l u c o s ec o n c e n t r a t i o nr e a c h e d 4 0 0 m o r et h a n8 8 0 0 q a m y l a s ea c t i v i t yw e r er e p r e s s e d a tt h es a m et i m e ，i tw a sf o u n d t h a tg l u c o s ei m p a c t e dt h ea a m y l a s ea c t i v i t ym a i n l yi nt h el o g a r i t h m i cp h a s e t h e s es t u d i e s i n d i c a t e dt h a tc a c e t o b u t y l i c u mb r 8 1w a sas t r a i nr e s i s t a n tt oc a t a b o l i t er e p r e s s i o n b u ti t c a nn o tr e s i s tc a t a b o l i t er e p r e s s i o nc o m p l e t e l y w i t hs o l v e n tp r o d u c t i o na st h em a i ni n d e x ，t h ec a s s a v as t a r c hp r e t r e a u n e n tc o d i t i o n sa s w e l la sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r es t u d i e d t h ec a s s a v as t a r c hp r e t r e a t m e n tc o d i t i o n s ：6 0 m e s h , t e m p e r a t u r e9 0 f o r6 0 m i n ；f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ：i n i t i a lp h 5 2 ；t e m p e r a t u r e 3 7 ： i n o c u l a t i o ns i z e7 0 0 ：i n o c u l a t i o nt i m e2 6 h w i t hs o l v e n tp r o d u c t i o na n dr e s i d u a ls u g a r a m o u n ta si n d e x s ，7 0 0 c a s s a v as t a r c hw a ss e l e c t e da sc a r b o ns o u r c e ，1 o o w h e a tb r a np l u s 0 2 5 y e a s te x t r a c tw c i es l e e t e da sn i t r o g e ns o u r c e a n d2 5 0 0 w a s t el i q u i d n e u t r a lr e dm a d et h ef l o wt o w a r d sb u t a n o la n de t h a n o l 。鼢e n0 。10 n e u t r a lr e dw a s a d d e dt ot h ec u l t u r e t h er a t i oo fb u t a n o li n c r e a s e df r o m6 0 3 5 t o6 6 4 3 ，a n dt h er a t i oo f e t h n o li n c r e a s e df r o m1 0 1 9 t o1 5 8 4 ；m e a n w h i l e t h er a t i oo fa c e t o n ed e c r e a s e df r o m 2 9 4 6 t 01 7 7 3 s o d i u ma c e t a t ep l a y e dar o l ei nm a k i n gt h ef l o wt o w a r d sb u t a n o la n d a c e t o n e w h e n0 6 0 s o d i u ma c e t a t ew a sa d d e dt ot h ec u l t u r e t h er a t i oo fb u t a n o li n c r e a s e d f r o m6 0 9 7 t o6 4 7 8 a n dt h er a t i oo fa c e t o n ei n c r e a s e df r o m 2 9 0 0 t o3 3 4 4 k e yw o r d s ：a c e t o n e - b u t a n o lf e r m e n t a t i o n ；m u t a n t ；a - a m y l a s e ；r e g u l a t i o n i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是芩人在导师指导下进行的研究5 - 作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：么鳢 日 期：计) 彬 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 幺金兰 导师签名： 第一章引言 第一章引言 1 1 正丁醇简介 1 1 1 正丁醇的理化性质 正丁醇( n b u t a n 0 1 ) 化学名称是1 丁醇，其分子式为c h 3 c h 2 c h 2 c h 2 0 h ，习惯称为丁 醇，无色液体，有酒味，相对密度o 8 1 0 9 ，2 0 c 时在水中的溶解度7 7 0 ( 重量) 。与乙 醇乙醚及其他多种有机溶剂混溶，蒸气与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限 1 4 5 1 1 2 5 ( 体积) 。有毒、易燃，属二级易燃危险品【。 1 1 2 正丁醇的用途 丁醇在现代工业中有举足轻重的地位，它广泛应用于有机合成、塑料、树脂、油漆 和医药等工业。可以用作溶剂，如喷漆的溶剂及稀释剂；制药工业的溶剂( 抗生素工厂) ； 燃料的溶剂；复写纸混合剂的溶剂等。可以用作有机合成化学工业的原料，如用正丁醇 和苯酐为原料，用硫酸作催化剂，经酯化反应生成苯二甲酸二甲酯，是早被应用的增塑 剂，用于聚氯乙烯p v c 、硝化纤维、赛璐珞等方面，也可用于油漆润滑剂、乳化剂等。 丁醇还是一种极具潜力的新型燃料。乙醇作为一种重要的可再生燃料已经引起足够 的重视，但丁醇在燃料方面的重要性尚未引起足够的重视。丁醇、乙醇及汽油的特性比 较见表1 1 。 表1 1 丁醇、乙醇及汽油的特性比较【2 】 t a b l e l 1c o m p a r i s o no fp r o p e r t i e so fb u t a n o l ，e t h a n o la n dg a s o l i n e 由表1 1 可以看出，丁醇的辛烷值和热值都接近汽油，可以作为生物燃料添加到汽 油中，替代部分汽油。由于一般生物燃料会腐蚀发动机的输油管和垫圈，因此目前的汽 车发动机只允许使用含5 生物燃料和9 5 普通汽油或柴油的混合燃料。而丁醇的腐蚀 性则要小得多，混合燃料中可混入2 0 的丁醇。同时，丁醇不像乙醇对汽油混合物中的 水分那么敏感，使用丁醇作为驱动能源，无须改造输油管和发动机。同时，相比乙醇让 人头疼的低能量密度，丁醇却是一种高能量生物燃料。同时，丁醇与源自石油炼制的运 输燃料相比具有明显的环境效益，燃烧时不产生s o x 和n o x ，能减少温室气体的排放。 丁醇的这些特点使其作为新型燃料具有极佳的发展前景。 江南大学硕士学位论文 1 1 3 正丁醇的生产方法 正丁醇的生产方法主要有化学法和发酵法。丁醇最早由法国人c a 孚兹于1 8 5 2 年从 发酵过程制酒精所得的杂醇油中发现。1 9 1 3 年，英国斯特兰奇格拉哈姆公司首先以玉 米为原料经发酵过程生产丙酮，正丁醇则作为主要副产物【1 , 3 】。第一次世界大战结束后， 杜邦公司首先发现：丁醇可制得乙酸丁酯，用做硝酸纤维喷漆的优良溶剂。因此，丁醇 由积压的废物一跃成为宝贵的溶剂，丙酮- 丁醇发酵工业改称为丁醇发酵工业。目前， 微生物法生产丁醇主要以淀粉质、纸浆废液、糖蜜和野生植物为原料，加水混合成醪液， 经蒸煮杀菌，加入丙酮丁醇梭菌等厌氧产溶剂的菌，在3 6 3 7 进行发酵，发酵醪液经 精馏分离得到正丁醇、丙酮和乙醇。发酵法生产丁醇条件温和，一般常温操作，不需贵 重金属催化剂，选择性好、安全性高、副产物少，易于分离纯化。 第二次世界大战期间，德国鲁尔化学公司首先用丙烯羰基合成法生产正丁醇。5 0 年代石油化工兴起，合成法制正丁醇的发展迅速，逐渐取代了微生物法生产丁醇，尤以 丙烯羰基合成法发展最快。丙烯羰基合成法生产丁醇是用丙烯、一氧化碳和氢经钴或铑 催化剂，通过羰基合成反应生成正丁醛和异丁醛，再经加氢得正丁醇和异丁醇。在用钴 催化剂时，反应在i o 2 0 m p a 和约1 3 0 1 6 0 下进行，生成的正丁醛与异丁醛之比约为 3 。1 9 7 6 年开始在工业上应用的铑络合物催化剂，使反应可在o 7 3 m p a 、8 0 1 2 0 下进 行，正丁醛与异丁醛之比达到8 1 6 。加氢可在气相用镍或铜作催化剂，也可在液相用镍 作催化剂。如果在高温高压下加氢，则一些副产物分解也可得丁醇，产品的纯度可提高。 此外，还有醇醛缩合法生产丁醇，由两分子乙醛，经缩合并脱水，可制得巴豆醛，巴豆 醛在镍铬催化剂存在下于1 8 0 和0 2 m p a 加氢生成正丁醇。化学合成法都是以石油为 原料，技术和工艺复杂，对设备要求高，特别是石油的不可再生性，严重影响了化学法 合成丁醇工业的发展【l j 。 1 2 发酵法生产丁醇的国内外研究进展 国外对丙酮丁醇发酵研究较早，早在1 9 1 1 年，f e m b a t h 教授受英国s t r a n g & g r a h a m 公司的委托，在研究丙酮的合成过程中，分离获得f i t z 型菌。该菌除能生成丁醇外，还 可生成丙酮。1 9 1 4 年w e i z m a n 博士成功地分离得到一株丙酮丁醇菌，属于b y 型菌。它 能发酵多种淀粉质原料，且发酵产物中丙酮含量比f i t z 型菌提高了4 倍，溶剂生成比例 是丁醇：丙酮：乙醇= 6 ：3 ：1 ( 即b ：a ：e = 6 ：3 ：1 ) ，该菌后来被命名为c l o s t r 翮u ma c e t o b u t y l i c u m w e i z m a n ，此菌的发现为丙酮丁醇发酵的工业化奠定了基础，促进了丙酮丁醇发酵工业 的发展【3 ，4 1 。c a c e t o b u t y l i c u m 为革兰氏阳性菌，细胞成梭状，能产生丙酮和丁醇等溶剂 的厌氧芽孢杆菌，细胞大小( 0 鲫9 ) 1 t m ( 2 似7 ) r t m 。芽孢卵圆形，次端生。表面菌落 圆形、突起，直径3 5 r a m ，边缘不规则，色灰白，半透明，表面有光泽。严格厌氧。 能分解蛋白质和糖类；生物素和对氨基苯甲酸作生长因子。在玉米粉培养液中生长旺盛， 产生大量的丙酮、丁醇和乙醇( 3 ：6 ：1 ，w w ) 等溶剂，广泛分布于土壤和谷物等种子表面。 我国第一个生产丙酮丁醇的发酵厂于1 9 5 4 年底在上海建成，并带动了其他省的发 酵法生产溶剂的工厂的发展。我国溶剂生产工厂主要是以玉米和山芋干为原料，少数工 2 第一章引言 厂如广西溶剂厂曾用糖蜜为生产原料。我国丙酮、丁醇的产品质量已达到国际先进水平， 并且还出口到海外。原料和能源的消耗也相当低，达到世界一流水平。菌种方面采用我 国自行选育的优良菌种，发酵速度快、得率高，还具有抗噬菌体特性。技术方面，我国 完全有能力自主设计、制造、安装、调试和生产。经过多年的发展，造就了一大批这方 面的技术人才。但是从上世纪9 0 年代开始，随着石油化工产业的发展，通过石油化工 合成溶剂的成本大幅降低，我国的丙酮丁醇发酵工业逐渐衰退，1 9 9 6 年我国最后一家利 用发酵法生产丙酮一丁醇的厂家关闭。 2 0 0 4 年河南天冠企业集团公司下属的上海天之冠可再生能源有限公司和中国科学 院上海生命科学研究院正式签订了丙酮一丁醇发酵技术合作项目，双方决定在“改进丙 酮一丁醇发酵技术的相关项目方面开展合作研究，加快其产业化进程。2 0 0 7 年6 月由 联通实业、上由房地产公司等公司投资8 0 0 0 万美元兴建了江苏联海生物科技有限公司， 设计年产2 0 万吨正丁醇、1 0 万吨丙酮的工厂，一期工程已于2 0 0 8 年6 月竣工。同时， 国内其它溶剂生产厂家也在恢复生产。 1 2 1 菌种选育的研究 微生物育种，无论从自然变异中选择还是从人工诱变中选择都是建立在遗传和变异 的基础上，遗传和变异是生物界生命活动的基本属性之一。没有变异，生物界就失去了 进化的素材；而没有遗传，选择到的优良性状也不能进行延续。诱变育种是以人工诱变 基因突变为基础的，是有效的菌种改良方法，尤其是发酵工业绝大多数优良高产菌株都 是采用诱变育种方法获得的。 自然筛选的菌株，产量一般都比较低，因此需要对菌株进行改良。国内对丙酮丁醇 梭菌的菌株改良，主要还是用传统的诱变方法，如紫外诱变、亚硝基胍诱变【5 ，6 j 等。紫外 线诱变是一种使用最早、沿用最久、应用广泛、效果明显的微生物诱变剂。其诱变频率 高，而且不易回复突变，在微生物育种史上留下了它的功绩，迄今仍然是微生物育种中 最常用和有效的诱变剂之一。山西大学颜叙秀 - q 等人通过紫外诱变筛选到代谢产物提高， 稳定性好的菌株。亚硝基胍应用范围比较广，造成的遗传损伤比较多，有“超诱变剂 之称，是对丙酮丁醇梭菌诱变效果比较好的一种诱变剂。上海植物生理研究所张益蕖惜j 等人通过亚硝基胍诱变选育出菌株e a 2 0 1 8 ，该菌株的丁醇比例得到了极大提高，百吨 发酵罐试验中，丁醇比例达7 1 ，比出发菌株提高了1 0 左右。 国外对菌株的改造除了传统的诱变育种【9 ，1 0 j 以外，还有原生质体融合育种和基因工 程改造育种。r e i l l y 1 1 】等对丙酮丁醇梭菌的原生质体的制备及再生做了研究，发现在梭 菌基本培养基中添加o 4 的甘氨酸可以提高原生质体的制备率，添加ca ：冲、m g z + 可以 提高原生质体的稳定性，添加水解酪蛋白或者丙酮丁醇梭菌的自溶物，可以提高再生率， 这些都为原生质体育种奠定了基础。h a n sb l a s c h e k 1 2 】等人通过同源重组使得s o l r 基因 ( 编码假定的丁醇、丙酮阻遏物) 失活，获得了丁醇最终浓度提高3 2 倍的突变株；通过 过度表达a a d 基因编码的质粒获得的突变株能将丁醇的浓度由1 3 1 e d l 提高到1 6 4 9 l 。 通过使p t a 基因失活降低磷酸转乙酰酶( p t a ) 和乙酸激酶( a k ) 的活力能大幅降低乙酸的 产生；通过使b u k 基因失活能降低丁酸激酶( b k ) 的活力从而降低丁酸的产量，提高丁醇 江南大学硕士学位论文 的产量。 1 2 2a - 淀粉酶的研究 丙酮丁醇发酵的主要淀粉质物质为原料，因此对丙酮丁醇梭菌的a 淀粉酶的研究有 重要意义。国外对丙酮丁醇梭菌的q 淀粉酶做过许多研究，但国内尚无有关这方面的报 j 厶 逗o b a s s a m 和h a n s 1 3 通过亚硝基胍诱变，筛选到两株a 淀粉酶活提高的菌株 c a c e t o b u t ) ，l i c u mb a l 0 1 和c a c e t o b u t y l i c u m b a l 0 5 。通过对这两株菌株的a 淀粉酶活的 调控，发现c a c e t o b u t y l i c u mb a l 0 1 为单纯的a 淀粉酶活提高型的菌株，在有0 4 的葡 萄糖存在时，a 淀粉酶活有8 2 被抑制：而c a c e t o b u t y l i c u mb a l 0 5 为抗代谢阻遏株， 在有0 4 的葡萄糖存在时，a 淀粉酶活只有2 5 被抑制。f o g o r t y t l 4 】等发现丙酮丁醇梭 菌的q 淀粉酶能被淀粉诱导而被分解代谢物阻遏，当以淀粉为底物时，9 7 5 的a 淀粉 酶为胞外酶；当添加1 的葡萄糖时，a 淀粉酶活下降8 0 ，且6 9 1 为胞内酶，2 8 3 为胞外酶，另外有少量为与细胞膜结合的酶。p r i e s t ”】分析这可能是由于，当有淀粉存 在时，微生物事先合成的一种水解酶可以将淀粉分解成小的分子，这些分子可以进入细 胞诱导q 淀粉酶的产生。a n 岫越a i l 【1 6 j 贝0 有不同的解释，他通过对细胞超微结构的观察 发现，当培养基中存在淀粉时，丙酮丁醇梭菌的细胞膜通透性会增强，使得合成的a 淀粉酶大量分泌出来，于是表现为0 【淀粉酶活的提高；当有葡萄糖存在时，细胞膜则不 会表现出这样的改变。b k s o n i 4 1 1 报道丙酮丁醇梭菌a 淀粉酶的最适p h 为5 2 ，这与产 溶剂的最适p h 4 4 不一致，这说明旺淀粉酶主要在产酸期起作用，且发酵初始p h 对产 溶剂的影响主要通过影响a 淀粉酶活起作用的。 1 2 3 发酵原料的研究 原料价格几乎占了丙酮丁醇生产成本的6 0 - 7 0 ，是影响丁醇价格的重要因素。 因此选择合适的原料作为碳源能在很大程度上提高发酵法生产丙酮丁醇的竞争力。目前 丙酮丁醇发酵最常用的原料是玉米与山芋干，这两种原料的价格相对较高，使得生产成 本较高。李冬刨1 1 7 】等人利用新型玉米秸秆气爆玉米秸秆膜循环酶解耦合发酵系统进行了 丙酮丁醇发酵的研究，使利用来源广泛、价格低廉的玉米秸秆为原料成为可能。陈守文 瞄】等人研究了稻草酶水解液发酵生产丙酮丁醇的条件，为利用稻草为原料奠定基础。同 时，丙酮丁醇发酵与酒精发酵有很多相似之处，应用于酒精发酵的一些原料也可以在丙 酮丁醇发酵中应用。国外研究人员对价廉易得的纤维素原料应用于丙酮丁醇发酵做了许 多研究。其中，w o o d s i s 应用小麦秸秆水解液为原料生产出了丁醇，这表明以纤维素为 原料生产丁醇是可行的。j e s s e 等以c 抛i f p ，f 玎c 翮b a l o l 为生产菌株，以压榨花生和农 业废物为发酵原料生产丙酮丁醇，总溶剂产量分别达2 1 7 9 l 和1 4 8 9 l 。荷兰学者以城 市垃圾作为发酵底物生产丙酮丁醇，1 0 0 9 城市垃圾可生产出4 9 总溶剂。当添加一定廉 价的纤维素和葡萄糖苷酶时总溶剂可达7 5 9 。这些研究都表明来源广泛的纤维素原料可 作为丙酮丁醇发酵的原料，而且极具发展前景。 4 第一章引言 i 6 a 。p 公0 2 n a 。h 乳酸_ 丙酮酸 乙? 强乙酰# 逻受二醇 i u a i p a 。p j n a 。h n a 。+ n e 。hn ，d + 丁酸j i 么卜t 酰- c o a 二z l 二：主t 蕾 图i - i 丙酮丁醇梭茵代谢简图 f i g l - 1 t h es i m p l ef e r m e n t a t i o np a t h w a y so fc l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i u m 丙酮丁醇梭菌丙酮一丁醇发酵代谢途径如图1 1 所示，代谢支路较多，如何使代谢 流更多的流向丁醇是解决丁醇生产能力较低的关键：第一阶段为产酸阶段 ( a c e t o g e n e s i s l ，葡萄糖经过糖酵解( e m p ) 途径产生丙酮酸，五碳糖通过磷酸戊糖途径 ( h m p ) ，转化为6 磷酸果糖和3 磷酸甘油醛，进入e m p 途径产生丙酮酸。丙酮酸和c o a 在丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶的作用下生成乙酰 c o a 。磷酸酰基转移酶( p t a ) 催化 乙酰 c o a 生成酰基磷酸酯，接着在乙酸激酶( 削p 的催化下生成乙酸。乙酰 c o a 在一 系列酶的催化下生成丁酰以o a ，然后经磷酸丁酰转移酶( p t b ) 催化生成丁酰磷酸盐，最 后丁酰磷酸盐经丁酸激酶去磷酸化，生成丁酸。在该阶段中，谢调控的关键是使n a d h 大量积累，为丁醇和乙醇的生成提供大量的还原力。 第二阶段是产溶剂期，乙酰乙酰c o a 转移酶、乙酸丁酸c o a 转移酶是溶剂形成 途径中的关键酶之一，产酸阶段产生的乙酸和丁酸经过乙酸丁酸c o a 转移酶的催化作 用分别形成乙酰o a 和丁酰q o a ，乙酰c o a 在硫激酶的作用下形成乙酰乙酰 c o a ， 乙酰乙酰 c o a 再经过乙酰乙酰- - c o a 转移酶的催化作用转化为乙酰乙酸，乙酰乙酸脱 羧形成丙酮。丁酰 c o a 在丁醛脱氢酶和丁醇脱氢酶催化下，经过两步还原生成丁醇。 江南大学硕士学位论文 在这一步的代谢调控主要通过添加中间代谢产物来实现的。 1 2 5 发酵工艺的研究 发酵工艺的改良对于丙酮丁醇发酵有重大意义。传统的丙酮丁醇发酵主要以间歇发 酵和蒸馏提取的方式进行的，目前产量只有1 5 1 8 9 l ，以该生产方式生产，丙酮丁醇的 产量只有达到2 6 , - - 2 8 9 l 时，才具经济竞争力【1 9 1 。因此，对丙酮丁醇发酵工艺的改进对 整个产业的发展有重大意义。丙酮丁醇发酵的工艺改进主要有气体发酵，萃取发酵，气 提发酵等。浙江大学杨立荣【2 0 】等人从十三种有机物对丙酮丁醇梭菌的毒性及它们的物理 性质出发，选出油醇和混合醇( 油醇和硬脂醇的混合物) 作为丙酮丁醇发酵的萃取剂。江 南大学胡翠英【2 l j 等人以四种生物柴油为萃取剂，进行了丙酮丁醇萃取发酵的研究，丁醇 的生产强度可达0 2 1 9 l h ，比对照提高了1 0 9 。国外对丙酮丁醇发酵工艺的研究也有 很大进步，如针对高浓度的发酵底物( 如葡萄糖) 对丙酮丁醇梭菌有抑制作用 2 2 j ， q u r e s h i 2 3 拼j 等采用补料分批发酵使反应器的生产率和总溶剂质量浓度分别达到 0 9 8 9 l h 、1 6 5 1 0 9 l ，相比之下分批发酵只分别达到o 3 9g l h 、2 5 3 0 9 l 。t a s h i r 0 1 2 5 等 利用丁醇高产菌株cs a c c h a r o p e r b u t y l a c e t o n i c u mn 4 1 发酵葡萄糖生产丁醇时发现，采 用补料分批发酵的方法不断流加葡萄糖和丁酸，能促进发酵，得到1 6 o o g l 的丁醇，高 于分别使用葡萄糖和丁醇为唯一碳源的发酵产量。从表2 可以看出提取工艺的不同，对 溶剂的得率和生产率有很大影响。 表1 2 丁醇发酵过程中不同提取工艺比较【3 】 t a b l e1 2c o m p a r i s o no fd i f f e r e n te x t r a c t i o np r o c e s s 1 3 立题意义 近年来，各国都非常重视能源安全，温室气体减排及气候变化等问题，为发展新的 能替代化石燃料的能源积极寻找应对策略，其中大力发展生物能源，是各国在环保问题 上达成的共识，丁醇作为极具潜力的生物能源的优势这时也凸显出来。我国也意识到能 源危机的问题，中国“十一五 规划中明确要求，至w j 2 0 1 0 年单位产值能耗降低2 0 ，这 意味着我国发展模式要进行根本性的转变。节约和合理利用能源，降低能源消耗，提高 6 第一章引言 能源利用效率，既是我国缓解能源供应紧张的重要措施，更是提升经济增长质量、创新 发展模式的重要手段。为此，我国必须在能源结构上进行天翻地覆的换代转型，发展新 型能源。国家发改委组织编制可再生能源中长期发展规划，确定了未来1 5 年可再生 能源发展的目标：至j j 2 0 2 0 年可再生能源在能源结构中的比例争取达到1 6 。而丙酮丁醇 发酵作为转化生物质化学品和燃料的重要手段将在我国能源战略和能源安全领域扮演 越来越重要的作用。 同时随着汽车产业的不断发展，石油危机愈演愈烈，过去的一年里围绕石油展开的 竞争也备受瞩目，石油价格在竞争中动荡，给世界经济很大冲击。我国是石油消费大国， 但石油储备仅占全球的2 ，这也使我国大力发展生物燃料迫在眉睫。 虽然发酵法生产丙酮丁醇在环保方面，节约能源方面有许多优势，但它同时也存在 一些问题，制约着它的发展，如现有菌株生产能力偏低，原料价格上涨等。现有的菌株 发酵产的终溶剂浓度低，一般在1 5 o o , - , 1 8 o o g l ，使产品的分离成本提高。丁醇对菌株 的毒性大，一般当丁醇浓度大于1 0 o o g l 时，丙酮丁醇梭菌的生长就会受到抑制，因此 总溶剂的终浓度偏低。产物比例不符合要求，一般丙酮丁醇发酵中，产物乙醇：丙酮：丁 醇为1 ：3 ：6 ，实际生产中要求丁醇比例更高的菌株。目前发酵法生产丙酮丁醇的主要原料 是玉米，2 0 0 8 年以来玉米的价格一路走高，而石油价格走低，丁醇的价格也走低，这样 就使发酵法生产丁醇的优势受到冲击，因此寻找价廉易得的原料能提高发酵法生产丙酮 丁醇的经济竞争力。 1 4 本课题的研究重点 ( 1 ) 通过紫外诱变和亚硝酸诱变筛选总溶剂产量高，丁醇耐受性强的菌株。 ( 2 ) 对产量提高的菌株的q 淀粉酶做初步研究。 ( 3 ) 对以木薯为原料的发酵条件进行研究。 ( 4 ) 对丙酮丁醇梭菌的代谢调控做初步研究。 7 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 出发菌株 丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) y g 本实验室保藏。 2 1 2 培养基 固体培养基( g l ) ：可溶性淀粉4 0 o o ，酵母膏2 0 0 ，牛肉膏2 o o ，胰蛋白胨6 0 0 ， 乙酸铵3 0 0 ，磷酸氢二钾o 5 0 ，硫酸镁0 2 0 ，硫酸亚铁0 0 1 ，琼脂2 0 0 0 ，p h 6 5 - 7 0 ， 1 2 1 ，灭菌2 0 r a i n 。 液体培养基( g l ) ：葡萄糖4 0 o o ，蛋白胨2 o o ，酵母膏1 0 0 ，硫酸铵2 0 0 ，磷酸 氢二钾1 0 0 ，磷酸二氢钾o 5 0 ，七水硫酸镁0 1 0 ，氯化钙o 0 1 ，一水硫酸锰o 0 1 ，复 合维生素片0 0 0 2 ，p h 7 0 ，1 2 1 ，灭菌2 0r a i n 。 筛选培养基：在固体培养基中添加2 脱氧一d 一葡萄糖( 2 一d o g ，浓度待定) 和0 0 7 5 9 l 的锥虫蓝【2 6 1 。 种子培养基：5 0 0 5 k 米醪培养基，称取过4 0 目筛的玉米粉5 0 0 0 9 ，加1 l 自来水，煮 沸5 0 r a i n ，补足挥发的水份。1 2 1 ，灭菌2 0 m i n 。 筛菌用发酵培养基：7 0 0 玉米醪培养基，配制过程同种子培养基。 木薯醪培养基：配置过程同种子培养基，具体浓度、粉碎度待定。 2 1 3 主要试剂 可溶性淀粉 酵母膏 胰蛋白胨 牛肉膏 乙酸铵 磷酸氢二钾 硫酸镁 硫酸亚铁 琼脂 2 d o g 锥虫蓝 中性红 玉米粉 3 5 一二硝基水杨酸 碘 碘化钾 分析纯 生化试剂 生化试剂 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 9 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 冬青化工厂 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 美国s i g m a 公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 市售 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 江南大学硕士学位论文 亚硝酸 醋酸 醋酸钠 正丁醇 无水乙醇 丙酮 磷酸氢二钠 浓硫酸 美蓝 硫酸铜 硫酸钾 玉米粉 葡萄糖 木薯粉 麸皮 尿素 硫酸铵 2 1 4 主要仪器 5 0 0 型电子天平 真空干燥箱 u v 2 8 0 0 a h 分光光度计 电热恒温培养箱 电热恒温水浴锅 电热式压力蒸汽消毒器 超净工作台 精密数显p h 计 w 5 0 1 升降恒温水浴锅 真空泵 g - c 2 0 1 0 气相色谱仪 高速冷冻离心机 厌氧瓶 a n a e r o p a e k 厌氧产气袋 a n a e r o p a c k 2 5 l 厌氧罐 振荡器z p 一2 0 0 磁力加热搅拌器j j - 7 9 - 1 微型涡旋混合器 分析纯 分析纯 分析纯 色谱纯 色谱纯 色谱纯 分析纯 9 8 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 l o 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 市售 国药集团上海化学试剂公司 市售 市售 国药集团上海化学试剂公司 国药集团上海化学试剂公司 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂 上海第三分析仪器厂 上海第三分析仪器厂 上海跃进医疗器材厂 北京靖卫科学仪器公司 无锡第二医疗器械厂 苏州空气净化设备厂 北京h a n n a 公司 上海申顺生物科技有限公司 巩义市英峪予华仪器厂 上海精密科学仪器有限公司 德国s i g m a 公司 江阴玻璃仪器厂 日本三菱化学有限公司 日本三菱化学有限公司 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 上海和欣科教设备有限公司 上海跃进医疗器械厂 第二章材料与方法 分析天平 紫外诱变箱 2 2 方法 2 2 1 厌氧培养方法 m e t t l e r 公司 上海安亭科学仪器厂 将待培养的平板放入罐中，伺时将厌氧产气袋迅速打开放入罐中，将顶盖封好。厌 氧产气袋通过化学反应吸收容器中的氧气，同时产生二氧化碳和氢气，3 0 6 0 m i n 内氧 气被完全吸收，从而确保罐内的无氧环境。厌氧罐示意图如图2 1 。 厌氧瓶培养：将种子培养基接种到厌氧瓶中，将厌氧瓶的橡皮塞塞紧，然后用循环 水真空泵抽真空，为菌体的生长创造无氧环境。 厌氧产气 封圈 平板 图2 - 1 厌氧i 罐示意图 f i g 2 - 1t h es k e t c ho fa n a e r o b i ct a n k 2 2 2 厌氧培养条件 种子培养：将甘油管保藏的菌种活化，9 0 c 加热9 0 s 后接种于种子培养基，置于3 7 恒温培养箱内静止培养。 发酵培养：向发酵培养基中接种7 0 0 ，置于3 7 恒温培养箱内静置培养。 2 2 3 酋落直径测量方法 于恒温箱内取出培养后的检测平板，翻转平板放在台面上，用游标卡尺测量其直径， 测量三次取平均值。 2 2 4 紫外诱变方法 ( 1 ) 菌悬液的制备 取3 7 c 培养1 8 h 的细菌培养液以3 0 0 0 r r a i n 离心，倾去上清液，将菌体打散加入无 菌生理盐水再离心洗涤，过滤，收集单细胞悬液，用无菌生理盐水稀释至1 0 8 个m l 。 ( 2 ) 紫外诱变r 7 取4 0 0 m l 单细胞菌悬液于半径为5 c m 的培养皿中，置于磁力搅拌器上，距离3 0 w 紫 外灯1 5 c m ，照射定时间。紫外诱变后的操作都要在红光灯下进行。 江南大学硕士学位论文 致死率( ) = 未经处理的菌落数m l 亚硝酸诱变后的茵落数m l 未经处理的菌落数m l 1 0 0 2 2 5 亚硝酸诱变方法 ( 1 ) 菌悬液的制备 同紫外诱变菌悬液的制备。 ( 2 ) 亚硝酸诱变【2 7 】 取5 0 0 m l0 1 0 m o l ln a n 0 2 加入5 o o m l 单细胞菌悬液，3 0 ，1 0 0 r r a i n ，振荡3 - 8 m i n 。 取2 0 0 m l 处理液，加入8 0 0 m l0 0 7 m o l ln a 2 h p 0 4 ( p h 8 6 0 ) 溶液，终止反应。 致死率( ) = 未经处理的菌落数m l 一亚硝酸诱变后的菌落数m l 未经处理的菌落数m l 1 0 0 2 2 6 增强茵株的丁醇耐受性的方法 将培养到o d 6 0 0 值大于0 8 0 的菌液转接入含1 0 0 0 9 l 丁醇的液体培养基中，当o d c ；0 0 值大于o 8 0 时再转接到丁醇浓度提高的液体培养基中，逐步提高