（微生物学专业论文）蛋白磷酸酶活性测定及其凝胶电泳检测方法的改进.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘要 蛋白质的磷酸化与去磷酸化在生物体中起着很重要的生理生化作用，对去磷 酸化酶的研究目前主要是从磷酸酯酶的研究转向蛋白磷酸酶( p r o t e i n p h o s p h a t a s e ) 的研究。迄今为止，只有少数的蛋白丝氨酸，苏氨酸磷酸酶被报道。现在蛋白磷酸 酶研究直接面l 临着瓶颈缺乏一种简便易行、特异快速的检测方法，造成了该 领域研究的困难。 本研究中用蛋白磷酸酶的天然底物酪蛋白作为检测反应底物，通过钼蓝 比色法测定反应后生成的无机磷酸根含量，建立了一种基于蛋白底物的蛋白磷酸 酶活力测定新方法，在测定中分析了去除底物蛋白的方法对显色的影响，并筛选 出t c a 、超滤等方法去除底物蛋白以免干扰后续显色检测，从而优化了测定条件。 该方法具有成本低、背景噪音小、操作简单、快速灵敏的特点。 结果表明，蛋白磷酸酶活性测定可采用如下方法：5 0 0 9 l 反应体系中( 缓冲 液由酶而定) ，包含0 2 m m 底物酪蛋白，加入具有蛋白磷酸酶活性样品，3 7 水 浴反应1 0 m i n 。再加t c a 终止反应、沉淀蛋白( 使其终浓度为5 ) ，离心1 0 ，0 0 0 r m p 1 5 m i n 去除沉淀。或直接将反应溶液超滤7 0 0 0 r p m x 5 0 m i n 。取上清，加入钼蓝 显色液( 加入量占总体积的1 1 0 ) ，3 7 水浴反应1 h ，在7 0 0 r i m 波长下测定吸收 值。 为了方便后续分离、快速鉴定及分析蛋白磷酸酶，有必要开发一种通过聚丙 烯酰胺凝胶电泳分离、分析同工酶谱带的简便、快速、特异、灵敏的方法。本实 验室从磷酸蛋白酶的底物出发，建立了一种蛋白磷酸同功酶的电泳分析方法。它 是将偶联有底物酪蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒作为电泳胶的成分加入，具有活性 的蛋白样品经电泳分离后在原位进行酶反应并使用一种新型的基于荧光的特异磷 酸蛋白染料( p r o q d i a m o n d p h o p h o p r o t e i n g e l s t a i n ) 染色，就可以进行磷酸蛋白 同工酶的分离、负染色、鉴定。本研究从偶联底物出发，对其专一性及对水解酶 类的耐受性进行实验验证分析。并针对现偶联底物的缺陷，对其进行了改进。 关键词：蛋白磷酸酶，无机磷，分光光度法，固相连接 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n a n d d e p h o s p h o r y l a t i o np l a yq u i t e a l l i m p o r t a n t b i o c h e m i c a lr o l ei no r g a n i s m s t h er e s e a r c hw o r ko nd e p h o s p h o r y l a t i o nh a sc h a n g e d f r o mp h o s p h a t a s et op r o t e i np h o s p h o t a s e , h o w e v e r , o n l yaf e wp r o t e i ns e r i n e a h r e o n i n e p h o s p h a t a s e sh a v eb e e nr e p o r t e du n t i ln o w d u et o t h el a c ko fas i m p l e , r a p i da n d s p e c i f i cd e t e c t i o nm e t h o d ，t h es t u d yo np r o t e i np h o s p h a t a s es u f f e r sab o t t l e n e c k an e wm e t h o db a s e do np r o t e i nr e a c t a n tf o rd e t e c t i n gt h ee u z y u l ea c t i v i t yo f p r o t e i np h o p h a t a s ew a se s t a b l i s h e di nt h i sr e s e a r c h t h en a t u r a lr e a c t a n tc a s e i nw a s u s e dt or e a c tw i t hp r o t e i nt y r o s i n ep h o p h a t a s oa n dt h ec o n t e n to fp r o d u c t , i n o r g a n i c p h o s p h a t e ，w a st h e nd e t e c t e db ys p e c t r o m e t r yt oa n a l y z et h ew “d z y l n ea c t i v i t y t h e e f f e c t so fv a r i o u sr e a g e n t so nt h er e a c t i o nw c r ea l s os t u d i e dt h r o u g h o u tt h ep r o c e s so f o p t i m i z a t i o n i tw a st h ef i r s tt i m et oi n v o l v et h en a t o r a lr e a c t a n tc a s e i nt od e t e r m i n et h e a c t i v i t yo fp r o t e i nt y r o s i n ep h o p h a t a s e , w h i c hc a ns i g n i f i c a n t l yr e d u c e dt h ed e t 嘲2 t i o n c o s ta sw e l la st h eb a c k g r o u n dn o i s e t h i sm e t h o di st h u sm o r er e l i a b l ea n dm o r e a p p l i c a b l ef o rr e l e v a n tr e s e a r c h t h ee f f e c to fv a r i o u sm e t h o d s ( s u c ha st c a a n d u l t r a f i l t r a t i o n ) t or e m o v i n gt h er e a c t a n tp r o t e i nw a ss t u d i e da n do p t i m i z e da c c o r d i n g l y t h i sf l e 、vm e t h o dw a sc o s t - e f f e c t i v e , r a p i d , s e n s i t i v e , l o wi nb a c k g r o u n dn o i s ea n d s i m p l ei no p e r a t i o n t h en o wd e t e c t i o ns y s t e mf o rp r o t e i np h o p h a t a s ea c t i v i t yc o u l db es u m m a r i z e da s f o l l o w s ：a5 0 0 p lr e a c t i o nv o l u m e ( b u f f e rb a s e do nt h e 部l z y n l eu s e d ) c o n t a i n i n g0 2 m m c a s e i n , 1 - 2 i _ t gp h o p h a t a s ew a si n c u b a t e di n3 7 cw a t e rf o r1 0 m i n ；a f t e ra d d i n gt c a ( f i n a lc o n c e n t r a t i o n5 ) ，t h ed e p o s i tw a se x c l u d e db yc e n t r i f o g a t i o nw i t h1 0 ，0 0 0r p m f o r1 5 r a i n ( o rn l t r a f i l t r a t i o nw i t l l7 , 0 0 0r p mf o r5 0r a i n ) ；m o l y b d a t es o l u t i o nw h i c h o c c u p i e dt o t a lv o l u m e1 1 0w a sa d d e d i n t os u p e m a t a n ta n di n c u b a t e di n3 7 w a t e rf o r l ha n dt h e nd e t e c t e db ys p e c t r o m e t e ra t7 0 0 n mw a v e l e n g t h i no r d e rt os i m p l i f yt h es u c c e s s i v ew o r ko fi s o l a t i o n , r a p i di d e n t i f i c a t i o na n d a n a l y s i so f p r o t e i np h o s p h a t a s e ，i ti sq u i t en e c e s s a r y t od e v e l o pas i m p l e , r a p i d , s p e c i f i c a n ds e n s i t i v em e t h o dt oi s o l a t ep r o t e i np h o s p h a t a s ef r o mc y t o p l a s mo rp r o t e i nc o m p l e x i nc u l t u r em e d i a o u rl a bh a se s t a b l i s h e dan o v e lp h o s p h a t a s ei s o e n z y m ea n a l y s i s m e t h o db a s e d0 ni t ss u b s t r a t e g e le l e c t r o p h o r e s i sa n dan o v e lf l u o r e s c e n c e - b a s e d d e t e c t i o nd y e ( p r o - qd i a m o n dp h o p h o p r o t e i ng e ls t a i n ) w e r ee m p l o y e dt os e p a r a t e a n da n a l y z et h ei s o e n z y m e sw h i c hf u l f i l l e dt h er e q u i r e m e n ta b o v e t h i sm e t h o ds t a r t e d n 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 w i t ht h er e a c t a n tc a s e i n ，w h i c hw a sc o u p l e dw i t ht h ep o l y a c r y l a m i d eg e l 毋证n su s i n g g l u t a r a l d e h y d el i n k i n gm e t h o d t h eg r a i n sw e l et h e na d d e di n t ot h ee l e c t r o p h o r e s i sg e l a sac o m p o n e n t a r e re l e c t r o p h o r e s i s ，t h ee n z y m a t i cr e a c t i o na n das p e c i f i cs t a i n i n g m e t h o dp e r f o r m e d ns i t u ，t h ei s o e n z y m e sw e r ei s o l a t e d ，n e g a t i v es t a i n e da n di d e n t i f i e d i nt h i sr e s e 棚j c l l w oh a v et e s t e dt h es u b s t r a t e s s p e c i f i c i t ya n di t s e n d u r a n c eo f p m t e i n a s e t h ec o u p l e ds u b s t r a t e sw t e l ei m p r o v e du p o nt h e i ra c t b a li n s t a n c e k e y w o r d s ：p r o t e i np h o p h a t a s e , i n o r g a n i cp h o s p h a t e , s p e c t r o m e t r y ，s o l i d p h a s e s y n t h e s i s m 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重迭太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：薅氛 签字日期： ? 7 年占月彦日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重庆太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重废太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“4 ”) 学位论文作者签名：薅岚 签字日期： 7 - 翻0 7 年6 月8 日 导师签名：磊l ，易 签字日期：砷年占月多e t 重庆大学硕士学位论文i 绪论 1 绪论 1 1 研究的目的及意义 磷酸化( p h o s p h o r y l 撕d n ) 和脱磷酸化( d e p h o s p h o r y l a t i o n ) 作用是生命活动的最基 本的两个相互矛盾又相辅相成的生物化学反应。蛋白磷酸化是蛋白磷酸化酶将磷 酸基团转移到底物蛋白的共价修饰过程，它调节酶的活性或生物学功能，由蛋白 激酶催化完成；蛋白激酶包括丝氨酸苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶两大类， 分别催化目标蛋白的特定丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点的磷酸化。而蛋白的去磷 酸化过程则由特异性蛋白磷酸酶催化除去磷酸根基团而实现。 可逆性蛋白磷酸化去磷酸化普遍存在于各种细胞活动过程中( 图1 1 ) ，并参 与许多细胞反应过程的调节。通过磷酸化，去磷酸化不仅影响许多生化酶的活性而 参与糖、脂肪和蛋白质等物质代谢，而且参与各种信号传递，影响转录因子活性 及其核转位，调节靶基因的转录激活。不仅如此，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基 的可逆磷酸化还在真核生物中起着调节功能蛋白和肽的翻译后修饰的重要作用。 可以说，许多种活性被精确调控且作用位点特异的蛋白激酶和蛋白磷酸酶所催化 的反应，构成了细胞的化学能量的贮存与动用、合成代谢与分解代谢、细胞信号 的发生与传导等生命活动的重要过程，几乎涉及到所有的生理、病理过程。因此， 开发并掌握用以确定蛋白质和肽的磷酸化情况的技术和工具，对研究各种生物现 象中( 包括：信号传导、细胞分裂、细胞运动、细胞凋亡、新陈代谢、细胞分化、 基因调控和癌变等) 有着重要意义。 图1 1 磷酸化去磷酸化的基本代谢图 f i g 1 1p h o s p h o r y l a t i o na n dd e p h o s p h o r y l a t i o n 重庆大学硕士学位论文1 绪论 迄今为止，只有少数的蛋白丝氨酸苏氨酸磷酸酶被报道。对各种磷酸化蛋白 质的去磷酸化主要是由四种蛋白磷酸酶：t y p e s l 、2 a 、2 b 和2 c 来催化的( 表1 1 ) 。 蛋白质酪氨酸残基的可逆磷酸化是生物生理及病理过程的关键机制，其磷酸化水 平受酪氨酸激酶( p r o t e i nt y r o s i n ek i n a s e s ，p t k s ) 和酪氨酸磷酸酶( p r o t e i nt y r o s i n e p h o s p h a t a s c s ，p t p s ) 的共同调节。由于蛋白磷酸化与去磷酸化在生命过程中的重要 意义，蛋白磷酸酶( p r o t e i np h o s p h a t a s e ) 的研究已经成为的热点。过去人们主要 研究p t k s ，近几年，广大科研工作者越来越重视对p t p s 的研究。而这些研究中 测定蛋白磷酸酶活性是研究中的日常工作。但是现在研究蛋白磷酸酶还没有一种 简便易行、特异快速的检测方法，因此直接影响了蛋白磷酸酶的研究进展。 表1 1 信号转导中的各种蛋白磷酸酶 t a b l e1 1p h o s p h a t a s e si ns i 部l a lt r a n s d u c t i o n 蛋自碍酸腾定位。调节藿将抑翻剂 p p l 细狍质，缎胞彼舭朦耋f 臻。( km 尽标重罄 铂晌抽九n o c l o l a 蝴- 懈1 一口 糖琢释技 ” p 隧 鲴瞻成线控辩擅臆擅 蟹旗。b 巫錾国f y c i l 轴a 、硼删如$ n 0 6 u 濂r i n o a 国d a l c m d 自妇蛐鲥。， p p 孀 螭缒质质脱甓麓小体拳8 蕾躲钙调嚣c y c l 。e i o n a 艘f 糙与各自免攥浓和 匏辕 “，。 擞囟雏嚷的笈台物国9 科m 删_ i l j n ”d 蜘m 倒 蜘f i 婶晴妇 p 璜艇维匏棱多种 e p v ( p h 帅) d e p h o s t a t i n 唧v p i c ) d m h r s o d i u m o 弛婚删嘲 目前，蛋白磷酸酶活性测定多用放射性同位素3 2 p 和3 3 p 来标记，然后通过放 射自显影来检测【”。但标记技术受限于有限范围的生物样本且涉及材料的安全操 作、处理和仪器的放射性污染问题，使得该方法的运用受到极大的限制。近些年 来，一些取代放射性同位素标记的方法发展起来，如用含有磷酸基团的芳香族底 物。常用的芳香族化合物有p n p p 、f d p 、d i f m u p 等【2 1 。然而这些物质并非蛋白 磷酸酶的天然底物，所检测出的是磷酸酶，而不一定是蛋白磷酸酶。如果是利用 荧光进行检测，实验条件要求相对较复杂，且荧光底物价格较高。还有一些方法 如用合成酪氨酸磷酸化肽段模拟天然底物进行反应，再通过测定被释放的磷酸根 离子来确定蛋白磷酸酶活力，但这些合成肤段价格同样很高。因此，探索并建立 一种成本低、背景噪音小、操作简单、快速灵敏的基于蛋白底物的蛋白磷酸酶活 力测定新方法对该类酶的研究具有重要意义。 2 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 2 研究的目标 本文旨在建立一种成本低、背景噪音小、操作简单、快速灵敏的基于蛋白底 物的蛋白磷酸酶活力测定新方法。并且对实验室现已建立的偶联底物一蛋白磷酸 同功酶电泳分析方法，从磷酸蛋白酶的底物出发，对其偶联底物进行专一性及对 水解酶类的耐受性进行实验验证分析。针对现偶联底物的缺陷，对偶联底物进行 改进。 1 3 研究主要内容及技术路线 1 3 1 磷比色法检测蛋白磷酸酶活性 本研究用蛋白磷酸酶的天然底物酪蛋白作为检测反应底物，通过磷比色 法测定酶作用后生成的无机磷酸根含量，建立了一种基于蛋白底物的蛋白磷酸酶 活力测定新方法，并对检测反应中的各因子进行优化。 技术路线： 设置磷离子浓度梯度，确定每种磷比色方法的显色灵敏度并制作标准曲 线，从而选定磷比色法用于酶活测定； 使用各种蛋白沉淀法去除底物蛋白以免干扰后续显色检测，分析比较各种 去除底物蛋白的方法对显色的影响，并进行沉淀方法的选定与优化； 利用实验室自产的具有蛋白磷酸酶活性的粗酶样品对此种检测方法进行 验证及应用。 1 3 2 蛋白磷酸酶凝胶电泳检测方法偶联底物的改进探索 本实验室已研究开发了连有蛋白磷酸酶底物的载体大分子( p a m c a s e i n ) ，将 此种微粒载体当作电泳凝胶的成分加入，制得含有底物且分布均匀的凝胶。经过 电泳分离后的磷酸蛋白同工酶就可以在原位进行酶反应对磷酸化的蛋白质去磷酸 化，通过p r o qd i a m o n dp h o s p h o p r o t e i ng e ls t a i n 特异的染色得到同工酶谱带。为 混合样品中蛋白磷酸酶的分离鉴定奠定了基础( 王震生，2 0 0 7 ，未发表) 。 由于该方法所连接的底物为酪蛋自，而具有蛋自磷酸酶活性的复杂的细胞内 物质或是培养液中难免会含有其它蛋白酶，它们同样可能作用于酪蛋白，将其分 解成小分子物质而失去磷酸基团。虽然与蛋白磷酸酶的去磷酸化作用机理不同， 但是在电泳图谱中同样会被p r o qd i a m o n dp h o s p h o p r o t e i ng ds t a i n 负染色。由于 底物的这种不专一性，造成了蛋白磷酸酶同工酶分析的不准确性。 本实验将在前人的蛋白磷酸酶电泳分离分析的基础上，将连接的底物改成蛋 白磷酸酶的专一性底物，如磷酸化酪氨酸，以避免非专一性降解，在特定蛋白磷 酸酶的分离鉴定方面做一些探索。 技术路线： 3 重庆大学硕士学位论文1 绪论 使用市售的具有底物专一性的不同的蛋白磷酸酶和蛋白酶k 对偶联底物 的专一性及水解酶类的耐受性进行实验分析； 为了克服现有偶联底物蛋白的缺陷，使用戊二醛偶联法将磷酸化酪氨酸与 聚丙烯酰胺载体微粒偶联； 1 4 研究创新性 本方法首次使用了蛋白磷酸酶的天然底物酪蛋白作为检测反应的底物，引 入无机磷检测中的磷钼杂多蓝分光光度法测定酶作用后生成的无机磷含量来测定 酶活。建立了一种基于蛋白底物的蛋白磷酸酶活力测定新方法，并对检测反应中 的各因子进行优化。 对蛋白磷酸同功酶凝胶电泳分析法的偶联底物的专一性和对水解酶类的 耐受性进行了分析验证。并针对现有底物的缺陷，以磷酸化酪氨酸作为底物用戊 二醛偶联法对聚丙烯酰胺载体颗粒进行连接。 4 重庆大学硕士学位论文2 文献综述 2 文献综述 蛋白质的磷酸化和去磷酸化，介导控制多种细胞过程的信号转导。目标蛋白 的特定丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点由蛋白激酶磷酸化，而其去磷酸化过程则由 特异性蛋白磷酸酶除去磷酸根团而实现( 见图1 1 ) 。作用于特定位点的同类蛋白 激酶或蛋白磷酸酶的活性被精确调控。 2 1 磷酸酶 磷酸酯键在活体细胞中具有非常重要的功能。它参与贮存和传递遗传信息， 运输化学能量，调节酶活性和信号分子。磷酸酶能够作用于磷酯键并催化磷酯键 断裂，属磷酸水解酶亚科。用不同的方法，可将磷酸酶进一步分类【3 】。基于它们的 底物不同，可被分为：非特异性磷酸酶，可以催化水解几乎所有的磷酸酯键；蛋 白磷酸酶，以磷酸蛋白和磷肽为底物。 非特异性磷酸酶基于它们作用的最适p h 又可被分为碱性和酸性磷酸酶。碱性 磷酸酶( a l k a l i n ep h o s p h a t a s e ，a p ，e c 3 1 3 1 ) 和酸性磷酸酶( a c i dp h o s p h a t a s e ，a c p ， e c 3 1 3 2 ) 可在新陈代谢过程中对磷酸根进行循环利$ c 4 j 。酸性磷酸酶分为低分子 量a c p 和高分子量a c p ，根据它们对抑制剂酒石酸的耐受性可分为酒石酸敏感 a c p 和酒石酸耐受性a c p 。 蛋白磷酸酶据其底物特异性分为两组：丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶( p s t p s ， e c 3 1 3 1 6 ) 和酪氨酸蛋白磷酸酶( p t p s ，e c3 1 3 4 8 ) 。前者水解丝氨酸或苏氨酸残 基的磷酸基团，包括p p p 和p p m 家族；后者从酪氨酸残基上水解磷酸基团。p t p s 还包括双特异性磷酸酶，可以水解所有三种磷酸化氨基酸的磷酸基团，是p t p 的 一个亚家族，参与蛋白磷酸酶调节信号转导途径1 4 - 6 。大约3 0 的胞内蛋白都有可 逆磷酸化过程p 】。p p p 和p p m 家族蛋白，催化域高度保守，调节域和调节亚基承 担功能的多样性。丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶是金属酶，并通过一个金属活性的亲 核水分子，使底物在单反应步骤中脱磷酸，而酪氨酸蛋白磷酸酶通过半胱氨酸磷 酸酶中间体来催化脱磷反应。 2 2 蛋白磷酸酶 自从上世纪5 0 年代中期以来，k r e b s 和f i s c h e r 发现了在控制糖原代谢过程中 蛋白质磷酸化的作用并首次鉴别了丝苏氨酸磷酸蛋白酶以来，蛋白质可逆的磷酸 化和去磷酸化作用在翻译后修饰过程中已被认为是最为关键的事件之一，它是构 成由胞外信号( 如：激素、促细胞分裂素和神经冲动等) 调节细胞生长、分化和 5 重庆大学硕士学位论文2 文献综述 转化的信号传导机制中一个重要的组成部分【纠o 】。机体内两类主要的酶类( 蛋白激 酶和蛋白磷酸酶) 分别密切参与了磷酸化和去磷酸化这两个完全相反的催化作用。 据估计，在典型的哺乳动物细胞中有超过了大约1 0 的蛋白质是磷酸化蛋白【1 1 】， 在人体中至少有三分之一的蛋白质含有共价偶联的磷酸侧1 2 】。事实上，每种人类 疾病都被认为是源于细胞信号传导的缺失，因而就使得把激酶和磷酸酶类作为新 治疗法的目标有了价值。 蛋白磷酸酶( p r o t e i np h o s p h a t a s e s ，p p s ) 家族可以根据它们的不同底物特异 性、对金属离子的依赖性以及对不同抑制剂的敏感程度进行分类。p p l 和p p 2 a 活 力不受金属离子影响。p p i 的催化亚基通过结合调节亚基实现其亚细胞定位和酶活 力。p p 2 a 分子上的t y r 残基被瞬时磷酸化时无活力。p p 2 b ，又称钙调神经磷酸酶 ( c a l e i n e u r i n ) ，由一个6 1 k d a 的催化亚基( a l p h a 亚基) 和一个1 9 k d a 的调节亚基 ( b e t a 亚基) 组成，其活力同时受c a 2 + 弄a 钙调素( c a m ) 调节。 现已发现超过4 0 种酪氨酸蛋白磷酸酶( p t p s ) ，它们都具有一个2 3 0 个氨基 酸的催化结构域，以及一系列与酶的亚细胞定位和酶活力调节相关的调节亚基。 表1 1 列出信号转导中涉及的不同蛋白磷酸酶的主要特性。 蛋白质中酪氨酸磷酸根基团的去磷酸化由蛋白酪氨酸磷酸酶实现。另一类磷 酸酶可以催化两类磷酸根基团( 磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸) 的去磷酸化。此 类磷酸酶参与细胞周期蛋白依赖性激酶和m a p 激酶的激活。磷酸酶缺乏或调节失 常与多种疾病有关，包括癌症和糖尿病。近来发现，p t p1 b 为胰岛素信号通路的 负反馈调节因子，这意味着p t p1 b 的抑制剂( 如d m h v ) 可能对二型糖尿病的治 疗起作用。 然而，目前对大多数的磷酸酶来说，它们相关底物的生理学性质还不清楚。 因此，实际上我们划分某类酶为丝苏氨酸磷酸酶时，并非意味着这就一定是它在 体内的唯一酶学活性。事实上，典型的丝苏氨酸蛋白磷酸酶之一的钙调磷酸酶 ( c n ) 就能像水解如硝基磷酸苯( p - n i 仃o p h e n y lp h o s p h a t e ，p n p p ) 这类的芳香基 磷酸酯一样的水解含有磷酸酪氨酸的肽类1 1 2 】。 近来，在蛋白磷酸酶的生理功能及其构象方面的认识有了不小的进展。通过 对酪氨酸磷酸蛋白酶和丝苏氨酸磷酸蛋白酶的晶体结构的研究，揭示了这些蛋白 质酶类不同方式的酶促机制是与它们的独特结构和去磷酸化催化作用相关的。这 些研究得出了几个重要的结论：首先是蛋白磷酸酶与蛋白激酶的活性既相互协作 又相互对抗这样一个明显矛盾的现象；其次是在特定结构家族中的蛋白磷酸酶类 是高度保守的。同时这个家族中蛋白磷酸酶的特异性很大程度上是来自其非催化 的调节和靶标域或相关亚基。因而蛋白磷酸酶性质的多样性对其构象的研究产生 了充满吸引力的问题。现在对p t p 家族蛋白酪氨酸磷酸酶和p p p 家族的蛋白丝 6 重庆大学硕士学位论文2 文献综述 苏氨酸磷酸酶的构象方面的研究已能回答部分这方面的问慰1 3 】。 岁加絮； p s t p ( s e r i n e t h r e o n i n ep h o s p h a t a s e s ) p p p p p l p p 2 a p p 2 b p p 4 - 7 p p m 上 p p 2 c p 1 1 p ( t y r o s i n ep h o p h a t a s e s ) j j j i c l a s sic y s - b a s e dp t p s c l a s si ic y s - b a s e dp t p s c l a s si i lc y s - b a s e dp t p s a s p - b a s e dp t p s 图2 1 蛋白磷酸酶的分类 f i g 2 1c l a s s i f i c a t i o no f p r t e i n p h o s p h a t a s e s 2 2 1p t s p s 由于蛋白质的磷酸化大约超过9 8 都是发生在丝苏氨酸残基，因而丝苏氨酸 的磷酸化去磷酸化在调控细胞过程中重起着至关重要的作用【1 3 】。此过程是由相应 的激酶和磷酸酶共同参与调控的。 在人类基因组的三万来个基因中，编码激酶的基因约有5 1 8 个【1 4 1 ，而编码蛋 白磷酸酶的基因数只有约1 5 0 个，其中编码p s t p s 的基因数仅约为4 0 来个。因此， p s t p s 通常是由在基因组上分散于不同位置的基因来编码的少数催化亚基，通过与 调控亚基和靶向亚基的结合，从而组成的大量具有不同生物学功能的特异全酶。 这也就是为什么在人体内只有约4 0 个编码p s t p s 催化亚基的基因，而与之对应的 编码蛋白丝苏氨酸激酶( 催化丝苏氨酸残基磷酸化的酶类，p s t k s ) 的基因数量则 高达4 2 8 个的原因! 它们共同调控了在细胞内超过三分之一的蛋白质的广泛磷酸 化作用。相较由各亚基相结合而组成的p s t p s 来说，p t p s 则是属于单链多域结构 的酶类，而相应的是在人类基因中，编码p t p s 和蛋白酪氨酸激酶( p t k s ) 的基因 数大致相同，分别为1 0 7 个和9 0 个。故而可以推测：与具有单链多域结构的p t p s 相比，通过组合亚基形式构成的p s t p s 可能更具有多样性和灵活性，但是p s t p s 在严格的特异性和严密的调控性方面可能是有所欠缺的 1 5 , 16 】。 7 重庆大学硕士学位论文 2 文献综述 p s t p s 根据其催化亚基的序列同源性可以亚分为两个家族：第一类主要是由 p p l ，p p 2 a ，依赖c a 2 + c a m 的p p 2 b ( 钙调磷酸酶c a l c i n c u r i n ，c n ) ，加上近来才 鉴定出的蛋白磷酸酶p p 4 ，p p 5 ，p p 6 和p p 7 构成，通常将其称为p p p 家族；第二 类是m 矿依赖性的p p 2 c ，由e d n a 克隆显示它与p p p 家族酶类没有序列相似性， 而是五种p p 2 c 异构酶与丙酮酸脱氢磷酸酶( p y r u v a t ed c h y d r o g e n a s ep h o s p h a t a s e ) 一起构成了称作p p m 的另一基因家蒯1 。7 】( 见图2 2 ) 。 图2 2p s t p s 根据其催化亚基的分类 f i g 2 2p s t p sc l a s s i f i e db yt h e i rc a t a l y s e ds u b u n i t 2 2 2p t p s 酪氨酸的磷酸化去磷酸化是真核生物生理功能的无数重要方面的一个基本机 制，关乎人体的健康和疾病 1 7 - z o ! 。与总的蛋白磷酸化去磷酸化相比，酪氨酸的磷 酸化去磷酸化只是在多细胞真核生物中广泛存在。酪氨酸磷酸化去磷酸化主要参 与细胞内外的通信，细胞运动和成形，增殖与分化的确定，调控基因转录的细胞 过程，m r n a 过程和分子的转运进出细胞等活动。并且在胚胎发育、器官发育、 组织的自体调节和免疫系统这些过程中起着协调邻接细胞的重要作用。而当其失 常时，它又与从癌症到免疫缺乏等众多的人类遗传或获得性疾病的发病机理有相 当关系 1 6 1 。 虽然酪氨酸的磷酸化去磷酸化作用是通过p t k 和p t p 以一种均等且平稳的作 8 重庆大学硕士学位论文2 文献综述 用在调节，但是相对而言，在对他们的研究上却是关注在p t k 上的研究要多得多。 这其中有一部分是历史原因：第一个被纯化1 2 1 】和克隆幽出的p t p 比第一个p t k 晚 了足足将近十年【2 3 】。最近的发现已经导致了对p t p 新的认识：即p t p 在决定细胞 内酪氨酸磷酸化的水平方面和在调节许多生理过程方面起着特殊和积极，甚至是 显著的作用1 2 4 - 2 7 , 1 9 挪】。 现在通过对p t p 保守的催化域片断和完整催化域的氨基酸序列在数据库中搜 索那些编码p i p 或类似p t p 的基因，从而在人类基因组中得到了1 0 7 个p t p 基因。 这1 0 7 个p t p 基因，只有8 1 个p t p 真正具有蛋白酪氨酸磷酸酶活性。与p s t p 一 样，基于的区分原则不同，p t p s 也可以有不同的分类，通常来说可以将其分为受 体p t p s ，非受体p t p s ，d s p s 和低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶( l m p t p s ，它是一类 能催化芳香基磷酸酯( 也包括磷酸酪氨酸残基) 去磷酸化的酶类) 。l m p t p s 尽管 与p t p s 没有序列相似性，但因其催化机制与典型的p t p s 相似，因而也常将其划 入到p t p 中，构成一超家族。 而现在根据p t p s 的催化域氨基酸序列，也可以将其分为四个家蒯1 6 l ：第一 个家族是最为庞大的一大类基于半胱氨酸的p t p s ，包含了3 8 个众所周知最为“经 典”的p t p s 【2 8 】( 它们具有严格的酪氨酸特异性，并都带有小鼠直系同源基因) 和 具有类似v h l 基因的双底物特异性蛋白磷酸酶( d s p s ，就底物特异性而言是最具 差异性的一组) 。基于标准的p t l s ，d s p s 和其它v h l 基因类似酶类的结构相似性， 第一家族的所有酶都是从一个共同的祖先处进化来的。第二个家族在人体中只有 一个酶类，它是一类基于半胱氨酸的小分子量的具有酪氨酸特异性的p t p s ( l m p t p s ) ，在进化起源上比第一个家族还要久远，在所有的门里都发现了有这 个家族的代表，包括了植物、大量的原生生物。l m p t p s 在结构上与细菌砷酸盐还 原酶相关。第三个家族是基于半胱氨酸的具有酪苏氨酸特异性的p t p s 。它最有可 能是从细菌硫氰酸酶类似酶进化而来。它们仅表现为三个p 8 0 c d c 2 5 细胞周期调节 器的作用。有趣的是，在第一个家族中的有一类p t p s 中含有一个无催化活性的硫 氰酸酶类似酶结构域这被认为是c d c 2 5 的同源( c h 2 ) 结构域。尽管在催化 机制2 9 】和活性位点结构上1 3 0 - n 1 具有相似性，但是这三个p t p s 家族都是独立进化来 的。不过，结构比对结果显示他们的起源可能是通过元件重排的原始折叠方式而 来【l ”。与此相反，p t p s 的第四个家族是具有不同的催化机制的酶，它有一个关键 的天冬氨酸和对阳离子的依赖性。这个家族包含了e y a ( e y e a b s e n t ) 蛋白，最近 发现e y a 蛋白是具有酪氨酸，或丝氨酸，或苏氨酸特异性的蛋白磷酸醪3 4 筇, 3 6 1 。鉴 定这个大的水解酶家族的底物特异性，需要广泛的分析来确定哪些e y a 是属于 9 重庆大学硕士学位论文2 文献综述 p t p s 的。现在，只有4 个e y a 蛋白表现出了实验上的p t p s 性质。 1 0 重庆大学硕士学位论文 2 文献综述 图2 3 全部f t p s 的结构域 f i g 2 3 t h es t r u c t u r eo f p t p s 缩写：b r o ，b a c u l o v i r u sb r oh o m o l o g y ；c i ，p r o t e i nk i n a s ccc o n s e r v e dr e g i o nl ；c 2 ，p r o t e i nk i n a s ecc o n s t r e g i o n2 ；c a , c a r b o n i ca u h y d r a s e - l i k e ；c a a xb o x ，f a r n e s y l a t i o ns i g n a l ；c h 2 ，c d c 2 5h o m o l o g yr e g i o n2 ；c r a l t r c e l l u l a r r e t i n a l d e h y d e b i n d i n g p r o t e i n 仕i n h o m o l o g y ( s e c l 4 p h o m o l o g y ) ；f e r m ，b a n d 4 i e z r i n m d i x i n m o c s i n h o m o l o g y ；f n ，f i b r 6 n l i k e ；f y v e ，f a b l y o t b v a c i p e a r l ye n d o s o m a la n t i g e n lh o m o l o g y ；i 舀 m m u n o g l o b u l i n - 1 k e ；m k i n a s ei n t e r a c t i o nm o t i f ；k i n d k i n a s enl o b e - l i k ed o m a i n ；m a m ，m e p r i n 。a 2 r p t p p h o m o l o g y ；, p b m ，p d zb i n d i n gm o t i f ；p d z ，p o s t s y n a p f i cd e n s i t y - 9 5 d i s c sl a r g 吡0 1h o m o l o g y ；, p h ，p l e c k s 位h l h o m o l o g y ( i n c l u d i n g g r a m d o m a i n s ) ；f i b ，p h o s p h o t y r o s i n e - b i n d i n g d o m a i n ；s h 2 ，s h o m o l o g y 2 ：s h 3 b ，s r c h o m o l o g y3d o m a i nb i n d m gm o t i f ；s h 4 ，s r ch o m o l o g y4 ( m 灿咖6 0 ns i g n a l ) ；c o i l ，c m l e d c o i ld o m a i n ；g b ，g l y c o b i n d i n g ；m r c ，m r n ac a p p i n g ；p e p n ，n - t e r m i n a lp e p t i d a s e - l i k e ；p r o - r i c h ，p r o l i n e - r i c h ；s e c l 4 ，s e c l 4 ph o m o l o g y “ c r n t r r 砒o ) 此外，图中黑色的小方块表示跨膜区，红色小叉的f r i 甲域表示无催化活性域。 重庆大学硕士学位论文2 文献综述 p t p s 的模型构造； p t p 家族的一个最为显著的特点就是大多数的酶都是一些模式结构域的组合 ( 见图2 3 ) 。全部的1 0 7 个p t p 有7 9 个除了催化结构域外至少还有一个结构域或 基序。这些结构域许多都是蛋白质相互作用或是结合磷脂的模式结构域。由于这 层关系，p t p s 与p t k s 是类似的【1 4 1 ，但是他们与丝苏氨酸蛋白磷酸酶明显是不一 样的。在p t k s 中，蛋白质相互作用域起着两个特殊的用途：调节和靶向底物或胞 内区间。虽然目前对许多结构域的情况还不是很清楚，