（微生物学专业论文）好氧聚磷菌的分离、鉴定及其聚磷特性的研究.pdf

摘要 本研究利用y g 培养基从巢潮底泥、校园池塘底泥和南淝河底泥等不同地点采集 的污泥中分离纯化了6 6 株细菌，其中3 0 株细菌生长旺盛，将这些菌株分别点种到限磷 与过磷的葡萄糖m o p s 培养基上培养2 d ，在两种培养基上都产生蓝斑的菌株有1 l 株， 即为初选聚磷菌。将这l1 株细菌进行厌氧好氧连续培养，进行内聚物的染色，其中有 7 t , 细菌能合成内聚b 羟基丁酸和多聚磷酸盐；好氧培养2 4 时，在7 株能合成内聚b 一 羟基丁酸和多聚磷酸盐的菌株体内含磷量均超过对照菌大肠杆菌，其中g p 4 4 的菌体 含磷量高达11 9 2 ，本文将对菌株g p 4 4 进一步的研究。 菌株g p 4 4 的个体形态为链杆状，无鞭毛，有荚膜，革兰氏染色阴性，大小为 0 7 5um x 2 2 5um ，菌落边缘平整，不透明，湿润，呈卵黄色，有臭味。1 6 s r d n a 序列分析表明，g p 4 4 的1 6 s r d n a 基因序列与k l e b s i e l l at e r r i g e n aa t c c3 3 2 5 7 t ( a f l 2 9 4 4 2 ) 同源性高达( 9 6 ) 。通过系统进化树分析和生理生化特征，g p 4 4 属于肠杆菌科 克雷伯氏菌属中土生克雷伯氏菌( c t e r r i g e n a ) 。 菌株g p 4 4 除磷的最佳培养基为废水合成培养基，生长曲线中菌株的对数生长期 在第4 h 到第1 6 h ，在除磷变化曲线中菌株在第2 4 h 除磷效率达到最高，此时为测定除磷 效率最佳时期。本文研究了非营养因素温度、p h 值和溶氧量对菌株g p 4 4 除磷效率影 响，温度在2 0 3 5 的范围内，菌株的生长对除磷的效果变化不是很大，除磷效果最 佳的温度为3 0 c 。在温度为3 0 c 条件下，溶氧量和p h 对菌株g p 4 4 的除磷效果影响较 显著，最佳装液量为1 2 0 m l 2 5 0 m l ，p h 为7 5 时生长状况和除磷效果最佳。营养因素 碳源、氮源和金属离子对菌株g p 4 4 的生长和除磷效果影响的研究表明，最适碳源和 氮源分别为为葡萄糖和酵母膏，除磷效率为5 9 1 2 ；m 矿、k 2 + 和f e 3 + 促进菌株g p 4 4 的生物除磷，但f e 3 + 对菌株的生长有一定抑制作用，m n 2 + 、c d 2 + 、p b 2 + 、c 0 2 + 和z n 2 + 对菌株生长和除磷效果均有抑制作用，其他金属离子对菌株的生长和除磷效果影响不 明显。正交实验获得最佳除磷效果组合为：以废水合成培养基为基础，葡萄糖0 5 9 l - l ， p h 值为7 5 ，装液量为1 2 0 m l 2 5 0 m l 1 ，培养温度为3 0 ，四因素对生物除磷效果影响 的顺序：溶氧l p h 碳源 温度。 菌株g p 4 4 在厌氧好氧循环连续培养时表现出厌氧释磷好氧吸磷的特性，厌氧培 养6 h 释磷量为5 1 9m g l 一，好氧培养1 2 h 吸磷量1 2 3 4m g l 。培养液中的磷浓度对菌 株g p 4 4 放磷和吸磷有一定的调节作用。溶液中磷浓度为0 8 9n a g ，l 1 时，菌株表现为释 放磷，溶液中的磷浓度上升后又呈下降趋势；磷浓度为1 7 8m g l - 1 时，菌株表现为摄 磷，培养液中的磷浓度呈下降趋势；磷浓度为1 7 8 4m g l 1 时，菌株的除磷速度和除 磷率下降。 以城市生活污水为培养基，在厌氧好氧连续2 次循环培养后污水中的磷浓度从 9 6 2m g l 。1 下降为o 8 6m g l - 1 ，达到国家污水排放二级标准。 关键词： 聚磷菌，磷的去除率，发酵条件，除磷机理，实际应用 a b s t r a c t mt h i se x p e r i m e n t , s i x t y - s i xs t r a i n sw e r ei s o l a t e df r o md i f f e r e n ts l u d g e sb yt h e y g m e s aa n d 蜘s t r a i n sw e r ef a s tg r o w i n g a f t e ri n c u b a t i o ni nm o p s g l u c o s ea g a rp l a t e s c o n t a i n i n gp i - l i m i t a i o na n dp i - e x c e s sr e s p e c t i v e l yf o rt w od a y s e l e v e ns w a i n sw e r e f o r m e db l u e c o l o n yo nd i f f e r e n tm e d i u ma n dt h e yw e r ep r i m a r yp a o s e v e ns t r a i n sc o u l d s y n t h e s i z ep h ba n dp o l y pi nt h ea op r o c e s s t h ep h o s p h o r u sc o n c e n t r a i o nr a t eo fs e v e n s t r a i n se x c e e de c o i la f t e r2 4 ha e r o b i ci n c u b a t i o na n dt h eg p 4 4r e a c h e d1 1 9 2 o fi 乜 w e i g h t t h i sa r t i c l ew o u l dd of b r t h e rr e s e a r c ha b o u tg p 4 4 m i c r o s c o p i ce x a m i n a t i o ns h o w e di t ss h a p ew a sb a c i l l i f o r ma n dt h i sb a c t e r i u m a p p e a r e db ys h o r tc h a i n , c a p s u l e ，n of l a g e l l u m ，s p o r e f o r m i n ga n dg r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a t h es i z eo ft h eb a c t e r i aw a s0 7 5 1 a m x 2 2 5 t t r na p p r o x i m a t e l y t h ec o l o n yo fg p 4 4i sr o u n d , s m o o t hm a r g i n , o p a q u e ，m o i s t , e g g - y e l l o wa n df i s h ys m e l l t h e16 sr d n ag e n e so fg p 4 4 a n dk l e b s i e l l at e r r i g e n at y p es t r a i na t c c3 3 2 5 7 t ( a f l 2 9 4 4 2 ) s h o w sah i g hl e v e lo f s i m i l a r i t y ( 9 6 ) a c c o r d i n gt op h e n o t y p i cc h a r a c t e r i s t i c sa n dp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，i tc a n b es u g g e s t e dt h a tt h es t r a i ng p 4 4h a sb e e ni d e n t i f i e da sk t e r r i g e n a s y n t h e s i z e ds e w a g ew a st h eb e s tc u l t u r em e d i u mf o rg p 4 4 l o g a r i t h m i cp h a s ew a s d u r i n gf o u rt os i x t e e nh o u r , t h eh i g he f f i c i e n c yo fp h o s p h o r u sr e m o v a lw a sa tt w e n t y - f o u r h o u r , a n dt h i sw a st h eo p t i m u mt i m ef o rt a s t i n gt h er a t eo fp h o s p h o r u sr e m o v a l i i lt h e t e m p e r a t u r e ，p ha n da e r a t i o ne x p e r i m e n t , t h eb e t t e rt e m p e r a t u r er a n g ew a sf r o m2 0 t o 4 0 c ，a n dt h eb e s tt e m p e r a t u r ew a sa b o u t3 0 s oi n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r ei sn o tl i m i t e d i np r o c e s so fa p p l i c a t i o no fp a ot ow a s t e w a t e r b u tp ha n da e r a t i o nt h a te f f e c t e dg p 4 4o n g r o w t ha n dp h o s p h o r u sr e m o v a lr a t ew e r er e m a r k a b l e t h eo p t i m a lp hv a l u ea n dv o l u m e o fl i q u i dw e r e7 5a n d12 0 m l 2 5 0 m l qr e s p e c t i v e l y h lt h ec a r b o ns o u r c e ，n i t r o g e ns o u r c e a n dm e t a li o nt e s t ，g l u c o s ea n dy e a s te x t r a c tw e r et h eb e s tc a r b o ns o u r c ea n dn i t r o g e n s o u r c ew i t hh i g hp h o s p h o r u sr e m o v a lr a t ea t5 9 12 m d + 、k 2 + a n df e 3 + c o u l ds t i m u l a t e t h ep h o s p h o r u sr e m o v a lr a t eo fg p 4 4 ，b u tf e 3 + h a dr e s t r a i n tt ot h eg r o w t ho fi t m n 2 ， c u 、p b 2 + 、c 0 2 + a n dz n 2 + c o u l dr e s t r a i n e dt h eg r o w t ha n dp h o s p h o r u sr e m o v a lr a t eo f g p 4 4 ，a n dt h ee f f e c tw a sv e r yr e m a r k a b l e t h eo t h e r sw e r en o t o r t h o g o n a le x p e r i m e n t d e t e r m i n e dt h eb e s tc o n d i t i o n ：s y n t h e s i z e ds e w a g ea sb a s i cm e d i u mc u l t u r e ，g l u c o s e 0 5 9 l ，p h 7 5 ，v o l u m eo fl i q u i d1 2 0 m l 2 5 0 m l 1a n dt e m p e r a t u r e3 0 c ，i nt h e s ef o u r f a c t o r s ，a e r a t i o nw a st h em a i ni n f l u e n t i a lf a c t o r t h eo r d e ro fp h o s p h o r u sr e m o v a le f f e c e d i s ：a e r a t i o n p h c a r b o ns o u r c e , t e m p e r a t u r e m s t r a i ng p 4 4s h o w e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so fat y p i c a lp h o s p h a t ea c c u m u l a t i n go r g a n i s m a si td i s p l a y e da p p a r e n tp h o s p h o r u sa c c u m u l a t e da n dr e l e a s e di nt h ea op r o c e s s i t s r e l e a s ep h o s p h o r u sw a s5 1 9 m g l 1 w h i t hg r o w t hi na n a e r o b i cc u l t u r ef o rs i xh o u r s ，a n d a c c u m u l a t e dp h o s p h o r u sw a sl2 3 4 m g l i na e r o b i cc u l t u r ef o rt w e l v eh o u r s t h e p h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o no fm e d i u mr e g u l a t eg p 4 4t or e l e a s eo ra c c u m u l a t ep h o s p h o r u s t oac e r t a i ne x t e n t g p 4 4r e l e a s e dp h o s p h o r u si nt h ep h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o no f 0 8 9 r a g l 一，a c c u m u l a t e dp h o s p h o r u si np h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o n so f1 7 8m g l 1 ，a n dt h e p h o s p h o r u sr e m o v a ls p e e da n dr a t ew e r es l o w l yi np h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o no f17 8 4 m g l - 1 t h ep h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o ni nw a s t e w a t e ro f9 6 2n a g l 1 t oo 8 6m g l - 1i nt h ea o p r o c e s st w i c eb yt h em u n i c i p a lw a s t e w a t e rm e d i u m t h ep h o s p h o r u sc o n c e n t r a t i o ni n w a s t e w a t e ri st ot h et w i c eo fi n t e g r a t e dw a s t e w a t e rd i s c h a r g es t a n d a r d k e yw o r d s ：p o l y p h o s p h a t e a c c u m u l a t i n go r g a n i s m s ( p a o ) ，p h o s p h o r u sr e m o v a lr a t e ， f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n , t h em e c h a n i s mo f p h o s p h o r n sr e m o v a l ，p r a c t i c a la p p l i c a t i o n i v 缩写 d b p p a o 心o a 2 | o 改进 p h o s t r i p 改良 b a r d e n p h o m u c t c a s t s b r e b p r b c f s d g g e f i s h p h a p h b p o l y p p p k p p x d a p i x p i m o p s t r i c i n e 中文名 反硝化聚磷菌 缩略词 好氧聚磷菌 缺氧好氧污水处理工艺 厌氧缺氧好氧脱氮除磷工 梦 乙 a 2 o 与侧流化学除磷工艺 改进p h o s t r i p 与除氮工艺 改进的a 2 o 脱氮除磷工艺 英文名 d e n i t r i f i c a t i o np h o s p h o r u sr e m o v a l b a c t e r i a p h o s p h o r u sa c c u m u l a t i n go r g a n i s m a n o x i c o x i cp r o c e s s a 2 oa n ds i d es t r e a mp h o s p h o r u s r e m o v a lp r o c e s s b a r d e n p h od e n i t r i f i c a t i o nt e c h n i q u e 娩| oa n dd e n i t r i f i c a t i o np r o c e s s 循环式活性污泥法 c y c l i ca c t i a v a t e ds l u d g es y s t e m 序列间歇式活性污泥法 强化生物除磷工艺 缺氧生物脱氮除磷工艺 用变性梯度凝胶电泳 荧光原位杂交技术 聚烃基链烷酸酯 聚p 羟基丁酸盐 多聚磷酸盐 碱性p o l y p 激酶 p o l y p 水解酶 4 ，6 二脒基2 苯基吲哚 5 溴4 一氯3 吲哚氧基磷酸 钠盐 3 一( n - 吗啉代) 一2 羟基丙磺酸 - - ( 羟甲基甲) 基甘氨酸 v s e q u e n c i n gb a r c hr e a c t o ra c t i v a t e d s l u d g ep r o c e s s e n h a n c e db i o l o g i c a lp h o s p h o r u s r e m o v a l b i o l o g i s c h c h e m i s c h e f o s f a a t - s t i k s t o f v e r w i j d e r i n g d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c r o p h o r e s i s f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n p o l yh y d r o x y a l k a n o a t e p o l y pk i n a s e e x o p o l y h o s p h a t a s e s 4 ，6 一d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y - p h o s p h a t e 3 - ( n m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c a c i d h i - t r i s ( h y d r o x y r n e t h y l ) m e t h y l g l y c i n e 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安 徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表 示了谢意。 研究生签名： i 星 时间：z ，罗年月莎e l 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文 件，允许论文被查阅和借阅。本人授权安徽农业大学可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文( 保密的学位论文在解密后适用本授权 书) 。 学位论文作者签名：幽z 乞 签字e i 簸j ；g - l r 海汨孑日 指导教师签名：世 签字日期：神年l 月扩e l 文献综述 聚磷菌是一类能够超出自身生理需要，可以过量的从外界吸收可溶性磷酸盐的 微生物。1 9 9 3 年荷兰d e l f t 大学的k u b a 毛e 试验中首次发现一些细菌在缺氧的环境下能 够从环境中超量吸收大量的磷，后来定义为反硝化聚磷菌( d b p d e n i t r i f i c a t i o n p h o s p h o r u sr e m o v a lb a e t e r i a ) 。随后又发现有些细菌在好氧的条件下也能够吸收大量的 磷，被定义为好氧聚磷菌( p a o - p h o s p h o r u sa c c u m u l a t i n go r g a n i s m ) 。随着研究的深入， 发现不动杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属等具有超量吸收水中磷的能力，并认为不 动杆菌属是磷的主要吸收者。尽管在活性污泥的许多菌体内都发现有多磷酸盐，但是 能被分离、培养和鉴定的聚磷菌却很少【l 】。因此，了解污水处理系统中活污泥的微生 物组成，探索不同微生物的磷代谢生理特性及生化机理，对于提高污泥处理效率尤为 重要。 关于生物除磷的机理和除磷的工艺研究，已经有较长的时间。但在很长的时期内， 主要集中生物除磷工艺的研究方面，例如a o 、p h o s t r i p 、a 2 o 、改i 曼b a r d e n p h o 、m u c t 、 c a s t 、s b r 、e b p r 、氧化沟以及具有反硝化功能的b c f s 工艺等，这些工艺各有特 点和不足，其中e b p r ( e n h a n c e db i o l o g i c a lp h o s p h o r u sr e m o v a l ，e b p r ) 工艺在理论研 究和工程应用方面取得较大的进展。在生物除磷工艺不断研究的过程中，人们也逐 步开始对生物除磷的机理进行了探讨。主要集中在分离纯化高效聚磷菌并对其进行聚 磷特性的研究；利用基因工程方法和技术研究有关聚磷基因；用变性梯度凝胶电泳 ( d o g e ) 和荧光原位杂交技术口i s h ) 等分子手段研究生物除磷工艺系统的微生物种群 结构变化。这些研究为聚磷菌在污水除磷中的应用奠定了重要的理论基础，也在很大 程度上补充了聚磷机理研究的空白。 l 我国磷污染的现状与危害 表l2 0 0 6 年度三湖湖体主要污染指标和营养状态 t a blp o l l u t i v ei n d e x e sa n dn u t r i t i o n a ls t a t u so f t h r e el a k e si n2 0 0 6 水是人类环境的重要组成部分，也是人类生存和国民经济建设的生命线，随着我 国工农业的不断发展和人类对水资源过分的使用，水资源已经遭受了多种污染物的污 染。水体富营养化过程通常是多种因子共同作用的结果，然而在诸多因素中必有一种 或几种因素的变化起主导作用的【2 】。在所有的营养元素中磷被认为是弓i 起水体富营养 化的最关键因素1 3 。国外通常将总磷浓度超过0 0 2n a g l d 作为富营养化水质标准。我 国在2 0 0 2 年实施的地面水环境质量标准规定总磷浓度超过0 2m g l 1 作为富营养化水 质【4 】。 2 0 0 6 年，2 7 个国控重点湖( 库) 中，类水质以上的湖( 库) 8 个，占2 9 ，而 v 类水质的湖( 库) 5 个，占1 9 ，劣v 类水质的湖( 库) 1 3 个，占4 8 。其中，巢 湖水质为v 类，太湖和滇池为劣v 类。主要污染指标为总氮和总磷见表1 【5 】o2 0 0 6 年， 巢湖西半湖处于中度富营养状态，水质为v 类，含磷量0 1 9n a g l - l ；东半湖处于轻 度富营养状态，水质为v 类，含磷量0 1l m g l 1 。虽然在2 0 0 6 年加大了对巢湖治理 的力度，但是由于技术与实际应用有一定的差距，水质依然没有明显的改善。 过量的磷导致水体富营养化【3 】。按藻类对氮、磷需要的关系论，磷的需要更为重 要，藻类的生长量受磷的限制更为明显。水体中的磷作为营养性物质，含量较高时会 形成富营养化，产生大量水生植物，覆盖水面，使水环境含氧量急剧减少，造成藻类 迅速繁殖，水体中溶解氧浓度下降，透明度降低，变黑、变臭，水生动物无法生存， 致使水生动植物死亡，破坏了水体生态平衡，过量的磷会引起藻类孳生，部分藻类还 能够分泌毒素危害人类的健康，这些都增加了水处理的技术难度，加大了水治理的费 用。湖泊富营养化也对地方的养殖业和旅游业产生一定的影响，治理湖泊富营养化的 技术中，降低水体中含磷量是治理湖泊富营养化的重要任务之一。 2 生物除磷与聚磷菌 生物除磷是一项新型的污水处理技术，是利用某些生物( 微型藻类、水生植物和 微生物) 具有超量吸收水中磷的能力，通过改变这些生物的生存环境，使得它们在生 态系统中取得优势，进而达到降低水中磷含量的目的。但是，目前生物除磷技术主要 是指利用活性污泥超量吸收磷，即微生物吸收的磷量超过微生物正常生长所需要的磷 量，通过污水生物处理系统的设计改进或运行方式的改变，使含磷量高的菌群能在处 理系统的中占据优势【6 】。从二十世纪六十年代初，人们已对生物除磷工艺进行了广泛 的研究，开发了不同类型的生物除磷工艺。这些生物除磷工艺在污水处理中发挥了巨 大的作用，为治理水体富营养化提供了一条环保和经济途径。但是，这些生物除磷工 艺在实际应用中并没有达到人们预计的那种效果，主要原因一是对生物除磷机理尚不 清楚，二是对究竟是哪些种群的生物负责污水处理系统的聚磷功能尚不完全了解，三 是筛选到的聚磷菌较少，而且这些聚磷菌在除磷工艺中尚不能表现出厌氧放磷好氧聚 磷的特点。 2 1 好氧聚磷菌( p a o ) 的聚磷机理 到目前为止，国际上普遍认可和接受的生物除磷理论是好氧聚磷菌在厌氧条件下 释放磷，好氧条件下摄取磷的原理。1 9 8 7 年，m i n o1 7 1 提出内源糖通过e m p 途径降解， 获得的能量用来吸收醋酸以合成p l - m ( 聚8 羟基丁酸盐) ，聚磷菌在厌氧段降解内源 2 糖的反应式为： c h 2 0 + 0 0 8 3 c 6 h 1 0 0 5 ( c h 卜0 4 4 h p 0 3 厶+ o 0 2 3 h 2 0 1 3 3 c h l 5 0o 。5 ( p h b 卜0 1 7 c 0 2 + 0 4 4 h 3 p 0 4 在厌氧条件下，聚磷菌合成p h b 所需的还原力来自于葡萄糖的代谢。葡萄糖经 e m p 或e d 途径氧化为丙酮酸，为乙酸转化为乙酰辅酶a 的反应提供一些a t p ，为p h b 合成提供部分还原力。丙酮酸反过来通过氧化脱羧基转化为乙酰辅酶a 和c 0 2 ，所释 放的电子也用于p h b 的合成。因此所有被吸收的乙酸及部分来自糖原的碳源都以p h b 形式储存起来。但是在该阶段p a o s 处于压抑状态，可将贮积在菌体内的聚磷酸盐分 解。在此过程中释放出的能量可供聚磷菌在厌氧环境下存活之用；另一部分能量可供 聚磷菌主动吸收乙酸、矿和e - ，使之p h b 的形式贮存在菌体内，并使发酵产酸过程得 以继续进行。聚磷酸盐分解后的无机磷酸盐释放至溶液中，此即观察到的聚磷菌厌氧 释磷现象。 研究发现，厌氧阶段释磷越多，好氧阶段摄磷越多，除磷效果越好【8 】。在好氧阶 段，好氧聚磷菌以氧为最终电子受体，分解储存的p h b 和外源基质以提供能量供细胞 生长、繁殖，同时一部分能量可供聚磷菌主动吸收溶解态的正磷酸盐，并在聚磷菌细 胞内合成多聚磷酸盐并加以积累。这种对磷积累的作用大大超过了聚磷菌生长所需要 的磷。生物除磷技术的关键在于厌氧阶段p h b 的合成，在厌氧阶段合成的p h b 量对于 好氧阶段摄取磷具有决定性意义 9 1 。 2 2 反硝化聚磷菌( d p b ) 的聚磷机理 自1 9 9 3 年k u b a 在污水处理系统中发现了一类具有反硝化能力的聚磷菌以来，许 多研究学者已经开始对这类细菌除磷机理进行了研究【1 0 1 。反硝化聚磷菌在硝酸盐存在 时能够利用其中的硝酸盐为最终电子受体，分解细胞内储存的有机物产生的能量摄取 水中大量的磷。研究证明，d p b 被证明具有同p a o 相似的除磷原理。主要的不同在于 d p b 在缺氧的条件下能够利用硝态氮为电子受体氧化细胞内储存的p h a ，然后以氮分 子的形式从废水中排除，同时从环境中的吸收大量的磷，合成多聚磷酸盐，在生物摄 磷的同时，硝酸氮被还原为氮气，引起水体富营养化的氮、磷两大主要元素都被去除。 另一个好处是摄磷在缺氧区完成可缩小曝气区的体积和降低活性污泥量。但是，由于 以硝基氮为电子受体时聚磷菌对有机物( p h a ) 利用率较低。所以吸磷的速率和数量均 不如以氧为电子受体的系统。反硝化聚磷菌研究主要在理论上的研究，在实际污水除 磷应用还需要进一步的研究。 2 3 多聚磷酸盐( p o l y p ) 的研究 生物除磷的主要原理是利用聚磷菌在污水中对磷的释放和吸收过程，对聚磷菌本 身而言，是多聚磷酸盐的分解和合成的过程。长期以来，由于缺乏灵敏的、准确的和 易操做的分析方法来测定p o l y p 在生物体内的浓度，所以对p o l y p 的研究被忽视。2 0 世 纪8 0 年代后，高效液相色谱、核磁共振波谱和酶分析法等检测细胞i 为p o l y p 的方法的 建立【l ，方开始了多聚磷酸盐的研究，如2 0 0 3 年，s h o t a r o 等在迂回螺菌中发现多聚 磷酸盐，并证明多聚磷酸盐是几十或者几百个正磷酸盐的的线型聚合物【1 2 1 。2 0 0 5 年， 任世英等对影响菌体内多聚磷酸盐形成的不同条件、菌体内多聚磷酸盐的形成与菌体 生长之间的关系进行了研究【l 引。 p o l y p 是i 主i p o l y p 激酶( p o l y pr i n s e ，p p k ) 合成的。p p k 催化a 1 p 的末端磷酸盐可逆 地转移到长链聚磷酸盐上，形成长度可达1 0 0 0 个磷酸盐，甚至更长的磷酸盐的线性聚 合体。p p k 在有过量a d p 存在时，它可反向作用形成a t p ，也可利用g t p 代替a t p 形 成p o l y p ，但g t p 的效率仅为a t p 效率的5 。1 9 9 7 年，l o o s d r e c h t 报道，已经从多种微 生物中获得编码p p k 的基因，并把它克隆出来【1 4 1 。 p o l y p 的聚合与解聚，即是p p 姘多聚磷酸盐水解酶( e x o p o l y h o s p h a t a s e s ，p p x ) 酶 活性强弱决定的，这两种酶的活性强弱受细胞生长的碳源和磷酸盐水平变化调控。研 究表明，在碳源丰富的条件下生长时，p o l y p 积累，在碳源缺乏的条件下生长时，p o l y p 降解；p p k 酶活性只是在有过量磷酸盐加入时才有提高，而p p x 酶活性则在磷饥饿条 件下迅速增加【l j 。 随着对聚磷菌的生理生化特性不断深入的研究，发现菌体内的多聚物使聚磷菌对 基质有竞争优势。一般采用染色法对聚磷菌中的内聚物进行种类鉴定，对聚b 羟基 丁酸常采用苏丹黑染色鉴定【1 5 1 。对多聚磷酸盐的染色鉴定常采用吕氏美蓝染色法、 a l b e r t 染色法和d a p i ( 4 6 d i a m i d i n o 2 - p h e n y l i n d o l e ) 染色法【1 6 】；r e e s 等描述了在同一茵 体中两种颗粒( 聚b 羟基丁酸和多磷酸盐颗粒) 的染色，采用尼罗兰和亚甲基蓝结合 染色【1 1 】，也有人把d a p i 染色、苏丹黑染色与荧光原位杂交相结合观察同一菌体中两种 颗粒。 3 聚磷菌的分离与筛选技术的研究 虽然用分子生物学技术了解到p a o 的生物多样性，并且可以监测p a o 种群的变 化，但是分离纯化出来的聚磷菌较少，使深入研究除磷工艺过程中微生物学和生物化 学的机制受到限制。如何筛选聚磷菌，如何在厌氧好氧条件培养聚磷菌是目前研究 聚磷菌重要任务之一。m u y i m a 认为，缺乏合适的培养基是聚磷菌难以分离培养的主 要原因旧。1 9 9 9 年s i d a t 等利用传统培养技术从活性污泥混合液体中分离出了8 0 种细 菌，其中1 7 种具有聚磷能力的细菌【l 引。m a s z e n a n 等人从活性污泥中分离出了属于一 种新属( t e t r a s p h a e r a ) 的两个新p a o s 种( t e t r a s p h a e r aj a p o n i c a 和t e t r a s p h a e r a a u s t r a l i e n s i s ) 1 9 】。2 0 0 2 年h a n a d a 等从活性污泥中分离得到一种具有较高聚磷能力的细 菌【2 0 】。2 0 0 5 年刘亚南等从运行稳定的以生活污水为碳源的污泥中经过7 次富集、1 2 次 分离及纯化，并将获得各菌株接种到简易生物除磷装置中测定其在实际生活污水处理 除磷能力，才筛选出一株聚磷能力较强的细菌p a o 1 2 1 1 。2 0 0 7 年任世英从海水中富集 4 培养，分离纯化单个菌株，以内聚物的含量鉴定为标准，分离筛选出了一株属于盐单 胞菌属鼢阴d 嬲) 的变种【1 3 】。 传统聚磷菌分离筛选技术没有定性的选择培养，工作量大，操作繁琐，效率差。 该方法从活性污泥中分离纯化单个菌株，然后对其进行厌氧好氧连续培养，测定各菌 株的除磷效率。 选择合适的筛选培养基是筛选聚磷菌的关键因素。随着对聚磷菌的聚磷机理的不 断认识，2 0 0 2 年m o r o h o s h l 提出蓝自斑筛选技术，该筛选技术根据聚磷菌产生碱性磷 酸激酶催化可溶性磷酸盐合成聚磷酸盐阎。聚磷酸盐的合成与碱性磷酸激酶活性有着 密切的关系，碱性磷酸激酶的活性与细胞生长的碳源和磷酸盐的水平变化有关。研究 表明在碳源丰富和磷酸盐过量的条件下，碱性磷酸激酶的活性提高。不同的菌种在过 磷和限磷的葡萄糖m o p s 培养基中生长时表达碱性磷酸激酶对x p i ( 5 b r o m o - 4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y - p h o s p h a t e ) 分解情况不同而产生不同色斑，聚磷菌在过磷和限 磷的培养基中都产生蓝斑，同时聚磷菌的聚磷能力还与其在厌氧条件下的聚p h b 的能 力有关，因此，在过磷和限磷培养时均呈蓝斑的，不一定聚磷能力就强。2 0 0 5 年，蔡 天明等人利用蓝白斑的筛选、聚磷酸盐染色的鉴定和好氧培养测菌体聚磷能力三种方 法来筛选高效聚磷菌费氏柠檬酸杆菌和恶臭假单胞菌，这种定性与定量相结合的方 法，提高了筛选方法的科学性和准确性。聚磷菌的筛选技术是生物除磷技术改进和发 展的基础，高效聚磷菌的分离筛选技术还需要进一步的发展】刚。 4 聚磷菌的聚磷特性的研究 4 1 溶解氧( d o ) 控制生物除磷工艺中厌氧段( e p 释磷区) 的厌氧条件极为重要，它直接影响聚磷菌 的生长、释磷能力和利用有机基质合成p h b 的能力。杭世郡等报道，在除磷系统中， 厌氧段的溶解氧应控制在0 2 m g l 1 以下好氧段的溶解氧应控制在1 5 2 5 m g l d 瞄】。 在厌氧阶段，溶解氧将作为最终电子受体而抑制厌氧菌的发酵产酸作用，阻碍聚磷菌 利用有机酸合成p h b 产生量，达不到好的除磷效果，所以厌氧阶段必须严格控制溶氧 量。在好氧阶段，要有足够的溶解氧满足聚磷菌对储存的p i - - 1 b 进行分解，获得足够的 能量摄取过量的磷，从而有效的吸收污水中的磷。 4 2 有效有机物 有效有机物对聚磷菌聚磷能力的影响主要取决于有机物的类型。不同的有机物为 基质时，磷的厌氧释放和好氧摄取是不同的。分子量较小的易降解有机物如低级脂肪 酸类物质易于被聚磷菌利用，其诱导磷释放的能力较强，而高分子难降解的有机物诱 导释磷的能力较弱 2 6 1 。另外，聚磷菌在厌氧阶段降解聚磷酸盐所产生的能量主要用于 其吸收进水中低分子有机基质合成p h b 储存在体内，以作为其在厌氧压抑环境下生存 的基础。因此，进水中是否含有足够的有机基质提供给聚磷菌合成p h b ，是关系到聚 5 磷菌在厌氧条件下能否顺利生存的重要因素。王锐萍等发现黄腐酸作为有机质可以提 高聚磷菌的聚磷能力 2 7 1 。 4 3 厌氧区硝态氮 厌氧区的硝态氮的存在，会引起反硝化菌和聚磷菌竞争有机基质而抑制聚磷菌对 磷的释放，从而影响好氧条件下聚磷菌对磷的吸收，降低除磷效果。硝态氮的存在可 能被部分聚磷菌( 气单胞菌) 作为电子受体进行反硝化，从而影响其以发酵中间产物作 为电子受体进行发酵产酸，进而抑制了聚磷菌的放磷能力以及p h b 的合成能力。另外 硝态氮还会使氧化还原电位升高，阻止聚磷茵在厌氧阶段对磷的释放。s i e b r i t z 等的实 验表明，厌氧阶段硝酸盐的存在限制甚至终止磷的释放【2 8 】。 4 4 污泥龄 由于生物除磷系统主要是通过排除剩余污泥去除磷的，所以污泥龄的长短对污泥 的摄磷作用及剩余污泥的排放量有着直接的影响。通常认为，污泥龄较长时聚磷菌吸 磷和放磷的能力下降且污泥的含磷率也会下降，除磷效果也会相应降低；污泥龄较短 时，聚磷菌活性较高，除磷效果较好 2 9 1 。如果泥龄过长，会出现聚糖菌，从而和聚磷 菌竞争碳源，破坏除磷生物体系；如果泥龄过短，会使系统中的聚磷菌被淘汰，因为 聚磷菌生长相对较慢，需要足够长的时间才能使聚磷菌生长达到较高数量。 4 5 初始p h 值 研究证明，生物除磷的适宜p h 值大致范围是6 5 - - 8 0 。徐乐中认为，生物除磷要 求厌氧区存在有机酸，p h 值宜小于等于7 0 ，当p h 值低于6 0 时，聚磷菌生长极为缓慢， 当p h 值大于8 0 时，磷的释放率增n 1 3 0 l 。好氧区p h 值对聚磷菌摄磷影响的研究还没有 报道。另外生物体内所有代谢过程都受酶的控制，这些酶的催化反应均依赖p h 值。 4 6 培养温度 温度对除磷系统中的聚磷菌有着较大影响，对任一种微生物都有一个最适生长温 度。温度影响磷的释放速率，在厌氧阶段，磷的释放速率随温度升高而变大。聚磷菌 在低温时生长的速率会减慢，在厌氧阶段要停留时间要更长一些以保证发酵作用的 完成和基质的吸收。但温度对温度对生物除磷影响较小，因为在高温、中温、低温条 件下，不同的菌群都具有生物除磷的能力。研究表明，在5 - 3 0 的范围内，均可以 得到良好的除磷效果m j 。 4 7 重金属离子 采用生物法处理污水的过程中，微量重金属是微生物生命活动所需营养物质，是 酶的活化剂或活性基。处理工业废水与城市废水，污水中重金属含量偏高，会对聚磷 菌引起毒害作用。当重金属进入生物体内时与体内的大分子结合，使生物体丧失原来 的活性，甚至死亡【3 2 。多种金属离子都能影响到碱性磷酸激酶的活性。对金属离子对 聚磷菌酶的活性影响研究还没有报道。谢曙光等对重金属离子对聚磷菌的聚磷能力的 6 研究，c u 2 + 对聚磷菌对磷的释放和吸收都有抑制作用及c u 2 + 和z n 2 + 同时影响聚磷菌表 现为协同作用，而cu ：2 + 和p b 2 + 表现为拮抗作用【3 3 】。 5 聚磷菌应用前景 5 1 聚磷菌在污水处理方面的应用 所有的污水除磷工艺都包含有两个必要的过程，首先将溶解性磷( 磷酸盐) 物质转 化为不溶性悬浮( 颗粒) 性状态，然后通过固液分离将磷从污水中除去。生物除磷工艺 是目前相对经济的方法，也是研究的热点。2 0 世纪6 0 年代s r i n a t h 等人于1 9 5 9 年首次 提及污水生物除磷现象以来，各国科学家对生物除磷机理进行了长n o 余年的摸索研 究刚。研究学者往往以实际污水处理工艺为主要研究对象，通过基础性研究、生产性 实验研究以及工程运行实践，