（微生物学专业论文）真菌疏水蛋白hfbi小试发酵和分离纯化的研究.pdf

南开大学硕士研究生毕业( 学位) 论文中文摘要 中文摘要 真菌疏水蛋白( f u n g a lh y d r o p h o b i n ) 是一类分泌性的具中等疏水性的小分子 结构蛋白。疏水蛋白在结构上具有八个位置相对保守的半胱氨酸残基和大量的疏 水氨基酸，其性质特点是遇到亲水疏水界面会自我装配成两亲性薄膜。疏水蛋 白对丝状真菌的生长和发育过程起重要作用并具有潜在的应用前景。本论文以瑞 氏木霉疏水蛋白h f b i 为模式研究了小试规模的疏水蛋白生产技术并成功地获得 了一整套h f b i 小试发酵技术。本论文还针对h f b i 的分离纯化方法进行了深入 的探讨。使用补料技术在3 0 l 全自动发酵罐发酵瑞氏木霉高产工程菌株n q m 3 共7 1 小时，放罐体积1 8 2 l ，生物量1 7 3 9 l ，菌丝体h f b i 含量5 0 8 4m e d l 。 纯化使用组合工艺：s d s 法、a t p s 法和层析法联用，计算头两步纯化总收率为 5 0 。小试的成功为中试和应用奠定了坚实的基础。 关键词：真菌疏水蛋白瑞氏木霉h f b i 小试生产 南开大学硕士毕业( 学位) 论文a b s t r a c l a b s t r a c t f t m g a lh y d r o p h o b i n sa r es m a l l ，s e c r e t e d ，m o d e r a t e l yh y d r o p h o b i cs t r u c t u r a l p r o t e i n s ，w h i c ha r ec h a r a c t e r i z e db yt h ep r e s e n c eo fe i g h tc o n s e r v e dc y s t e i n er e s i d u e s a n dh a v eas p e c i a lp r o p e r t yt os e l f - a s s e m b l ea t h y d r o p h i l i c h y d r o p h o b i ci n t e r f a c e s i n t oah i g h l ya m p h i p a t h i cf i l m h y d r o p h o b i n sp l a yar o l ei nab r o a dr a n g eo f p r o c e s s e si nt h eg r o w x ha n dd e v e l o p m e n to ff i l a m e n t o u sf u n g i ，a n dh a v ep u t a t i v e a p p l i c a t i o n s i nt h i st h e s i s ，i ti sr e p o r t e dt h a tas m a l l s c a l ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i o n p r o c e s so ft h eh y d r o p h o b i nh f b io ft r i c h o d e r m ar e e s e iw a ss t u d i e da n das e r i e so f s m a l l s c a l ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i o nt e c h n i q u e so fh f b lw a s d e v e l o p e ds u c c e s s f u l l y t h em e t h o d s o f p u r i f i c a t i o no f t h eh y d r o p h o b i nh f b lw a sa l s os t u d i e di nt h i st h e s i s af e d - - b a t c hf e r m e n t a t i o no fh f b i - - o v e r p r o d u c i n gt r i c h o d e r m ar e e s e in q m 3w a s p e r f o r m e df o r7 lh o u r sb ya3 0 一la u t o m a t i c f e r m e n t o ra n da tt h ee n do ft h e f e r m e n t a t i o n ，1 8 2lo f t o t a lv o l u m e ，1 7 3 9g lo f b i o m a s sa n d5 0 8 4m g lo f h f b i i nm y c e l i u mw e r eo b t a i n e d a c o m b i n a t i o no fp u r i f i c a t i o n t e c h n i q u e si n c l u d i n g s d s e x t r a c t i o n ，a t p ss e p a r a t i o na n dc h r o m a t o g r a p h yw a ss t u d i e d t h e5 0 o ft o t a l y i e l dw a sa c h i e v e di ft h ef i r s tt w os t e p so fp u r i f i c a t i o nw e r ec a l c a u l a t e d t h e a c h i e v e m e n to fs m a l l s c a l e - p r o d u c t i o no fh f b ip a v e saw a yf o r l a r g e r s c a l e p r o d u c t i o na n da p p l i c a t i o no f h y d r o p h o b i n s k e y w o r d s ：f u n g a lh y d r o p h o b i n ，t r i c h o d e r m ar e e s e i ，h f b i ，s m a l l s c a l e - p r o d u c t i o n 2 南开大学硕七毕业( 学位) 论文 第一部分绪沧 第一部分绪论 1 真菌疏水蛋白综述 1 1 真菌疏水蛋白的特性 疏水蛋白( h y d r o p h o b i n ) l 是高等丝状真菌在特定发育阶段大量分泌的一 类特殊的小型结构蛋白。这类蛋白具有两大特性：( 1 ) 氨基酸序列差别很大，但 都保留有八个位置相对保守的半胱氨酸残基、前体的n 段都有指导分泌到细胞 外的信号肽和极多的疏水性氨基酸。氨基酸序列的水缘性图谱也很相似。成熟蛋 白的结构通式见图1 。( 2 ) 分泌到绌胞外的疏水蛋白在亲水一疏水界面自我装配成 约1 0 h m 厚的两亲性薄膜，这层薄膜的形成不需要其它物质的协助并且性质很稳 定队5 1 。 有关疏水蛋白在细胞内肽链折叠和构象变化的研究不多。成熟的疏水蛋白在 细胞外具有三种状态：游离单体、可溶性多聚体和界面自组装的多聚体膜【“。关 于疏水蛋白的三维结构所知不多。x 射线的核磁共振研究表明s c 3 的时露糖残 基暴露在装配好的s c 3 膜的亲水丽【7 j 。有证据显示二聚体s c 3 是溶液中聚合和 亲水一疏水界面自我组装的起始元件【7 8 】。当前三维结构测定疏水蛋白只有唯一的 一个：h f b i i ，见图2 。其组成显示，蛋白表面基本亲水，为一个a 一螺旋的紧密 单环和包裹两个二硫健四个反向平行的0 一链，b 一发夹环含有几个保守的脂肪族 侧链，形成扁平的疏水碎片 9 】。疏水蛋白单体稳定性很差。容易被蛋白酶降解和 在高p h 下脱酰胺。有趣的是，发现s d s 可以抑制蛋白酶对h f b 的降解。另外， 发现疏水蛋白非常耐热 1 0 】。疏水蛋白在水中和6 0 乙醇中的浴解很高。如疏水 蛋白s c 3 单体在8 0 。c 以下加热聚合不明显，在液氮和一2 0 形成不多的多聚物， 室温下超滤聚合不明显，可溶于水，2 s d s ，6 0 乙醇，0 5 0 丙酮， o 6 0 乙腈；在5 0 乙醇振荡无聚合，在纯水中振荡立即聚合d 1 。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第一部分绪论 1 2 真菌疏水蛋白的种类和分布 图2 h f b l l 分子的三维结构。黄色为 二硫键，紫色为0 一折叠结构，蓝色为0 - 螺旋结构吼 f i g2s 仃u c t u r eo f t t f b i i ns t e r e o 根据在水缘性图谱和性质差异，可以把疏水蛋白分为i 型和型【l ”。在i 型疏水蛋白中紧接着半胱氨酸双联体( c y s 2 一c y s 3 和c y s 6 一c y s 7 ) 之后的是亲水 性氨基酸的延伸，而在i i 型疏水蛋白中则在半胱氨酸双联体之后直接地与疏水 性氨基酸相连。另外，与i i 型疏水蛋白的相比较，在i 型疏水蛋白中分开第3 和 第4 个半胱氨酸残基的氨基酸数目要少些( 见图3 ) d 2 i 。迄今为l 仁，仅在子囊菌 中发现i i 型疏水蛋白；而i 型疏水蛋白在子囊菌和担子菌都有发现。 i 型疏水蛋白形成的膜是高度不溶的，热s d s 不能使其解聚，仅能在如甲酸 和三氟乙酸之类的极端试剂中离解。相比，i i 型疏水蛋白形成的聚合物的稳定性 图3 推测的i 型疏水蛋白s c 3 和i i 型疏水蛋白c u 的二硫键结合方式。 f i g 3p u t a t i v ep r i m a r ys t r u c t u r eo f h y d r o p h o b i n sc l a s si ：s c 3a n dc l a s si i ：c u ( s c 3 的二硫键组成模式假设同c u ) 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第一部分绪论 稍差。如c u 和c r p 的聚合物能被6 0 乙醇和2 s d s 离解，而且装配好的 c u 存受压和冷却中也能离解。最具典型特征的i 型疏水蛋白是裂褶菌的s c 3 i i 8 】， 而i i 型疏水蛋白的代表是c u t l 3 】牙口h f b i l 。 根据n c b i 的蛋白质数据库索引疏水蛋白“h y d r o p h o b i n ”所获得的2 2 6 条序 列，并参考公开的文献，经整理认为到目前( 二o o 四年五月十五日) 为止，共 在约3 1 种真菌中发现约6 8 种疏水蛋白( 见表1 ) 。将这些序列用软件a n t h e p r o t v 6 0 和c l u s t a l w 进行多序列比较，比较结果用软件t r e e v i e w v l 6 6 绘出进化树 ( 见图4 ) 。从进化树图上可以看出i i 型疏水蛋白都集中在一个进化分支上，并 且都属于子囊菌类。i 型疏水蛋白分布在子囊菌和担子菌类。疏水蛋白序列在低 等真菌还未见报道。很明显，从进化的分支看，现有的疏水蛋白序列仅分成i 和 i i 型是不够的，还应该分成3 到4 个类型恤”j 。 表1 已发现的6 8 个疏水蛋白。 t a b 1a l l6 8h y d r o p h o b i n sf o u n d ( a c c o r d i n gt os t a t i s t i co nm a y1 5 t h , 2 0 0 4 ) 蛋白名称菌种 数据库索引号( g i l ) a a p r i 2 p a g r o c v b ea e g e r i t a 5 2 5 6 9 6 9 a b a b h 3 a g a r 七u sb i s p o r u s 2 3 4 2 5 5 91 2 6 4 3 5 3 5 9 7 9 6 0 2 09 7 9 6 0 1 8 2 3 4 2 5 5 7 a b h y p a a g a r i c u sb i s p o r u s 1 3 4 6 3 3 32 1 3 3 3 7 0 3 7 1 4 2 3 4 3 7 1 4 2 3 2 3 7 1 4 2 2 6 3 7 1 4 2 2 411 2 2 7 5 41 2 3 5 7 5 4 9 4 4 8 2 1 a b - h y p b a g a r i c u sb i s p o r u s 1 2 2 3 0 1 3 02 7 0 6 5 5 32 7 0 6 5 5 13 7 1 4 2 3 6 3 7 1 4 2 3 0 3 7 1 4 2 2 8 a b - h y p c a g a r i c u sb i s p o r u s 2 】3 3 3 7 11 7 0 8 3 7 91 2 3 5 7 5 5 a f - h y p la s p e r g i l l u sf u m i g a 抛 1 9 5 7 7 3 9 i a f r o d a a s p e r g i t l u sf u m i g a t u s 1 1 7 3 1 2 05 5 1 4 6 9 ，5 7 7 6 6 6 a f r o d b pa s p e r e i l t u s 向m i g a t u s 2 7 4 6 1 0 6 3 a n d e r a a s p e r g i l l u sn i d u l a n s 4 0 7 3 9 6 1 92 1 3 3 2 7 61 7 0 6 3 6 75 3 3 4 2 5 e m e r i c e l l an i d u l a n s a n r o d a a s p e r g i h u sn i d u l a n s 1 3 3 2 6 4 e m e r i c e l l an i d u l a n s a o h y p aa s p e r g i l l u so r y z a e 31 3 7 6 2 6 32 8 8 7 5 5 2 9 a o - h y p b a s p e r g i l l u so r v z a e 3 1 3 7 6 2 6 5 c c c o h l c o p r i n o p s i sc i n e r e a 1 8 0 5 6 9 1 ( c o p r i n u sc i n e r e u s ) c c - c o h 2 c o p r i n o p s i sc i n e r e a 1 8 4 3 4 3 8 ( c o p r i n u sc i n e r e u s ) c f c f t h l c l a v i c e p s 乔i f o r m i s 2 5 0 9 1 4 2 16 4 4 8 5 0 4 c f h c f 1 c l a d o s p o r i u m 加l v u m 1 7 2 9 7 5 2 c f h c f - 2 c t a d o s p o r i u m 危l v u m 31 7 4 4 9 9 4 4 4 9 9 8 2 1 c f h c f - 3 c l a d o s p o r i u mf u l v u m 4 4 9 9 8 2 4 31 6 2 0 9 3 9 c f - h c f - 4 c l a d o s p o r i u mf u l v u m 4 4 9 9 8 2 7 31 6 2 0 9 4 1 c f - h c f - 5 c l a d o s p o r i u mf u l v u m 4 4 9 9 8 3 01 2 5 8 4 5 3 0 c f h c f - 6 c l a d o s p o r i u m f u l v u m 1 2 5 8 4 5 2 8 南开大学硕士毕业( 学位) 论文第一部分绪沦 c h h c h 1 c l a d o s p o r i u mh e r b a r u m 2 2 7 9 6 1 5 3 d a v i d i e l l at a s s i a n a c p - c p p h lc l a v i c e p sp u r p u r e a 2 4 4 7 4 5 0 7 c p c r p c r y p h o n e c t r i a p a r a s i t i c a 1 7 0 6 t 5 4 d g h l d i c 秒o n e m a g l a b r a t u m 1 6 9 7 4 1 0 8 d g - 1 1 2 d i c & o n e m ag l a b r a t u m 1 6 9 7 4l l o d g _ h 3 d i c w o n e m a 譬l a b r a l u m 1 6 9 7 4 1 1 2 f v f v h lf l a m m u l i n av e l u t 扣e s1 1 0 9 4 18 8 】1 0 9 4 1 8 6 f v - h y d l f l a m m u l i n av e t u t i p e s 4 1 6 8 8 0 5 8 0 m - h y d lf u s a r i u mv e r t i c i l l i o i d e s3 7 7 2 3 3 0 7 g i b b e r e l l am o n i l i f o r m i s g m h y d 2f z l s a r i u mv e r t i c i l l i o i d e s 3 7 7 2 3 3 1 1 g i b b e r e l 肠m o n i t 扣r m i s g m h y d 3f u s a r i u mv e r t i e i l l i o i d e s3 7 7 2 3 3 】3 g i b b e r e l l am o n i l i f o r m & 0 m h y d 4n d a r i u mv e r t i c i l l i o i d e s 3 7 7 2 3 3 1 5 g i b b e r e l l am o n i l 【f o r m i s g m h y d 5f u s a r i u mv e r t i c i l l i o i d e s3 7 7 2 4 0 8 3 g i b b e r e l l am o n i l i f o r m i s h j h 下b l h y p o c r e a j e c o r i n a 1 7 0 8 3 7 82 1 3 3 3 0 41 5 8 7 2 1 11 0 8 5 1 1 8 丹耙h o d e r m ar e e s e i2 1 3 3 3 0 5 h j h f b 2 h y p o c r e a j e c o r i n a 6 6 4 7 5 5 51 9 0 3 3 2 5 4 2 5 4 3 4 6 84 2 5 4 3 4 6 7 打证h o d e r m ar e e s e i h i ，q 1 d 3h y p o c r e al i x i i 1 7 0 9 9 6 6 开i c h o d e r m ah a r z i a n u m h l - s r h l h y p o c r e al i x i i 1 9 0 3 3 2 i 开i c h o d e r m ah a r z i a n u m l e h y d l l e n t i n u t ae d o d e s9 8 5 7 7 0 87 3 4 0 0 3 1 l e h y d 2 l e n t i n u l ae d o d e s7 3 4 0 0 3 3 9 8 5 7 7 1 0 m a s s g am e t a r h i z i w na n i s o p l i a e3 2 3 0 2 21 7 5 3 61 6 8 3 4 5 m g m a g m a g n a p o r t h eg r i s e a 4 3 3 7 0 6 3 m g - m p g l m a g n a p o r l h e 只r i s e a7 0 - 1 5 3 8 1 0 1 2 6 43 9 9 6 9 4 0 93 0 8 9 5 l1 7 0 9 0 8 5 n c e a s n e u r o s p o r ac r a s s a 4 1 6 7 7 i4 2 2 2 3 13 8 4 2 1 02 9 8 4 o u c u o p h i o s t o m au l m i 1 7 0 5 7 5 6 p b - h y d l p a r a c o c c i d i o i d e sb r a s i l i e n s i s 2 2 0 0 0 8 2 2 p b 1 彻2p a r a c o c c i d i o i d e sb r a s i l i e n s i s3 8 1 2 2 6 4 0 p n - p d i 2 5 1p h o l i o t an a m e k o 1 8 4 7 9 0 0 3 p n p d i 2 6 3 p 矗o l i o t an a m e k o1 8 4 7 9 0 0 8 p n - 耐i 3 15p h o l i o t an a m e k o1 8 4 7 9 0 1 3 p 0 t b h ip l e u r o t u ss p f l o r i d a 1 4 3 2 9 7 6 52 9 8 2 6 2 7 ，16 3 0 4 6 8 0 p o h| p l e u r o t u , o s t r e a t u s 1 8 0 3 3 1 9 2 p 0 p o h l尸l e u r o l u so s t r e a t u $2 9 8 2 6 1 82 3 7 0 3 6 9 p o - p o h 2尸l e u r o l u 2o s t r e a t u s 2 3 7 0 3 7 12 9 8 2 6 2 0 p o - p o h 3 p l e u r o t u so s t r e a t u s2 9 6 0 3 5 0 p 0 v m h lp i e u r o t u so s l r e a t u s4 6 8 8 9 8 4 p 0 v m h 2p l e u r o t u ss p f l o r i d a l 1 7 4 2 6 7 6 4 p o - v m h 3p l e u r o t l l ss p f l o r i d a 4 6 8 8 9 8 6 p t _ h y d 1p i s o l i t h u st i n c t o r i u s 1 7 0 8 3 7 72 1 4 4 1 9 79 0 5 3 7 1 p t - h y d - 2，i s o l i t h u st i n c t o r i u s 2 1 4 4 1 9 89 0 5 3 7 31 7 0 8 3 8 0 p t - h y d 3 p i s o l i m u st i n c t o r i u s 4 0 0 8 0 1 6 s c s c l s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e 1 3 4 2 7 4 s c s c 3 s c h i z o p h v l l c o m m u n e1 7 1 0 8 6 0 ，1 0 1 9 5 7 s c s c 4 s c h i z o p h y l l u mc o m m u n e 1 3 4 2 8 4 is c s c 6 s c h i z o p h y l t u mc o m ? n i o l g6 6 4 7 7 9 63 2 9 3 0 2 9 ；t t - h y d l t r i c h o l o ? n ot e r r e u mi9 3 3 5 6 0 6 6 南开火学硕士毕业 9 5 ) 。 葡萄糖检测等试剂要求分析纯以上。 4 实验方法 4 1 摇瓶发酵 南开大学硕士毕业( 学位) 论文第= 部分实验材料与方法 培养基组成：葡萄糖( 2 0 0g l ) ，蛋白胨( 4 0g l ) ，酵母抽提物( 1 0g l ) ， k h 2 p 0 4 ( 4 0g l ) ，( n h 4 ) 2 s 0 4 ( 2 8 l ) ，m g s 0 4 7 h 2 0 ( 0 6g l ) ，c a c l 22 1 1 2 0 ( o 8g l ) ，自来水配制。消前用h c l 调到p h 4 6 【1 0 。 摇瓶培养使用2 5 0 一m l 和5 0 0 一m l 三角瓶，有效体积为2 0 4 0 ，装入的培养 液体积越少则通气越好。4 8 层纱布扎口，1 2 1 度灭菌2 0 分钟。 接种后，温度2 96 c ，转速2 0 0 r p m 振荡培养，时间一般为3 7 天。 发酵完毕，用64 c8 0 0 0 9 离心2 5m i n ，分开菌丝体和发酵清液。菌丝体立即 进行抽提或先放在一2 0 。c 储存。发酵清液立即进行纯化或先放在4 储存。 4 2 小罐发酵 小罐发酵的培养基组成同摇瓶，试剂的级别可以降为化学纯，甚至工业级。 采用1 5 或3 0 升全自动发酵罐，工作体积5 0 7 5 ，即1 5 一l 发酵罐的装罐 体积为8 l ，3 0 l 发酵罐为1 5 7 l 。自来水配制，1 1 5 。c 灭菌2 0 分钟。冷却到2 9 后，接种。 培养时，搅拌转速3 0 0 1 0 0 0 r p m ，空气的通气量约o 5 2 ：1 ( 每分钏一通过 发酵液总体积的0 5 2 倍) 。罐压o ，0 5 0 1 0 m p a 。用n a o h 和h 3 p 0 4 调p h4 5 5 0 。准备3 0 0 ( w v ) 的葡萄糖溶液，1 1 0 。c 灭菌2 0 分钟。小罐发酵过程隔适当 时间测一次葡萄糖的浓度，保持罐内葡萄糖在1 0 3 0 l 范围内。发酵3 7 天。 初期加少量消泡剂，后期不加。 放罐条件：3 天以后，发酵液特别粘稠，泡沫控制不住，菌丝体湿重达到9 0 9 l 以上，h f b i 总含量达5 0 0 m g l 以上。等葡萄糖浓度降到约o 5g l 立即放罐， 即认定菌丝生长在稳定期即可放罐。 放罐后发酵液经抽滤将菌丝体和发酵清液分开。若有泡沫，也进行收集。不 立即进行纯化的材料的储存方法见4 1 。 4 3s d s 法抽提出h f b i 配制1 7 s t h 缓冲液：称2 0 ，6gt r i s 碱溶于8 0 0m l 蒸馏水中，用2 nh c l 调p h 到9 0 ( 使用p h 计) ，加入1 7gs d s ，加水定容至1 0 0 0 m l ，混匀即得1 7 s t h 缓冲液。 每批菌丝体可用终浓度1 的s d s 抽提三次10 1 。第一次抽提时，考虑菌丝 含水，使用1 7 x s t h ( 都假设干重1 9 5 ) 。第二和第三次则只用1 s t h 进行 1 9 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第二部分实验材料与方法 抽提。具体加法如下： ( 1 ) 第一次按1 1 4 4 m l ( 1 9 湿菌丝体) 加1 7 s t h ， ( 2 ) 第二和第三次按1 9 4 9m l ( 1 9 湿菌丝体) 加1 0 xs t h 。 加完s t h 缓冲液后在室温下振荡1 小时，6 。c8 0 0 0 9 离心2 5m i n ，分开菌 丝体和清液。清液量体积后加入0 4 体积的2mk c l ，混匀，6 。c8 0 0 0 9 离心 2 5m i n 。上清即所需h f b i 制备液。 具体实例 称1 0g 湿重的f 2 菌丝体于5 0 - m l 离心管，加入1 7 x s t h1 1 4 4m l ，3 7 。c 下摇1 小时，之后8 0 0 0 9 离心2 5 m i n ，获上清1 2 5m l 。加入0 4 体积的2 mk c i 5m l ，振摇片刻，8 0 0 0 9 离心，获得上清1 2 0m l ，取样标为f 2 a 0 。 4 4 双水相系统对h f b i 的纯化 ( 1 ) 萃取：待纯化的h f b i 溶液在66 c8 0 0 0 9 离心2 5m i n 后，量取适当体 积的上清，加入2 ( 或5 ) 体积的b e r o l5 3 2 。混匀，2 0 下振摇1 小时后， 在2 0 下8 0 0 0 9 离心2 5m i n ，溶液分成t - 十wb e r o l5 3 2 和下相水溶液。 ( 2 ) 反萃取：分出a t p s 萃取的上相b e r o l5 3 2 ，加入一定体积的缓冲液( 根 据h f b i 浓度和残留的下相水溶液，一般是加与b e r o l5 3 2 同体积的p h8 92 0 m m 的t r i s 缓冲液) 。再加入5 倍所加b e r o l5 3 2 体积的水饱和正丁醇。混合，8 0 0 0 g 离心2 5m i n 。弃去正丁醇，所得的水溶液即已纯化的h f b i 制备液。 具体实例 ( a ) a t p s 抽提发酵上清和泡沫沉降液获得h f b i ： 收集f 2 发酵泡沫的破碎液，离心，取上清。此上清取样标为f 2 8 0 。f 2 发 酵滤液也离心，取上清，此上清取样标为f 2 s 0 。 取f 2 8 0 和f 2 s 0 各9 5 0u l ，各加入b e r o l5 3 25 0 i x l ，2 0 。c 振摇1 小时，6 0 0 0 9 离心5 m i n ，下相分别标为f 2 8 1 和f 2 s 1 ，在上相中加入水饱和正丁醇2 5 0ul ， 振摇片刻，离心分相后，取下相溶液，标为f 2 8 2 和f 2 s 2 。 ( b ) 、a t p s 法分离来源于菌丝体的s d s 抽提液： s d s 法抽提菌丝体获得的h f b i 溶液f 2 a 0 通过葡聚糖凝胶g - 2 5 的s e p h a d e x 柱脱盐，将含h f b i 流分收集起来，标为f 2 c 0 ( 层析见下一章) 。 没有脱盐的溶液f 2 a 0 和脱盐的溶液f 2 c 0 都用如上的a t p s 法抽提。抽提 南开大学硕士毕业( 学位) 论文第二部分实验材料与方法 时分离的下相水溶液分别标为f 2 a 1 和f 2 c 1 ，正丁醇反抽提后获得下相水溶液 标为f 2 a 2 和f 2 c 2 。 4 5 葡聚糖凝胶g 2 5 脱色 葡聚糖凝胶g 一2 5 的预处理和装柱参见精编分子生物学指南 3 7 臻3 7 3 3 7 7 页。实验中使用自制的玻璃柱。柱内直径为l c m ，装柱的工作体积1 0 m l ， 柱高1 2 7 c m 。手动调流速和分管收集。 进柱前，h f b i 制备液( f 2 a 1 样品) 经过6 1 00 0 0 9 离心2 5 r a i n 阻上，弃 去沉淀。上清进柱3m l 。进完立即用p h8 92 0m m 的t r i s 缓冲液洗脱。流速控 制在o 5m l m i n 。在进柱和洗脱的同时用1 5 - m l 离心管收集流分。每管约l m l 。 一般收集2 0 管就够了。2 0 管之后继续沈过但不必再分管了。3 0 m i n 后停止洗脱。 称重法计算准确的体积( 假设密度为纯水的密度) 。用a 2 8 0 紫外法测总蛋白相对 含量。用s d s 。p a g e 分析蛋白质组成 4 6 离子交换层析纯化 阴离子交换填料qs e p h a r o s ef a s tf l o w 的操作说明见p h a r m a c i a5 6 1 1 9 1 0 0 手册，版本a c 或a d 。使用的柱子同4 5 。实际柱高1 4 5 c m ，高径比为1 4 5 ：1 ， 床体积为1 1 4 m l 。自然最大流速进行进柱和洗脱。自动分部收集器收集，每管 最大收集体积不超过4 m l 。 工作基本缓冲液为p h8 9 的2 0 m mt r i s h c l 缓冲液，进柱样品的缓冲液也 先用葡聚糖凝胶g 一2 5 柱层析交换到此工作缓冲液中。在进柱之前样品经过6 c 1 00 0 0 9 离心2 5m i n 离心，弃去沉淀。进样1 6 m l 后按顺序用含0 0 ，0 1 ，0 2 ， o 3 ，0 4 ，o 5 ，2 0 m n a c i 的工作缓冲液各约5 0 m l 进行阶梯式洗脱。 洗脱时用2 1 5 n m 和2 2 5 n m 双波长紫外法测量已出流分的吸光值。洗脱完毕 计算各管的双波长法总蛋白含量，用e x c e l 绘制层析图。选取几个蛋白峰的流分 进行s d s p a g e 分析。选取最高峰的流分用e l i s a 法测h f b i 含量。 4 7 检测方法 4 7 1 紫外双波长法测总蛋白 ( 1 ) 标准曲线的绘制：取1 0 0 m g m l 的b s a 溶液用p b s 缓冲液按表3 稀 释，测2 1 5 n m 和2 2 5 n m 的吸光值。用软件c u r v e e x p e r t 绘制标准曲线。 ( 2 ) 样品总蛋白浓度测量：用p b s 缓冲液适当稀释样品，测量a 2 1 5 和a 2 2 ； 南开大学硕士毕业( 学位) 论文第二部分实验材料与方法 并计算吸光值差，用软件c u r v e e x p e r t 直接读出总蛋白浓度，或者用公式计算： 总蛋白浓度( ug m l ) = 1 4 4 ( a 2 1 s - - a 2 2 s ) 稀释倍数 4 7 2s d s p a g e 与w e s t e r nb l o t t i n g 分析 具体操作参见精编分子生物学指南 3 7 1 第3 3 3 - - 3 7 3 页。半干转移操作还 另参见s t - i 型小型半干式转移电泳槽的使用说明书。 4 7 2 1 普通l a e m m l i 系统s d s p a g e 流程简述 ( 1 ) 组装d y c z 一2 4 d 型垂直板电泳槽，一般使用o 7 5 m m 胶厚的规格。标 记分离胶5 c m 。 ( 2 ) 配胶：2 0 的分离胶，脱气，灌胶。饱和正丁醇封胶。1 ，- 2 h 后洗去 正丁醇，配5 的浓缩胶并灌胶。般插l o 齿梳子。1 2 h 后浓缩胶就凝固了。 ( 3 ) 制样：样品和标准品分别和2 样缓混合。l o o 。c n 热5 r a i n 。冷至室温， 离心后点上清。 ( 3 ) 电泳：浓缩胶中电压5 0 伏，分离胶中电压1 0 0 伏。 ( 4 ) 电泳完用2 5 异丙醇加1 0 乙酸的溶液固定，o 0 6 考马斯亮蓝g 2 5 0 加1 0 乙酸的溶液染色2 小时( 室温) 。用7 甲醇加5 乙酸的溶液脱色至无 底色。可用微波炉加热来加快显色和脱色速度。 4 7 2 2t r i s t r i e i n e 缓冲系统s d s p a g e 流程简述 ( 1 ) 组装完模具，同时配制1 6 的分离胶和5 的浓缩胶，脱气，先灌分 离胶后立即灌浓缩胶，最后插梳子。 ( 2 ) 制样流程与普通l a e m m l i 的相同。 ( 3 ) 电泳：3 0 伏1 h 之后恒流1 0 m a 下4 小时。 ( 4 ) 考马斯亮蓝g 2 5 0 染色过程同普通l a e m m l i 系统，电可采用精编 上快速银染法显色。 4 7 2 3w e s t e r nb l o t t i n g 流程简述 电泳后半于式转移1 小时，膜用丽春红s 染色，洗后用2 ( w v ) 脱脂牛 奶粉封闭，洗后加一抗( 稀释度1 ：1 0 0 0 ) ，洗后加二抗( 稀释度1 ：4 0 0 1 ，最后用 b c i p 和n b t 显色。洗液都为v f b s 缓冲液，每次洗4 次。 显色后膜在室湿下晾干，扫描或摄像变成电子图像。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文第二部分实验材料与方法 4 7 3e l i s a 法定量检测i - i f b i 具体操作参见精编分子生物学指南【3 7 第4 1 l 4 2 5 页。实验由其他师弟 师妹代测，使用直接抗原e l i s a 法和抗原竞争e l i s a 法检测h f b i 的浓度。 4 7 4 斐林法测葡萄糖浓度 具体操作见中华人民共和国专业标准：还原糖测定法：z bx6 6 0 4 0 8 7 1 亚铁氰化钾快速法，详细的方法这里不再列出。但注意事项很重要：每批试 样测试前必须做空白滴定，二次平行测定误差不得超过0 1 m l 。空白滴定、预备 ： 滴定及正式滴定操作条件应保持一致。滴定速度应以每秒1 2 滴为宜。热源要 稳定，在正式滴定时，待试样沸腾后，标准糖液的滴定量必须控制在0 ，5 l m l 之内，否则要重做。整个滴定过程必须始终保持沸腾状态。凡样品含糖量在6 以上时，应适当增加稀释倍数，否则会加大误差。 南开大学硕士毕业( 学位) 论文第三部分结果与讨论 第三部分结果与讨论 1 实验结果 1 1 摇瓶发酵的结果 研究了不同的起始p h 值和接种量、发酵天数等因素对菌丝体的湿重和p h 值的影响情况，并做出了木霉的生长曲线。结果见图9 。 生长曲线 蚓2 0 ： ；澳蒸蒸豢 。誊蒸瑟黧鬈蒸誊i 囊囊攀囊囊誊 2 0 0 器 赠l5 * 埘。瓣，蛾：女篓鼍“。 1 9 5 世 1 0戮嚣黧鬃蘸鬣震荔 9 0 8 5+ 湿重 8 0 p h 5霾霾纛鬻橥熏鬻 7 5 7 0 十体积 i 0 j 瑟骥鬻鬻i 纛鬓鬟鬟豢鬻黧i 鬻i 鏊鬻 6 0 o j 冀琏瓣：；溉捌誊m ：捕戮r 。i 。蠢。鬻+ 。疑。舞+ ”? 5 5 ol2345 5 0 e 数 + 湿重 oo 4 1 61 6 8 78 0 8 3 7 1 0 69 6 8 8 矗 p h 4 6 74 62 9 72 7 72 5 12 4 2 + 体积 2 0 01 9 01 6 9 1 8 0 l7 7 1 7 3 图9 瑞氏木霉摇瓶生长曲线 f i g 9t h eg r o w t hc h i v eo f s h a k i n gc u l t u r eo fzr e e s e i 从图9 中可以发现消前p h 值对摇瓶发酵的影响不大。接种量和发酵天数对 发酵有很大的影响，这可能预示培养基的成分对发酵菌丝体收率有极大的关系。 根据接种量的不同，菌丝的生长情况可以分三种： ( 1 ) 形成几个大球型孢子或接斜面菌丝极少时，或者摇瓶过程中菌丝 贴壁难以分开，菌丝体在培养中形成几个菌丝球，成团生长。 ( 2 ) 菌丝较少但粗壮型和菌丝密集而细碎型当接种量达到十几个到几 百个时，菌丝发育得充分，菌丝粗壮，抱团现象不明显。 ( 3 ) 菌丝密集而细碎型当接种量达到一定数，如1 0 0m l 接3 0 0 个孢予 以上时，菌丝太多，菌丝的就变的很细且容易断裂，菌丝生长旺盛，p h 下降得 很快，接近p h 2 。显微镜下观察，4 天后有孢子出现和菌丝自溶形象。 1 2 小罐发酵的结果 根据多次摇瓶试验结果用1 5 l 发酵罐共进行了两次发酵，批号编为f 1 和 f 2 ；取得两次初步小试发酵数据后，用3 0 l 发酵罐进行了一次完整的小试发酵， 南开大学硕士毕业( 学位) 论文 第三部分结果与讨论 批号编为f 3 。三次小罐发酵过程记录见附录二。总共三次发酵的结果见表2 。 表2 f 1 、f 2 和f 3 批小罐发酵的统计数据 t a b 2t h es t a t i s t i cd a t ao f f e r m e n t a t i o n so f b a t c hn o f i ，f 2a n df 3 批号 f lf 2 f 3 发酵液起始体积 8 0 l8 0l1 7 0 l 发酵起始p h 4 8 34 7 44 8 0 发酵起始葡萄糖浓度 1 6 6 1 7 8 1 4 接种孢子悬浮液1 m l 孢子悬浮液1 m l2 天的摇瓶液2 0 0 m l 发酵总小时数 9 9 h1 3 5 h7 1h 放罐葡萄糖浓度 o o o 9 发酵共耗葡萄糖2 4 0 93 8 0 9 1 6 2 3g 放罐p h 2 3 93 8 6 p h50 3 放罐体积 6 0 l6 2 l1 8 2 l 放罐时泡沫多多无 放罐菌丝体总湿重 2 4 8g 2 6 5g1 8 3 6g 放罐湿重 4 1 3f i t 4 2 ，7 9 几8 9 ，2 9 几 放罐时总h f b i 含量( 估) 。 2 3 5 m g l 2 4 4 m g ，l 5 0 8 4m g l 由实验原始记录上看( 不便公示) 和表2 可以看出：f 1 和f 2 补糖不及时， 并且总量不足；调p h 值时补碱没有跟上。发酵液溶氧后期总达不到0 以上。 结果：放罐时葡萄糖被完全消耗，p h 很低，收获的湿重和估算的h f b i 含量都 约是预期放罐要求( 放罐最低标准：湿重9 0e i ，h f b i 总含量5 0 0m g l ) 的 半。 f 3 批发酵是成功的。从原始记录和表2 看，p